Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Optimalisert protokoll for ekstraksjon av proteiner fra Human Mitral Valve

Published: June 14, 2017 doi: 10.3791/55762
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1, 2,3,4
1Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 2Cardiovascular Tissue Bank of Milan, Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 3Department of Clinical Sciences and Community Health, Cardiovascular Section, University of Milan, 4Department of Cardiovascular Disease, Development and Innovation Cardiac Surgery Unit, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

Summary

Proteinsammensetningen av den humane mitralventilen er fortsatt delvis ukjent, fordi dens analyse er komplisert ved lav cellularitet og derfor ved lav proteinbiosyntese. Dette arbeidet gir en protokoll for effektivt å ekstrahere protein for analyse av mitralventilproteomet.

Abstract

Analyse av det cellulære proteomet kan bidra til å belyse de molekylære mekanismene som ligger til grunn for sykdommer på grunn av utviklingen av teknologier som tillater storskala identifisering og kvantifisering av proteiner som finnes i komplekse biologiske systemer. Viten som oppnås fra en proteomisk tilnærming kan potensielt føre til en Bedre forståelse av de patogene mekanismene som ligger til grunn for sykdommer, noe som gjør det mulig å identifisere nye diagnostiske og prognostiske sykdomsmarkører, og forhåpentligvis av terapeutiske mål. Imidlertid representerer kardial mitralventilen en meget utfordrende prøve for proteomanalyse på grunn av den lave cellulariteten i proteoglykan og kollagen-anriket ekstracellulær matrise. Dette gjør det vanskelig å ekstrahere proteiner for en global proteomanalyse. Dette arbeidet beskriver en protokoll som er kompatibel med etterfølgende proteinanalyse, som kvantitativ proteomikk og immunoblotting. Dette kan tillate korrelasjon av dataeneG-proteinuttrykk med data om kvantitativt mRNA-ekspresjon og ikke-kvantitativ immunhistokjemisk analyse. Faktisk vil disse tilnærmingene, når de utføres sammen, føre til en mer omfattende forståelse av molekylære mekanismer som ligger til grunn for sykdommer, fra mRNA til post-translasjonell proteinmodifisering. Dermed kan denne metoden være relevant for forskere som er interessert i studiet av hjerteventil-fysiopatologi.

Introduction

Nylige bevis har endret forståelsen av rollene til de mange regulatoriske mekanismer som oppstår etter mRNA-syntese. Faktisk kan translasjonelle, post-transkriptionelle og proteolytiske prosesser regulere protein overflod og funksjon. Dogmen - som sier at mRNA-konsentrasjoner er proxier til de tilsvarende proteinene, forutsatt at transkripsjonsnivåene er hovedbestemmende for protein overflod - har blitt delvis revidert. Innledningsvis forutsier transkripsjonsnivåer kun delvis overflod av protein, noe som tyder på at posttranskripsjonelle hendelser Forekommer for å regulere proteinene i cellene 1 , 2 .

Videre dikterer proteiner til slutt cellens funksjon og dikterer derfor fenotypen, som kan gjennomgå dynamiske endringer som følge av autokrine, parakrine og endokrine faktorer. Blodbårne mediatorer; temperatur; Medisinsk behandling; Og sykdomsutviklingmente. Således er en ekspresjonsanalyse fokusert på proteinnivået nyttig for å karakterisere proteomet og for å løse de kritiske forandringene som oppstår for det som en del av sykdomspatogenese 3 .

Derfor er mulighetene som proteomikkene presenterer for å klargjøre helse- og sykdomsforhold, formidabel, til tross for de eksisterende teknologiske utfordringene. De spesielt lovende forskningsområdene som proteomics kan bidra med inkluderer: identifisering av endret proteinuttrykk på noe nivå ( dvs. hele celler eller vev, subcellulære rom og biologiske væsker); Identifisering, verifisering og validering av nye biomarkører som er nyttige for diagnose og prognose av sykdom; Og forhåpentligvis identifisering av nye proteinmål som kan brukes til terapeutiske formål, samt for vurdering av narkotikapåvirkning og toksisitet 4 .

Fange kompleksiteten tilProteomet representerer en teknologisk utfordring. De nåværende proteomiske verktøyene gir mulighet til å utføre storskala, høy gjennomstrømningsanalyse for identifisering, kvantifisering og validering av endrede proteinnivåer. I tillegg har introduksjonen av fraksjonerings- og anrikningsteknikker, som har til hensikt å unngå forstyrrelser forårsaket av de mest rikelige proteiner, også forbedret proteinidentifikasjon ved å inkludere de minste rikelige proteiner. Endelig har proteomics blitt komplementert ved analyse av posttranslasjonelle modifikasjoner, som gradvis oppstår som viktige modulatorer av proteinfunksjon.

Prøvepreparasjonen og proteinutvinningen i de biologiske prøvene under analyse forblir imidlertid begrensende trinn i den proteomiske arbeidsflyten og øker potensialet for mulige fallgruver 5 . Faktisk, i de fleste molekylærbiologi teknikker som må optimaliseres, er de første trinnene vev homogenizatIon og celle lysis, spesielt under analysen av lav-overflod proteiner for hvilke amplifikasjonsmetoder ikke eksisterer. I tillegg kan proteinets kjemiske natur påvirke egen gjenoppretting. For eksempel er analysen av svært hydrofobe proteiner svært utfordrende, fordi de lett utfeller under isoelektrisk fokusering, mens trans-membranproteiner er nesten uoppløselige (omtalt i referanse 5). Videre skaper vevsammensetningsvariabiliteten en betydelig barriere for å utvikle en universell ekstraksjonsmetode. Til slutt, fordi nesten alle de kliniske prøvene er av begrenset mengde, er det essensielt å muliggjøre proteinpreparering med maksimal utvinning og reproduserbarhet fra minimale prøvebeløp 6 .

Dette arbeidet beskriver en optimal protokoll for proteinutvinning fra den normale hjerte-mitralventilen, som representerer en svært utfordrende prøve for proteomanalyse. Den normale mitralventilen er en kompLex struktur liggende mellom venstre atrium og hjerte venstre ventrikel ( figur 1 ). Det spiller en viktig rolle i kontrollen av blodstrømmen fra atriumet til ventrikkelen, hindrer tilbakestrømning og sikrer riktig oksygentilførsel til hele kroppen, og opprettholder dermed en tilstrekkelig hjerteutgang. Imidlertid regnes det ofte for å være et "inaktivt" vev, med lav cellularitet og få komponenter, hovedsakelig i den ekstracellulære matriksen. Dette skyldes at, under normale forhold, de residente valvulære interstitialceller (VICs) presenterer en hvilende fenotype med en lav proteinbiosyntesehastighet 7 .

Det har imidlertid vist seg at i en patologisk tilstand øker antall VICs i spongiosa og deres proteinsyntese aktiveres, sammen med andre funksjonelle og fenotypiske endringer 8 . Derfor er det ikke overraskende at de minimale dataene som er tilgjengelige iLitteraturen fokuserer på analysen av patologiske mitralventiler 9 , 10 , hvor det økte antallet aktiverte VICs kan forklare det relativt høye antallet identifiserte proteiner.

Som konklusjon kan foreliggende protokoll tjene til å utvikle forståelsen av de patogene mekanismene som er ansvarlige for mitralventilssykdommer gjennom studiet av mitralventilproteinkomponenter. Faktisk kan en større forståelse for de underliggende patologiske prosessene bidra til å forbedre den kliniske styringen av ventilsykdommer, hvis nåværende indikasjoner for intervensjon i stor grad er basert på hemodynamiske hensyn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I denne protokollen samles de menneskelige hjerter under multiorgan explantation (kald iskemitid på 4-12 timer, gjennomsnittlig 6 ± 2 timer) fra multi-organdonorer ekskludert fra organtransplantasjon av tekniske eller funksjonelle grunner, til tross for normale ekkokardiografiske parametere. De sendes til kardiovaskulær vævsbank i Milano, Monzino kardiologisk senter (Milano, Italia) for banken av aorta og lungeventiler. Mitral posterior brosjyrer brukes ikke til kliniske formål, så de samles inn under aorta- og lungeventilisolasjon etter informert samtykke er hentet fra giverens slektninger. Vevet til transplantasjon og forskning samles kun etter foreldres samtykke; På samtykkearket godkjenner de (eller ikke) bruk av kardialt vev for forskning bare hvis det ikke er egnet for human klinisk bruk ( dvs. mikrobiologiske, funksjonelle og serologiske problemer), i henhold til retningslinjene fra etikkutvalget forMonzino kardiologisk senter.

1. Mitralventilpreparasjon

  1. Høst den menneskelige mitralventilen så snart som mulig etter organteksplantering (kald iskemitid på 4-12 timer).
  2. I et rent rom, fjern hjertet fra transportposen som inneholder en kald (4 ° C) løsning ( dvs. saltvannsløsning eller balansert medium Eurocollins eller Wisconsin). Sett det i en bøtte og plasser den i et biosikkerhetsskap (biohazard vertikal luftstrøm, klasse A, god produksjonspraksis (GMP) klassifisering) for å fortsette med ventilpreparatet.
  3. Plasser hjertet på en steril engangsslange i skapet. Ved hjelp av en steril disponibel skalpell, kutt hjertet helt, vinkelrett på hovedaksen, på nivået til venstre og høyre ventrikler, ca 4 cm unna toppunktet.
  4. Flytt den stigende aorta og lungearterien for å vise det venstre atrielle taket.
  5. Med sterile autoklaverbare pincett og plukker, kutt rundt venstre auricle påVenstre atrieltak, noe som gjør mitralventilen synlig og muliggjør identifisering av det store mitralbladet (anterior) og det lille mitralbladet (bakre).
    MERK: Antero-lateral og de bakre mediale kommisjonene definerer grensen til den fremre bøylen og det bakre området.
  6. Ved hjelp av sterile autoklaverbare saks og ikke-traumatiske tinger, disser venstre atrium og ventrikelveggtykkelse rundt omkretsen av hele mitralventilen .
  7. Identifiser mitro-aorta ventil kontinuitet.
    MERK: Venstre ventrikkel inneholder hele mitralventilen og akkordene.
  8. Separat den fremre mitralventilsprosedralen fra den bakre mitralventilbrikken, kutte den bakre brosjyren langs innsatsen med ventrikkelen (kommissur).
  9. Vask den bakre bøylen i saltoppløsningen. Klipp brosjyren i små stykker (<1 cm 2 ) og pakk dem individuelt i aluminiumsfolie. Snapfrys dem med flytende nitrogen.
    Forsiktig: Følg organisatoriske sikkerhetsprosedyrer ved bruk av flytende nitrogen.
    1. Rengjør bordet på skapet med en 70% isopropylalkoholoppløsning og en 6% hydrogenperoksidløsning ved slutten av prosedyren.

2. Proteinekstraksjon

  1. Bruk tanger for å plukke opp prøven som er lagret i flytende nitrogen, og legg det umiddelbart på tøris, mens det fortsatt er innpakket i aluminiumsfolien. Ikke la prøven tine under overføringer.
  2. Før sliping, køl porselen / zirkoniummørtelen og pestlene i et grindersystem ( f.eks. CryoGrinder) sammen med prøven ved å sette dem i en Dewar-kolbe som inneholder flytende nitrogen (~ 500 ml).
    Forsiktig: Følg organisatoriske sikkerhetsprosedyrer ved bruk av flytende nitrogen.
  3. Sett mørtel og pestles i en polystyrenboks som inneholder tøris. Fjern prøven fra aluminiumsfolien og sett den inn i mørtel.
  4. Grind tHan prøver med den store stammen mot mørtelen 15-20 ganger, ved hjelp av skrutrekker for å rotere stammen. Bland prøven med spissen av en forkjølt spatel under slipingsprosessen.
    1. Gjenta med den lille stammen.
  5. Overfør grunnprøven til et tidligere veid rør ( f.eks. 15 ml sentrifugerør) ved å invertere røret, plasser det over mørtelen og vend dem sammen for å flytte prøven til røret. Bruk en forkjølt spatel for å gjenvinne alt materiale fra mørtel.
    1. Hold røret med prøven på tøris, for å unngå prøveopptining under overføringen.
  6. Beregn nettovikten av prøven.
  7. Rengjør mørtel og pestles etter hver prøve og dekontaminere dem ved autoklavering eller oppvarming dem ved 200 ° C i 2 timer.
  8. Overfør den pulveriserte prøven fra sentrifugerøret til glassrøret av en homogenisator ved inversjon.
  9. Tilsett filtrert ureabuffetR (8 M urea, 2 M tiourea, 4% w / v CHAPS, 20 mM Tris og 55 mM dithiotreitol) til glassrøret, 200 μl ureabuffer for hver 10 mg pulverisert vev.
    MERK: Resterende pulverisert prøve som er igjen i sentrifugerøret, kan gjenvinnes ved bruk av en del av det beregnede volumet av ureabuffer.
  10. Homogeniser prøven ved hjelp av en omrører utstyrt med en borosilikatglassmørtel og en polytetrafluoretylen (PTFE) -pestel. Trykk langsomt pestlen på prøven med en vridningsbevegelse (1500 rpm) 10 ganger.
  11. Gjenoppløs supernatanten og overfør den til et rent 1,7 ml sentrifugerør. Ta igjen gjenværende prøve med fersk ureabuffer, og tilsett halvparten av volumet som ble brukt under den første ekstraksjonen.
  12. Gjenta trinn 2.10.
  13. Gjenopprett supernatanten og kombinere den med supernatanten fra trinn 2.11. Plasser den kombinerte supernatanten på en rørrotator i 30 minutter.
  14. Sentrifuger røret i 30 minutter ved 13.000 xg og 4 ° C.
  15. Gjenopprett supernatanten anD måle proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Bradford-proteinanalysen, i henhold til produsentens instruksjoner. Oppbevar prøven ved -80 ° C til bruk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ekstraksjonen og oppløsningen av proteiner i ureabufferen er direkte kompatibel med proteomiske metoder basert på isoelektrofokusering (todimensjonal elektroforese (2-DE) 11 og væskefase-isoelektrisk fokusering (IEF) 12 ) og med immunoblotting etter fortynning i Laemmli buffer 13 Inneholdende en proteaseinhibitor cocktail 14 .

For gelfri massespektrometri-baserte metoder ( dvs. væskekromatografi koblet til data-uavhengig massespektrometrianalyse (LC / MS E ) og todimensjonal LC / MS E (2D-LC / MSE)) 15 ble prøvene ekstrahert I den beskrevne ureabufferen må ytterligere behandles for å eliminere urea og tiourea, som kan forstyrre etterfølgende proteinfordøyning og væskekromatografiseparasjon. ThiS avsaltingstrinn kan oppnås ved anvendelse av de kommersielle proteinutfellingssettene, etter produsentens instruksjoner for å utfelle proteinene. Prøven kan deretter oppløses i 25 mM NH4HCO3 inneholdende 0,1% spaltbare vaskemidler for proteinfordøyning 16 . Utfelling av proteiner kan eliminere bufferkomponenter, noe som minimal påvirker proteininnholdet (proteinutvinning:> 85%), slik at prøven er egnet for alle typer analyser.

Anvendelsen av denne protokollen for proteinutvinning fra humane mitralventiler tillatt for identifisering av totalt 422 proteiner, kombinering av fire forskjellige proteomiske tilnærminger som tidligere er beskrevet i detalj 11 , 15 . Spesifikt ble 169 proteiner identifisert ved 2-DE, 330 proteiner ved flytende fase IEF, 96 proteiner av LC / MS E og 148 proteinerVed 2D-LC / MS E (tabell 1).

For å klassifisere 422 identifiserte proteiner med hensyn til subcellulær lokalisering, ble en programvare brukt til gen ontologi (GO) analyse ( f.eks. Cytoscape). Nettverket som ble opprettet med programvaren og tilhørende plugin, viste at, i tillegg til de forventede proteinene lokalisert i den ekstracellulære regionen (se øvre høyre del av figur 2 ), var de fleste proteiner identifisert ved de proteomiske tilnærmingene fra den intracellulære regionen ( Dvs. cytoplasma, organeller, vesikler og cytoskelet). Cell-overflateproteiner ble også identifisert ( figur 2 ).

Resultatene ble ytterligere bekreftet i tre uavhengige mitralventilprøver. Immunoblotting ble brukt til å analysere en gruppe av fire proteiner ( dvs. septin-11, fire og en halv LIM-domener protein 1 (FHL-1), derMatopontin og alfa-krystallin B (CryAB)) som aldri har blitt identifisert i den normale mitralventilen ( figur 3 ).

Figur 1
Figur 1: Mitralventilstruktur. Øvre utsikt over det menneskelige hjerte som viser den lukkede ( A ) eller åpne ( B ) menneskelige mitralventilen. Forsiden av venstre hjertekammer av et menneskelig hjerte ( C ). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Analyse av de identifiserte mitralventilproteiner i løpet av celledistribusjon. Cytoscape og plugin BiNGO ble brukt til å obtaiN fordelingen av gen ontologi (GO) termer fra cellekomponentkategorier. Sirkelstørrelsen er proporsjonal med antall proteinkomponenter assosiert med de valgte GO-vilkårene, og farveskalaen for p-verdien av overrepresentasjon er rapportert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Immunoblottingsanalyse av septin-11, FHL-1, dermatopontin og CryAB i hel ekstrakt fra tre humane normale mitralventilbladene. Immunoblotting ble utført ved bruk av musmonoklonalt antistoff mot CryAB og kaninpolyklonale antistoffer mot septin-11, FHL-1 og dermatopontin-antistoffene. Vær så snillKlikk her for å se en større versjon av denne figuren.

<td> x <td> <Td> Proteasome subunit beta type 4 forløper <td> </ Tr> <Td> Transgelin 2 <td> <tr> <td>
tiltredelse Beskrivelse 2-DE 2D-LC LC-MS E Flytende fase IEF
A6NMZ7 Kollagen alfa VI x
O00151 PDZ- og LIM-domeneprotein 1 x
O00299 Klorid intracellulært kanalprotein 1 x
O00764 Pyridoksal kinase x
O14558 Varm sjokkprotein beta 6 x
O43399 Tumorprotein D54 x
O43488 Aflatoksin B1-aldehydreduktaseelement 2 x
O43707 Alpha actinin 4 x x
O43866 CD5 antigen som forløper x
O60493 Sortering av nexin 3 x
O60701 UDP glukose 6 dehydrogenase x
O75223 Ukarakterisert protein x
O75368 SH3 domenebindende glutaminsyre rik på protein x
O75390 Citrat syntase mitokondriell forløper x
O75489 NADH dehydrogenase ubiquinon jern svovelprotein 3 mitokondriell forløper x x
O75608 Acylproteintioesterase 1 x
O75828 Karbonylreduktase NADPH 3 x
O75874 Isocitrat dehydrogenase NADP cytoplasmatisk x
O75955 Flotillin x
O94760 NG NG dimetylarginindimetylaminohydrolase 1 x
O94788 Retinal dehydrogenase 2 x
O95865 NG NG dimetylarginindimetylaminohydrolase 2 x x
P00325 Alkohol dehydrogenase 1B x x
P00338 L-laktatdehydrogenase A-kjede x
P00352 Retinal dehydrogenase 1 x
P00441 Superoksyd dismutase Cu Zn x x
P00450 Ceruloplasmin forløper x x
P00488 Koagulasjonsfaktor XIII En kjedeforløper x
P00491 Purinukleosidfosforylase x
P00492 Hypoksantin-guaninfosforibosyltransferase x
P00558 Fosfoglyceratkinase 1 x x
P00568 Adenylatkinaseisoenzym 1 x
P00734 protrombin x x
P00738 haptoglobin x x x x
P00739 Haptoglobin-relatert proteinforløper x
P00751 Komplementfaktor B x x x
P00915 Karbonanhydrase 1 x
P00918 Karbonanhydrase 2 x
P01008 Antitrombin III forløper x x x
P01009 Alfa 1 antitrypsin x x x x
P01011 Alfa 1 antichymotrypsin x x x x
P01019 Angiotensinogen forløper x x
P01023 Alfa 2 makroglobulin x x
P01024 Komplement C3 x x x x
P01033 Metalloproteinase inhibitor 1 forløper x
P01042 Kininogen 1 forløper x
P01593 Ig kappa kjede VI region AG x
P01598 Ig kappa kjede VI region EU x
P01600 Ig kappa kjede VI region Hau x x
P01611 Ig kappa kjede VI region Wes x
P01620 Ig kappa kjede V III region SIE x
P01625 Ig kappa kjede V IV region Len x
P01766 Ig tungkjede V III region BRO x x
P01781 Ig tungkjede V III region GAL x
P01834 Ig kappa kjede C-regionen x x x x
P01842 Ig lambda-kjede C-regioner x x x
P01857 Ig gamma 1-kjede C-regionen x x x x
P01859 Ig-gamma 2-kjede C-regionen x x x x
P01860 Ig gamma 3-kjede C-regionen x x x
P01861 Ig gamma 4-kjede C-regionen x x x
P01871 Ig mu-kjede C-regionen x x x
P01876 Ig alfa 1-kjede C-regionen x x x x
P01877 Ig alfa 2-kjede C-regionen x
P02144 myoglobin x x
P02452 Kollagen alfa 1 I kjede x x x x
P02511 Alfa-krystallinske B-kjede x
P02545 Laminat AC 70 kDa laminat x x x x
P02647 Apolipoprotein Al x x x x
P02649 Apolipoprotein E x x x x
P02671 Fibrinogen alfa kjede x x x x
P02675 Fibrinogen beta-kjede x x x x
P02679 Fibrinogen gamma kjede x x x x
P02689 Myelin P2 protein x
P02735 Serumamyloid En proteinforløper x
P02741 C-reaktiv proteinforløper x
P02743 Serum amyloid P-komponent x x x x
P02746 Komplement C1q underkomponent subunit B x x
P02747 Komplement C1q subkomponent subenhet C forløper x
P02748 Komplementkomponent C9 x x x
P02749 Beta 2 glykoprotein 1 x x x x
P02750 Leucinrik alfa 2 glykoproteinprecursor x
P02751 fibronektin x x
P02760 AMBP protein forløper x x x x
P02763 Alfa 1 syre glykoprotein 1 x x x
P02765 Alpha 2 HS glykoproteinforløper x
P02766 Transthyretin forløper x x x
P02768 Serumalbumin x x x x
P02774 Vitamin D bindende protein forløper x
P02787 Serotransferrin x x x x
P02788 Laktotransferrinforløper x
P02790 Hemopexin x x x x
P02792 Ferritin lettkjede x
P04004 vitronektin x x x x
P04075 Fructose bisfosfat aldolase A x
P04083 Annexin A1 x x x x
P04179 Superoksyd dismutase Mn mitokondriell forløper x
P04196 Histidinrik glykoproteinprecursor x
P04217 Alfa 1B glykoproteinforløper x x
P04350 Tubulin beta 4 kjede x
P04406 Glyceraldehyd 3 fosfat dehydrogenase x x x x
P04792 Heat shock protein beta 1 x x x x
P05091 Aldehyd dehydrogenase mitokondriale forløper x x
Plasma protease C1 inhibitor forløper x
P05156 Komplementfaktor I forløper x
P05413 Fettsyrebindende proteinhjerte x
P05452 Tetranektin forløper TN x x
P05787 Keratin type II cytoskeletal 8 x
P06396 gelsolin x x x x
P06576 ATP syntase subunit beta mitokondriell forløper x x
P06732 Kreatin kinase M type x x
P06733 Alpha enolase x x x x
P06753 Tropomyosin alfa 3 kjede x x
P07108 Acyl CoA bindende protein x
P07195 L laktat dehydrogenase B kjede x x x
P07196 Neurofilament lyspolypeptid x
P07197 Neurofilament medium polypeptid x x
P07237 Proteindisulfid-isomeraseforløper x x
P07339 Cathepsin D forløper x x
P07355 Vedlegg A2 x x x x
P07360 Komplementkomponent C8 gamma kjedeforløper x
P07437 Tubulin beta-kjede x x x x
P07585 decorin x x x x
P07737 Profilin 1 x
P07858 Cathepsin B forløper x
P07900 Varmestøtprotein HSP 90 alpha x x
P07951 Tropomyosin beta-kjede x
P07954 Fumarathydratase mitokondriell forløper x
P07996 Trombospondin 1 x x x
P08107 Varm sjokk 70 kDa protein 1A 1B x x x x
P08123 Kollagen alfa 2 I kjede x x x x
P08133 Vedlegg A6 x x
P08238 Varmestøtprotein HSP 90 beta x x
P08253 72 kDa type IV kollagenase forløper x
P08294 Ekstracellulær superoksiddismutase Cu Zn precursor x x x
P08590 Myosin-lyspolypeptid 3 x x
P08603 Komplementfaktor H x x x x
P08670 vimentin x x x x
P08729 Keratin type II cytoskeletal 7 x
P08758 Annexin A5 x x x x
P09211 Glutathion S transferase P x x x
P09382 Galectin 1 x x x
P09417 Dihydropteridinreduktase x
P09493 Tropomyosin 1 alfa kjede x x
P09525 Annexin A4 x x
P09651 Heterogen nukleær ribonukleoprotein Al x
P09871 Komplement C1s subkomponent forløper x
P09936 Ubiquitin karboksylterminal hydrolase isozym L1 x
P09972 Fructose bisfosfat aldolase C x
P0C0L4 Komplement C4 En forløper x
P0CG05 IgLambda 2 kjede C regioner x
P0CG38 POTE ankyrin domene familiemedlem I x
P10515 Dihydrolipoyllysinrest-acetyltransferasekomponent av pyruvat-dehydrogenaskompleks x
P10768 S-formylglutathionhydrolase x
P10809 60 kDa varmeskok protein-mitokondriell forløper x
P10909 Clusterin x x x x
P10915 Hyaluronan og proteoglykan-link protein 1 forløper x x
P11021 78 kDa gLukose regulert protein x x x
P11047 Laminin subunit gamma 1 forløper x
P11142 Varmestørrelse medregnet 71 kDa protein x x x x
P11177 Pyruvat dehydrogenase E1 komponent subunit beta mitokondriale forløper x
P11217 Glykogen fosforylase muskelform x
P11310 Mellomkjede spesifikk acyl CoA dehydrogenase mitokondriell forløper x
P11413 Glukose 6 fosfat 1 dehydrogenase x
P11766 Alkohol dehydrogenase klasse 3 chi kjede x
P12036 Neurofilament tungt polypeptid x
P12109 Kollagen alfa 1 VI kjede x x x x
P12110 Kollagen alfa 2 VI kjede x x x x
P12111 Kollagen alfa 3 VI kjede x x x
P12277 Kreatin-kinase B-type x
P12429 Annexin A3 x x
P12814 Alpha actinin 1 x x
P12829 Myosin-lyspolypeptid 4 x
P12882 Myosin 1 x
P12883 Myosin 7 x x
P12955 Xaa Pro dipeptidase x
P13489 Ribonuklease inhibitor x
P13533 Myosin 6 x x
P13611 Versican kjerneproteinforløper x x
P13639 Forlengelsesfaktor 2 x
P13716 Delta-aminolevulinsyre dehydratase x
P13796 Plastin 2 x
P13804 Electron transfer flavoprotein subunit alfa mitokondriale forløper x
P13929 Beta-enolase x x
P14136 Glialfibrillær sur protein astrocyt x
P14314 Glukosidase 2 subunit beta forløper x
P14550 Alkohol dehydrogenase NADP x
P14618 Pyruvat kinase isozymer M1 M2 x x x
P14625 </ Td> Endoplasmin forløper x x
P15121 Aldose reduktase x
P15259 Fosfoglyceratmutase 2 x
P16152 Karbonylreduktase NADPH 1 x
P17066 Varmestokk 70 kDa protein 6 x x x
P17174 Aspartat aminotransferase cytoplasmatisk x
P17540 Kreatinkinasensarcomerisk mitokondriell forløper x
P17661 desmin x x x x
P17980 26S protease regulatorisk underenhet 6A x
P17987 T kompleks protein 1 underenhet alfa x
P18206 vinculin x x
P18428 Lipopolysakkaridbindende proteinforløper x
P18669 Fosfoglyceratmutase 1 x
P19105 Myosin regulatorisk lettkjede 2 x x
P19623 Spermidin syntase x
P19652 Alfa 1 syre glykoprotein 2 forløper x x
P19823 Inter alfa trypsininhibitor tungkjede H2 x
P19827 Inter alfa trypsininhibitor tungkjede H1 x x
P20073 Vedlegg A7 x
P20618 Proteasome subunit beta type 1 forløper x
P20774 Mimecan x x x x
P21266 Glutathion S transferase Mu 3 x
P21333 Filamin A x x
P21796 Spenningsavhengig anion selektivt kanalprotein1 x
P21810 Biglycan x x x x
P21980 Protein glutamin gamma glutamyltransferase 2 x x
P22105 Tenascin X x x
P22314 Ubiquitin-aktiverende enzym E1 x
P22352 Glutationperoxidase 3 forløper x x
P22626 Heterogene nukleare ribonukleoproteiner A2 B1 x
P22695 Ubiquinol cytokrom c reduktase kompleks kjerneprotein 2 mitokondriell forløper x
P23141 Leverkarboxylesterase 1 forløper x
P23142 Fibulin 1 x x x x
P23284 Peptidyl prolyl cis trans isomerase B forløper x
P23381 Cytoplasmatisk tryptofanyl-tRNA-syntetase x
P23526 Adenosylhomocysteinase x x
P23528 Cofilin 1 x
P24752 Acetyl CoA acetyltransferase mitokondriell forløper x
P25311 Sink alfa 2 glykoproteiN forløper x
P25705 ATP syntase subunit alfa mitokondriel x
P25788 Proteasom subunit alfa type 3 x x
P25789 Proteasom subunit alfa type 4 x
P26447 Protein S100 A4 x
P27348 14 3 3 protein theta x x
P27797 Calreticulin forløper x
P28066 Proteasome subunit alfa type 5 x
P28070 x x
P28072 Proteasome subunit beta type 6 forløper x
P28074 Proteasome subunit beta type 5 forløper x
P28331 NADH ubiquinon-oksidoreduktase 75 kDa subunit mitokondriell forløper x
P28838 Cytosol aminopeptidase x
P29218 Inositolmonofosfatase x
P29401 Transketolase x
P29692 Forlengelsesfaktor 1 delta x
P29966 Myristoylert alaninrikt C-kinasubstrat x
P30040 Endoplasmatisk retikulumprotein ERp29 forløper x
P30041 Peroksiredoksin 6 x x
P30043 Flavin reduktase x
P30044 Peroksiredoksin 5 mitokondriell forløper x
P30085 UMP CMP kinase x
P30086 Fosfatidyletanolaminbindende protein 1 x
P30101 ProteinkonN-disulfid-isomerase A3-forløper x x x
P30613 Pyruvat kinase isozymer RL x
P30740 Leukocyt elastase inhibitor x
P31025 Lipokalin 1 forløper x
P31937 3 hydroksyisobutyrat dehydrogenase mitokondriale forløper x
P31942 Heterogent nukleært ribonukleoprotein H3 x
P31943 Heterogent nukleært ribonukleoprotein H x
P31946 14 3 3 protein beta alfa x x
P31948 Stress indusert fosfoprotein 1 x
P31949 Protein S100 A11 x
P32119 Peroksiredoksin 2 x x
P34931 Varm sjokk 70 kDa protein 1 som x x
P34932 Varmestøt 70 kDa protein 4 x
P35232 Prohibitin x
P35237 Serpin B6 x
P35443 Trombospondin 4 x
P35555 Fibrillin 1 x x
P35579 Myosin 9 x x x
P35580 Myosin 10 x x
P35609 Alpha actinin 2 x
P35625 Metalloproteinaseinhibitor 3 x x
P35998 26S protease regulatorisk underenhet 7 x
P36871 Fosfoglukomutase 1 x x
P36955 Pigmentepitelutledd faktor x x
P37802 x x
P37837 Transaldolase x
P38117 Electron transfer flavoprotein subunit beta x
P38646 Stress 70 protein mitokondriell forløper x x
P39687 Syre-leucinrikt nukleært fosfoprotein 32-familiemedlem A x
P40121 Makrophage capping protein x
P40925 Malat dehydrogenase cytoplasmatisk x
P40926 Malat dehydrogenase mitokondriell forløper x
P41219 peripherin x
P42330 Aldo keto reduktase familie 1 medlem C3 x
P45880 Spenningsavhengig anion selektivt kanalprotein 2 x
P47755 F actin capping protein subunit alfa 2 x x
P47756 F actin capping protein subunit beta x x
P47985 Ubiquinol cytokrom c reduktase jern svovel subunit mitokondriale forløper x
P48047 ATP syntase O subunit mitokondriell forløper x
P48637 Glutation syntetase x
P48741 Varmestøt 70 kDa protein 7 x x
P49189 4 trimetylaminobutyraldehyddehydrogenase x
P49368 T kompleks protein 1 subenhet gamma x
P49747 Brusk oligomert matriksprotein x x x x
P49748 Meget langkjedet spesifikk acyl CoA dehydrogenase mitokondriell forløper x
P50395 Rab BNP dissosjonsinhibitor beta x x </ Td>
P50454 Serpin H1 forløper x
P50995 Annexin A11 x
P51452 Dual spesifisitet protein fosfatase 3 x
P51884 Lumican x x x x
P51888 Prolargin forløper x x x x
P52565 Rho GDP dissosjonsinhibitor 1 x
P52566 Rho GDP dissociation inhibitor 2 x
P54652 Varmestokkrelatert 70 kDa protein 2 x x x x
P55072 Overgangsendoplasmatisk retikulum ATPase x
P55083 Mikrofibril assosiert glykoprotein 4 forløper x x
P57053 Histon H2B type F x
P60174 Triosephosphat isomerase x x x
P60660 Myosin-lyspolypeptid 6 x x
P60709 Actin cytoplasmisk 1 x x x x
P60981 Destrin x
P61086 Ubiquitin-konjugerende enzym E2 25 kDa x
P61088 Ubiquitin-konjugerende enzym E2 x
P61224 Rasrelatert protein Rap 1b forløper x
P61978 Heterogent nukleært ribonukleoprotein K x x
P61981 14 3 3 protein gamma x x x
P62258 14 3 3 protein epsilon 14 3 3E x
P62491 Rasrelatert protein x
P62714 Serin-treoninproteinfosfatase 2A katalytisk underenhet beta-isoform x
P62736 Actin aorta glatt muskel x x x
P62805 Histon H4 x
P62826 GTP-bindende nukleær protein Ran x
P62873 Guanin-nukleotidbindende protein GIGSGT-underenhet beta 1 x
P62879 Guanin-nukleotidbindende protein GIGSGT-underenhet beta 2 x
P62937 Peptidyl prolyl cis trans isomerase A x x
P62987 Ubiquitin 60S ribosomalt protein L40 x
P63104 14 3 3 proTein zeta delta x x x x
P63241 Eukaryotisk oversettelse initieringsfaktor 5A 1 x
P63244 Guanin-nukleotidbindende proteinunderenhet beta 2 som 1 x
P63267 Actin gamma enterisk glatt muskel x x
P67936 Tropomyosin alfa 4 kjede x
P68032 Actin alfa-hjerte muskel 1 x
P68104 Forlengelsesfaktor 1 alfa 1 x x x
P68133 Actin alfa skjelettmuskulatur
P68363 Tubulin alfa 1B kjede x x x
P68371 Tubulin beta 2C kjede x x x
P68402 Blodplateaktiveringsfaktor acetylhydrolase IB subunit beta x
P68871 Hemoglobin subunit beta x x x
P69905 Hemoglobin subunit alfa x x
P78371 T-kompleks protein 1-underenhet beta x
P78417 Glutathion transferase omega 1 x x
P80748 Ig lambda kjede VIII-regionen LOI x
P98095 Fibulin 2 x x
Q01082 Spektrin beta kjedehjerne 1 x
Q01449 Myosin regulatorisk lettkjede 2 atriell isoform x
Q01518 Adenyllylsyklaseassosiert protein 1 x
Q01995 Transgelin Glatt muskelprotein 22 alpha x
Q03252 Lamin B2 x x
Q03591 Komplementfaktor H-relatert protein 1 forløper x
Q04917 14 3 3 protein eta x x
Q06323 Proteasomaktivator kompleks underenhet 1 x
Q06828 Fibromodulin x x x x
Q06830 Peroksiredoksin 1 x x
Q07507 Dermatopontin x x x x
Q07960 Rho GTPase-aktiverende protein 1 x
Q08257 Quinon oksidoreduktase x
Q08431 Lactadherin x x
Q12765 SEcernin 1 x
Q13011 Delta 3 5 Delta 2 4 dienoyl CoA isomerase mitokondriell forløper x x
Q13228 Selenbindende protein 1 x x
Q13404 Ubiquitin-konjugerende enzym E2-variant 1 x
Q13409 Cytoplasmisk dynein 1 mellomproduktkjede 2 x
Q13509 Tubulin beta 3 kjede x x x
Q13642 Fire og en halv LIM-domener protein 1 x
Q13765 Nascent polypeptidassosiert kompleks underenhet alfa x
Q13885 N Tubulin beta 2A kjede x x
Q14194 Dihydropyrimidinase-relatert protein 1 x
Q14195 Dihydropyrimidinase-relatert protein 3 x x x x
Q14624 Inter alpha trypsininhibitor tungkjede H4 forløper x
Q14697 Nøytral alfa glukosidase AB forløper x
Q14764 Stort hvaleprotein x
Q14767 Latent transformerende vekstfaktor beta bindende protein 2 x x
Q14894 Mu-krystallinsk homolog-NADP-regulert skjoldbruskhormonbindende protein x
Q15063 Periostin forløper x x x x
Q15084 Proteindisulfid-isomerase A6-forløper x
Q15113 Prokollagen C endopeptidaseforsterker 1 forløper x
Q15181 Uorganisk pyrofosfatase x
Q15365 Poly rC bindingsprotein 1 x
Q15366 PolyrC-bindingsprotein 2 x
Q15582 Transformere vekstfaktor beta-indusert protein x x x
Q15819 Ubiquitin-konjugerende enzym E2-variant 2 x
Q16352 Alpha internexin x
Q16473 Putative tenascin XA x
Q16555 Dihydropyrimidinase-relatert protein 2 x x x
Q16698 2 4 dienoyl CoA reduktase mitokondriell forløper x
Q16891 Mitokondriell indre membran x
Q562R1 Beta aktin som protein 2 x
Q6S8J3 POTE ankyrin domene familiemedlem E x
Q6UWY5 Olfactomedin som protein 1 forløper x x
Q71U36 Tubulin alfa 1A kjede x x x
Q7Z7G0 Mål for Nesh SH3 forløper x x x
Q8WUM4 Programmert celledød 6 samspillende protein x
Q8WWX9 Thioredoksin som selenoprotein M forløper x
Q92597 Protein NDRG1 x
Q92945 Lang oppstrøms elementbindende protein 2 x
Q96CN7 Isokorismatase-domene som inneholder protein 1 x
Q96CX2 BTB POZ-domene som inneholder protein x
Q96KK5 Histon H2A type 1 H x x
Q96KP4 Cytosolisk ikke-spesifikk dipeptidase x
Q99426 Tubulin-spesifikk chaperon B x
Q99497 Protein DJ 1 x x
Q99536 Synaptisk vesikkel membranprotein x x x
Q99714 3 hydroksyacyl CoA dehydrogenase type 2 x
Q99715 Kollagen alfa 1 XII kjede x x
Q99798 Akoniter hydratase mitokondriell forløper x
Q9BQE3 Tubulin alfa 6 kjede x
Q9BUF5 Tubulin beta 6 kjede x x
Q9BUT1 3 hydroksybutyrat dehydrogenase type 2 x
Q9BVA1 Tubulin beta 2B kjede x x x
Q9BXN1 Asporin x x </ Td> x x
Q9H0W9 Esterhydrolase C11orf54 x
Q9H4B7 Tubulin beta 1 kjede x
Q9NRN5 Olfactomedin som protein 3 forløper x x
Q9NRV9 Heme bindende protein 1 x
Q9NSB2 Keratin type II kutikulær Hb4 x x
Q9NVA2 Septin 11 x
Q9UBR2 Cathepsin Z forløper x
Q9UBX5 Fibulin 5 x x
Q9UK22 F boks kun protein 2 x
Q9Y277 Spenningsavhengig anion-selektivt kanalprotein 3 x
Q9Y281 Cofilin 2 x
Q9Y490 Talin 1 x
Q9Y696 Klorid intracellulært kanalprotein 4 x
Q9Y6C2 EMILIN 1 x x

Tabell 1: Liste over proteiner identifisert i mitralventilvekstraktet når fire forskjellige proteomiske tilnærminger ble anvendt: todimensjonal elektroforese (2-DE), todimensjonal LC-MS E (2D-LC / MSE), LC / MS E og væskefase-IEF. Metoden hvor hvert protein ble identifisert, er rapportert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Et kritisk trinn i denne protokollen er bruken av flytende nitrogen for å fryse prøven og å kjøle grindersystemet. Bruken av flytende nitrogen forhindrer biologisk nedbrytning og muliggjør effektiv pulverisering, men det krever spesiell trening for sikker håndtering.

I denne protokollen finnes et grindersystem for prøvesliping, fordi små prøver er vanskelige å gjenopprette fra standard mørtel og pestler. I dette tilfellet spredes små prøver som et fint pulver over mørteloverflaten, noe som gjør innsamling vanskelig. En annen fordel er at kvernen er motorisert, noe som gjør at flere prøver kan bearbeides på en reproduserbar måte og uten ekstra tretthet. En begrensning på bruken av en kvern er at størrelsen på prøven som må være liten (100 mg eller mindre) for at pestelen skal presses effektivt mot mørtel. Videre må kvernkomponentene varmes opp til romtemperatur mellom bruk for rengjøring g. Følgelig er prosedyren tidskrevende, og hvis mange prøver behandles daglig, er det mange sett nødvendig.

Et ytterligere kritisk trinn er fremstillingen av ekstraksjonsbufferen. Saltkonsentrasjonene, spesielt for urea (8 M) og tiourea (2 M), er ganske høye; Dermed er volumet av salt nesten halvparten av totalvolumet av løsningen. Videre er oppløsningen ikke lett, med tanke på at varme må unngås fordi urea ved mer enn 37 ° C kan føre til proteinkarbamylering ved N-terminaler av proteiner / peptider og ved sidekjede aminogruppene av lysin- og argininrester 17 . Når oppløsningen er oppløst, må ureabufferen filtreres med 0,22 μm filtre og kan lagres ved -80 ° C i 4 uker uten å påvirke utvinningsvirkningen, men den må varmes til over 15 ° C før bruk for å muliggjøre fullstendig oppløsning .

Modifikasjoner og feilsøking

I denne protokollen utføres proteinutvinning ved å bruke den beskrevne ureabufferen fordi den er en av de mest brukte proteinutvinningsløsninger for proteomiske studier på grunn av dets kompatibilitet med isoelektrofokusering og dens effektivitet ved oppløsningen av svakt oppløselige proteiner 18. Det har vært Viste at denne bufferen effektivt kan solubilisere sparsomt oppløselige proteiner, så som integrerte membranproteiner 19 eller proteiner som er svært utsatt for aggregering, slik som tubulin 18. Videre er denne bufferen fullt kompatibel med Bradford-analysen for å bestemme proteinkonsentrasjonen, og Den kan brukes direkte i 2-DE og væskefase-IEF-analyser.

Imidlertid er denne bufferen ikke ideell for oppløsningen av alle proteiner som er tilstede i en prøve. Det er mulig at forskjellige ekstraksjonsbuffere kunne avsløre proteiner som ikke kan oppdages ved denne protokollen. For eksempel er det godt knoIdet ribosomale og nukleare proteiner kan ekstraheres ekstrakt med syreekstraksjon eller trikloreddiksyre / acetonutfelling 20 , mens alkaliske pH-nivåer er mer egnet for membranproteiner 21 , 22 . Derfor kan bruken av alternative buffere kreve ytterligere trinn for proteinutfelling for å eliminere salter som forstyrrer 2-DE eller væskefase-IEF.

Begrensninger av teknikken

Antallet proteiner identifisert ved denne protokollen er relativt lavt, men antall identifikasjoner og dekning av proteomanalysen kan ytterligere økes ved bruk av nyere instrumenter, hvis massenøyaktighet og sekvenseringshastighet har økt dramatisk de siste årene 23. Det er mulig å dekke en stor del av proteomet, uten noen prefraksjoneringstrinn, ved å anvende en lang gradient for flytende chRomatografiseparasjoner kombinert med et høyoppløselig MS-instrument som har en rask sekvenseringshastighet 24 .

Betydningen av teknikken med hensyn til eksisterende / alternative metoder

Evnen til å identifisere og kvantifisere proteiner i de menneskelige hjerteventiler, som mitralventilen, er en viktig og utfordrende oppgave som vil bidra til å belyse mekanismer for fysiologiske / patologiske prosesser i ventilsykdommer. Definere endringene i mitralventilproteomet vil øke forståelsen av naturen til de biologiske prosessene som er forbundet med sykdomstilstanden til vevet.

Den nåværende kunnskapen om mitralventilens fysiopatologi er begrenset og generelt oppnådd ved analyse av individuelle proteiner involvert i spesifikke prosesser, slik som ekstracellulær matrisemodellering, hemostase, betennelse eller oksidativt stress 25 9 , 10 .

Mangelen på omfattende proteomiske studier kan tilskrives kompleksiteten til dette lavcellulært vev som er svært rik på ekstracellulære matriksproteiner ( dvs. proteoglykaner, kollagen og elastin). Disse proteinene utgjør rundt 80% av den totale mengden, og hindrer analysen av lavmengdeproteiner 26 .

Således var det nødvendig å etablere en effektiv ekstraksjonsprotokoll for å maksimere proteinoppløseliggjøring for å beskrive proteomet av dette vevet. Denne protokollen tillot for ekstraksjon av ~ 50 μg protein fra 1 mg vev. Dette er et relativt lavt utbytte i forhold til "mykt" vev, slikSom lever (~ 135 μg fra 1 mg vev), men det er tilstrekkelig å utføre en proteinanalyse på individuelle prøver. Dette er spesielt relevant når man definerer den intra-individuelle variabiliteten til et fenomen.

Videre har denne metoden fordelen av å være kompatibel med mange analytiske applikasjoner. Mitralventilproteinene oppløst i den foreslåtte ekstraksjonsbufferen kan benyttes direkte til immunblotting og proteomanalyse basert på todimensjonal elektroforese og væskefaseisoelektroforese 11 , 12 eller etter proteinutfelling for å eliminere bufferkomponentinterferens for andre analyser, slik som Gel-fri massespektrometri 15 .

Ved anvendelse av denne ekstraksjonsprotokollen er det blitt oppnådd en mer uttømmende karakterisering av proteinkomponentene i normalt mitralventilvev ved identifisering av mange intracelLulære proteiner. Disse proteinene er lokalisert i cytosolen eller i organeller, ikke bare i den ekstracellulære matriksen, og har forskjellige molekylære og biologiske funksjoner. Andre interessante proteiner ( dvs. CryAB, septin-11, FHL-1 og dermatopontin) ble også identifisert. Disse proteinene har ukjente funksjoner i mitralventilen, men deres biologiske egenskaper antyder en mulig rolle i ventilsykdommer.

Fremtidige bruksområder eller retninger etter å ha behersket denne teknikken

Med denne protokollen er det mulig å korrelere data angående proteinuttrykk med data om kvantitativt mRNA-ekspresjon og ikke-kvantitative immunhistokjemiske analyser. Faktisk, når de brukes sammen, vil disse tilnærmingene føre til en mer omfattende forståelse av molekylære mekanismer som ligger til grunn for sykdommen, fra mRNA til post-translasjonell proteinmodifisering. Dermed kan denne metoden være av interesse for forskere fokusert på hjerteventil-fysiopatologi. FinAlliert, denne protokollen kan også påføres porcine-mitralventilen, som har en nær likhet med den menneskelige ventil 27 og brukes som en eksperimentell modell for ventilfunksjonsevaluering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Det italienske helsedepartementet støttet denne studien (RC 2013-BIO 15). Vi takker Barbara Micheli for sin gode tekniske assistanse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
  3. Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
  4. Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
  5. Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
  6. Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
  7. Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
  8. Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
  9. Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
  10. Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
  11. Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
  12. Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
  13. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  14. Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
  15. Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
  16. Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
  17. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  18. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
  19. Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
  20. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
  21. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
  22. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
  23. Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
  24. Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
  25. Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
  26. Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
  27. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).

Tags

Biochemistry human normal mitralventil proteinutvinning vevshomogenisering proteinanalyse proteomikk biokjemi
Optimalisert protokoll for ekstraksjon av proteiner fra Human Mitral Valve
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi,… More

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter