Summary
在这个协议中, 笼状蛋白激酶 a (PKA), 细胞信号转导 bioeffector, 被固定在纳米粒子表面, 微量进入胞, 并激活由 upconverted 紫外线光近红外线 (近红外) 照射, 诱导下游应力纤维解体的胞。
Abstract
转换纳米粒子 (UCNP) 介导的活化是一种新的方法远程控制 bioeffectors 与更少的光和更深的组织渗透。然而, 现有的仪器在市场上是不容易兼容的转换应用。因此, 修改商业上可用的仪器是这项研究的关键。本文首先阐述了传统的 fluorimeter 和荧光显微镜的改进, 使其与光子转换实验相兼容。然后, 我们描述了一个近红外线 (近红外) 触发笼蛋白激酶催化亚基 (PKA) 固定在 UCNP 复合物的合成。还报告了显微注射和近红外活化程序的参数。在笼 PKA-UCNP 微量成 REF52 成纤维细胞后, 近红外辐射明显优于传统的紫外线照射, 有效地触发了活细胞中的 PKA 信号传导通路。同时, 正、负控制实验证实, PKA 诱导的应力纤维分解通路是由近红外辐射引起的。因此, 使用蛋白质修饰的 UCNP 提供了一种创新的方法, 远程控制 light-modulated 细胞实验, 其中直接暴露在紫外线必须避免。
Introduction
化学修饰的蛋白质, 可以光 (例如, PKA 笼的蛋白质) 已经发展成为一个新兴的领域, 在化工生物学性操作细胞间生化过程1,2 ,3。当激活这些笼中的蛋白质时, 利用光作为刺激提供了绝佳的时空分辨率。然而, 紫外线会导致不需要的形态学改变, 细胞凋亡和 DNA 损伤4,5。因此, photocaging 组的设计最近的发展重点是使 photocleavage 在较长波长或双光子激励下减少光, 以及增加深层穿透6,7。响应较长波长的锁定组允许我们选择合适的 uncaging 波长 (即、通道), 以便在两个或多个锁定组存在7时有选择性地激活 bioeffectors。鉴于这些有用的特征, 开发新的红光 photocaging 小组是非常重要的上游工作, 在光化学方法的生物研究范围内, 从探索的反应机制, 以控制细胞活动8。然而, 一个双光子锁定群通常过于疏水性由于融合芳香环结构, 和可见光锁定组通常是有机金属, 与芳香配体。当 bioeffector 是蛋白质或酵素时, 这种疏水/芳香物产不适合, 因为它使酵素或蛋白质的激活站点和导致作用损失, 即使共轭和光解仍然工作在化工水平上2 ,9。
UCNPs 是将近红外激发光转换为紫外线的有效传感器。这一独特而迷人的 UCNPs 的财产提供了现实的解决方案, 以应对与活化和触发控制释放小分子, 包括叶酸10, 顺铂衍生物11, DNA/siRNA12, 共聚物泡13, 空心粒子14。然而, 据我们所知, 目前为止, UCNP 辅助的酶或蛋白质活化还没有经过测试。因为没有成功的案例使用红光或近红外光谱来光酶, 我们被提示执行的近红外触发活化的蛋白质/酶结构组成的化学改性笼酶复合物与二氧化硅涂层,掺杂稀土的 UCNP15。在这项研究中, UCNP 被共轭的快速反应信号转导激酶的形式笼 PKA。PKA 控制糖原合成和骨架调节, 响应外部刺激通过循环腺苷磷酸 (阵营) 调节在胞16。本文研究了近红外辐照下细胞实验中酶激活的时间和空间方式的可行性。这种 UCNP 辅助的活化平台是一种新的方法, photoactivate 的酶使用近红外光谱和避免不受欢迎的信号转导反应由传统的紫外线照射2,4。
在细胞膜上转移大的 bioeffectors (例如,蛋白质) 很难控制细胞活动。虽然粒子固定化的蛋白质可能更容易通过吞转移到胞, 吞可能被破坏或退化通过内涵诱捕和随后的溶酶体退化2,4。即使笼状蛋白在膜移位后仍然功能正常, 移位量也不足以触发细胞响应2,17。与之形成鲜明对比的是, 微注射是一种直接和定量的方法, 可以将大的 bioeffectors 到细胞的细胞质中。此外, UCNP 固定化的 bioeffector 需要 upconverted 光来激活。因此, 光学仪器需要进一步的修改来测量、可视化和利用转换光。在这项工作中, 提供一个笼 PKA-UCNP 复合物的细胞使用显微注射和以下基本光谱学和显微镜修改的近红外活化将详细介绍。
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Protocol
注意: 该协议描述了对转换辅助活化的一个详细的仪表修改, 这是一种生成笼式 PKA-UCNP 的合成过程, 它是由二氧化硅涂层的 UCNP 的透射电子显微镜 (TEM)和笼 PKA-UCNP 样品, 紫外线和近红外光解设置, 细胞制备, PKA UCNP 显微注射, 活化研究, 和 REF52 细胞的应力纤维染色.
1. 转换频谱测量的 Fluorimeter 设置
- 在荧光光谱仪的试管持有者旁边安装4X 物镜, 以便激光聚焦在试管的中间.
- 将可调谐的 0.5-至 8 W 980 nm 半导体激光二极管90和 #176; 与物镜匹配.
注意: 操作人员需要具备激光安全知识, 并佩戴近红外激光护目镜. - 在物镜和激光器的光路相交处安装全反射镜。放置一个黑色阳极氧化金属板, 以阻止光谱的励磁窗口和保护内部部分.
- 将试管的二氧化硅涂层 UCNP 溶液 (0.2-0.6 毫克/毫升) 放在试管支架上, 使明亮的转换光束可以可视化, 并可用于调整镜像安装的最佳光对齐方式.
- 将光谱学转换为最小 PMT 电压设置的发光模式 (如果信号太弱则调整到更高的设置)。将镜像调整到最佳对准, 其中光束位于试管的中间, PMT 拾取最强的信号.
- 对齐后测量转换频谱, 并使用所需的电源设置。使用热堆功率计, 在激光电源上的电流读数上建立激光功率的校准曲线。不断检查激光性能, 确保性能在校准范围内.
2。显微镜设置
注意: 以下设置适用于配备双层光路的显微镜。如果用户打算在后端安装一个励磁光源开关, 使近红外激光器和卤化物灯共享同一端口, 则在后端端口的准直器将显著阻挡近红外光谱, 因为它是为减少样品加热而设计的。用户必须作出困难的选择: 保持准直器在和遭受非常低的转换效率, 或删除的准直和牺牲强度的励磁光的荧光.
注意: 显示修改后的光的光路方案的剖面图、转换发光和近红外解离模式的显微镜、荧光和 UV 光解模式, 以及实验设置用于此实验的说明如 图 2 所示.
- 将荧光显微镜与金属卤化物灯导轨一起配置到后端.
注意: 在这个上层的光路中, 有一个立方体炮塔, 一个立方体的位置必须是空的, 允许从较低层光路径来的近红外光谱. - 在右侧端口上安装可调谐的0.5 到 8.0 W 980 nm 激光二极管, 并打开侧面端口准直器.
注: 这将激光光斑放大到大约500和 #181; 当使用10X 物镜时, 直径为 m。除去这个准直器会产生微米范围的光点, 使近红外细胞照射变得不切实际。这种准直器是近红外透明的. - 在下层光路中安装一个分色镜 (850 nm 短路) 和一个励磁滤镜 (950 nm long-pass).
- 使用 UCNP 的解决方案来可视化近红外光点。调整激光的位置, 使近红外光束在视野中居中, 以完成对准.
3。笼型 PKA UCNP 的制备与表征
- 孵化重组 PKA (9 和 #181; M) 与0.5 毫米 2-nitrobenzylbromide (NBB) 在锁定缓冲 (20 毫米三盐酸, 100 毫米氯化钠和10毫米氯化镁 2 ; 8.5-1 h 在2和 #176; c. 淬火过剩的 NBB 与10毫米 dthiothreitol (数码), 然后透析反对 4-(2 羟乙基) 哌嗪-1-磺酸 (HEPES) 缓冲 (10 毫米, pH 7.5) 去除多余的试剂和盐.
注: 在透析过程中, 锁定溶液的 ph 值从8.5 降低到 7.5, HEPES ph 值7.5 用于随后的固定化反应. - 混合稀土盐-Y (CH 3 CO 2 ) 3 水合物 (99.9%, 0.4527 克, 1.38 摩尔), Yb (ch 3 CO 2 ) 3 水合物 (99.9%, 0.2533 g, 0.60 摩尔) 和 Tm (ch 3 co 2 ) 3 水合物 (99.9%, 0.0168 g, 0.02 摩尔)-在十八 (30 毫升) 和油酸 (12 毫升), 加热混合物到115和 #176; c 为30分钟, 冷却到50和 #176; c。然后, 将反应混合物溶解在甲醇溶液 (20 毫升) 中, 用0.2 克 (5.0 摩尔) 的氢氧化钠颗粒和0.2964 克 (8 摩尔) 的氟化铵超声为15分钟. 将反应温度提高到300和 #176; C 获取 UCNP 核心 (#946;-NaYF 4 : 1.0% Tm 3 + /30% Yb 3 + ) 纳米颗粒。
- 溶解在环己烷 (10 毫升) CO-520 (0.5 毫升) 的核心纳米颗粒 (25 毫克)。添加氨水 (重量30% 伏/v, 0.08 毫升) 和 tetraethylorthosilicate (乙, 0.04 毫升), 并在室温下应用恒定搅拌12小时, 以获得二氧化硅涂层和 #946;-NaYF 4 : 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + 核心纳米粒子.
- 孵育 PKA (6 nmol) 或笼 PKA (6 nmol) 与 UCNP (1 毫克) 15 在 HEPES 缓冲区 (10 毫米, pH 7.5) 在4和 #176; C 为 3 h 固定 PKA 在硅涂层的 UCNP 通过 静电相互作用.
- 使用 PVDF 过滤器过滤混合物 (0.45 和 #181; m), 离心机在 1.7万 x g 为10分钟在4和 #176; C, 和 redisperse HEPES (50 和 #181; L, 10 毫米, pH 7.5) 含有0.1% 蛋白稳定剂, 以获得纯化的 PKA-UCNP 复合物的颗粒。离心机在 1.7万 x g 为10分钟在4和 #176; C 和收集上清为布拉德福德化验在1.5 毫升管.
- 分析从步骤3.5 中保存的上清中的无界 PKA, 用布拉德福德法对 UCNP 粒子的 PKA 置换水平进行反计算, 后者通常具有 4.5 nmol 每毫克粒子的 PKA 的替代水平.
注意: 布拉德福德化验显示了一个强烈的蓝颜色的颗粒, 这意味着高水平和稳定的蛋白质固定不脱附, 而笼 PKA-UCNP 溶液的上清分数显示一种颜色类似 HEPES 缓冲区 ( 图 4 c-4e ).
4。特性
注意: 激酶测定用于量化丙酮酸激酶的特定活性。简言之, 与丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶结合的肽的磷酸化, 导致 NADH 氧化。后者的形成是通过测量 NADH 在 340 nm 的吸光度下降来监测的.
- 确定60和 #181 中的 PKA 和 PKA UCNP 的活动; 含 4-morpholinepropanesulfonic 酸 (拖把, 100 毫米, pH 7.5), 氯化钾 (100 毫米), 丙酮 (PEP, 1 毫米), 三磷酸腺苷 (ATP, 1 毫米), 和 #946 的测定混合物的总容积。烟酰胺腺嘌呤核苷酸, 减少的形式 (NADH, 0.8 毫米), 氯化镁 (氯化镁 2 , 1 毫米), kemptide (0.4 毫米) 和丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶混合物 (PK/LDH 的30/40 单位).
- 测量 PKA 溶液 (2-#181; L) 加入测定混合物后的 NADH 吸收量的减少。计算直线的斜率, 以直接反映被测激酶的活动.
- 测量 PKA-UCNP 15 和整个活动的活动, 该行为应与本机 PKA 特定活动的乘法乘积以及计算的 PKA 表面涂层量匹配.
5。光解设置
- 多边环境协定使用热堆传感器和计算功率密度 (PD = 功率 (W)/面积 (cm 2 )) 的所有光源功率, 基于光点区域的 18 .
- 执行 体外 紫外线光解实验在一个商业系统与 365 nm LED (200 兆瓦/cm 2 ) 15 。
- 对于显微镜阶段的 UV 活化, 用商业立方体过滤的激发光照亮 PKA UCNP 溶液 15 .
注: 功率密度为 ~ 15 兆瓦/cm 2 , 无物镜聚焦. - For 体外 近红外活化在显微镜阶段, 用 980 nm 激光照射 PKA-UCNP 溶液, 在下层光路上安装有定制的转换滤镜/镜像设置, 分色镜 (850 nm 短路),励磁过滤器 (950 nm long-pass).
注: 在4X 物镜聚焦前, 输出功率密度为5瓦特/厘米 2 。在4X 物镜聚焦后, 功率密度估计为68瓦特/cm 2 .
6。PKA-UCNP 配合物的细胞样品制备及显微注射
- 通过0.45 和 #181 对样本进行预筛选; m PKA 固定后的过滤器 (步骤 3.5).
- 在注射期内孵育含有 L-15 培养基的10% 胎牛血清 (FBS) 中的细胞, 以便在恒温箱外进行稳定的 pH 控制.
注: 要确认微注射完成, co-inject 原 PKA-UCNP, 笼 PKA UCNP, 或乙二醇 UCNP (7.5 毫克/毫升) 15 具 5 (6)-四 (TAMRA) (10 和 #181; M) 到单元格中. - 调整 PKA UCNP 颗粒的浓度, 使其在微注射后, 胞浆浓度为 1-3 和 #956; M PKA-一个细胞内 PKA 的生理浓度范围, 假设注射量是1/10 的细胞体积.
- 使用带有单轴液压微 ( 图 3 ) 的微量设备对单元 (步骤 6.2) 执行微注射.
- 使用数字压力表监测微量所施加的压力在操作范围内 (50-200 hPa), 并在定制加压室中密封分配器阀, 以提供微注射的补偿压力。使用拉拔器将针向后拉出.
- 保持50和 75 hpa 之间的注射压力, 注入时间为200-300 毫秒, 15 hpa 的补偿压力, 以防止培养基通过毛细管作用回流到针头中.
- 检查针头的尖端开口, 以确保它们的外径介于1.3 和1.5 和 #181 之间; m, 可以通过使用40x 物镜拍摄图像来确认.
- 用2毫升的 L-15 培养基在注射后用 10% FBS 冲洗细胞。观察 5 (6)-carboxytetramethyl-罗丹明 (TAMRA) 的细胞荧光成像, 以确认微注射完成.
7。在活细胞中使用紫外或近红外光的活化笼 PKA UCNP
- 在 PKA-UCNP 微注射后, 在3.5 和 #181 上生长 REF52 细胞; m 盘, 将它们放在显微镜舞台上, 然后用 uv 光照射它们立方体为3分钟, 没有物镜聚焦.
注: REF52 细胞保持在 DMEM 10% FBS 37 和 #176; C 在 5% CO 2 孵化器中, 当70-100 每90% 天达到2-3 时, 细胞被继. - 对于 PKA-UCNP 微注射后的近红外活化, 请按照步骤5.4 中的说明, 从较低层的滤镜/镜像设置中照射 980 nm 的激光器上的单元格.
注: 功率密度输出为5瓦特/厘米 2 前10X 物镜对焦和估计是300瓦特/厘米 2 后10x 物镜聚焦。转换是一个需要高光子密度的过程, 特别是当需要更大的反斯托克位移时。因此, 在活化中需要集中. - 当需要更大的光点 (650 和 #181; m x 520 和 #181 m) 时, 用10x 物镜聚焦的近红外光谱照射这些细胞, 使准直器为 15 min. 允许在每5分钟照射后5分钟的暗间隔, 以避免发热.
注意: 当需要高空间分辨率 (亚细胞光点) 时, 使用40X 物镜, 并在导光指南的出口端安装针孔, 以生成亚细胞尺寸的光点 (5 和 #181; m x 4 和 #181; m)。在这种情况下, 1 s 的辐照是足够的近红外活化由于高通量的光子. - 在 UV 或近红外光解之后, 允许单元格恢复在 5% CO 2 孵化器在37和 #176; C 为 1 h 在完全培养基产生细胞反应。随后, 将它们固定在1毫升的4% 甲醛/磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 20 分钟前进一步染色.
警告: 甲醛是剧毒的;避免接触皮肤、眼睛或粘膜。在测量和准备过程中避免吸入粉末.
8。近红外活化引起的应力纤维崩解的可视化
- 在固定后, 使用 Alexa 594-笔 (添加5和 #181; l 6.6 和 #181; M 库存解决方案, 以200和 #181; 我的 PBS 染色; 在室温下孵育25分钟) 染色可视化应力纤维。使用滤镜集可视化 Alexa 594-笔 (前 581 nm/Em 609 nm) 的图像.
- 在室温下孵育4和 #39 中的细胞5分钟;, 6-diamidino-2-吲 (DAPI)。染色后, 用 PBS 清洗样品, 分别取应力纤维和细胞核的荧光图像.
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Representative Results
在图 1中说明了笼式酶 UCNP 结构的设计。PKA 酶第一反应与 2-硝基苄溴生成一个非活性笼 PKA, 然后静电固定在 UCNP 表面。UCNPs 发出 upconverted 光, 因此 photolytically 在胱氨酸199和胱氨酸343上切割邻硝基苄基基团, 生成激活的 PKA。TEM 图像和布拉德福德化验证实, PKA 和笼 PKA 被固定在 UCNPs 表面, 并在紫外 UCNP 检测后的笼 PKA 活化溶液的激酶活性 (图 4)。在 PKA 固定化后, 动态光散射仪揭示了 PKA 粒子复合体的大小和泽塔电位分别为 120 nm 和-16.0 mV。布拉德福德测定的 PKA-UCNP 溶液显示了强烈的紫色颜色的粒子, 这表明高水平和稳定的蛋白质固定。
选择 REF52 大鼠胚胎成纤维细胞进行细胞实验研究活化。在这个实验中, PKA 通路可以由内源性 PKA 活化 (这是由细胞渗透性 8-CPT-阵营的孵化触发) 或注射活性或 triggerable PKA。活化 PKA (有或没有微粒固定化) 瓦解重音纤维并且暴露更多丝状肌动蛋白 (f-肌动蛋白) 表面和因而荧光标记笔, 强烈结合对 F 肌动蛋白, 产生更高的染色信号。经过 8-CPT-阵营孵化或微注射的自由 PKA, 活性 PKA UCNP, 或紫外线活化 PKA UCNP (作为阳性对照实验), 我们确认存在强应力纤维解体造成的 PKA 路径激活 (图 5)。内源性 PKA 和微量 PKA 研究显示全细胞应力纤维解体, 而粒子固定化 PKA (活性 PKA-UCNP 和紫外线活化 PKA-UCNP) 只在微注射部位显示应力纤维解体, 进一步建议在 UCNPs 上稳定固定 PKA。在近红外活化实验中, 在被囚禁的 PKA UCNP 和近红外辐射照射后, UCNPs 发出 upconverted 光, 并在胱氨酸199和胱氨酸343上切割邻硝基苄基。因此, 他们产生活化 PKA, 瓦解的应力纤维, 并产生一个更高的信号通过荧光标记笔染色 (图 6)。REF52 细胞微量的阴性对照实验 UCNP 无笼 PKA, 随后近红外辐射, 以及 REF52 细胞与笼 PKA-UCNP 在没有照射的情况下, 对应力纤维的完整性没有影响。
图 1.笼 PKA-UCNP 设计和转换辅助 PKA Uncaging 的插图.请单击此处查看此图的较大版本.
图 2:显示光路径方案的剖面图.(a) 修改后的光和 (b) 显微镜用于转换发光和近红外光解模式 (左), 以及荧光和 UV 解模式 (右), 以及它们的实验设置。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3:微注射实验装置注射架与一轴油液微在30°和45°之间的夹角上耦合。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4:确认 UCNP 上的 PKA 固定.TEM 图像 (a) 二氧化硅涂层 UCNP 和 (b) 笼 PKA 固定的 UCNP;布拉德福德测定 (c) HEPES 缓冲区, (d) 悬浮笼 PKA-UCNP 溶液的颗粒部分, 和 (e) 笼式 PKA-UCNP 溶液的上清分数;和 (f) 在紫外线活化后笼 PKA UCNP 溶液的激酶活性测定。这个数字是从高, H。et al.经过明确的许可后获得了出版商, 美国化学学会。缩放栏 = 20 nm请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: REF52 细胞的应力纤维染色 (绿色) 和 DAPI 染色的荧光图像, 显示了不同 PKA 活化引起的应力纤维分裂和形态学变化.(a) 未经处理的细胞, (b) 8-(4-Chlorophenylthio) 腺苷 3 ", 5"-循环单磷酸 (8-CPT-cAMP) 处理细胞, (c) 活动 PKA-微量细胞, (d) 活动 PKA-UCNP-微量细胞, 和 (e) 在紫外线照射后, 笼 PKA-UCNP-微量细胞。(f-j)分别从 (a-e) 获得的光学密度 (外径) 图。(k o)沿蓝色箭头的相应强度曲线。白色箭头指示微量单元格。刻度栏 = 50 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 6:荧光图像的 REF52 细胞微量与各种 PKA 形式.细胞微量与 (a) 笼 PKA UCNP 后近红外辐照, (b) PEG 接枝 UCNP 在近红外辐射, 和 (c) 笼 PKA-UCNP 没有辐射。(d-f)UCNP (在虚线框中) 的 upconverted 发射 (a-c)。(g i)合并图像的应力纤维 (绿色), 转换排放 (红色) 的 UCNP 复合体, DAPI 染色的核 (蓝色)。在650µm x 的照射区进行近红外活化细胞的研究520µm 使用10X 物镜。用40X 物镜获取荧光图像。因此, 近红外辐射面积减少到150µm x 120 µm, 如虚线红色框所示。转换发光可以在 (c) 中看到。对于使用 ImageJ 的定量研究, 外径图片 (j l) 分别来源于 (a-c)。在 (j l) 中显示的蓝色箭头的强度曲线是在 (m-o) 中绘制的。该系统观测到高信噪比 (S/N), 被认为是一种积极的反应。该方法适用于所有 Alexa 594-笔染色 quantifications。白色箭头指示微量单元格。刻度栏 = 50 µm.请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
此前, 霍夫曼和同事发现, 在自由 PKA19的微注射后, 在 REF52 细胞中观察到戏剧性的形态学改变。在另一项研究中, 劳伦斯小组证明, 笼 PKA 可以激活在体内, 导致形态学变化和应力纤维的解体时, 受到紫外线光解20。早先关于开发 upconverted 紫外光的报告活化显示了激活的几个 UCNP 协助, 笼, 小分子 bioeffectors21,22,23。然而, 在最重要的 bioeffector (酶) 上使用 UCNP 辅助活化的协议还有待开发。因此, 在本研究中, 我们描述了一个细胞实验协议, 包括近红外活化的笼 PKA 使用 UCNPs。在这一近红外活化平台中, 被固定在二氧化硅涂层 UCNPs 表面的笼式 PKA20被用来证明用近红外光谱作为触发器控制细胞信号传导通路的可行性。REF52 细胞微量与笼 PKA UCNP 结构和辐照的近红外光谱显示了影响应力纤维解体, 以及细胞内的形态学变化。此外, 还进行了正、负控制实验, 证明了 PKA 诱导的导致应力纤维崩解的途径是由近红外辐射引发的。
这份手稿中介绍了仪器的修改, 而 PKA 的化学修饰在其他地方也有记录15。如果一个设计良好的实验需要进行故障排除, 首先要确定问题是否是从以下方面产生的: (i) 蛋白 UCNP 复合物, (ii) 显微注射, 或 (iii) 光学仪器。在蛋白质活化问题的情况下: (1) 确保 PKA 是活动的, (2) 确认笼中的 PKA 有剩余的活动, #60; 5% 的原始值, (3) 确定 UV-"PKA 至少有50% 的活动恢复, (4) 确保笼 PKA 是固定在 UCNP 表面 (执行布拉德福德化验), 和 (5) 确保笼 PKA-UCNP 也至少有50% 的活动恢复 (通过执行紫外线照射)。对于微注射问题: (1) 确保针尖打开, 并正确加载蛋白 UCNP 溶液。将载针 (针尖) 放在显微镜上, 用近红外激励通道。如果观察到转换荧光, 则加载是正确的。(2) 将蛋白 UCNP 注入细胞中, 观察合作 5 (6)-四 (TAMRA) 染料和转换颗粒的荧光强度。适当的注射将导致强烈的 TAMRA 和转换粒子荧光的细胞。用于显微镜光学修改故障排除: (1) 去除物镜, 打开近红外激光器, 将热堆功率计传感器放在显微镜台上测量近红外光谱, 不应因设置不当而受阻。(2) 安装物镜, 并在显微镜台上放置一个透明底试管, 用10毫克/毫升 UCNP 溶液填充。如果光学装置都安装妥当, 将会看到溶液中的尖锐的蓝色光束。
微注射只能提供有限数量的细胞进行分析。注入成功率是操作者 (或经验) 依赖的, 这是这项技术的主要限制。然而, 目前还没有其他方法可以绕过它。许多科学家认为, 使用粒子细胞的孵化允许细胞吸收粒子。然而, 这不是一个可行的方法。即使细胞粒子摄取量的发生和吸收数量是足够的, 它会积累在体/溶酶体, 但不是在胞。这种特定的信号转导酶需要位于胞, 而不是体, 是有效的。此外, 当 PKA 被溶解在一个完美的存储缓冲区在37° c, 它的活动不会持续过夜存储。细胞培养基中的酶稳定性更短, 使孵化方法不切实际。
这报告仪器设置, 显微注射和激酶近红外活化协议应普遍适用, 不仅对化学修饰激酶, 但也为其他蛋白质或酶类。此外, 这将是有益的细胞研究, 直接紫外线照射是不可取的。此外, 笼 bioeffector-UCNP 复合体可以与细胞外靶点 (如膜蛋白或膜受体) 相互作用, 避免细胞内传递问题, 并使该平台适用于体内使用。静脉注射后, 笼中的蛋白激素或治疗蛋白将仅在近红外照射的地区 bioeffector 活化的形式。
微注射是该协议中最关键的一步。为精确注射, 避免在针加载期间的气泡。装入后, 立即将针头安装在注射器中, 将针尖浸入介质中, 防止针尖干燥, 从而导致堵塞。显微注射操作技能是提高成功注射率的关键。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
我们感谢中央研究院纳米科技项目和台湾科技部的资助 (101-2113 米-001-001-MY2; 103-2113 米-001-028-MY2)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Ammonium hydroxide (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
