Summary
La composición proteica de la válvula mitral humana sigue siendo parcialmente desconocida, debido a que su análisis se complica por baja celularidad y por lo tanto por biosíntesis baja en proteínas. Este trabajo proporciona un protocolo para la extracción eficiente de proteínas para el análisis del proteoma de la válvula mitral.
Abstract
El análisis del proteoma celular puede ayudar a dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades debido al desarrollo de tecnologías que permiten la identificación y cuantificación a gran escala de las proteínas presentes en sistemas biológicos complejos. El conocimiento adquirido a partir de un enfoque proteómico puede conducir potencialmente a una Una mejor comprensión de los mecanismos patogénicos subyacentes a las enfermedades, permitiendo la identificación de nuevos marcadores diagnósticos y de pronóstico de enfermedad y, esperamos, de objetivos terapéuticos. Sin embargo, la válvula mitral cardiaca representa una muestra muy desafiante para el análisis proteómico debido a la baja celularidad en el proteoglicano y en la matriz extracelular enriquecida con colágeno. Esto hace que sea difícil extraer proteínas para un análisis proteómico global. Este trabajo describe un protocolo que es compatible con el posterior análisis de proteínas, tales como la proteómica cuantitativa y immunoblotting. Esto puede permitir la correlación de los datosG expresión de la proteína con datos sobre la expresión cuantitativa mRNA y no cuantitativos inmunohistoquímica análisis. De hecho, estos enfoques, cuando se realizan juntos, conducirá a una comprensión más completa de los mecanismos moleculares subyacentes a las enfermedades, desde mRNA a la modificación de la proteína post-traducción. Por lo tanto, este método puede ser relevante para los investigadores interesados en el estudio de la fisiopatología de la válvula cardíaca.
Introduction
La evidencia reciente ha alterado la comprensión de los papeles de los muchos mecanismos reguladores que ocurren después de la síntesis del mRNA. De hecho, los procesos de traslación, post-transcripción y proteolíticos pueden regular la abundancia y la función de las proteínas. El dogma - que dice que las concentraciones de mRNA son proxies a las de las proteínas correspondientes, suponiendo que los niveles de transcripción son el principal determinante de la abundancia de proteínas - ha sido parcialmente revisado. De hecho, los niveles de transcripción sólo parcialmente predecir abundancia de proteínas, lo que sugiere que post- Ocurren para regular las proteínas dentro de las células 1 , 2 .
Además, las proteínas dictan en última instancia la función de la célula y por lo tanto dictan su fenotipo, que puede experimentar cambios dinámicos en respuesta a los factores autocrinos, parácrinos y endocrinos; Mediadores sanguíneos; temperatura; Tratamiento farmacológico; Y la enfermedad se desarrollanCión. Por lo tanto, un análisis de la expresión centrado en el nivel de proteína es útil para caracterizar el proteoma y para desentrañar los cambios críticos que se le ocurren como parte de la patogénesis de la enfermedad [ 3] .
Por lo tanto, las oportunidades que presenta la proteómica para aclarar las condiciones de salud y enfermedad son formidables, a pesar de los desafíos tecnológicos existentes. Las áreas de investigación particularmente prometedoras a las que la proteómica puede contribuir incluyen: la identificación de la expresión alterada de la proteína a cualquier nivel ( es decir, células enteras o tejidos, compartimentos subcelulares y fluidos biológicos); La identificación, verificación y validación de nuevos biomarcadores útiles para el diagnóstico y pronóstico de la enfermedad; Y, con suerte, la identificación de nuevas proteínas objetivo que se pueden utilizar con fines terapéuticos, así como para la evaluación de la eficacia de los medicamentos y la toxicidad [ 4] .
Capturar la complejidad deEl proteoma representa un desafío tecnológico. Las herramientas proteómicas actuales ofrecen la oportunidad de realizar análisis a gran escala y de alto rendimiento para la identificación, cuantificación y validación de niveles alterados de proteínas. Además, la introducción de técnicas de fraccionamiento y enriquecimiento, destinadas a evitar la interferencia causada por las proteínas más abundantes, también ha mejorado la identificación de proteínas mediante la inclusión de las proteínas menos abundantes. Finalmente, la proteómica se ha complementado con el análisis de las modificaciones postraduccionales, que progresivamente emergen como importantes moduladores de la función de las proteínas.
Sin embargo, la preparación de la muestra y la recuperación de proteínas en los especímenes biológicos en análisis siguen siendo los pasos limitantes en el flujo de trabajo proteómico y aumentar el potencial de posibles trampas [ 5] . De hecho, en la mayoría de las técnicas de biología molecular que deben ser optimizadas, los primeros pasos son homogenizat de tejidoIon y lisis celular, especialmente durante el análisis de proteínas de baja abundancia para las que no existen métodos de amplificación. Además, la naturaleza química de las proteínas puede influir en su propia recuperación. Por ejemplo, el análisis de proteínas altamente hidrófobas es muy difícil, ya que fácilmente precipitan durante el enfoque isoeléctrico, mientras que las proteínas trans-membrana son casi insolubles (revisado en la Referencia 5). Además, la variabilidad de la composición del tejido crea una barrera significativa para desarrollar un método de extracción universal. Finalmente, debido a que casi todos los especímenes clínicos son de cantidad limitada, es esencial para permitir la preparación de proteínas con máxima recuperación y reproducibilidad de cantidades mínimas de muestra [ 6] .
Este trabajo describe un protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral cardiaca humana normal, que representa una muestra muy desafiante para el análisis proteómico. La válvula mitral normal es un compLex estructura situada entre la aurícula izquierda y el ventrículo izquierdo del corazón ( Figura 1 ]. Desempeña un papel importante en el control del flujo sanguíneo desde la aurícula hasta el ventrículo, evitando el reflujo y asegurando el nivel adecuado de suministro de oxígeno a todo el cuerpo, manteniendo así un adecuado gasto cardíaco. Sin embargo, a menudo se considera que es un tejido "inactivo", con una baja celularidad y pocos componentes, principalmente en la matriz extracelular. Esto se debe a que, en condiciones normales, las células valvulares intersticiales residentes (VICs) presentan un fenotipo quiescente con una baja tasa de biosíntesis de proteínas [ 7] .
Sin embargo, se ha demostrado que, en un estado patológico, el número de VICs en la esponja aumenta y su síntesis de proteínas se activa, junto con otros cambios funcionales y fenotípicos [ 8] . Por lo tanto, no es sorprendente que los datos mínimosLa literatura se centra en el análisis de las válvulas mitológicas patológicas 9,10, en las que el aumento del número de VIC activados podría explicar el número relativamente elevado de proteínas identificadas.
En conclusión, el presente protocolo puede servir para desarrollar la comprensión de los mecanismos patógenos responsables de las enfermedades de la válvula mitral a través del estudio de los componentes de la válvula valvular mitral. De hecho, una mayor comprensión de los procesos patológicos subyacentes podría ayudar a mejorar el manejo clínico de las enfermedades valvulares, cuyas indicaciones actuales para la intervención se basan principalmente en consideraciones hemodinámicas.
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Protocol
En este protocolo, los corazones humanos se recogen durante la explanación multiorganizada (tiempo de isquemia fría de 4 a 12 h, media ± 6 h ± 2 h) de donantes de múltiples órganos excluidos del trasplante de órganos por razones técnicas o funcionales, a pesar de los parámetros ecocardiográficos normales. Se envían al Banco de Tejidos Cardiovascular de Milán, Centro Cardiológico de Monzino (Milán, Italia) para la banca de las válvulas aórtica y pulmonar. Los folíolos mitrales posteriores no se utilizan con fines clínicos, por lo que se recogen durante el aislamiento de la válvula aórtica y pulmonar después de obtener el consentimiento informado de los familiares de los donantes. El tejido para el trasplante y la investigación se recopila sólo después del consentimiento de los padres; En la hoja de consentimiento, autorizan (o no) el uso del tejido cardíaco para investigación sólo si no es adecuado para el uso clínico humano ( es decir, problemas microbiológicos, funcionales y serológicos), siguiendo las directrices del comité de ética deCentro Cardiológico de Monzino.
1. Preparación de la válvula mitral
- Cosechar la válvula mitral humana tan pronto como sea posible después de la explicación del órgano (tiempo de isquemia fría de 4-12 h).
- En una habitación limpia, retire el corazón de la bolsa de transporte que contenga una solución fría (4 ° C) ( es decir, una solución salina o medio balanceado Eurocollins o Wisconsin). Colóquelo en un cubo y colóquelo en un gabinete de bioseguridad (flujo de aire vertical de riesgo biológico, clase A, clasificación de Buenas Prácticas de Manufactura (GMP)) para proceder con la preparación de la válvula.
- Coloque el corazón sobre un paño desechable estéril en el gabinete. Usando un bisturí desechable estéril, corte el corazón completamente, perpendicularmente a su eje principal, a nivel de los ventrículos izquierdo y derecho, a unos 4 cm del ápice.
- Mueva la aorta ascendente y la arteria pulmonar para mostrar el techo de la aurícula izquierda.
- Con fórceps y picos esterilizados en autoclave, corte alrededor de la aurícula izquierdaEl túnel de la aurícula izquierda, haciendo visible la válvula mitral y permitiendo identificar el gran folíolo mitral (anterior) y el pequeño folíolo mitral (posterior).
NOTA: Las comisuras antero-lateral y medial posterior definen el borde del folíolo anterior y el área posterior. - Usando tijeras esterilizables en autoclave y fórceps no traumáticos, disecar la aurícula izquierda y el grosor de la pared del ventrículo alrededor de la circunferencia de toda la válvula mitral .
- Identificar la continuidad de la válvula mitro-aórtica.
NOTA: El ventrículo izquierdo contiene toda la válvula mitral y los acordes. - Separar el folíolo valvar mitral anterior del folíolo mitral posterior, cortando el folíolo posterior a lo largo de la inserción con el ventrículo (comisura).
- Lave el folíolo posterior en la solución salina. Cortar el folleto en trozos pequeños (<1 cm 2 ) y envolverlos individualmente en papel de aluminio. Snap-freeze con nitrógeno líquido.
Precaución: Siga los procedimientos de seguridad de la organización cuando use nitrógeno líquido.- Desinfectar la mesa del gabinete con una solución de alcohol isopropílico al 70% y una solución de peróxido de hidrógeno al 6% al final del procedimiento.
2. Extracción de proteínas
- Utilice un fórceps para recoger la muestra almacenada en nitrógeno líquido e inmediatamente colóquela en hielo seco mientras esté envuelta en el papel de aluminio. No deje la muestra descongelar durante las transferencias.
- Antes de la molienda, enfríe el mortero de porcelana / zirconio y los pilones de un sistema de molienda ( por ejemplo, CryoGrinder), junto con la muestra, poniéndolos en un matraz de Dewar que contiene nitrógeno líquido (~ 500 ml).
Precaución: Siga los procedimientos de seguridad de la organización cuando use nitrógeno líquido. - Ponga el mortero y las majas en una caja de poliestireno que contiene hielo seco. Retire la muestra de la lámina de aluminio y póngala en el mortero.
- MolerÉl muestra con el mortero grande contra el mortero 15-20 veces, con el destornillador para girar el mortero. Mezclar la muestra con la punta de una espátula pre-enfriada durante el proceso de molienda.
- Repita con el pequeño mortero.
- Transfiera la muestra molida a un tubo previamente pesado ( p. Ej., Tubo de centrífuga de 15 ml), invirtiendo el tubo, colocándolo sobre el mortero e invirtiéndolo para mover la muestra al tubo. Utilice una espátula previamente enfriada para recuperar todo el material del mortero.
- Mantenga el tubo con la muestra en hielo seco para evitar la descongelación de la muestra durante la transferencia.
- Calcular el peso neto de la muestra.
- Limpiar el mortero y los pilones después de cada muestra y descontaminarlos en autoclave o calentarlos a 200 ° C durante 2 h.
- Transferir la muestra en polvo del tubo de centrífuga al tubo de vidrio de un homogeneizador por inversión.
- Añadir filtro de urea filtrada(8 M de urea, 2 M de tiourea, 4% p / v de CHAPS, 20 mM de Tris y 55 mM de ditiotreitol) al tubo de vidrio, 200 mu l de tampón de urea por cada 10 mg de tejido en polvo.
NOTA: La muestra residual en polvo que queda en el tubo de centrífuga puede recuperarse utilizando parte del volumen calculado de tampón de urea. - Homogeneizar la muestra utilizando un agitador equipado con un mortero de vidrio borosilicato y un pilón de politetrafluoroetileno (PTFE). Presione lentamente el mazo sobre la muestra con un movimiento de torsión (1.500 rpm) 10 veces.
- Recuperar el sobrenadante y transferirlo a un tubo de centrífuga limpio de 1,7 ml. Extraer de nuevo la muestra restante con tampón de urea fresco, añadiendo la mitad del volumen utilizado durante la primera extracción.
- Repita el paso 2.10.
- Recuperar el sobrenadante y combinarlo con el sobrenadante de la etapa 2.11. Colocar el sobrenadante combinado en un rotador de tubo durante 30 min.
- Centrifugar el tubo durante 30 min a 13.000 xg y 4 ° C.
- Recuperar el sobrenadanteD medir la concentración de proteína usando el ensayo de proteína Bradford, según las instrucciones del fabricante. Guarde la muestra a -80 ° C hasta su uso.
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Representative Results
La extracción y disolución de proteínas en el tampón de urea es directamente compatible con los métodos proteómicos basados en el isoelectroenfoque (electroforesis bidimensional (2-DE) 11 y en el enfoque isoeléctrico en fase líquida (IEF) 12 ) y con inmunotransferencia después de la dilución en tampón Laemmli 13 Que contiene un cóctel inhibidor de proteasa 14 .
Para los métodos basados en espectrometría de masas libres de gel ( es decir, cromatografía líquida acoplada a análisis de espectrometría de masas independiente de datos (LC / MS E ) y LC / MS E bidimensional (2D-LC / MS E ) 15 , las muestras extraídas En el tampón de urea descrito deben tratarse adicionalmente para eliminar la urea y la tiourea, lo que podría interferir con la subsiguiente digestión de las proteínas y la separación por cromatografía líquida. EsteS puede llevarse a cabo usando los kits comerciales de precipitación de proteínas, siguiendo las instrucciones del fabricante para precipitar las proteínas. La muestra puede ser entonces disuelta en NH4HCO3 25 mM conteniendo detergentes escindibles al 0,1% para la digestión de proteínas 16 . La precipitación de las proteínas puede eliminar los componentes del tampón, afectando mínimamente el contenido de proteínas (recuperación de proteínas:> 85%), haciendo así que la muestra sea adecuada para cada tipo de análisis.
La aplicación de este protocolo para la extracción de proteínas de las válvulas mitrales humanas permitió la identificación de un total de 422 proteínas, la combinación de cuatro enfoques diferentes proteómica anteriormente descritos en detalle [ 11 , 15] . Específicamente, 169 proteínas fueron identificadas por 2-DE, 330 proteínas por fase líquida IEF, 96 proteínas por LC / MS E , y 148 proteínasPor 2D-LC / MS E (Tabla 1).
Para clasificar las 422 proteínas identificadas en términos de localización subcelular, se utilizó un software para el análisis de ontología génica (GO) ( por ejemplo, Cytoscape). La red creada con el software y su correspondiente plug-in mostró que, además de las proteínas esperadas localizadas en la región extracelular (ver la parte superior derecha de la Figura 2 ), la mayoría de las proteínas identificadas por los enfoques proteómicos eran de la región intracelular ( Es decir, citoplasma, organelos, vesículas y citoesqueleto). También se identificaron proteínas de la superficie celular ( Figura 2 ).
Los resultados fueron confirmados en tres muestras independientes valvula mitral. La inmunotransferencia se utilizó para analizar un grupo de cuatro proteínas ( es decir, septin-11, cuatro y medio LIM dominios de la proteína 1 (FHL-1), derMatopontin y alfa-cristalina B (CryAB)) que nunca han sido identificados en la válvula mitral normal ( Figura 3 ).
Figura 1: Estructura de la válvula mitral. Vista superior del corazón humano que muestra la válvula mitral humana cerrada ( A ) o abierta ( B ). Vista frontal del ventrículo izquierdo de un corazón humano ( C ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de las proteínas de la válvula mitral identificadas en términos de distribución celular. Cytoscape y el plugin BiNGO se utilizaron para obtaiN la distribución de términos de ontología génica (GO) a partir de las categorías de componentes celulares. El tamaño del círculo es proporcional al número de componentes de proteínas asociadas con los términos de GO seleccionados, y se informa de la escala de color para el valor de p de sobrerepresentación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de inmunotransferencia de septin-11, FHL-1, dermatopontina y CryAB en extracto completo de tres folíolos de válvula mitral normal humana. La inmunotransferencia se realizó usando anticuerpo monoclonal de ratón contra anticuerpos policlonales CryAB y conejo contra los anticuerpos septin-11, FHL-1 y dermatopontina. Por favorHaga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Adhesión | Descripción | 2-DE | 2D-LC | LC-MS E | Fase líquida IEF |
| A6NMZ7 | Colágeno alfa VI | x | |||
| O00151 | PDZ y la proteína 1 del dominio LIM | x | |||
| O00299 | Cloruro intracelular canal proteína 1 | x | |||
| O00764 | Piridoxal quinasa | x | |||
| O14558 | Proteína de choque térmico beta 6 | x | |||
| O43399 | Proteína del tumor D54 | x | |||
| O43488 | Aflatoxina B1 aldehído reductasa miembro 2 | x | |||
| O43707 | Alfa actinina 4 | x | x | ||
| O43866 | Antígeno CD5 como precursor | x | |||
| O60493 | Clasificación nexin 3 | x | |||
| O60701 | UDP glucosa 6 deshidrogenasa | x | |||
| O75223 | Proteína no caracterizada | x | |||
| O75368 | SH3 dominio de ácido glutámico rico en proteínas | x | |||
| O75390 | Citrato sintasa precursor mitocondrial | x | |||
| O75489 | NADH deshidrogenasa ubiquinona hierro sulfuro proteína 3 precursor mitocondrial | x | x | ||
| O75608 | Acil proteína tioesterasa 1 | x | |||
| O75828 | Carbonil reductasa NADPH 3 | x | |||
| O75874 | Isocitrato deshidrogenasa NADP citoplasmático | x | |||
| O75955 | Flotillin | x | |||
| O94760 | NG NG dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 1 | x | |||
| O94788 | Retinal deshidrogenasa 2 | x | |||
| O95865 | NG NG dimetilarginina dimetilaminohidrolasa 2 | x | x | ||
| P00325 | Alcohol deshidrogenasa 1B | x | x | ||
| P00338 | L lactato deshidrogenasa Una cadena | x | |||
| P00352 | Retinal deshidrogenasa 1 | x | |||
| P00441 | Superóxido dismutasa Cu Zn | x | x | ||
| P00450 | Precursor de la ceruloplasmina | x | x | ||
| P00488 | Factor de coagulación XIII Un precursor de cadena | x | |||
| P00491 | Nucleósido fosforilasa de purina | x | |||
| P00492 | Hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa | x | |||
| P00558 | Fosfoglicerato quinasa 1 | <Td> xx | x | ||
| P00568 | Adenilato quinasa isoenzima 1 | x | |||
| P00734 | Protrombina | x | x | ||
| P00738 | Haptoglobina | x | x | x | x |
| P00739 | Precursor de la proteína relacionada con la haptoglobina | x | |||
| P00751 | Factor de complemento B | x | x | x | |
| P00915 | Anhidrasa carbónica 1 | x | |||
| P00918 | Anhidrasa carbónica 2 | x | |||
| P01008 | Precursor de la antitrombina III | x | x | x | |
| P01009 | Alfa 1 antitripsina | x | x | x | x |
| P01011 | Antiquimotripsina Alfa 1 | x | x | x | x |
| P01019 | Precursor del angiotensinógeno | x | x | ||
| P01023 | Macroglobulina alfa 2 | x | x | ||
| P01024 | Complemento C3 | x | x | x | x |
| P01033 | Precursor del inhibidor de metaloproteinasa 1 | x | |||
| P01042 | Precinente de Kininogen 1 | x | |||
| P01593 | Ig cadena kappa región VI AG | x | |||
| P01598 | Ig kappa cadena VI región UE | x | |||
| P01600 | Ig cadena kappa VI región Hau | x | x | ||
| P01611 | Ig cadena kappa VI región Wes | x | |||
| P01620 | Ig cadena kappa V III región SIE | x | |||
| P01625 | Ig cadena kappa V IV región Len | x | |||
| P01766 | Ig cadena pesada V III región BRO | x | x | ||
| P01781 | Ig cadena V III región GAL | x | |||
| P01834 | Ig cadena kappa región C | x | x | x | x |
| P01842 | Ig lambda cadena C regiones | x | x | x | |
| P01857 | Ig gamma 1 cadena C región | x | x | x | x |
| P01859 | Ig gamma 2 cadena C región | x | x | x | x |
| P01860 | Ig gamma 3 cadena C región | x | x | x | |
| P01861 | Ig gamma 4 cadena C región | x | x | x | |
| P01871 | Ig cadena mu región C | x | x | x | |
| P01876 | Ig alfa 1 cadena C región | x | x | x | x |
| P01877 | Ig alfa 2 cadena C región | x | |||
| P02144 | Mioglobina | x | x | ||
| P02452 | Cadena alfa 1 del colágeno | x | x | x | x |
| P02511 | Cadena B de cristalina alfa | x | |||
| P02545 | Lamin AC 70 kDa lamin | x | x | x | x |
| P02647 | Apolipoproteína AI | x | x | x | x |
| P02649 | Apolipoproteína E | x | x | x | x |
| P02671 | Fibrinógeno cadena alfa | x | x | x | x |
| P02675 | Fibrinógeno beta-cadena | x | x | x | x |
| P02679 | Cadena gamma de fibrinógeno | x | x | x | x |
| P02689 | Proteína P2 de mielina | x | |||
| P02735 | Amiloide sérica Un precursor de la proteína | x | |||
| P02741 | Precursor de la proteína C reactiva | x | |||
| P02743 | Componente P del amiloide sérico | x | x | x | x |
| P02746 | Complemento Subunidad B del subcomponente C1q | x | x | ||
| P02747 | Complemento C1q Subcomponente subunidad C precursor | x | |||
| P02748 | Complemento componente C9 | x | x | x | |
| P02749 | Beta 2 glicoproteína 1 | x | x | x | x |
| P02750 | Precursor de la glicoproteína alfa 2 rica en leucina | x | |||
| P02751 | Fibronectina | x | x | ||
| P02760 | Precursor de la proteína AMBP | x | x | x | x |
| P02763 | Alfa 1 glucoproteína ácida 1 | x | x | x | |
| P02765 | Precursor de la glucoproteína Alfa 2 HS | x | |||
| P02766 | Precursor de la transtiretina | x | x | x | |
| P02768 | Albúmina de suero | x | x | x | x |
| P02774 | Precursor de la proteína de unión a la vitamina D | x | |||
| P02787 | Serotransferrina | x | x | x | x |
| P02788 | Precursor de la Lactotransferrina | x | |||
| P02790 | Hemopexina | x | x | x | x |
| P02792 | Cadena ligera de ferritina | x | |||
| P04004 | Vitronectina | x | x | x | x |
| P04075 | Fructosa bisfosfato aldolasa A | x | |||
| P04083 | Anexina A1 | x | x | x | x |
| P04179 | Superóxido dismutasa Mn precursor mitocondrial | x | |||
| P04196 | Precursor de la glicoproteína rica en histidina | x | |||
| P04217 | Precursor de la glucoproteína Alfa 1B | x | x | ||
| P04350 | Tubulina beta 4 cadena | x | |||
| P04406 | Gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa | x | x | x | x |
| P04792 | Proteína de choque térmico beta 1 | x | x | x | x |
| P05091 | Aldehído deshidrogenasa precursor mitocondrial | x | x | ||
| Precursor del inhibidor C1 de la proteasa plasmática | x | ||||
| P05156 | Precursor del factor I del complemento | x | |||
| P05413 | Corazón de proteínas de unión a ácidos grasos | x | |||
| P05452 | Tetranectin precursor TN | x | x | ||
| P05787 | Queratina tipo II citoesquelético 8 | x | |||
| P06396 | Gelsolin | x | x | x | x |
| P06576 | Subunidad de ATP sintasa beta precursora mitocondrial | x | x | ||
| P06732 | Tipo de creatina quinasa M | x | x | ||
| P06733 | Alfa alfa | x | x | x | x |
| P06753 | Tropomiosina cadena alfa 3 | x | x | ||
| P07108 | Proteína de unión de Acyl CoA | x | |||
| P07195 | Cadena L lactato deshidrogenasa | x | x | x | |
| P07196 | Polipéptido ligero de Neurofilamento | x | |||
| P07197 | Polipéptido medio de neurofilamento | x | x | ||
| P07237 | Precursor de la disulfuro de isomerasa de la proteína | x | x | ||
| P07339 | Precursor de la catepsina D | x | x | ||
| P07355 | Anexina A2 | x | x | x | x |
| P07360 | Componente de complemento C8 precursor de la cadena gamma | x | |||
| P07437 | Tubulina cadena beta | x | x | x | x |
| P07585 | Decorin | x | x | x | x |
| P07737 | Profilin 1 | x | |||
| P07858 | Precursor de la catepsina B | x | |||
| P07900 | Proteína de choque térmico HSP 90 alfa | x | x | ||
| P07951 | Tropomiosina beta | x | |||
| P07954 | Fumarato hidratasa precursor mitocondrial | x | |||
| P07996 | Trombospondina 1 | x | x | x | |
| P08107 | Proteína de 70 kDa de choque térmico 1A 1B | x | x | x | x |
| P08123 | Cadena alfa 2 I de colágeno | x | x | x | x |
| P08133 | Annexin A6 | x | x | ||
| P08238 | Proteína de choque térmico HSP 90 beta | x | x | ||
| P08253 | Precursor de colagenasa tipo IV de 72 kDa | x | |||
| P08294 | Superóxido dismutasa extracelular Cu Zn precUrsor | x | x | x | |
| P08590 | Polipéptido ligero de miosina 3 | x | x | ||
| P08603 | Factor de complemento H | x | x | x | x |
| P08670 | Vimentina | x | x | x | x |
| P08729 | Queratina tipo II citoesquelético 7 | x | |||
| P08758 | Anexina A5 | x | x | x | x |
| P09211 | Glutatión S transferasa P | x | x | x | |
| P09382 | Galectina 1 | x | x | x | |
| P09417 | Dihidropteridina reductasa | <Td> | x | ||
| P09493 | Tropomiosina 1 cadena alfa | x | x | ||
| P09525 | Anexo A4 | x | x | ||
| P09651 | La ribonucleoproteína A1 nuclear heterogénea | x | |||
| P09871 | Complemento C1s subcomponente precursor | x | |||
| P09936 | Ubiquitina carboxil terminal hidrolasa isoenzima L1 | x | |||
| P09972 | Fructosa bisfosfato aldolasa C | x | |||
| P0C0L4 | Complemento C4 A precursor | x | |||
| P0CG05 | Yo GLambda 2 cadenas C regiones | x | |||
| P0CG38 | POTE miembro de la familia del dominio ankyrin I | x | |||
| P10515 | El componente de la acetiltransferasa del residuo de dihidrolipoylisina del complejo piruvato deshidrogenasa | x | |||
| P10768 | S formilglutatión hidrolasa | x | |||
| P10809 | Precursor mitocondrial de proteína de choque térmico de 60 kDa | x | |||
| P10909 | Clúster en | x | x | x | x |
| P10915 | El hialuronano y el proteoglicano unen el precursor de la proteína 1 | x | x | ||
| P11021 | 78 kDa gProteína regulada por lucosa | x | x | x | |
| P11047 | Subunidad de la laminina gamma 1 precursor | x | |||
| P11142 | Proteína cognoscitiva de choque térmico de 71 kDa | x | x | x | x |
| P11177 | Piruvato deshidrogenasa E1 componente subunidad beta mitocondrial precursor | x | |||
| P11217 | Forma del glucógeno fosforilasa muscular | x | |||
| P11310 | Precursor mitocondrial específico de la cadena acıl CoA deshidrogenasa | x | |||
| P11413 | Glucosa 6 fosfato 1 deshidrogenasa | x | |||
| P11766 | Cadena de chi de la deshidrogenasa de la clase 3 del alcohol | x | |||
| P12036 | Neurofilamento polipéptido pesado | x | |||
| P12109 | Colágeno alfa 1 VI cadena | x | x | x | x |
| P12110 | Colágeno alfa 2 VI cadena | x | x | x | x |
| P12111 | Colágeno alfa 3 VI cadena | x | x | x | |
| P12277 | Tipo de creatina quinasa B | x | |||
| P12429 | Anexina A3 | x | x | ||
| P12814 | Alfa actinina 1 | x | x | ||
| P12829 | Polipéptido ligero de miosina 4 | x | |||
| P12882 | Miosina 1 | x | |||
| P12883 | Miosina 7 | x | x | ||
| P12955 | Xaa Pro dipeptidasa | x | |||
| P13489 | Inhibidor de la ribonucleasa | x | |||
| P13533 | Miosina 6 | x | x | ||
| P13611 | Precursor de proteína central de Versican | x | x | ||
| P13639 | Factor de elongación 2 | x | |||
| P13716 | Delta aminolevulinic acid dehydratase | x | |||
| P13796 | Plastin 2 | x | |||
| P13804 | Subunidad de la flavoproteína de transferencia de electrones precursor mitocondrial alfa | x | |||
| P13929 | Beta enolasa | x | x | ||
| P14136 | Astrócito de proteína ácida fibrilar glial | x | |||
| P14314 | Precursor de la subunidad beta de la glucosidasa 2 | x | |||
| P14550 | Alcohol deshidrogenasa NADP | x | |||
| P14618 | Isoenzimas de piruvato quinasa M1 M2 | x | x | x | |
| P14625 </ Td> | Precursor de la Endoplasmina | x | x | ||
| P15121 | Aldosa reductasa | x | |||
| P15259 | Phosphoglycerate mutase 2 | x | |||
| P16152 | Carbonil reductasa NADPH 1 | x | |||
| P17066 | Proteína de 70 kDa de choque térmico 6 | x | x | x | |
| P17174 | Aspartato aminotransferasa citoplasmática | x | |||
| P17540 | Precursor mitocondrial sarcomérico de la creatina quinasa | x | |||
| P17661 | Desmin | x | x | x | x |
| P17980 | 26S subunidad reguladora de proteasa 6A | x | |||
| P17987 | T subunidad alfa compleja de la proteína 1 | x | |||
| P18206 | Vinculina | x | x | ||
| P18428 | Precursor de la proteína de unión al lipopolisacárido | x | |||
| P18669 | Phosphoglycerate mutase 1 | x | |||
| P19105 | Cadena ligera reguladora de miosina 2 | x | x | ||
| P19623 | Spermidina sintasa | x | |||
| P19652 | Alfa 1 glucoproteína ácida 2 precursor | x | x | ||
| P19823 | Inhibidor de tripsina Inter, cadena pesada H2 | x | |||
| P19827 | Inhibidor de tripsina inter, cadena pesada H1 | x | x | ||
| P20073 | Anexina A7 | x | |||
| P20618 | Precursor de la subunidad beta tipo 1 de la proteasa | x | |||
| P20774 | Mimecan | x | x | x | x |
| P21266 | Glutatión S transferasa Mu 3 | x | |||
| P21333 | Filamina A | x | x | ||
| P21796 | Proteína del canal selectivo del anión dependiente del voltaje1 | x | |||
| P21810 | Bigwincan | x | x | x | x |
| P21980 | Proteína glutamina gamma glutamiltransferasa 2 | x | x | ||
| P22105 | Tenascin X | x | x | ||
| P22314 | La enzima activadora de la ubiquitina E1 | x | |||
| P22352 | Precursor de la glutatión peroxidasa 3 | x | x | ||
| P22626 | Las ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas A2 B1 | x | |||
| P22695 | Ubiquinol citocromo c reductasa complejo núcleo proteína 2 precursor mitocondrial | x | |||
| P23141 | Precursor de la carboxilesterasa 1 del hígado | x | |||
| P23142 | Fibulina 1 | x | x | x | x |
| P23284 | Precursor de la peptidil prolyl cis trans isomerasa B | x | |||
| P23381 | Tryptophanyl tRNA sintetasa citoplasmática | x | |||
| P23526 | Adenosilhomocisteasa | x | x | ||
| P23528 | Cofilin 1 | x | |||
| P24752 | Acetil CoA acetiltransferasa precursor mitocondrial | x | |||
| P25311 | Zinc alpha 2 glycoproteiPrecursor | x | |||
| P25705 | Subunidad de la ATP sintasa alfa mitocondrial | x | |||
| P25788 | Subunidad de proteasa subtipo alfa tipo 3 | x | x | ||
| P25789 | Subunidad de proteasa subtipo alfa tipo 4 | x | |||
| P26447 | Proteína S100 A4 | x | |||
| P27348 | 14 3 3 proteína teta | x | x | ||
| P27797 | Precursor de la calreticulina | x | |||
| P28066 | Subunidad de proteasa subtipo alfa tipo 5 | x | |||
| P28070 | <Td> Precursor de la subunidad beta de tipo 4 de proteasomax | x | |||
| P28072 | Precursor de la subunidad beta tipo 6 de la proteasa | x | |||
| P28074 | Subunidad de proteasa subtipo beta 5 precursor | x | |||
| P28331 | NADH ubiquinona oxidorreductasa subunidad de 75 kDa precursor mitocondrial | x | |||
| P28838 | Citosol aminopeptidasa | x | |||
| P29218 | Inositol monofosfatasa | x | |||
| P29401 | Transketolasa | x | |||
| P29692 | Delta de factor de elongación 1 | <Td> | x | ||
| P29966 | Substrato de cinasa C rico en alanina miristoilada | x | |||
| P30040 | Proteína reticular endoplasmática ERp29 precursor | x | |||
| P30041 | Peroxirredoxina 6 | x | x | ||
| P30043 | Flavin reductasa | x | |||
| P30044 | Precursor mitocondrial de peroxiredoxina 5 | x | |||
| P30085 | UMP CMP quinasa | x | |||
| P30086 | Proteína de unión a fosfatidiletanolamina 1 | x | |||
| P30101 | ProteiN disulfuro isomerasa A3 precursor | x | x | x | |
| P30613 | Isoenzimas de piruvato quinasa RL | x | |||
| P30740 | Inhibidor de elastasa de leucocitos | x | |||
| P31025 | Lipocalin 1 precursor | x | |||
| P31937 | 3 hidroxiisobutirato deshidrogenasa precursor mitocondrial | x | |||
| P31942 | La ribonucleoproteína H3 heterogénea | x | |||
| P31943 | La ribonucleoproteína H nuclear heterogénea | x | |||
| P31946 | 14 3 3 proteína beta alfa | x | x | ||
| P31948 | La fosfoproteína 1 inducida por estrés | x | |||
| P31949 | Proteína S100 A11 | x | |||
| P32119 | Peroxiredoxina 2 | x | x | ||
| P34931 | Calor choque 70 kDa proteína 1 como | x | x | ||
| P34932 | Proteína de choque térmico 70 kDa 4 | x | |||
| P35232 | Prohibitina | x | |||
| P35237 | Serpin B6 | x | |||
| P35443 | Trombospondina 4 | x | </ Tr> | ||
| P35555 | Fibrilina 1 | x | x | ||
| P35579 | Miosina 9 | x | x | x | |
| P35580 | Miosina 10 | x | x | ||
| P35609 | Alfa actinina 2 | x | |||
| P35625 | Inhibidor de metaloproteinasa 3 | x | x | ||
| P35998 | 26S subunidad reguladora de la proteasa 7 | x | |||
| P36871 | Fosfoglucomutasa 1 | x | x | ||
| P36955 | Factor derivado del epitelio pigmentario | x | x | ||
| P37802 | <Td> Transgelin 2x | x | |||
| P37837 | Transaldolasa | x | |||
| P38117 | Subunidad beta de la flavoproteína de transferencia de electrones | x | |||
| P38646 | Estrés 70 proteína precursora mitocondrial | x | x | ||
| P39687 | Miembro de la familia A de la familia de la fosfoproteína nuclear rica en leucina A | x | |||
| P40121 | Proteína capsuladora de macrófagos | x | |||
| P40925 | Malato deshidrogenasa citoplasmática | x | |||
| P40926 | Precursor mitocondrial malato deshidrogenasa | <Td> | x | ||
| P41219 | Periférico | x | |||
| P42330 | Aldo keto reductasa familia 1 miembro C3 | x | |||
| P45880 | Anión dependiente del voltaje canal selectivo proteína 2 | x | |||
| P47755 | F subunidad α 2 de la proteína capsuladora de la actina | x | x | ||
| P47756 | Subunidad beta de la proteína de bloqueo de la actina beta | x | x | ||
| P47985 | Ubiquinol citocromo c reductasa hierro subunidad de azufre precursor mitocondrial | x | |||
| P48047 | Precursor mitocondrial de la subunidad ATP sintasa O | x | |||
| P48637 | Glutatión sintetasa | x | |||
| P48741 | Proteína de 70 kDa de choque térmico 7 | x | x | ||
| P49189 | 4 trimetilaminobutiraldehído deshidrogenasa | x | |||
| P49368 | T complejo de la subunidad gamma de la proteína 1 | x | |||
| P49747 | Proteína de matriz oligomérica de cartílago | x | x | x | x |
| P49748 | Precursor mitocondrial de acyl CoA deshidrogenasa de cadena muy larga | x | |||
| P50395 | Rab inhibidor de la disociación del PIB beta | x | X </ Td> | ||
| P50454 | Precursor de Serpin H1 | x | |||
| P50995 | Anexoin A11 | x | |||
| P51452 | Proteína fosfatasa de especificidad dual 3 | x | |||
| P51884 | Lumican | x | x | x | x |
| P51888 | Prolargin precursor | x | x | x | x |
| P52565 | Rho GDP inhibidor de disociación 1 | x | |||
| P52566 | Rho GDP inhibidor de disociación 2 | x | |||
| P54652 | Proteína de 70 kDa relacionada con el choque térmico 2 | x | x | x | x |
| P55072 | Retículo endoplasmático transicional ATPasa | x | |||
| P55083 | Precursor de la glicoproteína 4 asociada a microfibrilas | x | x | ||
| P57053 | Histona H2B tipo F | x | |||
| P60174 | Trifosfato isomerasa | x | x | x | |
| P60660 | Polipéptido ligero de miosina 6 | x | x | ||
| P60709 | Actina citoplasmática 1 | x | x | x | x |
| P60981 | Destrin | x | |||
| P61086 | Ecuación de conjugación de ubiquitina E2 25 kDa | x | |||
| P61088 | Enzima de conjugación de ubiquitina E2 | x | |||
| P61224 | Ras proteína relacionada con Rap 1b precursor | x | |||
| P61978 | La ribonucleoproteína K heterogénea | x | x | ||
| P61981 | 14 3 3 proteína gamma | x | x | x | |
| P62258 | 14 3 3 proteína epsilon 14 3 3E | x | |||
| P62491 | Proteína relacionada con Ras | x | |||
| P62714 | Serone treonina proteína fosfatasa 2A subunidad catalítica beta isoforma | x | |||
| P62736 | Actina músculo liso aórtico | x | x | x | |
| P62805 | Histona H4 | x | |||
| P62826 | La proteína nuclear de unión al GTP funcionó | x | |||
| P62873 | Guanina proteína de unión de nucleótidos GIGSGT subunidad beta 1 | x | |||
| P62879 | Guanina proteína de unión de nucleótidos GIGSGT subunidad beta 2 | x | |||
| P62937 | Peptidil prolyl cis trans isomerasa A | x | x | ||
| P62987 | Ubiquitina 60S proteína ribosomal L40 | x | |||
| P63104 | 14 3 3 proTein zeta delta | x | x | x | x |
| P63241 | Factor de iniciación de la traducción eucariótica 5A 1 | x | |||
| P63244 | Subunidad beta 2 de proteína de unión a nucleótidos de guanina como 1 | x | |||
| P63267 | Actina gamma músculo liso entérico | x | x | ||
| P67936 | Tropomiosina cadena alfa 4 | x | |||
| P68032 | Actina alfa del músculo cardiaco 1 | x | |||
| P68104 | Factor de elongación 1 alfa 1 | x | x | x | |
| P68133 | Actin alfa músculo esquelético | ||||
| P68363 | Tubulina cadena alfa 1B | x | x | x | |
| P68371 | Tubulina beta 2C cadena | x | x | x | |
| P68402 | Factor activador de plaquetas acetilhidrolasa IB subunidad beta | x | |||
| P68871 | Subunidad beta de la hemoglobina | x | x | x | |
| P69905 | Subunidad alfa de la hemoglobina | x | x | ||
| P78371 | T complejo proteína 1 subunidad beta | x | |||
| P78417 | Glutatión transferasa omega 1 | x | x | ||
| P80748 | Ig lambda cadena VIII región LOI | x | |||
| P98095 | Fibulina 2 | x | x | ||
| Q01082 | Cerebro de la cadena beta de Spectrin 1 | x | |||
| Q01449 | Cadena ligera reguladora de miosina 2 isoforma auricular | x | |||
| Q01518 | Adenylyl cyclase associated protein 1 | x | |||
| Q01995 | Transgelin Proteína del músculo liso 22 alfa | x | |||
| Q03252 | Lamin B2 | x | x | ||
| Q03591 | Factor de complemento H relacionado con la proteína 1 precursor | x | Q04917 | 14 3 3 proteína eta | x | x |
| Q06323 | Subunidad 1 del complejo activador del proteasoma | x | |||
| Q06828 | Fibromodulina | x | x | x | x |
| Q06830 | Peroxiredoxina 1 | x | x | ||
| Q07507 | Dermatopontin | x | x | x | x |
| Q07960 | Proteína activadora de Rho GTPasa 1 | x | |||
| Q08257 | Quinone oxidorreductasa | x | |||
| Q08431 | Lactadherina | x | x | ||
| Q12765 | SEcernin 1 | x | |||
| Q13011 | Delta 3 5 Delta 2 4 dienoil CoA isomerasa precursor mitocondrial | x | x | ||
| Q13228 | Selenium binding protein 1 | x | x | ||
| Q13404 | La enzima de conjugación de ubiquitina E2 variante 1 | x | |||
| Q13409 | Dineína citoplasmática 1 cadena intermedia 2 | x | |||
| Q13509 | Tubulina beta 3 cadena | x | x | x | |
| Q13642 | Cuatro y medio LIM dominios proteína 1 | x | |||
| Q13765 | La subunidad alfa asociada al polipéptido naciente | x | |||
| P13885 | N Tubulina beta 2A cadena | x | x | ||
| Q14194 | Proteína relacionada con la dihidropirimidinasa 1 | x | |||
| Q14195 | Proteína relacionada con la dihidropirimidinasa 3 | x | x | x | x |
| Q14624 | Precursor H4 de la cadena pesada inhibidor de la tripsina inter | x | |||
| Q14697 | Precursor de la alfa glucosidasa AB neutra | x | |||
| Q14764 | Mayor proteína de bóveda | x | |||
| Q14767 | Factor de crecimiento transformante latente beta proteína de unión 2 | x | <Td>x | ||
| Q14894 | Mu cristalin homólogo NADP regulado hormona tiroidea proteína de unión | x | |||
| Q15063 | Periostin precursor | x | x | x | x |
| Q15084 | Precursor de proteína disulfuro isomerasa A6 | x | |||
| Q15113 | Procollagen C endopeptidase enhancer 1 precursor | x | |||
| Q15181 | Pirofosfatasa inorgánica | x | |||
| Q15365 | Proteína de unión a Poly rC 1 | x | |||
| Q15366 | Proteína de unión a Poly rC 2 | x | |||
| Q15582 | Factor de crecimiento de transformación proteína inducida por beta | x | x | x | |
| Q15819 | La enzima de conjugación de ubiquitina E2 variante 2 | x | |||
| Q16352 | Intersexo alfa | x | |||
| Q16473 | Putativo tenascin XA | x | |||
| Q16555 | Proteína relacionada con la dihidropirimidinasa 2 | x | x | x | |
| Q16698 | 2 4 dienoyl CoA reductasa precursor mitocondrial | x | |||
| Q16891 | Membrana interna mitocondrial | x | |||
| Q562R1 | Beta actina como la proteína 2 | x | |||
| Q6S8J3 | POTE ankyrin dominio miembro de la familia E | x | |||
| Q6UWY5 | Precursor de la proteína 1 similar a la olfactomedina | x | x | ||
| Q71U36 | Tubulina cadena alfa 1A | x | x | x | |
| Q7Z7G0 | Objetivo del precursor Nesh SH3 | x | x | x | |
| Q8WUM4 | Proteína que interactúa con la muerte celular programada 6 | x | |||
| Q8WWX9 | Thioredoxin como selenoprotein M precursor | x | |||
| Q92597 | Proteína NDRG1 | x | |||
| Q92945 Proteína 2 de enlace de elemento aguas arriba | x | ||||
| Q96CN7 | Isochorismatase dominio que contiene la proteína 1 | x | |||
| Q96CX2 | Dominio BTB POZ que contiene proteína | x | |||
| Q96KK5 | Histona H2A tipo 1 H | x | x | ||
| Q96KP4 | Dipeptidasa citosólica inespecífica | x | |||
| Q99426 | Tubulina específica chaperona B | x | |||
| Q99497 | Protein DJ 1 | x | x | ||
| Q99536 | Proteína de la membrana vesicular sináptica | x | x | x | |
| Q99714 | 3 hidroxiacilo CoA deshidrogenasa tipo 2 | x | |||
| Q99715 | Colágeno alfa 1 XII cadena | x | x | ||
| Q99798 | Precursor mitocondrial de Aconitate hidratase | x | |||
| Q9BQE3 | Tubulina cadena alfa 6 | x | |||
| Q9BUF5 | Tubulina beta 6 cadena | x | x | ||
| Q9BUT1 | 3 hidroxibutirato deshidrogenasa tipo 2 | x | |||
| Q9BVA1 | Tubulina beta 2B cadena | x | x | x | |
| Q9BXN1 | Asporin | x | X </ Td> | x | x |
| Q9H0W9 | Ester hidrolasa C11orf54 | x | |||
| Q9H4B7 | Tubulina beta 1 cadena | x | |||
| Q9NRN5 | Precursor de la proteína 3 similar a la olfactomedina | x | x | ||
| Q9NRV9 | Heme proteína de unión 1 | x | |||
| Q9NSB2 | Queratina tipo II cuticular Hb4 | x | x | ||
| Q9NVA2 | Septin 11 | x | |||
| Q9UBR2 | Precursor de la catepsina Z | x | |||
| Q9UBX5 | Fibulina 5 | x | x | ||
| Q9UK22 | F sólo caja proteína 2 | x | |||
| Q9Y277 | Proteína del canal selectivo del anión dependiente del voltaje 3 | x | |||
| Q9Y281 | Cofilin 2 | x | |||
| Q9Y490 | Talin 1 | x | |||
| Q9Y696 | Cloruro intracelular canal proteína 4 | x | |||
| Q9Y6C2 | EMILIN 1 | x | x |
Tabla 1: Lista de las proteínas identificadas en el extracto de tejido valvular mitral cuando se aplicaron cuatro enfoques proteómicos diferentes: electroforesis bidimensional (2-DE), LC-MS E bidimensional (2D-LC / MS E ), LC / MS E y IEF en fase líquida. Se describe el método mediante el cual se identificó cada proteína.
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Discussion
Un paso crítico de este protocolo es el uso de nitrógeno líquido para congelar la muestra y enfriar el sistema de molienda. El uso de nitrógeno líquido evita la degradación biológica y permite una pulverización eficiente, pero requiere entrenamiento específico para una manipulación segura.
En este protocolo cuenta con un sistema de molienda para la molienda de la muestra debido a que las pequeñas muestras son difíciles de recuperar de mortero estándar y pilones. En este caso, las pequeñas muestras se diseminan como un polvo fino sobre la superficie del mortero, dificultando la recolección. Otra ventaja es que la amoladora está motorizada, lo que permite procesar un mayor número de muestras de una manera reproducible y sin fatiga adicional. Una limitación en el uso de un molino es que el tamaño de la muestra que debe ser pequeño (100 mg o menos) para que el mazo sea presionado eficazmente contra el mortero. Además, los componentes del molino deben calentarse a temperatura ambiente entre los usos para limpiar gramo. En consecuencia, el procedimiento consume mucho tiempo y, si se procesan muchas muestras diariamente, se necesitan muchos conjuntos.
Un paso crítico adicional es la preparación del tampón de extracción. Las concentraciones de sal, especialmente para la urea (8 M) y la tiourea (2 M), son bastante altas; Por lo tanto, el volumen de sal es casi la mitad del volumen total de la solución. Además, la disolución no es fácil considerando que se debe evitar el calor porque, a más de 37ºC, la urea puede conducir a la carbamilación de proteínas en los terminales N de proteínas / péptidos y en los grupos amino de cadena lateral de residuos de lisina y arginina 17 . Una vez disuelto, el tampón de urea debe filtrarse con filtros de 0,22 μm y puede almacenarse a -80 ° C durante 4 semanas sin afectar su eficacia de extracción, pero debe calentarse a más de 15 ° C antes de su uso para permitir la disolución completa .
Modificaciones y solución de problemas
En este protocolo, la extracción de proteínas se realiza utilizando el tampón de urea descrito, ya que es una de las soluciones de extracción de proteínas más comúnmente utilizadas para estudios proteómicos debido a su compatibilidad con el isoelectroenfoque y su eficiencia en la solubilización de las proteínas escasamente solubles. Demostraron que este tampón puede solubilizar muy eficientemente las proteínas escasamente solubles, tales como las proteínas de membrana integral 19 , o las proteínas que son altamente propensas a la agregación, tales como la tubulina 18. Además, este tampón es totalmente compatible con el ensayo de Bradford para determinar la concentración de proteína y Puede ser utilizado directamente en 2-DE y en fase líquida IEF análisis.Sin embargo, este tampón no es ideal para la solubilización de todas las proteínas presentes en una muestra. Es posible que diferentes tampones de extracción podrían revelar proteínas indetectables por este protocolo. Por ejemplo, es bien conocidoWn que las proteínas ribosómicas y nucleares podrían ser mejor extraídos con extracción ácida o ácido tricloroacético / acetona precipitación [ 20] , mientras que los niveles de pH alcalino son más adecuados para las proteínas de membrana [ 21 , 22] . Por lo tanto, el uso de tampones alternativos podría requerir pasos adicionales para la precipitación de proteínas para eliminar sales que interfieren con 2-DE o IEF en fase líquida.
Limitaciones de la técnica
El número de proteínas identificadas por este protocolo es relativamente bajo, pero el número de identificaciones y la cobertura del análisis proteómico puede incrementarse aún más mediante el uso de instrumentos más modernos, cuya precisión de masa y velocidad de secuenciación han aumentado dramáticamente en los últimos años 23. Es posible cubrir una gran parte del proteoma, sin ninguna etapa de prefracción, empleando un gradiente largo para el líquidoRomatografía, junto con un instrumento MS de alta resolución que tiene una velocidad de secuenciación rápida 24 .
Significado de la técnica con respecto a los métodos existentes / alternativos
La capacidad de identificar y cuantificar proteínas en las válvulas cardíacas humanas, como la válvula mitral, es una tarea importante y desafiante que ayudará a dilucidar los mecanismos de los procesos fisiológicos / patológicos en las enfermedades valvulares. Definir los cambios del proteoma de la válvula mitral aumentará en gran medida la comprensión de la naturaleza de los procesos biológicos que están asociados con el estado de enfermedad del tejido.
El conocimiento actual sobre la fisiopatología de la válvula mitral es limitado y generalmente se obtiene a través del análisis de proteínas individuales implicadas en procesos específicos, tales como remodelación de la matriz extracelular, hemostasia, inflamación o estrés oxidativo. 9 , 10 .
La falta de estudios proteómicos completos puede atribuirse a la complejidad de este tejido de baja celularidad que es altamente rico en proteínas de la matriz extracelular ( es decir, proteoglicanos, colágeno y elastina). Estas proteínas representan alrededor del 80% de la cantidad total, dificultando el análisis de las proteínas de baja abundancia [ 26] .
Por lo tanto, fue necesario establecer un protocolo de extracción eficiente para maximizar la solubilización de proteínas con el fin de describir el proteoma de este tejido. Este protocolo permitió la extracción de ~ 50 μg de proteína de 1 mg de tejido. Este es un rendimiento relativamente bajo en comparación con el tejido "blando",Como el hígado (~ 135 μg de 1 mg de tejido), pero es suficiente para realizar un análisis de proteínas en muestras individuales. Esto es particularmente relevante cuando se define la variabilidad intraindividual de un fenómeno.
Además, este método tiene la ventaja de ser compatible con muchas aplicaciones analíticas. Las proteínas de la válvula mitral disueltas en el tampón de extracción propuesto pueden usarse directamente para la inmunotransferencia y el análisis proteómico basado en la electroforesis bidimensional y la isoelectroforesis en fase líquida 11 , 12 o, después de la precipitación de la proteína para eliminar la interferencia del componente tampón, para otros ensayos tales como Espectrometría de masas libre de gel 15 .
Con la aplicación de este protocolo de extracción, se ha obtenido una caracterización más exhaustiva de los componentes proteicos del tejido valvular mitral normal a través de la identificación de muchos componentes intracelularesLulares. Estas proteínas están localizadas en el citosol o en organelos, no sólo en la matriz extracelular, y tienen diferentes funciones moleculares y biológicas. También se identificaron otras proteínas interesantes ( es decir, CryAB, septin-11, FHL-1 y dermatopontin). Estas proteínas tienen funciones desconocidas en la válvula mitral, pero sus propiedades biológicas sugieren un posible papel en las enfermedades valvulares.
Aplicaciones o direcciones futuras después de dominar esta técnica
Con este protocolo, es posible correlacionar los datos relativos a la expresión de la proteína con datos sobre la expresión cuantitativa de mRNA y análisis no inmunohistoquímicos cuantitativos. De hecho, cuando se usan conjuntamente, estos enfoques llevarán a una comprensión más completa de los mecanismos moleculares subyacentes a la enfermedad, desde el mRNA a la modificación de la proteína post-traduccional. Por lo tanto, este método puede ser de interés para los investigadores centrados en la fisiopatología de la válvula cardíaca. AletaEste protocolo también se puede aplicar a la válvula mitral porcina, que se asemeja mucho a la válvula humana 27 y se utiliza como modelo experimental para la evaluación de la función de la válvula.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El Ministerio de Salud de Italia apoyó este estudio (RC 2013-BIO 15). Damos las gracias a Barbara Micheli por su excelente asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
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