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Biochemistry

Protocolo otimizado para a extração de proteínas da válvula mitral humana

doi: 10.3791/55762 Published: June 14, 2017

Summary

A composição protéica da válvula mitral humana ainda é parcialmente desconhecida, pois sua análise é complicada pela baixa celularidade e, portanto, pela baixa biossíntese de proteínas. Este trabalho fornece um protocolo para extrair eficientemente proteínas para a análise do proteoma valvar mitral.

Abstract

A análise do proteoma celular pode ajudar a elucidar os mecanismos moleculares subjacentes às doenças devido ao desenvolvimento de tecnologias que permitem a identificação e quantificação em larga escala das proteínas presentes em sistemas biológicos complexos. O conhecimento adquirido a partir de uma abordagem proteômica pode potencialmente levar a uma Melhor compreensão dos mecanismos patogênicos subjacentes às doenças, permitindo a identificação de novos marcadores diagnósticos e de doenças prognósticas e, espero, de alvos terapêuticos. No entanto, a válvula mitral cardíaca representa uma amostra muito desafiadora para análise proteômica devido à baixa celularidade em proteoglicano e matriz extracelular enriquecida com colágeno. Isso torna desafiador extrair proteínas para uma análise proteômica global. Este trabalho descreve um protocolo que é compatível com análises de proteínas subseqüentes, como proteômica quantitativa e imunotransferência. Isso pode permitir a correlação de dados relacionadosG expressão de proteína com dados sobre a expressão quantitativa de mRNA e análise imuno-histoquímica não-quantitativa. Na verdade, essas abordagens, quando realizadas em conjunto, levarão a uma compreensão mais abrangente dos mecanismos moleculares subjacentes às doenças, do mRNA à modificação da proteína pós-tradução. Assim, este método pode ser relevante para pesquisadores interessados ​​no estudo da fisiopatologia valvular cardíaca.

Introduction

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Evidências recentes alteraram a compreensão dos papéis dos muitos mecanismos regulatórios que ocorrem após a síntese de mRNA. Na verdade, processos translacionais, pós-transcrição e proteolíticos podem regular a abundância e a função da proteína. O dogma - que diz que as concentrações de mRNA são proxies para as proteínas correspondentes, assumindo que os níveis de transcrição são o principal determinante da abundância de proteína - foi parcialmente revisado. De fato, os níveis de transcrição apenas prevêem parcialmente a abundância de proteína, sugerindo que os eventos pós-transcrição Ocorrem para regular as proteínas nas células 1 , 2 .

Além disso, as proteínas determinam a função da célula e, portanto, ditar seu fenótipo, que pode sofrer mudanças dinâmicas em resposta a fatores autocrinos, paracrinos e endócrinos; Mediadores transmitidos pelo sangue; temperatura; Tratamento medicamentoso; E desenvolvimento da doençaMent. Assim, uma análise de expressão focada no nível de proteína é útil para caracterizar o proteoma e desvendar as mudanças críticas que ocorrem como parte da patogênese da doença 3 .

Portanto, as oportunidades que a proteômica apresentar para esclarecer condições de saúde e doença são formidáveis, apesar dos desafios tecnológicos existentes. As áreas de pesquisa particularmente promissoras para as quais a proteômica pode contribuir: a identificação da expressão protéica alterada em qualquer nível ( ou seja, células inteiras ou tecido, compartimentos subcelulares e fluidos biológicos); Identificação, verificação e validação de novos biomarcadores úteis para o diagnóstico e prognóstico da doença; E, esperançosamente, a identificação de novos alvos de proteínas que podem ser utilizados para fins terapêuticos, bem como para a avaliação da eficácia e toxicidade da droga 4 .

Capturar a complexidade deO proteoma representa um desafio tecnológico. As ferramentas proteômicas atuais oferecem a oportunidade de realizar análises em grande escala e de alto débito para identificação, quantificação e validação de níveis de proteína alterados. Além disso, a introdução de técnicas de fracionamento e enriquecimento, visando evitar a interferência causada pelas proteínas mais abundantes, também melhorou a identificação de proteínas, incluindo as proteínas menos abundantes. Finalmente, a proteômica foi complementada pela análise de modificações pós-tradução, que emergem progressivamente como importantes moduladores da função protéica.

No entanto, a preparação da amostra e a recuperação de proteínas nos espécimes biológicos em análise continuam a ser as etapas limitantes no fluxo de trabalho proteômico e aumentam o potencial de possíveis armadilhas 5 . Na verdade, na maioria das técnicas de biologia molecular que devem ser otimizadas, os primeiros passos são homogeneização de tecidoLise de íons e células, especialmente durante a análise de proteínas de baixa abundância para as quais os métodos de amplificação não existem. Além disso, a natureza química das proteínas pode influenciar a sua própria recuperação. Por exemplo, a análise de proteínas altamente hidrofóbicas é muito desafiadora, porque elas se precipitam facilmente durante a focagem isoelétrica, enquanto as proteínas trans-membranas são quase insolúveis (revisada na Referência 5). Além disso, a variabilidade da composição do tecido cria uma barreira significativa ao desenvolvimento de um método de extração universal. Finalmente, porque quase todos os espécimes clínicos são de quantidade limitada, é essencial ativar a preparação de proteínas com recuperação máxima e reprodutibilidade a partir de quantidades mínimas de amostras 6 .

Este trabalho descreve um protocolo otimizado para a extração de proteínas a partir da valva mitral cardíaca humana normal, o que representa uma amostra muito desafiadora para análise proteômica. A válvula mitral normal é um compEstrutura lex situada entre o átrio esquerdo e o ventrículo esquerdo do coração ( Figura 1 ). Ele desempenha um papel importante no controle do fluxo sanguíneo do átrio para o ventrículo, evitando o refluxo e garantindo o nível adequado de fornecimento de oxigênio para todo o corpo, mantendo um débito cardíaco adequado. No entanto, muitas vezes é considerado um tecido "inativo", com baixa celularidade e poucos componentes, principalmente na matriz extracelular. Isso ocorre porque, em condições normais, as células intersticiais valvulares residentes (VICs) apresentam um fenótipo quiescente com baixa taxa de biossíntese de proteína 7 .

No entanto, demonstrou-se que, em um estado patológico, o número de VICs no spongiosa aumenta e sua síntese protéica é ativada, juntamente com outras mudanças funcionais e fenotípicas 8 . Portanto, não é surpreendente que os dados mínimos disponíveis emA literatura se concentra no análise de válvulas mitrais patológicas 9 , 10 , nas quais o aumento do número de VICs ativados pode explicar o número relativamente alto de proteínas identificadas.

Em conclusão, o presente protocolo pode servir para desenvolver a compreensão dos mecanismos patogênicos responsáveis ​​pelas valvopatias mitrais através do estudo dos componentes da proteína valvar mitral. De fato, uma maior compreensão dos processos patológicos subjacentes poderia ajudar a melhorar o manejo clínico das doenças valváticas, cujas indicações atuais de intervenção são em grande parte fundamentadas em considerações hemodinâmicas.

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Protocol

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Neste protocolo, os corações humanos são coletados durante a explicação multiorgânica (tempo de isquemia de 4-12 h, média 6 ± 2 h) de doadores de múltiplos órgãos excluídos do transplante de órgãos por razões técnicas ou funcionais, apesar dos parâmetros ecocardiográficos normais. Eles são enviados ao Banco de Tecidos Cardiovasculares de Milão, Monzino Cardiologic Center (Milão, Itália) para o banco das válvulas aórtica e pulmonar. Os folhetos mitrais posteriores não são utilizados para fins clínicos, portanto são coletados durante o isolamento da válvula aórtica e pulmonar após o consentimento informado dos parentes dos doadores. O tecido para transplante e pesquisa é coletado somente após o consentimento dos pais; Na folha de consentimento, eles autorizam (ou não) o uso do tecido cardíaco somente para pesquisa se não for adequado para uso clínico humano ( ou seja, problemas microbiológicos, funcionais e serológicos), seguindo as diretrizes do comitê de ética deMonzino Cardiologic Center.

1. Preparação da válvula mitral

  1. Colhe a válvula mitral humana o mais rápido possível após a explicação do órgão (tempo de isquemia de 4-12 h).
  2. Em uma sala limpa, remova o coração do saco de transporte contendo uma solução fria (4 ° C) ( isto é, solução salina ou Eurocollins de média equilibrada ou Wisconsin). Coloque-o em um balde e coloque-o em um gabinete de biossegurança (fluxo de ar vertical de risco biológico, classe A, classificação boas práticas de fabricação (GMP)) para prosseguir com a preparação da válvula.
  3. Coloque o coração sobre uma camada estéril descartável no armário. Usando um bisturi descartable estéril, corte o coração completamente, perpendicularmente ao seu eixo principal, no nível dos ventrículos esquerdo e direito, a cerca de 4 cm do ápice.
  4. Mova a aorta ascendente e a artéria pulmonar para exibir o telhado do átrio esquerdo.
  5. Com pinças esterilizadas autoclaváveis ​​e picaretas, corte ao redor da aurícula esquerda naTelhado do atrial esquerdo, visando a válvula mitral e permitindo a identificação do grande folheto mitral (anterior) e do pequeno folheto mitral (posterior).
    NOTA: As comissuras medulares antero-laterais e posteriores definem a borda do folheto anterior e a área posterior.
  6. Usando tesoura esterilizada autoclavável e fórceps não traumáticos, dissecar o átrio esquerdo e a espessura da parede do ventrículo ao redor da circunferência de toda a valva mitral .
  7. Identificar a continuidade da válvula mitro-aórtica.
    NOTA: O ventrículo esquerdo contém toda a válvula mitral e acordes.
  8. Separe o folheto da válvula mitral anterior do folheto da válvula mitral posterior, cortando o folheto posterior ao longo da inserção com o ventrículo (comissura).
  9. Lave o folheto posterior na solução salina. Corte o folheto em pequenos pedaços (<1 cm 2 ) e envolva-os individualmente em papel alumínio. Feche-os com nitrogênio líquido.
    Cuidado: siga procedimentos de segurança organizacional ao usar nitrogênio líquido.
    1. Desinfecte a mesa do armário com uma solução de álcool isopropílico a 70% e uma solução de peróxido de hidrogênio a 6% no final do procedimento.

2. Extração de proteínas

  1. Use fórceps para retirar a amostra armazenada em nitrogênio líquido e coloque-a imediatamente em gelo seco enquanto ainda está envolvido na folha de alumínio. Não deixe a amostra descongelar durante as transferências.
  2. Antes da moagem, esfriar a argamassa de porcelana / zircónio e pilões de um sistema de moedor ( por exemplo, CryoGrinder) , juntamente com a amostra, colocando-os em um balão Dewar contendo nitrogênio líquido (~ 500 mL).
    Cuidado: siga procedimentos de segurança organizacional ao usar nitrogênio líquido.
  3. Coloque a argamassa e pilões em uma caixa de poliestireno contendo gelo seco. Remova a amostra da folha de alumínio e coloque-a na argamassa.
  4. Grind tEle provoca com o grande pilão contra a argamassa 15-20 vezes, usando a chave de fenda para girar o pilão. Misture a amostra com a ponta de uma espátula pré-congelada durante o processo de moagem.
    1. Repita com o pequeno pilão.
  5. Transfira a amostra de solo para um tubo previamente pesado ( por exemplo, tubo de centrífuga de 15 mL), invadindo o tubo, colocando-o sobre a argamassa e invadindo-os para mover a amostra para o tubo. Use uma espátula pré-refrigerada para recuperar todo o material da argamassa.
    1. Mantenha o tubo com a amostra em gelo seco para evitar a descongelação da amostra durante a transferência.
  6. Calcule o peso líquido da amostra.
  7. Limpe a argamassa e os pilões após cada amostra e descontaminar-os por autoclave ou aquecê-los a 200 ° C por 2 h.
  8. Transfira a amostra em pó do tubo de centrífuga para o tubo de vidro de um homogeneizador por inversão.
  9. Adicione buffe de ureia filtradaR (8 M de ureia, 2 M de tioureia, 4% p / v de CHAPS, 20 mM de Tris e 55 mM de ditiotreitol) no tubo de vidro, 200 μL de tampão de ureia por cada 10 mg de tecido em pó.
    NOTA: A amostra de pó residual deixada no tubo da centrífuga pode ser recuperada usando parte do volume calculado de tampão de ureia.
  10. Homogeneizar a amostra usando um agitador equipado com uma argamassa de vidro de borosilicato e um pilão de politetrafluoroetileno (PTFE). Pressione lentamente o pilão na amostra com um movimento de torção (1.500 rpm) 10 vezes.
  11. Recupere o sobrenadante e transfira-o para um tubo de centrífuga limpo de 1,7 mL. Mais uma vez extraie a amostra restante com tampão de uréia fresco, adicionando metade do volume utilizado durante a primeira extração.
  12. Repita o passo 2.10.
  13. Recupere o sobrenadante e combine-o com o sobrenadante do passo 2.11. Coloque o sobrenadante combinado em um rotator de tubo durante 30 min.
  14. Centrifugue o tubo por 30 min a 13.000 xg e 4 ° C.
  15. Recupere o sobrenadante eD mede a concentração de proteína usando o teste de proteína de Bradford, de acordo com as instruções do fabricante. Armazene a amostra a -80 ° C até o uso.

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Representative Results

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A extração e dissolução de proteínas no tampão de ureia é diretamente compatível com métodos proteômicos baseados em isolectrofocus (eletroforese bidimensional (2-DE) 11 e foco isoelétrico em fase líquida (IEF) 12 ) e com imunotransferência após diluição no tampão Laemmli 13 Contendo um coquetel inibidor de protease 14 .

Para métodos baseados em espectrometria de massa sem gel ( ou seja, cromatografia líquida acoplada a análise de espectrometria de massa independente de dados (LC / MS E ) e LC / MS E bidimensional (2D-LC / MS E )) 15 , as amostras foram extraídas No tampão de ureia descrito, é necessário continuar a tratar para eliminar a ureia e a tioureia, o que pode interferir na posterior digestão de proteínas e na separação por cromatografia líquida. ThiO passo de dessalinização de S pode ser realizado utilizando os kits comerciais de precipitação de proteínas, seguindo as instruções do fabricante para precipitar as proteínas. A amostra pode então ser dissolvida em NH4OHCO3 25 mM contendo 0,1% de detergentes cliváveis ​​para a digestão de proteínas 16 . A precipitação das proteínas pode eliminar componentes de tampão, afetando minimamente o teor de proteína (recuperação de proteína:> 85%), tornando a amostra adequada para todo tipo de análise.

A aplicação deste protocolo para a extração de proteínas a partir de válvulas mitrais humanas permitiu a identificação de um total de 422 proteínas, combinando quatro abordagens proteômicas diferentes anteriormente descritas em detalhes 11 , 15 . Especificamente, 169 proteínas foram identificadas por 2-DE, 330 proteínas por fase líquida IEF, 96 proteínas por LC / MS E e 148 proteínasPor 2D-LC / MS E (Tabela 1).

Para classificar as 422 proteínas identificadas em termos de localização subcelular, foi utilizado um software para a análise de ontologia de genes (GO) ( por exemplo, Cytoscape). A rede criada com o software e seu plug-in correspondente mostrou que, além das proteínas esperadas localizadas na região extracelular (veja a parte superior direita da Figura 2 ), a maioria das proteínas identificadas pelas abordagens proteômicas eram da região intracelular ( Ie, citoplasma, organelas, vesículas e citoesqueleto). As proteínas da superfície celular também foram identificadas ( Figura 2 ).

Os resultados foram confirmados em três amostras valvulares mitrais independentes. A imunotransferência foi utilizada para analisar um grupo de quatro proteínas ( ou seja, septin-11, quatro e meia proteína de dominios LIM (FHL-1), derMatopontin e alfa-cristalina B (CryAB)) que nunca foram identificados na valva mitral normal ( Figura 3 ).

figura 1
Figura 1: Estrutura da válvula mitral. Vista superior do coração humano mostrando a válvula mitral humana fechada ( A ) ou aberta ( B ). Vista frontal do ventrículo esquerdo de um coração humano ( C ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Análise das proteínas da válvula mitral identificadas em termos de distribuição celular. Cytoscape e o plugin BiNGO foram usados ​​para obtaiN a distribuição dos termos de ontologia do gene (GO) das categorias de componentes celulares. O tamanho do círculo é proporcional ao número de componentes de proteína associados aos termos GO selecionados, e a escala de cores para o valor p da sobre-representação é relatada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: análise de imunotransferência de septin-11, FHL-1, dermatopontina e CryAB em extrato inteiro de três folhetos de válvula mitral normal humana. A imunotransferência foi realizada utilizando anticorpo monoclonal de ratinho contra CryAB e anticorpos policlonais de coelho contra os anticorpos de septin-11, FHL-1 e dermatopontina. Por favorClique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

<Td> x <Td> <Td Proteasome subunidade beta tipo 4 precursor <Td> </ Tr> <Td> Transgelin 2 <Td> <Tr> <Td>
Adesão Descrição 2-DE 2D-LC LC-MS E Fase líquida IEF
A6NMZ7 Colágeno alfa VI X
O00151 PDZ e domínio LIM proteína 1 X
O00299 Proteína 1 do canal intracelular de cloreto X
O00764 Pirinexal quinase X
O14558 Proteína de choque térmico beta 6 X
O43399 Proteína tumoral D54 X
O43488 Aflatoxina B1 aldeído redutase membro 2 X
O43707 Alpha actinin 4 X X
O43866 Antigénio CD5 como precursor X
O60493 Classificação nexin 3 X
O60701 UDP glucose 6 desidrogenase X
O75223 Proteína não caracterizada X
O75368 Ácido glutâmico de ligação ao domínio SH3 rico em proteína X
O75390 Citrato sintase mitochondrial precursor X
O75489 NADH desidrogenase ubiquinona ferro sulfato proteína 3 precursor mitocondrial X X
O75608 Proteína de acil tioesterase 1 X
O75828 Carbonil redutase NADPH 3 X
O75874 Isocitrato desidrogenase NADP citoplasmático X
O75955 Flotillin X
O94760 NG NG dimetilarginina dimetilaminohidrolase 1 X
O94788 Retinal desidrogenase 2 X
O95865 NG NG dimetilarginina dimetilaminohidrolase 2 X X
P00325 Álcool desidrogenase 1B X X
P00338 L cadeia de lactato desidrogenase A X
P00352 Retinol desidrogenase 1 X
P00441 Superóxido dismutase Cu Zn X X
P00450 Precursor de ceruloplasmina X X
P00488 O precursor de cadeia do factor de coagulação XIII A X
P00491 Nucleósido fosforilase de purina X
P00492 Hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase X
P00558 Fosfoglicerato quinase 1 X X
P00568 Isoenzima 1 de adenilato quinase X
P00734 Protrombina X X
P00738 Haptoglobina X X X X
P00739 Precursor de proteína relacionada com Haptoglobina X
P00751 Fator de complemento B X X X
P00915 Anidrase carbônica 1 X
P00918 Anidrase carbônica 2 X
P01008 Precursor de antitrombina III X X X
P01009 Alfa 1 antitripsina X X X X
P01011 Alpha 1 antichymotrypsin X X X X
P01019 Precursor de angiotensinogênio X X
P01023 Alpha 2 macroglobulin X X
P01024 Complemento C3 X X X X
P01033 Iniciador de metaloprotease 1 precursor X
P01042 Precursor de Kininogênio 1 X
P01593 Ig kappa chain VI region AG X
P01598 Ig kappa chain VI region EU X
P01600 Ig kappa cadeia VI região Hau X X
P01611 Ig kappa chain VI region Wes X
P01620 Ig kappa chain V III region SIE X
P01625 Ig kappa chain V IV region Len X
P01766 Ig de cadeia pesada V III região BRO X X
P01781 GAL de região V III da cadeia pesada de Ig X
P01834 Região da cadeia C de Ig Kappa X X X X
P01842 Regiões da cadeia C de Ig lambda X X X
P01857 Região de cadeia C da gama 1 de Ig X X X X
P01859 Região de cadeia C da gama 2 de Ig X X X X
P01860 Região de cadeia C da gama 3 de Ig X X X
P01861 Região da cadeia C da gama 4 de Ig X X X
P01871 Região da cadeia C Ig mu X X X
P01876 Região de Ig Al de alfa 1 cadeia C X X X X
P01877 Região da cadeia C da alfa 2 de Ig X
P02144 Myoglobin X X
P02452 Colágeno alfa 1 cadeia I X X X X
P02511 Corrente Alpha crystallin B X
P02545 Lamin AC 70 kDa lamin X X X X
P02647 Apolipoproteína AI X X X X
P02649 Apolipoproteína E X X X X
P02671 Cadeia alfa de fibrinogênio X X X X
P02675 Cadeia beta de fibrinogênio X X X X
P02679 Cadeia de gama de fibrinogênio X X X X
P02689 Proteína Myelin P2 X
P02735 Precursor de proteína de amilóide sérico A X
P02741 Precursor de proteína C reactiva X
P02743 Componente P amilóide sérico X X X X
P02746 Substituição da subunidade B de subcomponente C1q X X
P02747 Complemento C1q subcomponente subunidade C precursor X
P02748 Componente de complemento C9 X X X
P02749 Beta 2 glicoproteína 1 X X X X
P02750 Leucina rico em alfa 2 glicoproteína precursor X
P02751 Fibronectina X X
P02760 Precursor de proteína AMBP X X X X
P02763 Glicoproteína ácida alfa 1 1 X X X
P02765 Alpha 2 HS precursor da glicoproteína X
P02766 Precursor de transtiretina X X X
P02768 Albumina de soro X X X X
P02774 Precursor de proteína de ligação à vitamina D X
P02787 Serotransferrina X X X X
P02788 Precursor de lactato de transferrina X
P02790 Hemopexina X X X X
P02792 Cadeia leve Ferritin X
P04004 Vitronectina X X X X
P04075 Fructose bisfosfato aldolase A X
P04083 Anexo A1 X X X X
P04179 Superóxido dismutase Mn precursor mitocondrial X
P04196 Precursor de glicoproteína rica em histidina X
P04217 Alpha 1B precursor de glicoproteína X X
P04350 Tubulina beta 4 cadeia X
P04406 Gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase X X X X
P04792 Proteína de choque térmico beta 1 X X X X
P05091 Precursor mitocondrial de aldeído desidrogenase X X
Precursor de inibidor de protease de plasma C1 X
P05156 Precursor do fator de complemento I X
P05413 Coração de proteína de ligação de ácido gordo X
P05452 TNT precursor de tetranectina X X
P05787 Querato tipo II citoesquelético 8 X
P06396 Gelsolin X X X X
P06576 ATP sintase subunidade beta mitochondrial precursor X X
P06732 Tipo de creina quinase M X X
P06733 Alpha enolase X X X X
P06753 Corrente alfa 3 de Tropomyosin X X
P07108 Proteína de ligação de Acyl CoA X
P07195 L cadeia de lactato desidrogenase B X X X
P07196 Polipéptido leve de neurofilamento X
P07197 Polipéptido médio de neurofilamento X X
P07237 Precursor de isulfase de dissulfureto de proteína X X
P07339 Precursor de catepsina D X X
P07355 Anexo A2 X X X X
P07360 Complemento componente C8 precursor de cadeia gama X
P07437 Cadeia beta de tubulina X X X X
P07585 Decoração X X X X
P07737 Profilin 1 X
P07858 Precursor de catepsina B X
P07900 Proteína de choque térmico HSP 90 alpha X X
P07951 Cadeia beta de tropomiosina X
P07954 Precursor mitocondrial de fumarato hidratase X
P07996 Thrombospondin 1 X X X
P08107 Proteção contra choque térmico 70 kDa proteína 1A 1B X X X X
P08123 Colágeno alfa 2 I cadeia X X X X
P08133 Anexo A6 X X
P08238 Proteína de choque térmico HSP 90 beta X X
P08253 Precursor de colagenase de 72 kDa tipo IV X
P08294 Superoxido dismutase extracelular Cu Zn precUrsor X X X
P08590 Polipéptido leve de miosina 3 X X
P08603 Fator de complemento H X X X X
P08670 Vimentin X X X X
P08729 Cytoskeletal de Keratina tipo II 7 X
P08758 Anexo A5 X X X X
P09211 Glutathione S transferase P X X X
P09382 Galectina 1 X X X
P09417 Dihidropteridina redutase X
P09493 Cadeia alfa de Tropomiosina 1 X X
P09525 Anexo A4 X X
P09651 Ribonucleoproteína nuclear heterogênea A1 X
P09871 Complemento C1s subcomponente precursor X
P09936 Isoenzima L1 de hidrolase de carboxi terminal de ubiquitina X
P09972 Fructose bisfosfato aldolase C X
P0C0L4 Complemento C4 Um precursor X
P0CG05 IgRegiões da cadeia C da lambda 2 X
P0CG38 POTE membro da família do domínio Ankyrin I X
P10515 Componente de acetiltransferase de resíduos de dihidrolipoilisina do complexo de piruvato desidrogenase X
P10768 S formylglutathione hydrolase X
P10809 Precursor mitocondrial de proteína de choque térmico de 60 kDa X
P10909 Clusterin X X X X
P10915 Hyaluronan e proteoglycan link protein 1 precursor X X
P11021 78 kDa gProteína regulada por lúquer X X X
P11047 Subminente Laminin gamma 1 precursor X
P11142 Proteção contra choque térmico de 71 kDa X X X X
P11177 Subunidade de componente de piruvato-desidrogenase E1 subunidade beta precursor mitocondrial X
P11217 Forma do músculo glicógeno fosforilase X
P11310 Precursor mitocondrial de Acil CoA desidrogenase específico da cadeia média X
P11413 Glucose 6 fosfato 1 desidrogenase X
P11766 Cadeia de chi da classe 3 de álcool desidrogenada X
P12036 Polipéptido pesado de Neurofilamento X
P12109 Colágeno alfa 1 cadeia VI X X X X
P12110 Colágeno alfa 2 cadeia VI X X X X
P12111 Colágeno alfa 3 VI cadeia X X X
P12277 Tipo de creina quinase B X
P12429 Anexo A3 X X
P12814 Alpha actinin 1 X X
P12829 Polipéptido leve de miosina 4 X
P12882 Miosina 1 X
P12883 Myosina 7 X X
P12955 Xaa Pro dipeptidase X
P13489 Inibidor de Ribonuclease X
P13533 Miosina 6 X X
P13611 Precursor de proteínas do núcleo de Versan X X
P13639 Fator de alongamento 2 X
P13716 Delta aminolevulinic acid déshydratase X
P13796 Plastin 2 X
P13804 Subcutânea de flavoproteína de transferência eletrônica de precursor mitocondrial alfa X
P13929 Enolase beta X X
P14136 Astrocyte de proteína ácida fibrilar glial X
P14314 Precursor beta da subunidade de glucosidase 2 X
P14550 NADP de álcool desidrogenase X
P14618 Isozimas de piruvato quinase M1 M2 X X X
P14625 </ Td> Precursor de endoplasmina X X
P15121 Aldose redutase X
P15259 Fosfoglicerato mutase 2 X
P16152 Carbonil-redutase NADPH 1 X
P17066 Proteção contra choque térmico 70 kDa 6 X X X
P17174 Aspartato aminotransferase citoplasmático X
P17540 Precursor mitocondrial sarcomérico da creatina quinase X
P17661 Desmin X X X X
P17980 Subunidade reguladora de protease 26S 6A X
P17987 T subunidade de proteína 1 complexa alfa X
P18206 Vinculina X X
P18428 Precursor de proteína de ligação a lipopolisacarídeos X
P18669 Fosfoglicerato mutase 1 X
P19105 Cadeia leve reguladora de miosina 2 X X
P19623 Spermidina sintase X
P19652 Alpha 1 precursor de glicoproteína ácida 2 X X
P19823 Inter alpha trypsin inhibitor heavy chain H2 X
P19827 Inter-alfa-tripsina inibidor cadeia pesada H1 X X
P20073 Anexo A7 X
P20618 Precursor do tipo beta beta da subunidade Proteasome X
P20774 Mimecan X X X X
P21266 Glutathione S transferase Mu 3 X
P21333 Filamin A X X
P21796 Proteína de canal seletivo anión dependente de tensão1 X
P21810 Biglycan X X X X
P21980 Proteína glutamina gama glutamiltransferase 2 X X
P22105 Tenascin X X X
P22314 Enzima ativadora de ubiquitina E1 X
P22352 Precursor da glutationa peroxidase 3 X X
P22626 Ribonucleoproteínas nucleares heterogêneas A2 B1 X
P22695 O precursor mitocondrial do núcleo do complexo do complexo 2 do núcleo citocromo c-redutase do ubiquinol X
P23141 Precursor de carboxilésterase de fígado 1 X
P23142 Fibulin 1 X X X X
P23284 Precursor de peptidil prolil cis trans isomerase B X
P23381 Tryptophanyl tRNA synthetase citoplasmático X
P23526 Adenosilhomocysteinase X X
P23528 Cofilin 1 X
P24752 Precursor mitocondrial de Acetil CoA acetiltransferase X
P25311 Glicoprotei de zinco alfa 2N precursor X
P25705 ATP sintase subunidade alfa mitochondrial X
P25788 Subunidade proteasoma alfa tipo 3 X X
P25789 Subunidade proteasoma alfa tipo 4 X
P26447 Proteína S100 A4 X
P27348 14 3 3 proteína theta X X
P27797 Precursor de calreticulina X
P28066 Subunidade proteasoma alfa tipo 5 X
P28070 X X
P28072 Precursor do tipo beta beta tipo Sub-unidade Proteasome X
P28074 Subcedente do tipo Proteasome beta tipo 5 precursor X
P28331 NADH ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunidade mitochondrial precursor X
P28838 Aminopeptidase de citosol X
P29218 Inositol monofosfatase X
P29401 Transketolase X
P29692 Delta do factor 1 de alongamento X
P29966 Substrato de C quinase rico em alanina Myristoylated X
P30040 Proteína Retículo Endoplasmático ERp29 precursor X
P30041 Peroxiredoxina 6 X X
P30043 Flavina-redutase X
P30044 Precursor mitocondrial de peroxiredoxina 5 X
P30085 UMP CMP quinase X
P30086 Proteína 1 de ligação à fosfatidiletanolamina X
P30101 ProteiN disulfide isomerase A3 precursor X X X
P30613 Isoenzimas de piruvato quinase RL X
P30740 Inibidor de elastase leucocitária X
P31025 Lipocalin 1 precursor X
P31937 3 precursor mitocondrial de hidroxiisobutirato desidrogenase X
P31942 Honeogeneous nuclear ribonucleoprotein H3 X
P31943 Ribonucleoproteína nuclear heterogênea H X
P31946 14 3 3 proteína beta alfa X X
P31948 Fosfoproteína 1 induzida por estresse X
P31949 Proteína S100 A11 X
P32119 Peroxiredoxina 2 X X
P34931 Choque térmico A proteína 1 de 70 kDa gosta X X
P34932 Choque de calor 70 kDa de proteína 4 X
P35232 Prohibitina X
P35237 Serpin B6 X
P35443 Thrombospondin 4 X
P35555 Fibrilina 1 X X
P35579 Myosina 9 X X X
P35580 Myosina 10 X X
P35609 Alpha actinin 2 X
P35625 Inibidor de metaloproteinase 3 X X
P35998 Subunidade reguladora de protease 26S 7 X
P36871 Phosphoglucomutase 1 X X
P36955 Fator derivado do epitélio pigmentado X X
P37802 X X
P37837 Transaldolase X
P38117 Subunidade de flavoproteína de transferência de elétrons beta X
P38646 Stress 70 protein mitochondrial precursor X X
P39687 Acidic leucine nuclear rico em fosfoproteína 32 membro da família A X
P40121 Proteína de capsulação de macrófagos X
P40925 Malato desidrogenase citoplasmática X
P40926 Precursor mitocondrial de malato desidrogenase X
P41219 Periféricos X
P42330 Aldo keto redutase família 1 membro C3 X
P45880 Proteína de canal seletivo de ani dependente de tensão 2 X
P47755 Subunidade de proteína de cobertura de actina alfa 2 X X
P47756 Subunidade de proteína de bloqueio de actina beta X X
P47985 Ubiquinol citocromo c redutase ferro subunidade de enxofre mitochondrial precursor X
P48047 ATP sintase O subunidade de precursor mitocondrial X
P48637 Glutationa sintetase X
P48741 Proteção contra choque térmico 70 kDa 7 X X
P49189 4 trimetilaminobutiraldeído desidrogenase X
P49368 T complexa proteína 1 subunidade gama X
P49747 Proteína da matriz oligomérica da cartilagem X X X X
P49748 Precursor mitocondrial específico de acina CoA desidrogenase de cadeia muito longa X
P50395 Inibidor de dissociação do PIB de Rab beta X X </ Td>
P50454 Precursor Serpin H1 X
P50995 Anexo A11 X
P51452 Proteína de fosfatase de especificidade dupla 3 X
P51884 Lumican X X X X
P51888 Prolargin precursor X X X X
P52565 Rho inibidor da dissociação do PIB 1 X
P52566 Rho Inibidor de dissociação do PIB 2 X
P54652 Proteção contra o choque térmico 70 kDa 2 X X X X
P55072 ATPase do retículo endoplasmático de transição X
P55083 Prevalente de glicoproteína 4 associada a microfibrilas X X
P57053 Histona H2B tipo F X
P60174 Triosephosphate isomerase X X X
P60660 Polipéptido leve de miosina 6 X X
P60709 Actin citoplasmático 1 X X X X
P60981 Destrin X
P61086 Enzima conjugadora de ubiquitina E2 25 kDa X
P61088 Enzima conjugadora de ubiquitina E2 X
P61224 Ras relatou proteína Rap 1b precursora X
P61978 Ribonucleoproteína nuclear heterogênea K X X
P61981 14 3 3 proteína gama X X X
P62258 14 3 3 proteína epsilon 14 3 3E X
P62491 Proteína relacionada com Ras X
P62714 Serina treonina proteína fosfatase 2A catalítica subunidade beta isoforma X
P62736 Actin aortic smooth muscle X X X
P62805 Histone H4 X
P62826 GTP vinculativo proteína nuclear Ran X
P62873 Substância GIGSGT de ligação de nucleótido de guanina beta 1 X
P62879 Subunidade GIGSGT de ligação de nucleótido de guanina beta 2 X
P62937 Peptidil prolyl cis isomerase A X X
P62987 Proteína ribossômica Ubiquitin 60S L40 X
P63104 14 3 3 proTeim zeta delta X X X X
P63241 Factor de iniciação da tradução eucariótica 5A 1 X
P63244 Subunidade de proteína de ligação de nucleótido de guanina beta 2 como 1 X
P63267 Actin gamma enteric smooth muscle X X
P67936 Cadeia de alfa 4 de Tropomyosin X
P68032 Actin alpha cardíaco muscular 1 X
P68104 Fator de alongamento 1 alfa 1 X X X
P68133 Actin alfa-esquelético muscular
P68363 Tubulina alfa 1B cadeia X X X
P68371 Cadeia Tubulin beta 2C X X X
P68402 Factor de ativação de plaquetas acetilhidrolase IB subunidade beta X
P68871 Subunidade de hemoglobina beta X X X
P69905 Subunidade de hemoglobina alfa X X
P78371 T subunidade de proteína 1 complexa beta X
P78417 Glutationa transferase omega 1 X X
P80748 Cadeia de Ig lambda VILOI da região II X
P98095 Fibulin 2 X X
Q01082 Esqueleto da cadeia beta Spectrin 1 X
Q01449 A isoforma atrial de cadeia leve reguladora de miosina 2 X
Q01518 Proteína 1 associada à adenilil ciclase X
Q01995 Transgelina proteína do músculo liso 22 alfa X
Q03252 Lamin B2 X X
Q03591 Precursor de proteína 1 relacionado ao factor de complemento H X
Q04917 14 3 3 proteína eta X X
Q06323 Subconjunto complexo ativador proteasoma 1 X
Q06828 Fibromodulina X X X X
Q06830 Peroxiredoxina 1 X X
Q07507 Dermatopontina X X X X
Q07960 Rho GTPase ativando a proteína 1 X
Q08257 Quino oxidoreductase X
Q08431 Lactadherin X X
Q12765 SEcernin 1 X
Q13011 Delta 3 5 Delta 2 4 dienoyl CoA isomerase mitochondrial precursor X X
Q13228 Proteína 1 de ligação ao selênio X X
Q13404 Enzima conjugadora de ubiquitina E2 variante 1 X
Q13409 Dinaína citoplasmática 1 cadeia intermediária 2 X
Q13509 Tubulina beta 3 X X X
Q13642 Quatro e meia proteína de dominios LIM 1 X
Q13765 Subunidade complexa associada ao polipéptido nascente alfa X
Q13885 N tubulina beta 2A cadeia X X
Q14194 Proteína relacionada com dihidropirimidinase 1 X
Q14195 Proteína 3 relacionada à dihidropirimidinase X X X X
Q14624 Inter-alfa de inibidor de tripsina precursor H4 de cadeia pesada X
Q14697 Neutro alpha glucosidase AB precursor X
Q14764 Proteína principal do vault X
Q14767 Factor de crescimento transformante latente proteína de ligação beta beta 2 X X
Q14894 Proteína de ligação ao hormônio da tireóide regulada por NADP com proteína Mu X
Q15063 Precursor de periostina X X X X
Q15084 Protómero de proteína dissulfureto isomerase A6 X
Q15113 Precollador potenciador 1 de endopeptidase de Procollagen C X
Q15181 Pirofosfatase inorgânica X
Q15365 Proteína 1 de ligação de poli-rC X
Q15366 PolyRC binding protein 2 X
Q15582 Transformar a proteína induzida por beta do factor de crescimento X X X
Q15819 Enzima conjugadora de ubiquitina E2 variante 2 X
Q16352 Interligação alfa X
Q16473 XTA de tenascação putativa X
Q16555 Proteína relacionada com dihidropirimidinase 2 X X X
Q16698 2 4 dienoyl CoA redutase precursor mitocondrial X
Q16891 Membrana interna mitocondrial X
Q562R1 Beta actina como a proteína 2 X
Q6S8J3 POTE ankyrin domain family member E X
Q6UWY5 Olfactomedin como precursor de proteína 1 X X
Q71U36 Cadeia de tubulina alfa 1A X X X
Q7Z7G0 Alvo do precursor Nesh SH3 X X X
Q8WUM4 Mortalidade celular programada 6 proteína interagindo X
Q8WWX9 Thioredoxin como precursor de selenoproteína M X
Q92597 Proteína NDRG1 X
Q92945 Proteína 2 de ligação do elemento amplo a montante X
Q96CN7 Domínio de isoorismatase contendo proteína 1 X
Q96CX2 BTB POZ domínio contendo proteína X
Q96KK5 Histona H2A tipo 1 H X X
Q96KP4 Dipeptidase não específica citosólica X
Q99426 Chaperone específico de tubulina B X
Q99497 Protein DJ 1 X X
Q99536 Proteína de membrana de vesícula sináptica X X X
Q99714 3 hidroxiacil na CoA desidrogenase tipo 2 X
Q99715 Colágeno alfa 1 cadeia XII X X
Q99798 Aconitate hydratase mitochondrial precursor X
Q9BQE3 Tubulina alfa 6 cadeia X
Q9BUF5 Tubulina beta 6 cadeia X X
Q9BUT1 3 hidroxibutirato desidrogenase de tipo 2 X
Q9BVA1 Cadeia de tubulina beta 2B X X X
Q9BXN1 Asporin X X </ Td> X X
Q9H0W9 Ester hydrolase C11orf54 X
Q9H4B7 Tubulina beta 1 X
Q9NRN5 Olfactomedina como precursor de proteína 3 X X
Q9NRV9 Proteína 1 de ligação de Heme X
Q9NSB2 Queratin tipo II cuticular Hb4 X X
Q9NVA2 Sept 11 X
Q9UBR2 Precursor de catepsina Z X
Q9UBX5 Fibulin 5 X X
Q9UK22 Caixa F apenas proteína 2 X
Q9Y277 Proteína de canal seletivo de ani dependente de tensão 3 X
Q9Y281 Cofilin 2 X
Q9Y490 Talin 1 X
Q9Y696 Proteína 4 do canal intracelular de cloreto X
Q9Y6C2 EMILIN 1 X X

Tabela 1: Lista das proteínas identificadas no extracto de tecido da válvula mitral quando foram aplicadas quatro abordagens proteômicas diferentes: eletroforese bidimensional (2-DE), LC-MS E bidimensional (2D-LC / MS E ), LC / MS E e IEF em fase líquida. O método pelo qual cada proteína foi identificada é relatado.

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Discussion

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Um passo crítico deste protocolo é o uso de nitrogênio líquido para congelar a amostra e refrigerar o sistema de moagem. O uso de nitrogênio líquido evita a degradação biológica e permite o pulverização eficiente, mas requer treinamento específico para um manuseio seguro.

Neste protocolo apresenta um sistema de moagem para moagem de amostras porque pequenas amostras são difíceis de recuperar de argamassa e pilão padrão. Neste caso, pequenas amostras se espalham como um pó fino sobre a superfície da argamassa, tornando a coleta difícil. Outra vantagem é que o moedor é motorizado, o que permite que um maior número de amostras seja processado de forma reprodutível e sem fadiga adicionada. Uma limitação no uso de um moedor é que o tamanho da amostra que deve ser pequeno (100 mg ou menos) para que o pilão seja pressionado efetivamente contra a argamassa. Além disso, os componentes do moedor devem ser aquecidos até a temperatura ambiente entre as utilizações para limpeza G. Conseqüentemente, o procedimento é demorado e, se muitas amostras são processadas diariamente, são necessários muitos conjuntos.

Um passo crítico adicional é a preparação do buffer de extração. As concentrações de sal, especialmente para a ureia (8 M) e a tioureia (2 M), são bastante elevadas; Assim, o volume de sal é quase metade do volume total da solução. Além disso, a dissolução não é fácil considerando que o calor deve ser evitado porque, a mais de 37 ° C, a ureia pode levar à carbamilação de proteínas no terminal N de proteínas / péptidos e nos grupos amino de cadeia lateral de resíduos de lisina e arginina 17 . Uma vez dissolvido, o tampão de ureia deve ser filtrado com filtros de 0,22 μm e pode ser armazenado a -80 ° C por 4 semanas sem afetar a sua eficácia de extração, mas deve ser aquecido a mais de 15 ° C antes da utilização para permitir a dissolução completa .

Modificações e solução de problemas

Neste protocolo, a extração de proteína é realizada usando o tampão de ureia descrito, porque é uma das soluções de extração de proteína mais utilizadas para estudos proteômicos devido à sua compatibilidade com a isofefocalização e sua eficiência na solubilização de proteínas pouco solúveis 18. Foi Demonstraram que este tampão pode solubilizar de forma muito eficiente proteínas pouco solúveis, como proteínas de membrana integrais 19 ou proteínas que são altamente propensas a agregação, como a tubulina 18. Além disso, esse tampão é totalmente compatível com o ensaio de Bradford para determinar a concentração de proteína e Pode ser usado diretamente em 2-DE e em análises de IEF em fase líquida.

No entanto, este tampão não é ideal para a solubilização de todas as proteínas presentes numa amostra. É possível que diferentes buffers de extração possam revelar proteínas indetectáveis ​​por este protocolo. Por exemplo, é bomSe as proteínas ribossómicas e nucleares puderem ser melhor extraídas com extração de ácido ou precipitação de ácido tricloroacético / acetona 20 , enquanto que os níveis de pH alcalino são mais adequados para as proteínas da membrana 21 , 22 . Portanto, o uso de tampões alternativos pode exigir etapas adicionais para a precipitação de proteínas para eliminar os sais que interferem com 2-DE ou IEF de fase líquida.

Limitações da técnica

O número de proteínas identificadas por este protocolo é relativamente baixo, mas o número de identificações e a cobertura da análise proteômica podem ser aumentados através do uso de instrumentos mais modernos, cuja precisão em massa e velocidade de seqüência aumentaram dramaticamente nos últimos anos 23. É possível cobrir uma grande parte do proteoma, sem etapas de pré-tração, empregando um gradiente longo para líquidosSeparações de romatografia, juntamente com um instrumento de MS de alta resolução que possui uma velocidade de seqüenciamento rápida 24 .

Significado da técnica em relação aos métodos existentes / alternativos

A capacidade de identificar e quantificar proteínas nas válvulas cardíacas humanas, como a válvula mitral, é uma tarefa importante e desafiadora que ajudará a elucidar os mecanismos de processos fisiológicos / patológicos em doenças valvulares. Definir as mudanças do proteoma valvar mitral irá aumentar a compreensão da natureza dos processos biológicos que estão associados com o estado da doença do tecido.

O conhecimento atual sobre a fisiopatologia da valva mitral é limitado e geralmente obtido através da análise de proteínas individuais envolvidas em processos específicos, como remodelação da matriz extracelular, hemostasia, inflamação ou estresse oxidativo 25 9 , 10 .

A falta de estudos proteômicos abrangentes pode ser atribuída à complexidade deste tecido de baixa celularidade que é altamente rico em proteínas da matriz extracelular ( ie, proteoglicanos, colágeno e elastina). Essas proteínas representam cerca de 80% da quantidade total, dificultando a análise de proteínas de baixa abundância 26 .

Assim, foi necessário estabelecer um protocolo de extração eficiente para maximizar a solubilização de proteínas para descrever o proteoma desse tecido. Este protocolo permitiu a extração de ~ 50 μg de proteína a partir de 1 mg de tecido. Este é um rendimento relativamente baixo em comparação com o tecido "macio", comoComo fígado (~ 135 μg de 1 mg de tecido), mas é suficiente para realizar uma análise de proteína em amostras individuais. Isto é particularmente relevante quando se define a variabilidade intra-individual de um fenômeno.

Além disso, este método tem a vantagem de ser compatível com muitas aplicações analíticas. As proteínas da válvula mitral dissolvidas no tampão de extração proposto podem ser usadas diretamente para imunotransferência e análise proteômica com base em eletroforese bidimensional e isoeletroforese em fase líquida 11 , 12 ou, após a precipitação da proteína para eliminar a interferência do componente tampão, para outros ensaios, tais como Espectrometria de massa isenta de gel 15 .

Com a aplicação deste protocolo de extração, uma caracterização mais exaustiva dos componentes protéicos do tecido valvar mitral normal foi obtida através da identificação de muitos intracelosProteínas larulares. Estas proteínas estão localizadas no citossolo ou nas organelas, não apenas na matriz extracelular, e possuem diferentes funções moleculares e biológicas. Outras proteínas interessantes ( ie, CryAB , septin-11, FHL-1 e dermatopontina) também foram identificadas. Essas proteínas têm funções desconhecidas na valva mitral, mas suas propriedades biológicas sugerem um possível papel nas doenças valvulares.

Futuras aplicações ou direções depois de dominar esta técnica

Com este protocolo, é possível correlacionar dados relativos à expressão da proteína com dados sobre a expressão quantitativa de mRNA e análises imuno-histoquimáticas não quantitativas. Na verdade, quando usados ​​em conjunto, essas abordagens levarão a uma compreensão mais abrangente dos mecanismos moleculares subjacentes à doença, do mRNA à modificação da proteína pós-tradução. Assim, este método pode ser de interesse para pesquisadores focados na fisiopatologia da válvula cardíaca. FinEste protocolo também pode ser aplicado à válvula mitral porcina, que tem uma estreita semelhança com a válvula 27 humana e é utilizada como modelo experimental para a avaliação da função valvular.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

O Ministério da Saúde italiano apoiou este estudo (RC 2013-BIO 15). Agradecemos a Barbara Micheli por sua excelente assistência técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Saline solution 0.9 % NaCl
Eurocollins A SALF 30874046 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Eurocollins B SALF 30874022 Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins
Wisconsin Bridge life RM/N 4081 Balanced organ's transport medium
Biohazard vertical flow air Burdinola Class A GMP classification
Dewar Flask Thermo Scientific Nalgene 4150-1000
Cryogrinder system OPS diagnostics CG 08-01 Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver
Stainless steel forceps
Stainless steel spatula
Disposable sterile scalpel Medisafe MS-10
Stainless steel scissors Autoclavable
Stainless steel picks Autoclavable
Disposable sterile drap Mon&Tex 3.307.08
Sterilizing solution with isopropyl alcohol 70% isopropyl alcohol
Sterilizing solution with hydrogen peroxide 6% hydrogen peroxide
Micropipette, 1 mL, with tips
15 mL centrifuge tubes VWR international 9278
1.7 mL centrifuge tubes VWR international PIER90410
Urea buffer 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Urea Sigma aldrich U6504-1KG To be used for Urea buffer
Thiourea Sigma aldrich T8656 To be used for Urea buffer
CHAPS Sigma aldrich C3023-5GR To be used for Urea buffer
Dithiotreitol Sigma aldrich D0632-5G To be used for Urea buffer
Syringe 50 mL PIC To be used to filter Urea buffer
0.22 µm filter Millipore SLGP033RB To be used to filter Urea buffer
PFTE Pestle, 2 mL Kartell 6302 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Borosilicate glass mortar Kartell 6102 Part of Potter-Elvehjem homogenizer
Stirrer VELP scientifica Stirrer DLH To be used for homogenization by Potter-Elvehjem
Bradford Protein assay Bio-Rad laboratories 5000006
Tube rotator Pbi International F205
Liquid nitrogen
Aluminum foil
Ice
Polystyrene box
Dry ice
Centrifuge For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g
Freezer -80°C
Precision balance
Autoclave For sterilization
Cryogenic gloves for liquid nitrogen
Gloves
Professional forced ventilation and natural air convection oven For sterilization
Protease inhibitor cocktail Sigma aldrich P8340-5ML 100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation Kit Calbiochem 539180
RapiGest Waters 186001861
Cytoscape www.cytoscape.org version 2.7 Software platform for Gene Ontology analysis
BiNGO http://apps.cytoscape.org/apps/bingo version 3.0.3 Plugin for Gene ontology analysis
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody Novus Biologicals NBP1-97494 Mouse monoclonal antibody against CryAB
Septin-11 Antibody Novus Biologicals NBP1-83824 Rabbit polyclonal antibody against septin-11
FHL1 Antibody Novus Biologicals NBP-188745 Rabbit polyclonal antibody against FHL-1
Dermatopontin Antibody Novus Biologicals NB110-68135 Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin
Goat Anti mouse IgG HRP Sigma aldrich A4416-0.5ML Secondary antibody for immunoblotting
Goat Anti rabbit IgG HRP Bio-Rad laboratories 170-5046 Secondary antibody for immunoblotting

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References

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Protocolo otimizado para a extração de proteínas da válvula mitral humana
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Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).More

Banfi, C., Guarino, A., Brioschi, M., Ghilardi, S., Mastrullo, V., Tremoli, E., Polvani, G. Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve. J. Vis. Exp. (124), e55762, doi:10.3791/55762 (2017).

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