Summary
Proteinkompositionen av den mänskliga mitralventilen är fortfarande delvis okänd, eftersom dess analys är komplicerad av låg celluläritet och därför genom låg proteinbiosyntes. Detta arbete ger ett protokoll för att effektivt extrahera protein för analys av mitralventilproteomen.
Abstract
Analys av det cellulära proteomet kan bidra till att belysa de molekylära mekanismer som ligger till grund för sjukdomar på grund av utvecklingen av teknik som möjliggör storskalig identifiering och kvantifiering av proteinerna som finns i komplexa biologiska system. Den kunskap som erhålls från ett proteomiskt tillvägagångssätt kan potentiellt leda till en Bättre förståelse för de patogena mekanismer som ligger till grund för sjukdomar, vilket möjliggör identifiering av nya diagnostiska och prognostiska sjukdomsmarkörer och förhoppningsvis av terapeutiska mål. Emellertid representerar hjärt mitralventilen ett mycket utmanande prov för proteomanalys på grund av den låga celluliteten i proteoglykan och kollagenberikad extracellulär matris. Detta gör det svårt att extrahera proteiner för en global proteomanalys. Detta arbete beskriver ett protokoll som är kompatibelt med efterföljande proteinanalys, såsom kvantitativ proteomik och immunoblottning. Detta kan möjliggöra korrelation av data omG-proteinuttryck med data om kvantitativt mRNA-uttryck och icke kvantitativ immunhistokemisk analys. Faktum är att dessa tillvägagångssätt, när de utförs tillsammans, kommer att leda till en mer övergripande förståelse av de molekylära mekanismerna som ligger bakom sjukdomar, från mRNA till posttranslationell proteinmodifiering. Således kan denna metod vara relevant för forskare som är intresserade av studien av hjärtfluid-fysiopatologi.
Introduction
Nya bevis har förändrat förståelsen av rollerna hos de många regleringsmekanismer som uppstår efter mRNA-syntes. I själva verket kan translations-, post-transkriptionella och proteolytiska processer reglera proteinöverflöd och -funktion. Dogmen - som säger att mRNA-koncentrationer är proxier mot de motsvarande proteinerna, förutsatt att transkriptnivåerna är huvudbestämmaren för proteinöverskridande - har delvis reviderats. Inledningsvis förutspår transkriptnivåer endast partiellt proteinöverflöd, vilket tyder på att post-transkriptionella händelser Förekommer för att reglera proteinerna i cellerna 1 , 2 .
Vidare dikterar proteiner i slutändan cellens funktion och dikterar därmed sin fenotyp, som kan genomgå dynamiska förändringar som svar på autokrina, parakrina och endokrina faktorer. Blodburna mediatorer; temperatur; Drogbehandling; Och sjukdomsutvecklingmenade. Således är en expressionsanalys inriktad på proteinnivån användbar för att karakterisera proteomen och att riva upp de kritiska förändringar som uppträder för den som en del av sjukdomspatogenes 3 .
Därför är de möjligheter som proteomik presenterar för att klargöra hälso- och sjukdomstillstånd formidabel trots de nuvarande tekniska utmaningarna. De särskilt lovande forskningsområden som proteomics kan bidra med omfattar: identifiering av förändrat proteinuttryck på vilken nivå som helst ( dvs hela celler eller vävnader, subcellulära fack och biologiska vätskor); Identifiering, verifiering och validering av nya biomarkörer användbara för diagnos och prognos av sjukdom; Och förhoppningsvis identifiering av nya proteinmål som kan användas för terapeutiska ändamål, liksom för bedömning av läkemedelseffektivitet och toxicitet 4 .
Fånga komplexiteten hosProteomen representerar en teknisk utmaning. De nuvarande proteomiska verktygen erbjuder möjlighet att utföra storskalig analys med hög genomströmning för identifiering, kvantifiering och validering av förändrade proteinnivåer. Dessutom har införandet av fraktionerings- och anrikningstekniker, som syftar till att undvika störningen orsakad av de mest rikliga proteinerna, förbättrat proteinidentifiering genom att inkludera de minst rikliga proteinerna. Slutligen har proteomics kompletterats med analysen av posttranslationella modifieringar, vilka gradvis framträder som viktiga modulatorer av proteinfunktion.
Provberedningen och proteinåtervinningen i de biologiska proverna som analyseras är emellertid fortfarande de begränsande stegen i det proteomiska arbetsflödet och ökar potentialen för möjliga fallgropar 5 . I själva verket är de första stegen i vävnadshomogenizat i de flesta molekylärbiologitekniker som måste optimerasJon och celllys, speciellt under analysen av proteiner med låg överensstämmelse för vilka amplifieringsmetoder inte existerar. Dessutom kan den kemiska naturen hos proteiner påverka sin egen återhämtning. Analysen av högt hydrofoba proteiner är till exempel mycket utmanande, eftersom de lätt fäller ut under isoelektrisk fokusering, medan trans-membranproteiner är nästan olösliga (ses i Referens 5). Dessutom skapar variationen i vävnadskompositionen en betydande barriär för att utveckla en universell extraktionsmetod. Slutligen, eftersom nästan alla kliniska prover är av begränsad mängd, är det väsentligt att möjliggöra proteinberedning med maximal återhämtning och reproducerbarhet från minimala provmängder 6 .
I det här arbetet beskrivs ett optimerat protokoll för proteinutvinning från den normala mitralventilen för mänsklig hjärt, vilket representerar ett mycket utmanande prov för proteomanalys. Den normala mitralventilen är en kompLexstrukturen ligger mellan vänstra atriumet och hjärtans vänstra kammare ( Figur 1 ). Det spelar en viktig roll i kontrollen av blodflödet från atriumet till ventrikeln, förhindrar återflöde och säkerställer den korrekta nivån av syreförsörjning till hela kroppen och därigenom upprätthålla en tillräcklig hjärtutgång. Det anses emellertid ofta vara en "inaktiv" vävnad, med låg celluläritet och få komponenter, huvudsakligen i den extracellulära matrisen. Detta beror på att, vid normala förhållanden, de invändiga valvulära interstitiella cellerna (VICs) presenterar en vilande fenotyp med en biosyntesfrekvens med låg protein 7 .
Det har emellertid visat sig att i ett patologiskt tillstånd ökar antalet VIC i spongiosa och deras proteinsyntes aktiveras tillsammans med andra funktionella och fenotypiska förändringar 8 . Därför är det inte förvånande att de minimala data som finns tillgängliga iLitteraturen fokuserar på analysen av patologiska mitralventiler 9 , 10 , där det ökade antalet aktiverade VIC kan förklara det relativt höga antalet identifierade proteiner.
Sammanfattningsvis kan föreliggande protokoll tjäna till att utveckla förståelsen för de patogena mekanismerna som är ansvariga för mitralventilsjukdomar genom studiet av mitralventilproteinkomponenter. En större förståelse för de underliggande patologiska processerna skulle kunna bidra till att förbättra den kliniska hanteringen av ventilsjukdomar, vars nuvarande indikationer för intervention i stor utsträckning beror på hemodynamiska överväganden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I det här protokollet samlas de mänskliga hjärtan under multipelexplantering (kall ischemi-tid på 4-12 h, medelvärde 6 ± 2 h) från multirorgdonorer som undantas från organtransplantation av tekniska eller funktionella skäl, trots normala ekokardiografiska parametrar. De skickas till hjärt- och kärlsjukdomar i Milano, Monzino Cardiologic Center (Milano, Italien) för bankering av aorta och lungventiler. De mitrala bakre broschyren används inte för kliniska ändamål, så de samlas in under aorta- och lungventilisoleringen efter informerat samtycke erhålls från givarnas släktingar. Vävnaden för transplantation och forskning samlas endast efter föräldrars medgivande. På godkännandebladet godkänner de (eller inte) användningen av hjärtvävnaden endast för forskning om den inte är lämplig för human klinisk användning ( dvs. mikrobiologiska, funktionella och serologiska problem) enligt de etiska kommitténs riktlinjerMonzino Cardiologic Center.
1. Mitralventilberedning
- Skörda den mänskliga mitralventilen så snart som möjligt efter organt explantation (kall iskemi tid 4-12 h).
- I ett rent rum, ta bort hjärtat från transportväskan innehållande en kall (4 ° C) lösning ( dvs. saltlösning eller balanserat medium Eurocollins eller Wisconsin). Lägg det i en hink och placera den i ett biosäkerhetsskåp (biohazard vertikalt luftflöde, klass A, Good Manufacturing Practices (GMP) klassificering) för att fortsätta med ventilförberedelsen.
- Placera hjärtat på ett sterilt engångsdraperi i skåpet. Använd en steril engångs skalpell, skär hjärtat helt vinkelrätt mot huvudaxeln, på nivån på vänster och höger ventrikel, ca 4 cm från toppunkten.
- Flytta den stigande aortan och lungartären för att visa det vänstra atriella taket.
- Med sterila autoklaverbara pincett och picks, klippa runt vänster öron påVänster atrielltak, vilket gör mitralventilen synlig och möjliggör identifiering av den stora mitralbroschyren (främre) och den lilla mitralbroschyren (bakre delen).
OBS: Antero-lateral och de bakre mediala kommissionerna definierar gränsen på den främre broschyren och den bakre delen. - Använd steril autoklaverbar sax och icke-traumatiska tångar, dissekera det vänstra atriumet och ventrikelväggens tjocklek runt omkretsen av hela mitralventilen .
- Identifiera mitro-aorta ventil kontinuitet.
OBS: Vänster ventrikel innehåller hela mitralventilen och ackorden. - Separera den främre mitralventilens bipacksedel från den bakre mitralventilens bipacksedel, skär den bakre bipacksedeln längs insatsen med ventrikeln (commissure).
- Tvätta den bakre bipacksedeln i saltlösningen. Klipp broschyren i små bitar (<1 cm 2 ) och vrid dem individuellt i aluminiumfolie. Snapfrysa dem med flytande kväve.
Varning: Följ de organisatoriska säkerhetsförfarandena vid användning av flytande kväve.- Sanitera skåpets bord med en 70% isopropylalkohollösning och en 6% väteperoxidlösning vid slutet av proceduren.
2. Protein extraktion
- Använd tång för att hämta provet som är lagrat i flytande kväve och placera det omedelbart på torris medan det fortfarande är insvept i aluminiumfolien. Låt inte provet tina under några överföringar.
- Innan slipningen kyler du porslin / zirkoniummortel och pistlar i ett kvarnsystem ( t.ex. CryoGrinder) , tillsammans med provet, genom att placera dem i en Dewar-kolv innehållande flytande kväve (~ 500 ml).
Varning: Följ de organisatoriska säkerhetsförfarandena vid användning av flytande kväve. - Sätt mortel och pistlar i en polystyrenlåda innehållande torris. Avlägsna provet från aluminiumfolien och sätt in det i morteln.
- Grind tHan provar med den stora stammen mot morteren 15-20 gånger, med skruvmejseln för att rotera pisteln. Blanda provet med spetsen av en förkyld spatel under slipningsprocessen.
- Upprepa med den lilla pisteln.
- Överför markprovet till ett tidigare vägt rör ( t.ex. 15 ml centrifugrör) genom att vrida röret, placera det över morteln och vrid dem ihop för att flytta provet till röret. Använd en förkyld spatel för att återvinna allt material från morteln.
- Håll röret med provet på torris för att undvika provtining under överföringen.
- Beräkna provets nettovikt.
- Rengör mortel och pestlar efter varje prov och dekontaminera dem genom autoklavering eller upphettning av dem vid 200 ° C i 2 timmar.
- Överför det pulveriserade provet från centrifugröret till glasröret i en homogenisator genom inversion.
- Tillsätt filtrerad ureabufféR (8 M urea, 2 M tiokarbamid, 4% vikt / volym CHAPS, 20 mM Tris och 55 mM ditiotreitol) till glasröret, 200 | il ureumbuffer för varje 10 mg pulveriserad vävnad.
OBS: Återstående pulverprov kvar i centrifugröret kan återvinnas med användning av en del av den beräknade volymen ureabuffert. - Homogenisera provet med en omrörare utrustad med en borosilikatglasmörtel och en polytetrafluoreten (PTFE) -pestel. Tryck långsamt på pesteln på provet med en vridningsrörelse (1500 rpm) 10 gånger.
- Återställ supernatanten och överför den till ett rent 1,7 ml centrifugrör. Igen extrahera det återstående provet med färsk ureabuffert och tillsätt hälften av volymen som användes under den första extraktionen.
- Upprepa steg 2.10.
- Återställa supernatanten och kombinera den med supernatanten från steg 2.11. Placera den kombinerade supernatanten på en rörrotator i 30 minuter.
- Centrifugera röret i 30 minuter vid 13 000 xg och 4 ° C.
- Återställ supernatanten anD mäta proteinkoncentrationen med hjälp av Bradford-proteinanalysen, enligt tillverkarens instruktioner. Förvara provet vid -80 ° C tills användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utvinningen och upplösningen av proteiner i ureabufferten är direkt kompatibel med proteomiska metoder baserade på isoelektrofokusering (tvådimensionell elektrofores (2-DE) 11 och isofektrisk fokusering av flytande fas (IEF) 12 ) och med immunoblottning efter utspädning i Laemmli buffert 13 Innehållande en proteasinhibitor cocktail 14 .
För gelfria masspektrometri-baserade metoder ( dvs. vätskekromatografi kopplad till dataoberoende masspektrometrianalys (LC / MS E ) och tvådimensionell LC / MS E (2D-LC / MSE)) 15 extraherades proverna I den beskrivna karbamidbufferten måste ytterligare behandlas för att eliminera urean och tiourea, som skulle kunna störa den efterföljande proteindeltningen och vätskekromatografiseparationen. ThiS avsaltningssteg kan åstadkommas med användning av de kommersiella proteinutfällningssatserna, enligt tillverkarens instruktioner för att fälla ut proteinerna. Provet kan sedan lösas i 25 mM NH4HCO3 innehållande 0,1% klyvbara detergenter för proteinmjälkning 16 . Utfällningen av proteinerna kan eliminera buffertkomponenter, vilket minimerar proteininnehållet (proteinåtervinning:> 85%), vilket gör provet lämpligt för varje typ av analys.
Tillämpningen av detta protokoll för proteinutvinning från humana mitralventiler tillåtes för identifiering av totalt 422 proteiner, vilket kombinerar fyra olika proteomikmetoder som tidigare beskrivits i detalj 11 , 15 . Specifikt identifierades 169 proteiner med 2-DE, 330 proteiner genom flytande fas IEF, 96 proteiner av LC / MS E och 148 proteinerMed 2D-LC / MS E (tabell 1).
För att klassificera de 422 identifierade proteinerna i termer av subcellulär lokalisering användes en programvara för gen-ontologi (GO) -analysen ( t.ex. Cytoscape). Nätverket skapat med mjukvaran och dess motsvarande plugin visade att förutom de förväntade proteinerna lokaliserade i den extracellulära regionen (se den övre högra delen av figur 2 ) var de flesta proteinerna som identifierades genom proteomiska tillvägagångssätten från den intracellulära regionen ( Dvs cytoplasma, organeller, vesiklar och cytoskelet). Cell-ytproteiner identifierades också ( Figur 2 ).
Resultaten bekräftades ytterligare i tre oberoende mitralventilprover. Immunoblotting användes för att analysera en grupp av fyra proteiner ( dvs septin-11, fyra och en halv LIM-domäner protein 1 (FHL-1), derMatopontin och alfa-kristallin B (CryAB)) som aldrig har identifierats i den normala mitralventilen ( Figur 3 ).
Figur 1: Mitralventilstruktur. Uppifrån av det mänskliga hjärtat som visar den slutna ( A ) eller öppna ( B ) mänskliga mitralventilen. Framifrån av vänstra kammaren i ett mänskligt hjärta ( C ). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Analys av de identifierade mitralventilproteinerna i termer av cellfördelning. Cytoscape och plugin BiNGO användes för att obtaiN fördelningen av gen ontologi (GO) termer från cellkomponentkategorierna. Cirkelstorleken är proportionell mot antalet proteinkomponenter associerade med de valda GO-termerna och färgskalan för p-värdet av överrepresentation rapporteras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Immunoblottningsanalys av septin-11, FHL-1, dermatopontin och CryAB i hel extrakt från tre humana normala mitralventilblad. Immunoblotting utfördes med användning av musmonoklonal antikropp mot CryAB och kaninpolyklonala antikroppar mot septin-11, FHL-1 och dermatopontinantikroppar. Snälla duKlicka här för att se en större version av denna figur.
| Anslutning | Beskrivning | 2-DE | 2D-LC | LC-MS E | Flytande fas IEF |
| A6NMZ7 | Collagen alfa VI | x | |||
| O00151 | PDZ- och LIM-domänprotein 1 | x | |||
| O00299 | Klorid intracellulärt kanalprotein 1 | x | |||
| O00764 | Pyridoxalkinas | x | |||
| O14558 | Värmchokprotein beta 6 | x | |||
| O43399 | Tumorprotein D54 | x | |||
| O43488 | Aflatoxin B1-aldehydreduktaselement 2 | x | |||
| O43707 | Alfa aktinin 4 | x | x | ||
| O43866 | CD5 antigen som föregångare | x | |||
| O60493 | Sortering av nexin 3 | x | |||
| O60701 | UDP glukos 6 dehydrogenas | x | |||
| O75223 | Okarakteriserat protein | x | |||
| O75368 | SH3-domänbindande glutaminsyra som är rik på protein | x | |||
| O75390 | Citratsyntas mitokondriell föregångare | x | |||
| O75489 | NADH dehydrogenas ubiquinon järn svavelprotein 3 mitokondriell föregångare | x | x | ||
| O75608 | Acylproteintioesteras 1 | x | |||
| O75828 | Karbonylreduktas NADPH 3 | x | |||
| O75874 | Isocitrat dehydrogenas-NADP-cytoplasmatisk | x | |||
| O75955 | Flotillin | x | |||
| O94760 | NG NG dimetylarginindimetylaminohydrolas 1 | x | |||
| O94788 | Retinal dehydrogenas 2 | x | |||
| O95865 | NG NG dimetylarginindimetylaminohydrolas 2 | x | x | ||
| P00325 | Alkohol dehydrogenas 1B | x | x | ||
| P00338 | L-laktatdehydrogenas A-kedjan | x | |||
| P00352 | Retinal dehydrogenas 1 | x | |||
| P00441 | Superoxiddismutas Cu Zn | x | x | ||
| P00450 | Ceruloplasminprekursor | x | x | ||
| P00488 | Koagulationsfaktor XIII En kedjeprekursor | x | |||
| P00491 | Purin nukleosid fosforylas | x | |||
| P00492 | Hypoxantin-guaninfosforibosyltransferas | x | |||
| P00558 | Fosfoglyceratkinas 1 | <td> xx | x | ||
| P00568 | Adenylatkinasisoenzym 1 | x | |||
| P00734 | protrombin | x | x | ||
| P00738 | haptoglobin | x | x | x | x |
| P00739 | Haptoglobinrelaterad proteinprekursor | x | |||
| P00751 | Komplementfaktor B | x | x | x | |
| P00915 | Karbonanhydras 1 | x | |||
| P00918 | Karbonanhydras 2 | x | |||
| P01008 | Antitrombin III prekursor | x | x | x | |
| P01009 | Alfa 1 antitrypsin | x | x | x | x |
| P01011 | Alfa 1 antichymotrypsin | x | x | x | x |
| P01019 | Angiotensinogenprekursor | x | x | ||
| P01023 | Alfa 2-makroglobulin | x | x | ||
| P01024 | Komplement C3 | x | x | x | x |
| P01033 | Metalloproteinashämmare 1 prekursor | x | |||
| P01042 | Kininogen 1 prekursor | x | |||
| P01593 | Ig kappakedja VI region AG | x | |||
| P01598 | Ig kappakedja VI region EU | x | |||
| P01600 | Ig kappa kedja VI region Hau | x | x | ||
| P01611 | Ig kappa-kedjan VI-regionen Wes | x | |||
| P01620 | Ig kappa-kedjan V III-regionen SIE | x | |||
| P01625 | Ig kappakedja V IV region Len | x | |||
| P01766 | Ig tung kedja V III region BRO | x | x | ||
| P01781 | Ig tungkedjig V III region GAL | x | |||
| P01834 | Ig kappakedjiga C-regionen | x | x | x | x |
| P01842 | Ig lambda kedje C regioner | x | x | x | |
| P01857 | Ig gamma 1-kedjegrupp C | x | x | x | x |
| P01859 | Ig-gamma 2-kedje C-regionen | x | x | x | x |
| P01860 | Ig gamma 3-kedja C-regionen | x | x | x | |
| P01861 | Ig-gamma 4-kedja C-regionen | x | x | x | |
| P01871 | Ig-mu-kedjans C-region | x | x | x | |
| P01876 | Ig alfa 1 kedjegrupp C | x | x | x | x |
| P01877 | Ig-alfa 2-kedjiga C-regionen | x | |||
| P02144 | myoglobin | x | x | ||
| P02452 | Kollagen alfa 1 I-kedja | x | x | x | x |
| P02511 | Alfa-kristallin B-kedja | x | |||
| P02545 | Lamin AC 70 kDa laminat | x | x | x | x |
| P02647 | Apolipoprotein Al | x | x | x | x |
| P02649 | Apolipoprotein E | x | x | x | x |
| P02671 | Fibrinogen alfa-kedja | x | x | x | x |
| P02675 | Fibrinogen beta-kedja | x | x | x | x |
| P02679 | Fibrinogen gamma kedja | x | x | x | x |
| P02689 | Myelin P2-protein | x | |||
| P02735 | Serumamyloid En proteinprekursor | x | |||
| P02741 | C-reaktivproteinprekursor | x | |||
| P02743 | Serumamyloid P-komponent | x | x | x | x |
| P02746 | Komplement C1q underkomponent subenhet B | x | x | ||
| P02747 | Komplement C1q subkomponent subenhet C prekursor | x | |||
| P02748 | Komplementkomponent C9 | x | x | x | |
| P02749 | Beta 2 glykoprotein 1 | x | x | x | x |
| P02750 | Leucinrik alfa 2 glykoproteinprekursor | x | |||
| P02751 | fibronektin | x | x | ||
| P02760 | AMBP-proteinprekursor | x | x | x | x |
| P02763 | Alfa 1-syra glykoprotein 1 | x | x | x | |
| P02765 | Alpha 2 HS glykoproteinprekursor | x | |||
| P02766 | Transthyretinprekursor | x | x | x | |
| P02768 | Serumalbumin | x | x | x | x |
| P02774 | Vitamin D-bindande proteinprekursor | x | |||
| P02787 | Serotransferrin | x | x | x | x |
| P02788 | Laktotransferrinprekursor | x | |||
| P02790 | hemopexin | x | x | x | x |
| P02792 | Ferritin lätt kedja | x | |||
| P04004 | vitronektin | x | x | x | x |
| P04075 | Fruktosobisfosfat aldolas A | x | |||
| P04083 | Bilaga A1 | x | x | x | x |
| P04179 | Superoxiddismutas Mn mitokondriell föregångare | x | |||
| P04196 | Histidinrik glykoproteinprekursor | x | |||
| P04217 | Alfa 1B glykoproteinprekursor | x | x | ||
| P04350 | Tubulin beta 4-kedja | x | |||
| P04406 | Glyceraldehyd 3 fosfat dehydrogenas | x | x | x | x |
| P04792 | Värmchokprotein beta 1 | x | x | x | x |
| P05091 | Aldehyddehydrogenas mitokondriell föregångare | x | x | ||
| Plasmaproteas Cl-inhibitorprekursor | x | ||||
| P05156 | Komplementfaktor I prekursor | x | |||
| P05413 | Fettsyrabindande proteinhjärta | x | |||
| P05452 | Tetranektinprekursor TN | x | x | ||
| P05787 | Keratin typ II cytoskeletalt 8 | x | |||
| P06396 | gelsolin | x | x | x | x |
| P06576 | ATP-syntas-subenhet beta-mitokondriell föregångare | x | x | ||
| P06732 | Kreatin-kinas M-typ | x | x | ||
| P06733 | Alfa enolas | x | x | x | x |
| P06753 | Tropomyosin alfa 3-kedjan | x | x | ||
| P07108 | Acyl CoA-bindande protein | x | |||
| P07195 | L-laktatdehydrogenas B-kedjan | x | x | x | |
| P07196 | Neurofilamentljuspolypeptid | x | |||
| P07197 | Neurofilamentmediumpolypeptid | x | x | ||
| P07237 | Proteindisulfidisomerasprekursor | x | x | ||
| P07339 | Cathepsin D föregångare | x | x | ||
| P07355 | Bilaga A2 | x | x | x | x |
| P07360 | Komplementkomponent C8 gammakedjeprekursor | x | |||
| P07437 | Tubulin beta-kedja | x | x | x | x |
| P07585 | dekorin | x | x | x | x |
| P07737 | Profilin 1 | x | |||
| P07858 | Cathepsin B prekursor | x | |||
| P07900 | Värmekokprotein HSP 90 alfa | x | x | ||
| P07951 | Tropomyosin beta-kedja | x | |||
| P07954 | Fumarathydratas mitokondriell föregångare | x | |||
| P07996 | Trombospondin 1 | x | x | x | |
| P08107 | Värmechock 70 kDa protein 1A IB | x | x | x | x |
| P08123 | Kollagen alfa 2 I-kedja | x | x | x | x |
| P08133 | Bilaga A6 | x | x | ||
| P08238 | Värmekokprotein HSP 90 beta | x | x | ||
| P08253 | 72 kDa typ IV-kollagenasprekursor | x | |||
| P08294 | Extracellulärt superoxid dismutas Cu Zn precursor | x | x | x | |
| P08590 | Myosin-ljuspolypeptid 3 | x | x | ||
| P08603 | Komplementfaktor H | x | x | x | x |
| P08670 | vimentin | x | x | x | x |
| P08729 | Keratin typ II cytoskeletal 7 | x | |||
| P08758 | Annexin A5 | x | x | x | x |
| P09211 | Glutation S transferas P | x | x | x | |
| P09382 | Galektin 1 | x | x | x | |
| P09417 | Dihydropteridinreduktas | <td> | x | ||
| P09493 | Tropomyosin 1 alfa-kedja | x | x | ||
| P09525 | Bilaga A4 | x | x | ||
| P09651 | Heterogent nukleärt ribonukleoprotein Al | x | |||
| P09871 | Komplement C1s delkomponentprekursor | x | |||
| P09936 | Ubiquitin karboxylterminal hydrolasisozym L1 | x | |||
| P09972 | Fructosebisfosfat aldolas C | x | |||
| P0C0L4 | Komplement C4 En prekursor | x | |||
| P0CG05 | IgLambda 2 kedje C regioner | x | |||
| P0CG38 | POTE ankyrin domän familjemedlem I | x | |||
| P10515 | Dihydrolipoyllysinrest-acetyltransferaskomponent av pyruvatdehydrogenaskomplex | x | |||
| P10768 | S-formylglutationhydrolas | x | |||
| P10809 | 60 kDa värmekokprotein mitokondriell föregångare | x | |||
| P10909 | klusterin | x | x | x | x |
| P10915 | Hyaluronan och proteoglykan länkprotein 1 prekursor | x | x | ||
| P11021 | 78 kDa gLukosreglerat protein | x | x | x | |
| P11047 | Laminin subunit gamma 1 prekursor | x | |||
| P11142 | Värmeschock kognitivt 71 kDa protein | x | x | x | x |
| P11177 | Pyruvat dehydrogenas E1-komponent subunit beta mitokondriell föregångare | x | |||
| P11217 | Glykogenfosforylasmuskelform | x | |||
| P11310 | Medelkedjespecifik acyl CoA dehydrogenas mitokondriell föregångare | x | |||
| P11413 | Glukos 6 fosfat 1 dehydrogenas | x | |||
| P11766 | Alkohol dehydrogenas klass 3 chi kedjan | x | |||
| P12036 | Neurofilament tung polypeptid | x | |||
| P12109 | Kollagen alfa 1 VI kedja | x | x | x | x |
| P12110 | Kollagen alfa 2 VI kedja | x | x | x | x |
| P12111 | Kollagen alfa 3 VI kedja | x | x | x | |
| P12277 | Kreatin-Kinas B-typ | x | |||
| P12429 | Bilaga A3 | x | x | ||
| P12814 | Alpha-aktinin 1 | x | x | ||
| P12829 | Myosin-ljuspolypeptid 4 | x | |||
| P12882 | Myosin 1 | x | |||
| P12883 | Myosin 7 | x | x | ||
| P12955 | Xaa Pro dipeptidas | x | |||
| P13489 | Ribonukleasinhibitor | x | |||
| P13533 | Myosin 6 | x | x | ||
| P13611 | Versican kärnproteinprekursor | x | x | ||
| P13639 | Förlängningsfaktor 2 | x | |||
| P13716 | Delta-aminolevulinsyradehydratas | x | |||
| P13796 | Plastin 2 | x | |||
| P13804 | Elektronöverföring-flavoprotein-subenhet alfa-mitokondriell föregångare | x | |||
| P13929 | Beta-enolas | x | x | ||
| P14136 | Glialfibrillär sur proteinastrocyt | x | |||
| P14314 | Glukosidas 2-subenhet beta-prekursor | x | |||
| P14550 | Alkohol dehydrogenas NADP | x | |||
| P14618 | Pyruvatkinas-isozymer M1 M2 | x | x | x | |
| P14625 </ Td> | Endoplasminprekursor | x | x | ||
| P15121 | Aldosreduktas | x | |||
| P15259 | Fosfoglyceratmutas 2 | x | |||
| P16152 | Karbonylreduktas NADPH 1 | x | |||
| P17066 | Värmechock 70 kDa protein 6 | x | x | x | |
| P17174 | Aspartataminotransferascytoplasmatisk | x | |||
| P17540 | Kreatinskinomerisk mitokondriell föregångare | x | |||
| P17661 | desmin | x | x | x | x |
| P17980 | 26S-proteasreglerande subenhet 6A | x | |||
| P17987 | T-komplex protein 1-subenhet alfa | x | |||
| P18206 | vinkulin | x | x | ||
| P18428 | Lipopolysackaridbindande proteinprekursor | x | |||
| P18669 | Fosfoglyceratmutas 1 | x | |||
| P19105 | Myosin regelbunden lätt kedja 2 | x | x | ||
| P19623 | Spermidin syntas | x | |||
| P19652 | Alfa 1-syra glykoprotein 2-prekursor | x | x | ||
| P19823 | Inter alfa trypsininhibitor tung kedja H2 | x | |||
| P19827 | Inter alfa trypsininhibitor tung kedja H1 | x | x | ||
| P20073 | Bilaga A7 | x | |||
| P20618 | Proteasome subunit beta-typ 1 prekursor | x | |||
| P20774 | Mimecan | x | x | x | x |
| P21266 | Glutathione S transferas Mu 3 | x | |||
| P21333 | Filamin A | x | x | ||
| P21796 | Spänningsberoende anjonselektivt kanalprotein1 | x | |||
| P21810 | biglykan | x | x | x | x |
| P21980 | Proteinglutamin-gamma-glutamyltransferas 2 | x | x | ||
| P22105 | Tenascin X | x | x | ||
| P22314 | Ubiquitin-aktiverande enzym E1 | x | |||
| P22352 | Glutationperoxidas 3 prekursor | x | x | ||
| P22626 | Heterogena nukleära ribonukleoproteiner A2 B1 | x | |||
| P22695 | Ubiquinol cytokrom c reduktas komplex kärnprotein 2 mitokondriell föregångare | x | |||
| P23141 | Leverkarboxylesteras 1 prekursor | x | |||
| P23142 | Fibulin 1 | x | x | x | x |
| P23284 | Peptidyl prolyl cis trans-isomeras B-prekursor | x | |||
| P23381 | Cytoplasmatisk tryptofanyl-tRNA-syntetas | x | |||
| P23526 | Adenosylhomocysteinase | x | x | ||
| P23528 | Cofilin 1 | x | |||
| P24752 | Acetyl CoA acetyltransferas mitokondriell föregångare | x | |||
| P25311 | Zink alfa 2 glykoproteiN föregångare | x | |||
| P25705 | ATP-syntas-subenhet alfa-mitokondrial | x | |||
| P25788 | Proteasom subunit alfa typ 3 | x | x | ||
| P25789 | Proteasom subunit alfa typ 4 | x | |||
| P26447 | Protein S100 A4 | x | |||
| P27348 | 14 3 3 proteinet theta | x | x | ||
| P27797 | Calreticulin prekursor | x | |||
| P28066 | Proteasom subunit alfa typ 5 | x | |||
| P28070 | <Td> Proteasome subunit beta-typ 4 prekursorx | x | |||
| P28072 | Proteasome subunit beta typ 6 prekursor | x | |||
| P28074 | Proteasome subunit beta typ 5 prekursor | x | |||
| P28331 | NADH ubiquinonoxidoreduktas 75 kDa subunit mitokondriell föregångare | x | |||
| P28838 | Cytosolaminopeptidas | x | |||
| P29218 | Inositolmonofosfatas | x | |||
| P29401 | transketolase | x | |||
| P29692 | Förlängningsfaktor 1 delta | <td> | x | ||
| P29966 | Myristoylerat alaninrikt C-kinasubstrat | x | |||
| P30040 | Endoplasmatisk retikulumprotein ERp29-prekursor | x | |||
| P30041 | Peroxiredoxin 6 | x | x | ||
| P30043 | Flavinreduktas | x | |||
| P30044 | Peroxiredoxin 5 mitokondriell föregångare | x | |||
| P30085 | UMP CMP-kinas | x | |||
| P30086 | Fosfatidyletanolaminbindande protein 1 | x | |||
| P30101 | ProteiN-disulfid-isomeras A3-prekursor | x | x | x | |
| P30613 | Pyruvatkinas-isozymer RL | x | |||
| P30740 | Leukocyt elastasinhibitor | x | |||
| P31025 | Lipokalin 1 prekursor | x | |||
| P31937 | 3-hydroxisobutyrat dehydrogenas mitokondriell föregångare | x | |||
| P31942 | Heterogent nukleärt ribonukleoprotein H3 | x | |||
| P31943 | Heterogent nukleärt ribonukleoprotein H | x | |||
| P31946 | 14 3 3 protein beta alfa | x | x | ||
| P31948 | Stressinducerat fosfoprotein 1 | x | |||
| P31949 | Protein S100 A11 | x | |||
| P32119 | Peroxiredoxin 2 | x | x | ||
| P34931 | Värmechock 70 kDa protein 1 som | x | x | ||
| P34932 | Värmechock 70 kDa protein 4 | x | |||
| P35232 | prohibitin | x | |||
| P35237 | Serpin B6 | x | |||
| P35443 | Trombospondin 4 | x | </ Tr> | ||
| P35555 | Fibrillin 1 | x | x | ||
| P35579 | Myosin 9 | x | x | x | |
| P35580 | Myosin 10 | x | x | ||
| P35609 | Alpha-aktinin 2 | x | |||
| P35625 | Metalloproteinashämmare 3 | x | x | ||
| P35998 | 26S-proteasreglerande subenhet 7 | x | |||
| P36871 | Fosfoglukomutas 1 | x | x | ||
| P36955 | Pigmentepitel-härledd faktor | x | x | ||
| P37802 | <Td> Transgelin 2x | x | |||
| P37837 | transaldolas | x | |||
| P38117 | Electron transfer flavoprotein subunit beta | x | |||
| P38646 | Stress 70 protein mitokondriell föregångare | x | x | ||
| P39687 | Syra-leucinrik nukleär fosfoprotein 32-familjemedlem A | x | |||
| P40121 | Makrofaghuggande protein | x | |||
| P40925 | Malat dehydrogenas cytoplasmatisk | x | |||
| P40926 | Malat dehydrogenas mitokondriell föregångare | <td> | x | ||
| P41219 | peripherin | x | |||
| P42330 | Aldo-keto-reduktasfamilj 1-medlem C3 | x | |||
| P45880 | Spänningsberoende anjonselektivt kanalprotein 2 | x | |||
| P47755 | F aktin capping protein subunit alfa 2 | x | x | ||
| P47756 | F aktin capping protein subunit beta | x | x | ||
| P47985 | Ubiquinol cytokrom c reduktas järn svavel subunit mitokondriell föregångare | x | |||
| P48047 | ATP-syntas O-subenhets mitokondriell föregångare | x | |||
| P48637 | Glutation syntetas | x | |||
| P48741 | Värmechock 70 kDa protein 7 | x | x | ||
| P49189 | 4 trimetylaminobutyraldehyddehydrogenas | x | |||
| P49368 | T-komplex protein 1-subenhet gamma | x | |||
| P49747 | Bruskoligomermatrisprotein | x | x | x | x |
| P49748 | Mycket långkedjig specifik acyl CoA dehydrogenas mitokondriell föregångare | x | |||
| P50395 | Rab GDP dissociation inhibitor beta | x | x </ Td> | ||
| P50454 | Serpin Hl prekursor | x | |||
| P50995 | Annexin A11 | x | |||
| P51452 | Dual specificity protein phosphatase 3 | x | |||
| P51884 | lumikan | x | x | x | x |
| P51888 | Prolargin föregångare | x | x | x | x |
| P52565 | Rho GDP-dissociationsinhibitor 1 | x | |||
| P52566 | Rho BNP-dissociationsinhibitor 2 | x | |||
| P54652 | Värmchockrelaterat 70 kDa protein 2 | x | x | x | x |
| P55072 | Transitional endoplasmatisk retikulum ATPas | x | |||
| P55083 | Mikrofibril associerad glykoprotein 4 prekursor | x | x | ||
| P57053 | Histon H2B typ F | x | |||
| P60174 | Triosfosfatisomeras | x | x | x | |
| P60660 | Myosin-ljuspolypeptid 6 | x | x | ||
| P60709 | Actin cytoplasmisk 1 | x | x | x | x |
| P60981 | Destrin | x | |||
| P61086 | Ubiquitin-konjugerande enzym E2 25 kDa | x | |||
| P61088 | Ubiquitin-konjugerande enzym E2 | x | |||
| P61224 | Rasrelaterad protein Rap 1b-prekursor | x | |||
| P61978 | Heterogent nukleärt ribonukleoprotein K | x | x | ||
| P61981 | 14 3 3 protein gamma | x | x | x | |
| P62258 | 14 3 3 protein-epsilon 14 3 3E | x | |||
| P62491 | Rasrelaterat protein | x | |||
| P62714 | Serin treoninprotein fosfatas 2A katalytisk subenhet beta isoform | x | |||
| P62736 | Actin aortisk slätmuskel | x | x | x | |
| P62805 | Histon H4 | x | |||
| P62826 | GTP-bindande kärnprotein Ran | x | |||
| P62873 | Guanin-nukleotidbindande protein GIGSGT-subenhet beta 1 | x | |||
| P62879 | Guaninukleotidbindande protein GIGSGT-subenhet beta 2 | x | |||
| P62937 | Peptidylprolyl cis-transisomeras A | x | x | ||
| P62987 | Ubiquitin 60S ribosomalt protein L40 | x | |||
| P63104 | 14 3 3 proTein zeta delta | x | x | x | x |
| P63241 | Eukaryotisk translationsinitieringsfaktor 5A 1 | x | |||
| P63244 | Guanin-nukleotidbindande proteinunderenhet beta 2 som 1 | x | |||
| P63267 | Actin gamma enterisk glattmuskel | x | x | ||
| P67936 | Tropomyosin alfa 4-kedjan | x | |||
| P68032 | Actin alfa-hjärtmuskel 1 | x | |||
| P68104 | Förlängningsfaktor 1 alfa 1 | x | x | x | |
| P68133 | Actin alfa skelettmuskel | ||||
| P68363 | Tubulin alfa 1B kedja | x | x | x | |
| P68371 | Tubulin beta 2C-kedja | x | x | x | |
| P68402 | Blodplättsaktiverande faktor acetylhydrolas IB subenhet beta | x | |||
| P68871 | Hemoglobin subunit beta | x | x | x | |
| P69905 | Hemoglobin subunit alfa | x | x | ||
| P78371 | T-komplex protein 1-subenhet beta | x | |||
| P78417 | Glutationtransferas omega 1 | x | x | ||
| P80748 | Ig lambda-kedjan VIII-regionen LOI | x | |||
| P98095 | Fibulin 2 | x | x | ||
| Q01082 | Spectrin beta kedja hjärna 1 | x | |||
| Q01449 | Myosin regulatorisk lätt kedja 2 atriell isoform | x | |||
| Q01518 | Adenylylcyklas associerat protein 1 | x | |||
| Q01995 | Transgelin Glatt muskelprotein 22 alfa | x | |||
| Q03252 | Lamin B2 | x | x | ||
| Q03591 | Komplementfaktor H relaterat protein 1 prekursor | x | Q04917 | 14 3 3 protein eta | x | x |
| Q06323 | Proteasomaktivator komplex subenhet 1 | x | |||
| Q06828 | fibromodulin | x | x | x | x |
| Q06830 | Peroxiredoxin 1 | x | x | ||
| Q07507 | Dermatopontin | x | x | x | x |
| Q07960 | Rho GTPas-aktiverande protein 1 | x | |||
| Q08257 | Quinonoxidoreduktas | x | |||
| Q08431 | Lactadherin | x | x | ||
| Q12765 | SEcernin 1 | x | |||
| Q13011 | Delta 3 5 Delta 2 4 dienoyl CoA-isomeras mitokondriell föregångare | x | x | ||
| Q13228 | Selenbindande protein 1 | x | x | ||
| Q13404 | Ubiquitin-konjugerande enzym E2-variant 1 | x | |||
| Q13409 | Cytoplasmisk dynein 1 mellankedja 2 | x | |||
| Q13509 | Tubulin beta 3 kedja | x | x | x | |
| Q13642 | Fyra och en halv LIM-domäner protein 1 | x | |||
| Q13765 | Nascent polypeptidassocierad komplex subenhet alfa | x | |||
| Q13885 | N-tubulin beta 2A-kedjan | x | x | ||
| Q14194 | Dihydropyrimidinasrelaterat protein 1 | x | |||
| Q14195 | Dihydropyrimidinasrelaterat protein 3 | x | x | x | x |
| Q14624 | Inter alfa trypsininhibitor tungkedjig H4-prekursor | x | |||
| Q14697 | Neutral alfa glukosidas AB prekursor | x | |||
| Q14764 | Stort valvprotein | x | |||
| Q14767 | Latent transformerande tillväxtfaktor beta bindande protein 2 | x | <td>x | ||
| Q14894 | Mu-kristallint homolog-NADP-reglerat sköldkörtelhormonbindande protein | x | |||
| Q15063 | Periostinprekursor | x | x | x | x |
| Q15084 | Proteindisulfidisomeras A6-prekursor | x | |||
| Q15113 | Prokollagen C endopeptidasförstärkare 1 prekursor | x | |||
| Q15181 | Oorganisk pyrofosfatas | x | |||
| Q15365 | Poly rC-bindande protein 1 | x | |||
| Q15366 | PolyrC-bindande protein 2 | x | |||
| Q15582 | Transformera tillväxtfaktor beta-inducerat protein | x | x | x | |
| Q15819 | Ubiquitin-konjugerande enzym E2-variant 2 | x | |||
| Q16352 | Alpha internexin | x | |||
| Q16473 | Putative tenascin XA | x | |||
| Q16555 | Dihydropyrimidinasrelaterat protein 2 | x | x | x | |
| Q16698 | 2 4 dienoyl CoA reduktas mitokondriell föregångare | x | |||
| Q16891 | Mitokondriellt inre membran | x | |||
| Q562R1 | Beta-aktin som protein 2 | x | |||
| Q6S8J3 | POTE ankyrin domän familjemedlem E | x | |||
| Q6UWY5 | Olfactomedin som protein 1 prekursor | x | x | ||
| Q71U36 | Tubulin alfa 1A-kedja | x | x | x | |
| Q7Z7G0 | Mål av Nesh SH3-precursor | x | x | x | |
| Q8WUM4 | Programmerad celldöd 6 interaktivt protein | x | |||
| Q8WWX9 | Thioredoxin som selenoprotein M prekursor | x | |||
| Q92597 | Protein NDRGl | x | |||
| Q92945 Långt uppströms elementbindande protein 2 | x | ||||
| Q96CN7 | Isokorismatasdomän som innehåller protein 1 | x | |||
| Q96CX2 | BTB POZ-domäninnehållande protein | x | |||
| Q96KK5 | Histon H2A typ 1 H | x | x | ||
| Q96KP4 | Cytosolskt icke-specifikt dipeptidas | x | |||
| Q99426 | Tubulin-specifik chaperon B | x | |||
| Q99497 | Protein DJ 1 | x | x | ||
| Q99536 | Synaptiskt vesikelmembranprotein | x | x | x | |
| Q99714 | 3-hydroxiacyl-CoA-dehydrogenas typ 2 | x | |||
| Q99715 | Kollagen alfa 1 XII kedja | x | x | ||
| Q99798 | Akonita hydratas mitokondriell föregångare | x | |||
| Q9BQE3 | Tubulin alfa 6 kedja | x | |||
| Q9BUF5 | Tubulin beta 6 kedja | x | x | ||
| Q9BUT1 | 3 hydroxibutyrat dehydrogenas typ 2 | x | |||
| Q9BVA1 | Tubulin beta 2B-kedjan | x | x | x | |
| Q9BXN1 | Asporin | x | x </ Td> | x | x |
| Q9H0W9 | Esterhydrolas C11orf54 | x | |||
| Q9H4B7 | Tubulin beta 1 kedja | x | |||
| Q9NRN5 | Olfactomedin som protein 3 prekursor | x | x | ||
| Q9NRV9 | Heme bindande protein 1 | x | |||
| Q9NSB2 | Keratin typ II cutikulär Hb4 | x | x | ||
| Q9NVA2 | Septin 11 | x | |||
| Q9UBR2 | Cathepsin Z föregångare | x | |||
| Q9UBX5 | Fibulin 5 | x | x | ||
| Q9UK22 | F-låda endast protein 2 | x | |||
| Q9Y277 | Spänningsberoende anjonselektivt kanalprotein 3 | x | |||
| Q9Y281 | Cofilin 2 | x | |||
| Q9Y490 | Talin 1 | x | |||
| Q9Y696 | Klorid intracellulärt kanalprotein 4 | x | |||
| Q9Y6C2 | EMILIN 1 | x | x |
Tabell 1: Förteckning över proteinerna identifierade i mitralventilvävnadsextraktet när fyra olika proteomiska tillvägagångssätt applicerades: tvådimensionell elektrofores (2-DE), tvådimensionell LC-MS E (2D-LC / MSE), LC / MSE och vätskefas-IEF. Metoden genom vilken varje protein identifierades rapporteras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett kritiskt steg i detta protokoll är användningen av flytande kväve för att frysa provet och att kyla kvarnsystemet. Användningen av flytande kväve förhindrar biologisk nedbrytning och möjliggör effektiv pulverisering, men det kräver särskild träning för säker hantering.
I det här protokollet finns ett kvarnsystem för provslipning, eftersom små prov är svåra att återhämta sig från standardmortel och pistlar. I det här fallet sprids småprover som ett fint pulver över morterytan, vilket gör det svårt att göra insamling. En annan fördel är att kvarnen är motoriserad, vilket möjliggör ett större antal prov som ska bearbetas på ett reproducerbart sätt och utan extra utmattning. En begränsning av användningen av en kvarn är att provets storlek måste vara liten (100 mg eller mindre) för att pesteln ska pressas effektivt mot morteln. Vidare måste grindkomponenterna värmas upp till rumstemperatur mellan användningsområden för rengöring g. Följaktligen är förfarandet tidskrävande och, om många prover behandlas dagligen, behövs många uppsättningar.
Ett ytterligare kritiskt steg är beredningen av extraktionsbufferten. Saltkoncentrationerna, särskilt för urean (8 M) och tiourea (2 M), är ganska höga; Således är volymen av salt nästan halva den totala volymen av lösningen. Vidare är upplösningen inte lätt med tanke på att värme måste undvikas, eftersom urea vid mer än 37 ° C kan leda till karbamylering av proteiner vid N termini av proteiner / peptider och vid sidokedjaminogrupperna av lysin- och argininrester 17 . När det är löst, måste ureabufferten filtreras med 0,22 μm filter och kan förvaras vid -80 ° C i 4 veckor utan att påverka dess extraktionseffekt, men det måste värmas till mer än 15 ° C före användning för att möjliggöra fullständig upplösning .
Ändringar och felsökning
I detta protokoll utförs proteinutvinning med användning av den beskrivna ureabufferten eftersom den är en av de mest använda proteinutvinningslösningarna för proteomiska studier på grund av dess kompatibilitet med isoelektrofokusering och dess effektivitet vid solubilisering av svagt lösliga proteiner 18. Det har varit Visade att denna buffert mycket effektivt kan solubilisera svagt lösliga proteiner, såsom integrerade membranproteiner 19 eller proteiner som är mycket benägna att aggregera, såsom tubulin 18. Vidare är denna buffert fullständigt kompatibel med Bradford-analysen för att bestämma proteinkoncentrationen och Det kan användas direkt i 2-DE och flytande fas IEF analyser.Denna buffert är emellertid inte idealisk för solubiliseringen av alla proteiner närvarande i ett prov. Det är möjligt att olika extraktionsbuffertar kunde avslöja proteiner som inte kan detekteras genom detta protokoll. Det är till exempel bra knoMed det att ribosomala och kärnproteiner kan extraheras bättre med syraxtraktion eller triklorättiksyra / acetonutfällning 20 , medan alkaliska pH-nivåer är mer lämpliga för membranproteiner 21 , 22 . Därför kan användningen av alternativa buffertar kräva ytterligare steg för proteinutfällning för att eliminera salter som stör 2-DE eller flytande fas-IEF.
Begränsningar av tekniken
Antalet proteiner som identifieras med detta protokoll är relativt låga, men antalet identifieringar och täckningen av proteomanalysen kan ökas ytterligare genom användning av modernare instrument, vars massakrecision och sekvenseringshastighet har ökat dramatiskt de senaste åren 23. Det är möjligt att täcka en stor del av proteomen utan några förfraktionssteg, genom att använda en lång gradient för flytande chRomatografiseparationer kopplade med ett MS-instrument med hög upplösning som har en snabb sekvenseringshastighet 24 .
Betydelsen av tekniken med avseende på befintliga / alternativa metoder
Möjligheten att identifiera och kvantifiera proteiner i de mänskliga hjärtklaffarna, såsom mitralventilen, är en viktig och utmanande uppgift som kommer att bidra till att belysa mekanismerna för fysiologiska / patologiska processer vid ventilsjukdomar. Definiera förändringarna av mitralventilproteomet kommer avsevärt att öka förståelsen för naturen hos de biologiska processerna som är associerade med vävnads sjukdomstillstånd.
Den nuvarande kunskapen om mitralventilens fysiopatologi är begränsad och generellt erhållen genom analys av individuella proteiner som är involverade i specifika processer, såsom extracellulär matrisreformering, hemostas, inflammation eller oxidativ stress 25 9 , 10 .
Bristen på omfattande proteomiska studier kan hänföras till komplexiteten hos denna lågcellulära vävnad som är mycket rik på extracellulära matrisproteiner ( dvs proteoglykaner, kollagen och elastin). Dessa proteiner utgör omkring 80% av den totala mängden, vilket hindrar analysen av lågmängdsproteiner 26 .
Således var det nödvändigt att upprätta ett effektivt extraktionsprotokoll för att maximera proteinolubilisering för att beskriva proteomen hos denna vävnad. Detta protokoll tillät extraktionen av ~ 50 | ig protein från 1 mg vävnad. Detta är ett relativt lågt utbyte i jämförelse med "mjuk" vävnad, sådanSom lever (~ 135 μg från 1 mg vävnad), men det är tillräckligt att utföra en proteinanalys på enskilda prover. Detta är särskilt relevant när man definierar det individuella variabiliteten hos ett fenomen.
Vidare har denna metod fördelen av att vara kompatibel med många analytiska applikationer. Mitralventilproteinerna upplösta i den föreslagna extraktionsbufferten kan användas direkt för immunoblottning och proteomanalys baserad på tvådimensionell elektrofores och flytande fasisoelektrofores 11 , 12 eller efter proteinutfällning för att eliminera buffertkomponentinterferens för andra analyser, såsom Gelfri masspektrometri 15 .
Med tillämpningen av detta extraktionsprotokoll har en mer uttömmande karakterisering av proteinkomponenterna i normal mitralventilvävnad erhållits genom identifiering av många intracelLulära proteiner. Dessa proteiner är lokaliserade i cytosolen eller i organeller, inte bara i den extracellulära matrisen, och har olika molekylära och biologiska funktioner. Andra intressanta proteiner ( dvs CryAB, septin-11, FHL-1 och dermatopontin) identifierades också. Dessa proteiner har okända funktioner i mitralventilen, men deras biologiska egenskaper föreslår en möjlig roll i ventilsjukdomar.
Framtida applikationer eller anvisningar efter att ha behärskat denna teknik
Med detta protokoll är det möjligt att korrelera data avseende proteinuttryck med data om kvantitativa mRNA-uttryck och icke kvantitativa immunhistokemiska analyser. När de används tillsammans kommer dessa tillvägagångssätt att leda till en mer omfattande förståelse av de molekylära mekanismerna som ligger till grund för sjukdom, från mRNA till posttranslationell proteinändring. Således kan denna metod vara av intresse för forskare inriktade på hjärtfluid-fysiopatologi. FenaAllierat kan detta protokoll också appliceras på porcine mitralventilen, som har en nära likhet med den mänskliga ventilen 27 och används som en experimentell modell för utvärdering av ventilfunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Det italienska hälsovårdsministeriet stödde denna studie (RC 2013-BIO 15). Vi tackar Barbara Micheli för hennes utmärkta tekniska hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
- Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
- Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
- Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
- Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
- Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
- Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
- Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
- Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
- Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
- Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
- Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
- Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
- Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
- Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
- Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
- Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
- Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).
