Summary
A composição protéica da válvula mitral humana ainda é parcialmente desconhecida, pois sua análise é complicada pela baixa celularidade e, portanto, pela baixa biossíntese de proteínas. Este trabalho fornece um protocolo para extrair eficientemente proteínas para a análise do proteoma valvar mitral.
Abstract
A análise do proteoma celular pode ajudar a elucidar os mecanismos moleculares subjacentes às doenças devido ao desenvolvimento de tecnologias que permitem a identificação e quantificação em larga escala das proteínas presentes em sistemas biológicos complexos. O conhecimento adquirido a partir de uma abordagem proteômica pode potencialmente levar a uma Melhor compreensão dos mecanismos patogênicos subjacentes às doenças, permitindo a identificação de novos marcadores diagnósticos e de doenças prognósticas e, espero, de alvos terapêuticos. No entanto, a válvula mitral cardíaca representa uma amostra muito desafiadora para análise proteômica devido à baixa celularidade em proteoglicano e matriz extracelular enriquecida com colágeno. Isso torna desafiador extrair proteínas para uma análise proteômica global. Este trabalho descreve um protocolo que é compatível com análises de proteínas subseqüentes, como proteômica quantitativa e imunotransferência. Isso pode permitir a correlação de dados relacionadosG expressão de proteína com dados sobre a expressão quantitativa de mRNA e análise imuno-histoquímica não-quantitativa. Na verdade, essas abordagens, quando realizadas em conjunto, levarão a uma compreensão mais abrangente dos mecanismos moleculares subjacentes às doenças, do mRNA à modificação da proteína pós-tradução. Assim, este método pode ser relevante para pesquisadores interessados no estudo da fisiopatologia valvular cardíaca.
Introduction
Evidências recentes alteraram a compreensão dos papéis dos muitos mecanismos regulatórios que ocorrem após a síntese de mRNA. Na verdade, processos translacionais, pós-transcrição e proteolíticos podem regular a abundância e a função da proteína. O dogma - que diz que as concentrações de mRNA são proxies para as proteínas correspondentes, assumindo que os níveis de transcrição são o principal determinante da abundância de proteína - foi parcialmente revisado. De fato, os níveis de transcrição apenas prevêem parcialmente a abundância de proteína, sugerindo que os eventos pós-transcrição Ocorrem para regular as proteínas nas células 1 , 2 .
Além disso, as proteínas determinam a função da célula e, portanto, ditar seu fenótipo, que pode sofrer mudanças dinâmicas em resposta a fatores autocrinos, paracrinos e endócrinos; Mediadores transmitidos pelo sangue; temperatura; Tratamento medicamentoso; E desenvolvimento da doençaMent. Assim, uma análise de expressão focada no nível de proteína é útil para caracterizar o proteoma e desvendar as mudanças críticas que ocorrem como parte da patogênese da doença 3 .
Portanto, as oportunidades que a proteômica apresentar para esclarecer condições de saúde e doença são formidáveis, apesar dos desafios tecnológicos existentes. As áreas de pesquisa particularmente promissoras para as quais a proteômica pode contribuir: a identificação da expressão protéica alterada em qualquer nível ( ou seja, células inteiras ou tecido, compartimentos subcelulares e fluidos biológicos); Identificação, verificação e validação de novos biomarcadores úteis para o diagnóstico e prognóstico da doença; E, esperançosamente, a identificação de novos alvos de proteínas que podem ser utilizados para fins terapêuticos, bem como para a avaliação da eficácia e toxicidade da droga 4 .
Capturar a complexidade deO proteoma representa um desafio tecnológico. As ferramentas proteômicas atuais oferecem a oportunidade de realizar análises em grande escala e de alto débito para identificação, quantificação e validação de níveis de proteína alterados. Além disso, a introdução de técnicas de fracionamento e enriquecimento, visando evitar a interferência causada pelas proteínas mais abundantes, também melhorou a identificação de proteínas, incluindo as proteínas menos abundantes. Finalmente, a proteômica foi complementada pela análise de modificações pós-tradução, que emergem progressivamente como importantes moduladores da função protéica.
No entanto, a preparação da amostra e a recuperação de proteínas nos espécimes biológicos em análise continuam a ser as etapas limitantes no fluxo de trabalho proteômico e aumentam o potencial de possíveis armadilhas 5 . Na verdade, na maioria das técnicas de biologia molecular que devem ser otimizadas, os primeiros passos são homogeneização de tecidoLise de íons e células, especialmente durante a análise de proteínas de baixa abundância para as quais os métodos de amplificação não existem. Além disso, a natureza química das proteínas pode influenciar a sua própria recuperação. Por exemplo, a análise de proteínas altamente hidrofóbicas é muito desafiadora, porque elas se precipitam facilmente durante a focagem isoelétrica, enquanto as proteínas trans-membranas são quase insolúveis (revisada na Referência 5). Além disso, a variabilidade da composição do tecido cria uma barreira significativa ao desenvolvimento de um método de extração universal. Finalmente, porque quase todos os espécimes clínicos são de quantidade limitada, é essencial ativar a preparação de proteínas com recuperação máxima e reprodutibilidade a partir de quantidades mínimas de amostras 6 .
Este trabalho descreve um protocolo otimizado para a extração de proteínas a partir da valva mitral cardíaca humana normal, o que representa uma amostra muito desafiadora para análise proteômica. A válvula mitral normal é um compEstrutura lex situada entre o átrio esquerdo e o ventrículo esquerdo do coração ( Figura 1 ). Ele desempenha um papel importante no controle do fluxo sanguíneo do átrio para o ventrículo, evitando o refluxo e garantindo o nível adequado de fornecimento de oxigênio para todo o corpo, mantendo um débito cardíaco adequado. No entanto, muitas vezes é considerado um tecido "inativo", com baixa celularidade e poucos componentes, principalmente na matriz extracelular. Isso ocorre porque, em condições normais, as células intersticiais valvulares residentes (VICs) apresentam um fenótipo quiescente com baixa taxa de biossíntese de proteína 7 .
No entanto, demonstrou-se que, em um estado patológico, o número de VICs no spongiosa aumenta e sua síntese protéica é ativada, juntamente com outras mudanças funcionais e fenotípicas 8 . Portanto, não é surpreendente que os dados mínimos disponíveis emA literatura se concentra no análise de válvulas mitrais patológicas 9 , 10 , nas quais o aumento do número de VICs ativados pode explicar o número relativamente alto de proteínas identificadas.
Em conclusão, o presente protocolo pode servir para desenvolver a compreensão dos mecanismos patogênicos responsáveis pelas valvopatias mitrais através do estudo dos componentes da proteína valvar mitral. De fato, uma maior compreensão dos processos patológicos subjacentes poderia ajudar a melhorar o manejo clínico das doenças valváticas, cujas indicações atuais de intervenção são em grande parte fundamentadas em considerações hemodinâmicas.
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Protocol
Neste protocolo, os corações humanos são coletados durante a explicação multiorgânica (tempo de isquemia de 4-12 h, média 6 ± 2 h) de doadores de múltiplos órgãos excluídos do transplante de órgãos por razões técnicas ou funcionais, apesar dos parâmetros ecocardiográficos normais. Eles são enviados ao Banco de Tecidos Cardiovasculares de Milão, Monzino Cardiologic Center (Milão, Itália) para o banco das válvulas aórtica e pulmonar. Os folhetos mitrais posteriores não são utilizados para fins clínicos, portanto são coletados durante o isolamento da válvula aórtica e pulmonar após o consentimento informado dos parentes dos doadores. O tecido para transplante e pesquisa é coletado somente após o consentimento dos pais; Na folha de consentimento, eles autorizam (ou não) o uso do tecido cardíaco somente para pesquisa se não for adequado para uso clínico humano ( ou seja, problemas microbiológicos, funcionais e serológicos), seguindo as diretrizes do comitê de ética deMonzino Cardiologic Center.
1. Preparação da válvula mitral
- Colhe a válvula mitral humana o mais rápido possível após a explicação do órgão (tempo de isquemia de 4-12 h).
- Em uma sala limpa, remova o coração do saco de transporte contendo uma solução fria (4 ° C) ( isto é, solução salina ou Eurocollins de média equilibrada ou Wisconsin). Coloque-o em um balde e coloque-o em um gabinete de biossegurança (fluxo de ar vertical de risco biológico, classe A, classificação boas práticas de fabricação (GMP)) para prosseguir com a preparação da válvula.
- Coloque o coração sobre uma camada estéril descartável no armário. Usando um bisturi descartable estéril, corte o coração completamente, perpendicularmente ao seu eixo principal, no nível dos ventrículos esquerdo e direito, a cerca de 4 cm do ápice.
- Mova a aorta ascendente e a artéria pulmonar para exibir o telhado do átrio esquerdo.
- Com pinças esterilizadas autoclaváveis e picaretas, corte ao redor da aurícula esquerda naTelhado do atrial esquerdo, visando a válvula mitral e permitindo a identificação do grande folheto mitral (anterior) e do pequeno folheto mitral (posterior).
NOTA: As comissuras medulares antero-laterais e posteriores definem a borda do folheto anterior e a área posterior. - Usando tesoura esterilizada autoclavável e fórceps não traumáticos, dissecar o átrio esquerdo e a espessura da parede do ventrículo ao redor da circunferência de toda a valva mitral .
- Identificar a continuidade da válvula mitro-aórtica.
NOTA: O ventrículo esquerdo contém toda a válvula mitral e acordes. - Separe o folheto da válvula mitral anterior do folheto da válvula mitral posterior, cortando o folheto posterior ao longo da inserção com o ventrículo (comissura).
- Lave o folheto posterior na solução salina. Corte o folheto em pequenos pedaços (<1 cm 2 ) e envolva-os individualmente em papel alumínio. Feche-os com nitrogênio líquido.
Cuidado: siga procedimentos de segurança organizacional ao usar nitrogênio líquido.- Desinfecte a mesa do armário com uma solução de álcool isopropílico a 70% e uma solução de peróxido de hidrogênio a 6% no final do procedimento.
2. Extração de proteínas
- Use fórceps para retirar a amostra armazenada em nitrogênio líquido e coloque-a imediatamente em gelo seco enquanto ainda está envolvido na folha de alumínio. Não deixe a amostra descongelar durante as transferências.
- Antes da moagem, esfriar a argamassa de porcelana / zircónio e pilões de um sistema de moedor ( por exemplo, CryoGrinder) , juntamente com a amostra, colocando-os em um balão Dewar contendo nitrogênio líquido (~ 500 mL).
Cuidado: siga procedimentos de segurança organizacional ao usar nitrogênio líquido. - Coloque a argamassa e pilões em uma caixa de poliestireno contendo gelo seco. Remova a amostra da folha de alumínio e coloque-a na argamassa.
- Grind tEle provoca com o grande pilão contra a argamassa 15-20 vezes, usando a chave de fenda para girar o pilão. Misture a amostra com a ponta de uma espátula pré-congelada durante o processo de moagem.
- Repita com o pequeno pilão.
- Transfira a amostra de solo para um tubo previamente pesado ( por exemplo, tubo de centrífuga de 15 mL), invadindo o tubo, colocando-o sobre a argamassa e invadindo-os para mover a amostra para o tubo. Use uma espátula pré-refrigerada para recuperar todo o material da argamassa.
- Mantenha o tubo com a amostra em gelo seco para evitar a descongelação da amostra durante a transferência.
- Calcule o peso líquido da amostra.
- Limpe a argamassa e os pilões após cada amostra e descontaminar-os por autoclave ou aquecê-los a 200 ° C por 2 h.
- Transfira a amostra em pó do tubo de centrífuga para o tubo de vidro de um homogeneizador por inversão.
- Adicione buffe de ureia filtradaR (8 M de ureia, 2 M de tioureia, 4% p / v de CHAPS, 20 mM de Tris e 55 mM de ditiotreitol) no tubo de vidro, 200 μL de tampão de ureia por cada 10 mg de tecido em pó.
NOTA: A amostra de pó residual deixada no tubo da centrífuga pode ser recuperada usando parte do volume calculado de tampão de ureia. - Homogeneizar a amostra usando um agitador equipado com uma argamassa de vidro de borosilicato e um pilão de politetrafluoroetileno (PTFE). Pressione lentamente o pilão na amostra com um movimento de torção (1.500 rpm) 10 vezes.
- Recupere o sobrenadante e transfira-o para um tubo de centrífuga limpo de 1,7 mL. Mais uma vez extraie a amostra restante com tampão de uréia fresco, adicionando metade do volume utilizado durante a primeira extração.
- Repita o passo 2.10.
- Recupere o sobrenadante e combine-o com o sobrenadante do passo 2.11. Coloque o sobrenadante combinado em um rotator de tubo durante 30 min.
- Centrifugue o tubo por 30 min a 13.000 xg e 4 ° C.
- Recupere o sobrenadante eD mede a concentração de proteína usando o teste de proteína de Bradford, de acordo com as instruções do fabricante. Armazene a amostra a -80 ° C até o uso.
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Representative Results
A extração e dissolução de proteínas no tampão de ureia é diretamente compatível com métodos proteômicos baseados em isolectrofocus (eletroforese bidimensional (2-DE) 11 e foco isoelétrico em fase líquida (IEF) 12 ) e com imunotransferência após diluição no tampão Laemmli 13 Contendo um coquetel inibidor de protease 14 .
Para métodos baseados em espectrometria de massa sem gel ( ou seja, cromatografia líquida acoplada a análise de espectrometria de massa independente de dados (LC / MS E ) e LC / MS E bidimensional (2D-LC / MS E )) 15 , as amostras foram extraídas No tampão de ureia descrito, é necessário continuar a tratar para eliminar a ureia e a tioureia, o que pode interferir na posterior digestão de proteínas e na separação por cromatografia líquida. ThiO passo de dessalinização de S pode ser realizado utilizando os kits comerciais de precipitação de proteínas, seguindo as instruções do fabricante para precipitar as proteínas. A amostra pode então ser dissolvida em NH4OHCO3 25 mM contendo 0,1% de detergentes cliváveis para a digestão de proteínas 16 . A precipitação das proteínas pode eliminar componentes de tampão, afetando minimamente o teor de proteína (recuperação de proteína:> 85%), tornando a amostra adequada para todo tipo de análise.
A aplicação deste protocolo para a extração de proteínas a partir de válvulas mitrais humanas permitiu a identificação de um total de 422 proteínas, combinando quatro abordagens proteômicas diferentes anteriormente descritas em detalhes 11 , 15 . Especificamente, 169 proteínas foram identificadas por 2-DE, 330 proteínas por fase líquida IEF, 96 proteínas por LC / MS E e 148 proteínasPor 2D-LC / MS E (Tabela 1).
Para classificar as 422 proteínas identificadas em termos de localização subcelular, foi utilizado um software para a análise de ontologia de genes (GO) ( por exemplo, Cytoscape). A rede criada com o software e seu plug-in correspondente mostrou que, além das proteínas esperadas localizadas na região extracelular (veja a parte superior direita da Figura 2 ), a maioria das proteínas identificadas pelas abordagens proteômicas eram da região intracelular ( Ie, citoplasma, organelas, vesículas e citoesqueleto). As proteínas da superfície celular também foram identificadas ( Figura 2 ).
Os resultados foram confirmados em três amostras valvulares mitrais independentes. A imunotransferência foi utilizada para analisar um grupo de quatro proteínas ( ou seja, septin-11, quatro e meia proteína de dominios LIM (FHL-1), derMatopontin e alfa-cristalina B (CryAB)) que nunca foram identificados na valva mitral normal ( Figura 3 ).
Figura 1: Estrutura da válvula mitral. Vista superior do coração humano mostrando a válvula mitral humana fechada ( A ) ou aberta ( B ). Vista frontal do ventrículo esquerdo de um coração humano ( C ). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise das proteínas da válvula mitral identificadas em termos de distribuição celular. Cytoscape e o plugin BiNGO foram usados para obtaiN a distribuição dos termos de ontologia do gene (GO) das categorias de componentes celulares. O tamanho do círculo é proporcional ao número de componentes de proteína associados aos termos GO selecionados, e a escala de cores para o valor p da sobre-representação é relatada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise de imunotransferência de septin-11, FHL-1, dermatopontina e CryAB em extrato inteiro de três folhetos de válvula mitral normal humana. A imunotransferência foi realizada utilizando anticorpo monoclonal de ratinho contra CryAB e anticorpos policlonais de coelho contra os anticorpos de septin-11, FHL-1 e dermatopontina. Por favorClique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
| Adesão | Descrição | 2-DE | 2D-LC | LC-MS E | Fase líquida IEF |
| A6NMZ7 | Colágeno alfa VI | X | |||
| O00151 | PDZ e domínio LIM proteína 1 | X | |||
| O00299 | Proteína 1 do canal intracelular de cloreto | X | |||
| O00764 | Pirinexal quinase | X | |||
| O14558 | Proteína de choque térmico beta 6 | X | |||
| O43399 | Proteína tumoral D54 | X | |||
| O43488 | Aflatoxina B1 aldeído redutase membro 2 | X | |||
| O43707 | Alpha actinin 4 | X | X | ||
| O43866 | Antigénio CD5 como precursor | X | |||
| O60493 | Classificação nexin 3 | X | |||
| O60701 | UDP glucose 6 desidrogenase | X | |||
| O75223 | Proteína não caracterizada | X | |||
| O75368 | Ácido glutâmico de ligação ao domínio SH3 rico em proteína | X | |||
| O75390 | Citrato sintase mitochondrial precursor | X | |||
| O75489 | NADH desidrogenase ubiquinona ferro sulfato proteína 3 precursor mitocondrial | X | X | ||
| O75608 | Proteína de acil tioesterase 1 | X | |||
| O75828 | Carbonil redutase NADPH 3 | X | |||
| O75874 | Isocitrato desidrogenase NADP citoplasmático | X | |||
| O75955 | Flotillin | X | |||
| O94760 | NG NG dimetilarginina dimetilaminohidrolase 1 | X | |||
| O94788 | Retinal desidrogenase 2 | X | |||
| O95865 | NG NG dimetilarginina dimetilaminohidrolase 2 | X | X | ||
| P00325 | Álcool desidrogenase 1B | X | X | ||
| P00338 | L cadeia de lactato desidrogenase A | X | |||
| P00352 | Retinol desidrogenase 1 | X | |||
| P00441 | Superóxido dismutase Cu Zn | X | X | ||
| P00450 | Precursor de ceruloplasmina | X | X | ||
| P00488 | O precursor de cadeia do factor de coagulação XIII A | X | |||
| P00491 | Nucleósido fosforilase de purina | X | |||
| P00492 | Hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase | X | |||
| P00558 | Fosfoglicerato quinase 1 | <Td> xX | X | ||
| P00568 | Isoenzima 1 de adenilato quinase | X | |||
| P00734 | Protrombina | X | X | ||
| P00738 | Haptoglobina | X | X | X | X |
| P00739 | Precursor de proteína relacionada com Haptoglobina | X | |||
| P00751 | Fator de complemento B | X | X | X | |
| P00915 | Anidrase carbônica 1 | X | |||
| P00918 | Anidrase carbônica 2 | X | |||
| P01008 | Precursor de antitrombina III | X | X | X | |
| P01009 | Alfa 1 antitripsina | X | X | X | X |
| P01011 | Alpha 1 antichymotrypsin | X | X | X | X |
| P01019 | Precursor de angiotensinogênio | X | X | ||
| P01023 | Alpha 2 macroglobulin | X | X | ||
| P01024 | Complemento C3 | X | X | X | X |
| P01033 | Iniciador de metaloprotease 1 precursor | X | |||
| P01042 | Precursor de Kininogênio 1 | X | |||
| P01593 | Ig kappa chain VI region AG | X | |||
| P01598 | Ig kappa chain VI region EU | X | |||
| P01600 | Ig kappa cadeia VI região Hau | X | X | ||
| P01611 | Ig kappa chain VI region Wes | X | |||
| P01620 | Ig kappa chain V III region SIE | X | |||
| P01625 | Ig kappa chain V IV region Len | X | |||
| P01766 | Ig de cadeia pesada V III região BRO | X | X | ||
| P01781 | GAL de região V III da cadeia pesada de Ig | X | |||
| P01834 | Região da cadeia C de Ig Kappa | X | X | X | X |
| P01842 | Regiões da cadeia C de Ig lambda | X | X | X | |
| P01857 | Região de cadeia C da gama 1 de Ig | X | X | X | X |
| P01859 | Região de cadeia C da gama 2 de Ig | X | X | X | X |
| P01860 | Região de cadeia C da gama 3 de Ig | X | X | X | |
| P01861 | Região da cadeia C da gama 4 de Ig | X | X | X | |
| P01871 | Região da cadeia C Ig mu | X | X | X | |
| P01876 | Região de Ig Al de alfa 1 cadeia C | X | X | X | X |
| P01877 | Região da cadeia C da alfa 2 de Ig | X | |||
| P02144 | Myoglobin | X | X | ||
| P02452 | Colágeno alfa 1 cadeia I | X | X | X | X |
| P02511 | Corrente Alpha crystallin B | X | |||
| P02545 | Lamin AC 70 kDa lamin | X | X | X | X |
| P02647 | Apolipoproteína AI | X | X | X | X |
| P02649 | Apolipoproteína E | X | X | X | X |
| P02671 | Cadeia alfa de fibrinogênio | X | X | X | X |
| P02675 | Cadeia beta de fibrinogênio | X | X | X | X |
| P02679 | Cadeia de gama de fibrinogênio | X | X | X | X |
| P02689 | Proteína Myelin P2 | X | |||
| P02735 | Precursor de proteína de amilóide sérico A | X | |||
| P02741 | Precursor de proteína C reactiva | X | |||
| P02743 | Componente P amilóide sérico | X | X | X | X |
| P02746 | Substituição da subunidade B de subcomponente C1q | X | X | ||
| P02747 | Complemento C1q subcomponente subunidade C precursor | X | |||
| P02748 | Componente de complemento C9 | X | X | X | |
| P02749 | Beta 2 glicoproteína 1 | X | X | X | X |
| P02750 | Leucina rico em alfa 2 glicoproteína precursor | X | |||
| P02751 | Fibronectina | X | X | ||
| P02760 | Precursor de proteína AMBP | X | X | X | X |
| P02763 | Glicoproteína ácida alfa 1 1 | X | X | X | |
| P02765 | Alpha 2 HS precursor da glicoproteína | X | |||
| P02766 | Precursor de transtiretina | X | X | X | |
| P02768 | Albumina de soro | X | X | X | X |
| P02774 | Precursor de proteína de ligação à vitamina D | X | |||
| P02787 | Serotransferrina | X | X | X | X |
| P02788 | Precursor de lactato de transferrina | X | |||
| P02790 | Hemopexina | X | X | X | X |
| P02792 | Cadeia leve Ferritin | X | |||
| P04004 | Vitronectina | X | X | X | X |
| P04075 | Fructose bisfosfato aldolase A | X | |||
| P04083 | Anexo A1 | X | X | X | X |
| P04179 | Superóxido dismutase Mn precursor mitocondrial | X | |||
| P04196 | Precursor de glicoproteína rica em histidina | X | |||
| P04217 | Alpha 1B precursor de glicoproteína | X | X | ||
| P04350 | Tubulina beta 4 cadeia | X | |||
| P04406 | Gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase | X | X | X | X |
| P04792 | Proteína de choque térmico beta 1 | X | X | X | X |
| P05091 | Precursor mitocondrial de aldeído desidrogenase | X | X | ||
| Precursor de inibidor de protease de plasma C1 | X | ||||
| P05156 | Precursor do fator de complemento I | X | |||
| P05413 | Coração de proteína de ligação de ácido gordo | X | |||
| P05452 | TNT precursor de tetranectina | X | X | ||
| P05787 | Querato tipo II citoesquelético 8 | X | |||
| P06396 | Gelsolin | X | X | X | X |
| P06576 | ATP sintase subunidade beta mitochondrial precursor | X | X | ||
| P06732 | Tipo de creina quinase M | X | X | ||
| P06733 | Alpha enolase | X | X | X | X |
| P06753 | Corrente alfa 3 de Tropomyosin | X | X | ||
| P07108 | Proteína de ligação de Acyl CoA | X | |||
| P07195 | L cadeia de lactato desidrogenase B | X | X | X | |
| P07196 | Polipéptido leve de neurofilamento | X | |||
| P07197 | Polipéptido médio de neurofilamento | X | X | ||
| P07237 | Precursor de isulfase de dissulfureto de proteína | X | X | ||
| P07339 | Precursor de catepsina D | X | X | ||
| P07355 | Anexo A2 | X | X | X | X |
| P07360 | Complemento componente C8 precursor de cadeia gama | X | |||
| P07437 | Cadeia beta de tubulina | X | X | X | X |
| P07585 | Decoração | X | X | X | X |
| P07737 | Profilin 1 | X | |||
| P07858 | Precursor de catepsina B | X | |||
| P07900 | Proteína de choque térmico HSP 90 alpha | X | X | ||
| P07951 | Cadeia beta de tropomiosina | X | |||
| P07954 | Precursor mitocondrial de fumarato hidratase | X | |||
| P07996 | Thrombospondin 1 | X | X | X | |
| P08107 | Proteção contra choque térmico 70 kDa proteína 1A 1B | X | X | X | X |
| P08123 | Colágeno alfa 2 I cadeia | X | X | X | X |
| P08133 | Anexo A6 | X | X | ||
| P08238 | Proteína de choque térmico HSP 90 beta | X | X | ||
| P08253 | Precursor de colagenase de 72 kDa tipo IV | X | |||
| P08294 | Superoxido dismutase extracelular Cu Zn precUrsor | X | X | X | |
| P08590 | Polipéptido leve de miosina 3 | X | X | ||
| P08603 | Fator de complemento H | X | X | X | X |
| P08670 | Vimentin | X | X | X | X |
| P08729 | Cytoskeletal de Keratina tipo II 7 | X | |||
| P08758 | Anexo A5 | X | X | X | X |
| P09211 | Glutathione S transferase P | X | X | X | |
| P09382 | Galectina 1 | X | X | X | |
| P09417 | Dihidropteridina redutase | <Td> | X | ||
| P09493 | Cadeia alfa de Tropomiosina 1 | X | X | ||
| P09525 | Anexo A4 | X | X | ||
| P09651 | Ribonucleoproteína nuclear heterogênea A1 | X | |||
| P09871 | Complemento C1s subcomponente precursor | X | |||
| P09936 | Isoenzima L1 de hidrolase de carboxi terminal de ubiquitina | X | |||
| P09972 | Fructose bisfosfato aldolase C | X | |||
| P0C0L4 | Complemento C4 Um precursor | X | |||
| P0CG05 | IgRegiões da cadeia C da lambda 2 | X | |||
| P0CG38 | POTE membro da família do domínio Ankyrin I | X | |||
| P10515 | Componente de acetiltransferase de resíduos de dihidrolipoilisina do complexo de piruvato desidrogenase | X | |||
| P10768 | S formylglutathione hydrolase | X | |||
| P10809 | Precursor mitocondrial de proteína de choque térmico de 60 kDa | X | |||
| P10909 | Clusterin | X | X | X | X |
| P10915 | Hyaluronan e proteoglycan link protein 1 precursor | X | X | ||
| P11021 | 78 kDa gProteína regulada por lúquer | X | X | X | |
| P11047 | Subminente Laminin gamma 1 precursor | X | |||
| P11142 | Proteção contra choque térmico de 71 kDa | X | X | X | X |
| P11177 | Subunidade de componente de piruvato-desidrogenase E1 subunidade beta precursor mitocondrial | X | |||
| P11217 | Forma do músculo glicógeno fosforilase | X | |||
| P11310 | Precursor mitocondrial de Acil CoA desidrogenase específico da cadeia média | X | |||
| P11413 | Glucose 6 fosfato 1 desidrogenase | X | |||
| P11766 | Cadeia de chi da classe 3 de álcool desidrogenada | X | |||
| P12036 | Polipéptido pesado de Neurofilamento | X | |||
| P12109 | Colágeno alfa 1 cadeia VI | X | X | X | X |
| P12110 | Colágeno alfa 2 cadeia VI | X | X | X | X |
| P12111 | Colágeno alfa 3 VI cadeia | X | X | X | |
| P12277 | Tipo de creina quinase B | X | |||
| P12429 | Anexo A3 | X | X | ||
| P12814 | Alpha actinin 1 | X | X | ||
| P12829 | Polipéptido leve de miosina 4 | X | |||
| P12882 | Miosina 1 | X | |||
| P12883 | Myosina 7 | X | X | ||
| P12955 | Xaa Pro dipeptidase | X | |||
| P13489 | Inibidor de Ribonuclease | X | |||
| P13533 | Miosina 6 | X | X | ||
| P13611 | Precursor de proteínas do núcleo de Versan | X | X | ||
| P13639 | Fator de alongamento 2 | X | |||
| P13716 | Delta aminolevulinic acid déshydratase | X | |||
| P13796 | Plastin 2 | X | |||
| P13804 | Subcutânea de flavoproteína de transferência eletrônica de precursor mitocondrial alfa | X | |||
| P13929 | Enolase beta | X | X | ||
| P14136 | Astrocyte de proteína ácida fibrilar glial | X | |||
| P14314 | Precursor beta da subunidade de glucosidase 2 | X | |||
| P14550 | NADP de álcool desidrogenase | X | |||
| P14618 | Isozimas de piruvato quinase M1 M2 | X | X | X | |
| P14625 </ Td> | Precursor de endoplasmina | X | X | ||
| P15121 | Aldose redutase | X | |||
| P15259 | Fosfoglicerato mutase 2 | X | |||
| P16152 | Carbonil-redutase NADPH 1 | X | |||
| P17066 | Proteção contra choque térmico 70 kDa 6 | X | X | X | |
| P17174 | Aspartato aminotransferase citoplasmático | X | |||
| P17540 | Precursor mitocondrial sarcomérico da creatina quinase | X | |||
| P17661 | Desmin | X | X | X | X |
| P17980 | Subunidade reguladora de protease 26S 6A | X | |||
| P17987 | T subunidade de proteína 1 complexa alfa | X | |||
| P18206 | Vinculina | X | X | ||
| P18428 | Precursor de proteína de ligação a lipopolisacarídeos | X | |||
| P18669 | Fosfoglicerato mutase 1 | X | |||
| P19105 | Cadeia leve reguladora de miosina 2 | X | X | ||
| P19623 | Spermidina sintase | X | |||
| P19652 | Alpha 1 precursor de glicoproteína ácida 2 | X | X | ||
| P19823 | Inter alpha trypsin inhibitor heavy chain H2 | X | |||
| P19827 | Inter-alfa-tripsina inibidor cadeia pesada H1 | X | X | ||
| P20073 | Anexo A7 | X | |||
| P20618 | Precursor do tipo beta beta da subunidade Proteasome | X | |||
| P20774 | Mimecan | X | X | X | X |
| P21266 | Glutathione S transferase Mu 3 | X | |||
| P21333 | Filamin A | X | X | ||
| P21796 | Proteína de canal seletivo anión dependente de tensão1 | X | |||
| P21810 | Biglycan | X | X | X | X |
| P21980 | Proteína glutamina gama glutamiltransferase 2 | X | X | ||
| P22105 | Tenascin X | X | X | ||
| P22314 | Enzima ativadora de ubiquitina E1 | X | |||
| P22352 | Precursor da glutationa peroxidase 3 | X | X | ||
| P22626 | Ribonucleoproteínas nucleares heterogêneas A2 B1 | X | |||
| P22695 | O precursor mitocondrial do núcleo do complexo do complexo 2 do núcleo citocromo c-redutase do ubiquinol | X | |||
| P23141 | Precursor de carboxilésterase de fígado 1 | X | |||
| P23142 | Fibulin 1 | X | X | X | X |
| P23284 | Precursor de peptidil prolil cis trans isomerase B | X | |||
| P23381 | Tryptophanyl tRNA synthetase citoplasmático | X | |||
| P23526 | Adenosilhomocysteinase | X | X | ||
| P23528 | Cofilin 1 | X | |||
| P24752 | Precursor mitocondrial de Acetil CoA acetiltransferase | X | |||
| P25311 | Glicoprotei de zinco alfa 2N precursor | X | |||
| P25705 | ATP sintase subunidade alfa mitochondrial | X | |||
| P25788 | Subunidade proteasoma alfa tipo 3 | X | X | ||
| P25789 | Subunidade proteasoma alfa tipo 4 | X | |||
| P26447 | Proteína S100 A4 | X | |||
| P27348 | 14 3 3 proteína theta | X | X | ||
| P27797 | Precursor de calreticulina | X | |||
| P28066 | Subunidade proteasoma alfa tipo 5 | X | |||
| P28070 | <Td Proteasome subunidade beta tipo 4 precursorX | X | |||
| P28072 | Precursor do tipo beta beta tipo Sub-unidade Proteasome | X | |||
| P28074 | Subcedente do tipo Proteasome beta tipo 5 precursor | X | |||
| P28331 | NADH ubiquinone oxidoreductase 75 kDa subunidade mitochondrial precursor | X | |||
| P28838 | Aminopeptidase de citosol | X | |||
| P29218 | Inositol monofosfatase | X | |||
| P29401 | Transketolase | X | |||
| P29692 | Delta do factor 1 de alongamento | <Td> | X | ||
| P29966 | Substrato de C quinase rico em alanina Myristoylated | X | |||
| P30040 | Proteína Retículo Endoplasmático ERp29 precursor | X | |||
| P30041 | Peroxiredoxina 6 | X | X | ||
| P30043 | Flavina-redutase | X | |||
| P30044 | Precursor mitocondrial de peroxiredoxina 5 | X | |||
| P30085 | UMP CMP quinase | X | |||
| P30086 | Proteína 1 de ligação à fosfatidiletanolamina | X | |||
| P30101 | ProteiN disulfide isomerase A3 precursor | X | X | X | |
| P30613 | Isoenzimas de piruvato quinase RL | X | |||
| P30740 | Inibidor de elastase leucocitária | X | |||
| P31025 | Lipocalin 1 precursor | X | |||
| P31937 | 3 precursor mitocondrial de hidroxiisobutirato desidrogenase | X | |||
| P31942 | Honeogeneous nuclear ribonucleoprotein H3 | X | |||
| P31943 | Ribonucleoproteína nuclear heterogênea H | X | |||
| P31946 | 14 3 3 proteína beta alfa | X | X | ||
| P31948 | Fosfoproteína 1 induzida por estresse | X | |||
| P31949 | Proteína S100 A11 | X | |||
| P32119 | Peroxiredoxina 2 | X | X | ||
| P34931 | Choque térmico A proteína 1 de 70 kDa gosta | X | X | ||
| P34932 | Choque de calor 70 kDa de proteína 4 | X | |||
| P35232 | Prohibitina | X | |||
| P35237 | Serpin B6 | X | |||
| P35443 | Thrombospondin 4 | X | </ Tr> | ||
| P35555 | Fibrilina 1 | X | X | ||
| P35579 | Myosina 9 | X | X | X | |
| P35580 | Myosina 10 | X | X | ||
| P35609 | Alpha actinin 2 | X | |||
| P35625 | Inibidor de metaloproteinase 3 | X | X | ||
| P35998 | Subunidade reguladora de protease 26S 7 | X | |||
| P36871 | Phosphoglucomutase 1 | X | X | ||
| P36955 | Fator derivado do epitélio pigmentado | X | X | ||
| P37802 | <Td> Transgelin 2X | X | |||
| P37837 | Transaldolase | X | |||
| P38117 | Subunidade de flavoproteína de transferência de elétrons beta | X | |||
| P38646 | Stress 70 protein mitochondrial precursor | X | X | ||
| P39687 | Acidic leucine nuclear rico em fosfoproteína 32 membro da família A | X | |||
| P40121 | Proteína de capsulação de macrófagos | X | |||
| P40925 | Malato desidrogenase citoplasmática | X | |||
| P40926 | Precursor mitocondrial de malato desidrogenase | <Td> | X | ||
| P41219 | Periféricos | X | |||
| P42330 | Aldo keto redutase família 1 membro C3 | X | |||
| P45880 | Proteína de canal seletivo de ani dependente de tensão 2 | X | |||
| P47755 | Subunidade de proteína de cobertura de actina alfa 2 | X | X | ||
| P47756 | Subunidade de proteína de bloqueio de actina beta | X | X | ||
| P47985 | Ubiquinol citocromo c redutase ferro subunidade de enxofre mitochondrial precursor | X | |||
| P48047 | ATP sintase O subunidade de precursor mitocondrial | X | |||
| P48637 | Glutationa sintetase | X | |||
| P48741 | Proteção contra choque térmico 70 kDa 7 | X | X | ||
| P49189 | 4 trimetilaminobutiraldeído desidrogenase | X | |||
| P49368 | T complexa proteína 1 subunidade gama | X | |||
| P49747 | Proteína da matriz oligomérica da cartilagem | X | X | X | X |
| P49748 | Precursor mitocondrial específico de acina CoA desidrogenase de cadeia muito longa | X | |||
| P50395 | Inibidor de dissociação do PIB de Rab beta | X | X </ Td> | ||
| P50454 | Precursor Serpin H1 | X | |||
| P50995 | Anexo A11 | X | |||
| P51452 | Proteína de fosfatase de especificidade dupla 3 | X | |||
| P51884 | Lumican | X | X | X | X |
| P51888 | Prolargin precursor | X | X | X | X |
| P52565 | Rho inibidor da dissociação do PIB 1 | X | |||
| P52566 | Rho Inibidor de dissociação do PIB 2 | X | |||
| P54652 | Proteção contra o choque térmico 70 kDa 2 | X | X | X | X |
| P55072 | ATPase do retículo endoplasmático de transição | X | |||
| P55083 | Prevalente de glicoproteína 4 associada a microfibrilas | X | X | ||
| P57053 | Histona H2B tipo F | X | |||
| P60174 | Triosephosphate isomerase | X | X | X | |
| P60660 | Polipéptido leve de miosina 6 | X | X | ||
| P60709 | Actin citoplasmático 1 | X | X | X | X |
| P60981 | Destrin | X | |||
| P61086 | Enzima conjugadora de ubiquitina E2 25 kDa | X | |||
| P61088 | Enzima conjugadora de ubiquitina E2 | X | |||
| P61224 | Ras relatou proteína Rap 1b precursora | X | |||
| P61978 | Ribonucleoproteína nuclear heterogênea K | X | X | ||
| P61981 | 14 3 3 proteína gama | X | X | X | |
| P62258 | 14 3 3 proteína epsilon 14 3 3E | X | |||
| P62491 | Proteína relacionada com Ras | X | |||
| P62714 | Serina treonina proteína fosfatase 2A catalítica subunidade beta isoforma | X | |||
| P62736 | Actin aortic smooth muscle | X | X | X | |
| P62805 | Histone H4 | X | |||
| P62826 | GTP vinculativo proteína nuclear Ran | X | |||
| P62873 | Substância GIGSGT de ligação de nucleótido de guanina beta 1 | X | |||
| P62879 | Subunidade GIGSGT de ligação de nucleótido de guanina beta 2 | X | |||
| P62937 | Peptidil prolyl cis isomerase A | X | X | ||
| P62987 | Proteína ribossômica Ubiquitin 60S L40 | X | |||
| P63104 | 14 3 3 proTeim zeta delta | X | X | X | X |
| P63241 | Factor de iniciação da tradução eucariótica 5A 1 | X | |||
| P63244 | Subunidade de proteína de ligação de nucleótido de guanina beta 2 como 1 | X | |||
| P63267 | Actin gamma enteric smooth muscle | X | X | ||
| P67936 | Cadeia de alfa 4 de Tropomyosin | X | |||
| P68032 | Actin alpha cardíaco muscular 1 | X | |||
| P68104 | Fator de alongamento 1 alfa 1 | X | X | X | |
| P68133 | Actin alfa-esquelético muscular | ||||
| P68363 | Tubulina alfa 1B cadeia | X | X | X | |
| P68371 | Cadeia Tubulin beta 2C | X | X | X | |
| P68402 | Factor de ativação de plaquetas acetilhidrolase IB subunidade beta | X | |||
| P68871 | Subunidade de hemoglobina beta | X | X | X | |
| P69905 | Subunidade de hemoglobina alfa | X | X | ||
| P78371 | T subunidade de proteína 1 complexa beta | X | |||
| P78417 | Glutationa transferase omega 1 | X | X | ||
| P80748 | Cadeia de Ig lambda VILOI da região II | X | |||
| P98095 | Fibulin 2 | X | X | ||
| Q01082 | Esqueleto da cadeia beta Spectrin 1 | X | |||
| Q01449 | A isoforma atrial de cadeia leve reguladora de miosina 2 | X | |||
| Q01518 | Proteína 1 associada à adenilil ciclase | X | |||
| Q01995 | Transgelina proteína do músculo liso 22 alfa | X | |||
| Q03252 | Lamin B2 | X | X | ||
| Q03591 | Precursor de proteína 1 relacionado ao factor de complemento H | X | Q04917 | 14 3 3 proteína eta | X | X |
| Q06323 | Subconjunto complexo ativador proteasoma 1 | X | |||
| Q06828 | Fibromodulina | X | X | X | X |
| Q06830 | Peroxiredoxina 1 | X | X | ||
| Q07507 | Dermatopontina | X | X | X | X |
| Q07960 | Rho GTPase ativando a proteína 1 | X | |||
| Q08257 | Quino oxidoreductase | X | |||
| Q08431 | Lactadherin | X | X | ||
| Q12765 | SEcernin 1 | X | |||
| Q13011 | Delta 3 5 Delta 2 4 dienoyl CoA isomerase mitochondrial precursor | X | X | ||
| Q13228 | Proteína 1 de ligação ao selênio | X | X | ||
| Q13404 | Enzima conjugadora de ubiquitina E2 variante 1 | X | |||
| Q13409 | Dinaína citoplasmática 1 cadeia intermediária 2 | X | |||
| Q13509 | Tubulina beta 3 | X | X | X | |
| Q13642 | Quatro e meia proteína de dominios LIM 1 | X | |||
| Q13765 | Subunidade complexa associada ao polipéptido nascente alfa | X | |||
| Q13885 | N tubulina beta 2A cadeia | X | X | ||
| Q14194 | Proteína relacionada com dihidropirimidinase 1 | X | |||
| Q14195 | Proteína 3 relacionada à dihidropirimidinase | X | X | X | X |
| Q14624 | Inter-alfa de inibidor de tripsina precursor H4 de cadeia pesada | X | |||
| Q14697 | Neutro alpha glucosidase AB precursor | X | |||
| Q14764 | Proteína principal do vault | X | |||
| Q14767 | Factor de crescimento transformante latente proteína de ligação beta beta 2 | X | <Td>X | ||
| Q14894 | Proteína de ligação ao hormônio da tireóide regulada por NADP com proteína Mu | X | |||
| Q15063 | Precursor de periostina | X | X | X | X |
| Q15084 | Protómero de proteína dissulfureto isomerase A6 | X | |||
| Q15113 | Precollador potenciador 1 de endopeptidase de Procollagen C | X | |||
| Q15181 | Pirofosfatase inorgânica | X | |||
| Q15365 | Proteína 1 de ligação de poli-rC | X | |||
| Q15366 | PolyRC binding protein 2 | X | |||
| Q15582 | Transformar a proteína induzida por beta do factor de crescimento | X | X | X | |
| Q15819 | Enzima conjugadora de ubiquitina E2 variante 2 | X | |||
| Q16352 | Interligação alfa | X | |||
| Q16473 | XTA de tenascação putativa | X | |||
| Q16555 | Proteína relacionada com dihidropirimidinase 2 | X | X | X | |
| Q16698 | 2 4 dienoyl CoA redutase precursor mitocondrial | X | |||
| Q16891 | Membrana interna mitocondrial | X | |||
| Q562R1 | Beta actina como a proteína 2 | X | |||
| Q6S8J3 | POTE ankyrin domain family member E | X | |||
| Q6UWY5 | Olfactomedin como precursor de proteína 1 | X | X | ||
| Q71U36 | Cadeia de tubulina alfa 1A | X | X | X | |
| Q7Z7G0 | Alvo do precursor Nesh SH3 | X | X | X | |
| Q8WUM4 | Mortalidade celular programada 6 proteína interagindo | X | |||
| Q8WWX9 | Thioredoxin como precursor de selenoproteína M | X | |||
| Q92597 | Proteína NDRG1 | X | |||
| Q92945 Proteína 2 de ligação do elemento amplo a montante | X | ||||
| Q96CN7 | Domínio de isoorismatase contendo proteína 1 | X | |||
| Q96CX2 | BTB POZ domínio contendo proteína | X | |||
| Q96KK5 | Histona H2A tipo 1 H | X | X | ||
| Q96KP4 | Dipeptidase não específica citosólica | X | |||
| Q99426 | Chaperone específico de tubulina B | X | |||
| Q99497 | Protein DJ 1 | X | X | ||
| Q99536 | Proteína de membrana de vesícula sináptica | X | X | X | |
| Q99714 | 3 hidroxiacil na CoA desidrogenase tipo 2 | X | |||
| Q99715 | Colágeno alfa 1 cadeia XII | X | X | ||
| Q99798 | Aconitate hydratase mitochondrial precursor | X | |||
| Q9BQE3 | Tubulina alfa 6 cadeia | X | |||
| Q9BUF5 | Tubulina beta 6 cadeia | X | X | ||
| Q9BUT1 | 3 hidroxibutirato desidrogenase de tipo 2 | X | |||
| Q9BVA1 | Cadeia de tubulina beta 2B | X | X | X | |
| Q9BXN1 | Asporin | X | X </ Td> | X | X |
| Q9H0W9 | Ester hydrolase C11orf54 | X | |||
| Q9H4B7 | Tubulina beta 1 | X | |||
| Q9NRN5 | Olfactomedina como precursor de proteína 3 | X | X | ||
| Q9NRV9 | Proteína 1 de ligação de Heme | X | |||
| Q9NSB2 | Queratin tipo II cuticular Hb4 | X | X | ||
| Q9NVA2 | Sept 11 | X | |||
| Q9UBR2 | Precursor de catepsina Z | X | |||
| Q9UBX5 | Fibulin 5 | X | X | ||
| Q9UK22 | Caixa F apenas proteína 2 | X | |||
| Q9Y277 | Proteína de canal seletivo de ani dependente de tensão 3 | X | |||
| Q9Y281 | Cofilin 2 | X | |||
| Q9Y490 | Talin 1 | X | |||
| Q9Y696 | Proteína 4 do canal intracelular de cloreto | X | |||
| Q9Y6C2 | EMILIN 1 | X | X |
Tabela 1: Lista das proteínas identificadas no extracto de tecido da válvula mitral quando foram aplicadas quatro abordagens proteômicas diferentes: eletroforese bidimensional (2-DE), LC-MS E bidimensional (2D-LC / MS E ), LC / MS E e IEF em fase líquida. O método pelo qual cada proteína foi identificada é relatado.
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Discussion
Um passo crítico deste protocolo é o uso de nitrogênio líquido para congelar a amostra e refrigerar o sistema de moagem. O uso de nitrogênio líquido evita a degradação biológica e permite o pulverização eficiente, mas requer treinamento específico para um manuseio seguro.
Neste protocolo apresenta um sistema de moagem para moagem de amostras porque pequenas amostras são difíceis de recuperar de argamassa e pilão padrão. Neste caso, pequenas amostras se espalham como um pó fino sobre a superfície da argamassa, tornando a coleta difícil. Outra vantagem é que o moedor é motorizado, o que permite que um maior número de amostras seja processado de forma reprodutível e sem fadiga adicionada. Uma limitação no uso de um moedor é que o tamanho da amostra que deve ser pequeno (100 mg ou menos) para que o pilão seja pressionado efetivamente contra a argamassa. Além disso, os componentes do moedor devem ser aquecidos até a temperatura ambiente entre as utilizações para limpeza G. Conseqüentemente, o procedimento é demorado e, se muitas amostras são processadas diariamente, são necessários muitos conjuntos.
Um passo crítico adicional é a preparação do buffer de extração. As concentrações de sal, especialmente para a ureia (8 M) e a tioureia (2 M), são bastante elevadas; Assim, o volume de sal é quase metade do volume total da solução. Além disso, a dissolução não é fácil considerando que o calor deve ser evitado porque, a mais de 37 ° C, a ureia pode levar à carbamilação de proteínas no terminal N de proteínas / péptidos e nos grupos amino de cadeia lateral de resíduos de lisina e arginina 17 . Uma vez dissolvido, o tampão de ureia deve ser filtrado com filtros de 0,22 μm e pode ser armazenado a -80 ° C por 4 semanas sem afetar a sua eficácia de extração, mas deve ser aquecido a mais de 15 ° C antes da utilização para permitir a dissolução completa .
Modificações e solução de problemas
Neste protocolo, a extração de proteína é realizada usando o tampão de ureia descrito, porque é uma das soluções de extração de proteína mais utilizadas para estudos proteômicos devido à sua compatibilidade com a isofefocalização e sua eficiência na solubilização de proteínas pouco solúveis 18. Foi Demonstraram que este tampão pode solubilizar de forma muito eficiente proteínas pouco solúveis, como proteínas de membrana integrais 19 ou proteínas que são altamente propensas a agregação, como a tubulina 18. Além disso, esse tampão é totalmente compatível com o ensaio de Bradford para determinar a concentração de proteína e Pode ser usado diretamente em 2-DE e em análises de IEF em fase líquida.No entanto, este tampão não é ideal para a solubilização de todas as proteínas presentes numa amostra. É possível que diferentes buffers de extração possam revelar proteínas indetectáveis por este protocolo. Por exemplo, é bomSe as proteínas ribossómicas e nucleares puderem ser melhor extraídas com extração de ácido ou precipitação de ácido tricloroacético / acetona 20 , enquanto que os níveis de pH alcalino são mais adequados para as proteínas da membrana 21 , 22 . Portanto, o uso de tampões alternativos pode exigir etapas adicionais para a precipitação de proteínas para eliminar os sais que interferem com 2-DE ou IEF de fase líquida.
Limitações da técnica
O número de proteínas identificadas por este protocolo é relativamente baixo, mas o número de identificações e a cobertura da análise proteômica podem ser aumentados através do uso de instrumentos mais modernos, cuja precisão em massa e velocidade de seqüência aumentaram dramaticamente nos últimos anos 23. É possível cobrir uma grande parte do proteoma, sem etapas de pré-tração, empregando um gradiente longo para líquidosSeparações de romatografia, juntamente com um instrumento de MS de alta resolução que possui uma velocidade de seqüenciamento rápida 24 .
Significado da técnica em relação aos métodos existentes / alternativos
A capacidade de identificar e quantificar proteínas nas válvulas cardíacas humanas, como a válvula mitral, é uma tarefa importante e desafiadora que ajudará a elucidar os mecanismos de processos fisiológicos / patológicos em doenças valvulares. Definir as mudanças do proteoma valvar mitral irá aumentar a compreensão da natureza dos processos biológicos que estão associados com o estado da doença do tecido.
O conhecimento atual sobre a fisiopatologia da valva mitral é limitado e geralmente obtido através da análise de proteínas individuais envolvidas em processos específicos, como remodelação da matriz extracelular, hemostasia, inflamação ou estresse oxidativo 25 9 , 10 .
A falta de estudos proteômicos abrangentes pode ser atribuída à complexidade deste tecido de baixa celularidade que é altamente rico em proteínas da matriz extracelular ( ie, proteoglicanos, colágeno e elastina). Essas proteínas representam cerca de 80% da quantidade total, dificultando a análise de proteínas de baixa abundância 26 .
Assim, foi necessário estabelecer um protocolo de extração eficiente para maximizar a solubilização de proteínas para descrever o proteoma desse tecido. Este protocolo permitiu a extração de ~ 50 μg de proteína a partir de 1 mg de tecido. Este é um rendimento relativamente baixo em comparação com o tecido "macio", comoComo fígado (~ 135 μg de 1 mg de tecido), mas é suficiente para realizar uma análise de proteína em amostras individuais. Isto é particularmente relevante quando se define a variabilidade intra-individual de um fenômeno.
Além disso, este método tem a vantagem de ser compatível com muitas aplicações analíticas. As proteínas da válvula mitral dissolvidas no tampão de extração proposto podem ser usadas diretamente para imunotransferência e análise proteômica com base em eletroforese bidimensional e isoeletroforese em fase líquida 11 , 12 ou, após a precipitação da proteína para eliminar a interferência do componente tampão, para outros ensaios, tais como Espectrometria de massa isenta de gel 15 .
Com a aplicação deste protocolo de extração, uma caracterização mais exaustiva dos componentes protéicos do tecido valvar mitral normal foi obtida através da identificação de muitos intracelosProteínas larulares. Estas proteínas estão localizadas no citossolo ou nas organelas, não apenas na matriz extracelular, e possuem diferentes funções moleculares e biológicas. Outras proteínas interessantes ( ie, CryAB , septin-11, FHL-1 e dermatopontina) também foram identificadas. Essas proteínas têm funções desconhecidas na valva mitral, mas suas propriedades biológicas sugerem um possível papel nas doenças valvulares.
Futuras aplicações ou direções depois de dominar esta técnica
Com este protocolo, é possível correlacionar dados relativos à expressão da proteína com dados sobre a expressão quantitativa de mRNA e análises imuno-histoquimáticas não quantitativas. Na verdade, quando usados em conjunto, essas abordagens levarão a uma compreensão mais abrangente dos mecanismos moleculares subjacentes à doença, do mRNA à modificação da proteína pós-tradução. Assim, este método pode ser de interesse para pesquisadores focados na fisiopatologia da válvula cardíaca. FinEste protocolo também pode ser aplicado à válvula mitral porcina, que tem uma estreita semelhança com a válvula 27 humana e é utilizada como modelo experimental para a avaliação da função valvular.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O Ministério da Saúde italiano apoiou este estudo (RC 2013-BIO 15). Agradecemos a Barbara Micheli por sua excelente assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
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