Summary
I denne protokol, bur protein kinase A (PKA), en cellulær signaltransduktion bioeffector, var immobiliseret på en nanopartikel overflade, microinjected ind i cytosol, og aktiveres af upconverted UV-lys fra nær-infrarødt (NIR) bestråling, inducerende downstream stress fiber opløsning i cytosol.
Abstract
Upconversion nanopartikel (UCNP)-medieret photoactivation er en ny tilgang til fjernt kontrol bioeffectors med langt mindre fototoksicitet og med dybere væv penetration. De eksisterende instrumenter på markedet er imidlertid ikke vanskeligt kan forenes med upconversion ansøgning. Derfor er modificerer den kommercielt tilgængelige instrument væsentlige for denne forskning. I dette papir illustrere vi først ændringerne af en konventionel fluorimeter og fluorescens mikroskop til at gøre dem forenelige for photon upconversion eksperimenter. Vi derefter beskrive syntesen af et nær-infrarødt (NIR)-udløst bur protein kinase A katalytisk subunit (PKA) immobiliseret på en UCNP kompleks. Parametre for mikroinjektion og NIR photoactivation procedurer er også rapporteret. Efter den bur PKA-UCNP er microinjected i REF52 fibroblastceller, udløser NIR bestråling, som er betydeligt bedre end konventionelle UV-bestråling, effektivt PKA signaltransduktion pathway i levende celler. Derudover bekræfter positive og negative kontrol eksperimenter, at PKA-induceret vejen fører til nedbrydning af stress fibre specifikt er udløst af NIR bestråling. Således, at brugen af protein-modificerede UCNP giver en innovativ tilgang til at fjernstyre lys-moduleret cellulære eksperimenter, hvor direkte eksponering for UV-lys skal undgås.
Introduction
Kemisk modificerede proteiner, der kan være photoactivated (fx PKA bur proteiner) er blevet udviklet som et spirende felt i kemisk biologi til ikke-invasivt manipulere intercellulære biokemiske processer1,2 ,3. Ved hjælp af lys, som en stimulus giver fremragende spatiotemporelle opløsning, når du aktiverer disse bur proteiner. Men UV-lys kan forårsage uønskede morfologiske ændringer, apoptose og DNA skader på celler4,5. Derfor, den seneste udvikling i udformningen af photocaging grupper fokuserer på aktivering photocleavage efter længere bølgelængde eller to-foton excitation at reducere fototoksicitet, samt øge dybe væv penetration6,7. Anbringelse i bur grupper, der reagerer på længere bølgelængde tillader os at vælge egnet uncaging bølgelængder (dvs.kanaler) til selektivt aktivere bioeffectors når to eller flere grupper, anbringelse i bur er nuværende7. Givet disse nyttige funktioner, er udvikle nye røde lys photocaging grupper meget vigtige opstrøms arbejde i fotokemisk metoder til biologiske undersøgelser spænder fra sondering mekanismer af reaktionerne kontrollerende cellulære aktiviteter8. Ikke desto mindre en to-foton anbringelse i bur gruppe er normalt også hydrofobe på grund af sammenvoksede aromatisk ring struktur, og et synligt lys anbringelse i bur gruppe er normalt metalorganiske, med aromatiske ligander. Hydrofobe/aromatiske egenskaben er ikke egnet, når bioeffector er et protein eller enzym, som det denaturerer aktiveringswebsted enzym/protein og forårsager tab af funktion, selvom konjugering og fotolyse stadig arbejde på det kemiske niveau2 ,9.
UCNPs er effektive transducere, der konvertere NIR excitations lys til UV. Denne unikke og fascinerende egenskab af UCNPs har tilbudt realistiske beslutninger for at løse udfordringerne forbundet med photoactivation og udløst kontrolleret frigivelse af små molekyler, herunder folinsyre10, cisplatin derivater11 , DNA/siRNA12, copolymer vesikler13og hule partikler14. Dog til bedst af vores viden, er den UCNP-assisteret photoactivation af enzymer og proteiner ikke blevet testet indtil videre. Fordi der er ingen vellykket sag for at bruge rødt lys eller NIR til photoactive et enzym, vi blev bedt om at udføre aktiveringen af NIR-udløst af en protein/enzym konstruktion består af kemisk modificerede bur enzym komplekser med en silica-belagt, lanthanide-doped UCNP15. I denne undersøgelse, var UCNP konjugeret med et hurtigt reagerende signaltransduktion kinase i form af bur PKA. PKA styrer glykogen syntese og cytoskeletal forordning, der reagerer på eksterne stimuli via cyklisk adenosin fosfat (cAMP) forordning i cytosol16. Vi studerede gennemførligheden af enzymet aktivering i tidsmæssige og rumlige manerer i en cellulær eksperiment efter NIR bestråling. Denne UCNP-assisteret photoactivation platform er en ny metode til at photoactivate et enzym ved hjælp af NIR og undgår uønskede signaltransduktion svar fra celler forårsaget af konventionelle UV bestråling2,4.
Det er meget svært at translocate store bioeffectors (fx proteiner) over cellemembranen til at styre cellulære aktivitet. Selv om partikel-immobiliseret protein kan være lettere at translocate via endocytose ind i cytosol, kan endocytose blive beskadiget eller forringet via endosomal fastklemning og den deraf følgende forringelse af lysosomale2,4. Selvom den bur protein er stadig funktionel efter membran omplantning, kan de omplantede mængder ikke være nok til at udløse den cellulære reaktion2,17. I skarp kontrast er mikroinjektion en direkte og kvantitativ tilgang til at levere store bioeffectors til cytoplasmaet i en celle. Derudover kræver UCNP-immobiliseret bioeffector upconverted lys skal aktiveres. Derfor, den optiske instrumentation kræver yderligere modifikation at måle, visualisere og udnytte upconversion lys. I dette arbejde beskrives levering af et bur PKA-UCNP kompleks til en celle med mikroinjektion og følgende væsentlige spektroskopi og mikroskopi ændringer i NIR photoactivation i detaljer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: protokollen beskriver en detaljeret instrumentation modifikation for upconversion-assisteret photoactivation, en syntetisk procedure til at generere bur PKA-UCNP, transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) af silica-belagt UCNP og bur PKA-UCNP prøver, UV og NIR fotolyse setup, celle forberedelse, PKA-UCNP mikroinjektion, en photoactivation undersøgelse og stress fiber farvning af celler, REF52.
1. Fluorimeter Setup for Upconversion spektrum måling
- installere en 4 X mål linsen ved siden af kuvette indehaveren af fluorescens spektrometer, så laseren er fokuseret på midten af kuvette.
- Placerer en afstemmelige 0,5 - 8 W 980-nm laserdiode 90° mod mål linse.
Forsigtig: Operatoren skal have laser sikkerhed viden og bære NIR laser beskyttelsesbriller. - Installere en fuld Reflektionsgraden spejl i lys sti skæringspunktet mellem objektive linse og laser. Placer en sort anodiseret metalplade at blokere vinduet excitation af spektroskopi og beskytte de indvendige dele.
- Placere kuvette af silica-belagt UCNP løsning (0,2 - 0,6 mg/mL) i kuvette indehaveren, så en lyse upconversion stråle kan visualiseres og kan bruges til at justere den bedste lys justering for spejl installation.
- Skifter spektroskopi til luminescence tilstand med laveste ydelse voltage-indstillingen (justere for en højere indstilling, hvis signalet er for svagt). Justere spejlet til den bedste justering, hvor strålen er på midten af kuvette og ydelse opfanger det stærkeste signal.
- Måler spektret upconversion efter linjeføring, med den ønskede strømstyringsindstilling. Bruge en termisk bunke wattmeteret til at bygge en kalibreringskurve laser magt mod den elektriske nuværende læsning på laser power supply. Konstant tjekke laser performance for at sikre at udførelsen er inden for området kalibreret.
2. Mikroskop Setup
NOTE: følgende opsætning virker for mikroskoper udstyret med en optisk transmissionslængde på to-lags. Hvis brugeren har til hensigt at installere en excitation lyskilde switch i havnens tilbage at gøre NIR laser og metalhalogen lampe dele den samme port, blokere kollimator i havnens tilbage betydeligt i NIR, fordi det er designet til at reducere prøve varme. Brugeren skal foretage et svært valg: holde kollimatoren og lider af meget lavt upconversion effektivitet, eller fjerner en kollimator og ofre intensiteten af excitation lys til epifluorescensmikroskop.
Bemærk: en cutaway diagram viser ordningen lys sti til en modificeret spectrofluorometer, mikroskopi for upconversion luminescence og NIR fotolyse tilstand og epifluorescensmikroskop og UV fotolyse tilstand og opsætningen af eksperimenterende anvendt til dette eksperiment er illustreret i figur 2.
- Udstyr fluorescens mikroskop med en lys metalhalogen guide, instrueret i ryggen port.
Bemærk: I stiens øverste lag lys hvor der er en terning tårn, én terning position skal være tom at tillade NIR kommer fra det lavere niveau lys cmds - Installere en afstemmelige 0,5 til 8.0 W 980 nm laserdiode i højre side-port med side-port kollimator åben.
Bemærk: Dette forstørrer laser lys plet til omkring 500 µm i diameter, når en 10 X formålet objektivet er brugt. At fjerne denne kollimator resulterer i en mikrometer-range lys plet og gør NIR celle bestråling upraktisk. Denne kollimator er NIR-gennemsigtig. - Installere en dichroic spejl (850-nm kort-pass) og en excitation filter (950 nm long-pass) i det lavere niveau lys sti.
- Bruger en UCNP løsning til at visualisere NIR lys plet. Justere placeringen af laser til at centrere NIR lysstråle i synsfelt at afslutte tilpasningen.
3. Forberedelse og karakterisering af bur PKA-UCNP konstruere
- Incubate rekombinant PKA (9 µM) med 0,5 mM 2-nitrobenzylbromide (NBB) i bure buffer (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl og 10 mM MgCl 2, pH 8,5) i 1-2 timer ved 25 ° C. dæmpningen den overskydende NBB med 10 mM dthiothreitol (DTT) og derefter dialyze mod 4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-ethanesulfonic syre (HEPES) buffer (10 mM, pH 7,5) at fjerne overskydende reagenser og salte.
Bemærk: pH i opløsningen anbringelse i bur er sænket fra 8,5 til 7.5 under dialyse med HEPES pH 7,5 for efterfølgende immobilisering reaktion. - Mix lanthanide salte-Y(CH3CO2) 3 hydrat (99,9%, 0.4527 g, 1,38 mmol), Yb (CH 3 CO 2) 3 hydrat (99,9%, 0.2533 g, 0,60 mmol) og Tm (CH 3 CO 2) 3 hydrat (99,9%, 0.0168 g, 0,02 mmol)-i octadecene (30 mL) og oliesyre (12 mL), opvarmes blandingen til 115 ° C i 30 min og afkøles til 50 ° C. Dernæst opløses reaktionsblandingen i en methanol løsning (20 mL) med 0,2 g (5,0 mmol) NaOH pellet og 0.2964 g (8 mmol) af ammonium fluor ved hjælp af sonikering i 15 min. hæve temperaturen i reaktion til 300 ° C for at få UCNP kernen (β-NaYF 4 : 1,0% Tm 3 + / 30% Yb 3 +) nanopartikler.
- Opløses core nanopartikler (25 mg) med CO-520 (0,5 mL) i cyklohexan (10 mL). Tilføj ammoniak (wt 30% v/v, 0,08 mL) og tetraethylorthosilicate (TEOS, 0,04 mL) og anvende konstant omrøring i 12 timer ved stuetemperatur til at få silica-belagt β-NaYF 4: 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + core nanopartikler.
- Ruger PKA (6 nmol) eller bur PKA (6 nmol) med UCNP (1 mg) 15 i HEPES buffer (10 mM, pH 7,5) ved 4 ° C til 3 h til at immobilisere PKA på silica-belagt UCNP via elektrostatiske interaktioner.
- Filter blandingen ved hjælp af PVDF filter (0,45 µm), centrifuge på 17.000 x g i 10 min. ved 4 ° C, og redisperse pellet i HEPES (50 µL, 10 mM, pH 7,5) der indeholder 0,1% protein stabilisator at få renset PKA-UCNP komplekset. Der centrifugeres ved 17.000 x g i 10 min. ved 4 ° C og indsamle supernatanten til en Bradford assay i en 1,5 mL tube.
- Analysere den ubegrænsede PKA i supernatanten gemt fra trin 3.5 med en Bradford assay for at back-Beregn PKA substitution niveau på UCNP partiklerne, der normalt har en substitution niveau af ~ 4,5 nmol af PKA pr. mg af partikel.
Bemærk: Bradford analysen afslører en stærk blå farve på pellets, hvilket tyder på et højt niveau og stabil protein immobilisering uden desorption, mens den supernatanten brøkdel af bur PKA-UCNP løsning viser en farve svarende til HEPES buffer ( figur 4 c-4e).
4. Karakterisering
Bemærk: kinase analysen bruges til at kvantificere de specifikke aktivitet af pyruvat kinase. Kort sagt, resulterer fosforylering af peptid, som er koblet til pyruvat kinase og laktat dehydrogenase, i oxidationen af NADH. Dannelsen af sidstnævnte kontrolleres ved at måle fald i absorbans af NADH ved 340 nm.
- Bestem aktivitet af PKA og PKA-UCNP i en 60 µL samlede volumen af assay blanding indeholdende 4-morpholinepropanesulfonic syre (MOPS, 100 mM, pH 7,5), KCl (100 mM), phosphoenolpyruvat (PEP, 1 mM), adenosin trifosfat (ATP, 1 mM), β - nicotinamid-adenin-dinucleotid, reduceret form (NADH, 0,8 mM), magnesiumchlorid (MgCl 2, 1 mM), kemptide (0,4 mM) og en pyruvat kinase/laktat dehydrogenase blanding (30/40 enheder af PK/LDH).
- Måler faldet i NADH absorbans over tid efter tilsætning af PKA løsning (2 µL) assay blanding. Beregne hældningen af linjen direkte afspejler aktiviteten af den kinase måles.
- Måler aktiviteten af PKA-UCNP 15 og den samlede aktivitet, som bør være godt matchet med produktets multiplikation af indfødte PKA-specifikke aktivitet og det beregnede PKA overflade-belagt beløb.
5. Fotolyse Setup
- Measure alle strøm af lys kilder ved hjælp af en termisk bunke sensoren og Beregn effekttætheder (PD = effekt (W) / område (cm 2)) 18 baseret på området lys plet.
- Udfører in vitro- UV fotolyse eksperimenter på et kommercielt system med en 365 nm LED (200 mW/cm 2) 15.
- For UV photoactivation på stadiet mikroskop belyse PKA-UCNP løsning med excitation lys filtreret af en kommerciel cube 15.
Bemærk: Effekttætheden er ~ 15 mW/cm 2, uden mål objektivet fokuserer. - For in vitro- NIR photoactivation på stadiet mikroskop, belyse PKA-UCNP løsning ved hjælp af en 980 nm laser med tilpassede upconversion filter/spejl indstillinger installeret på lavere niveau lys sti, en dichroic spejl (850 nm kort-pass), og en magnetisering filter (950 nm long-pass).
Bemærk: Output effekttæthed er 5 W/cm 2 før 4 X mål linse fokus. Effekttætheden skønnes for at være ~ 68 W/cm 2 efter 4 X mål objektivet fokuserer.
6. Celle prøveforberedelsen og mikroinjektion af PKA-UCNP komplekser
- pre filtrere prøverne gennem et 0,45 µm filter efter PKA immobilisering (trin 3,5).
- Ruger celler i 10% føtal bovint serum (FBS) indeholdende L-15 medium for stabil pH kontrol uden for Væksthuset i perioden mikroinjektion.
Bemærk: for at bekræfte mikroinjektion fuldførelse, co injicere indfødte PKA-UCNP, bur PKA-UCNP eller PEGylated UCNP (7,5 mg/mL) 15 med 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) (10 µM) i celler. - Justere koncentrationen af PKA-UCNP partiklerne således, at efter mikroinjektion, cytosole koncentrationen er 1-3 μM PKA - en fysiologiske koncentrationsområde for PKA i en celle med den antagelse, at Injektionsvolumen er 1/10 af cellulære volumen .
- Udføre mikroinjektion ind i cellerne (trin 6.2) ved hjælp af en microinjector enhed kombineret med en one-akse hydrauliske micromanipulator ( figur 3).
- Bruge en digital trykmåler at overvåge pres fra microinjector er i driftsområdet (~ 50-200 hPa) og forsegle dispenser ventilen i et tilpasset pres kammer at give kompensation pres for mikroinjektion. Trække sig tilbage nålen ved hjælp af en puller.
- Vedligehold indsprøjtning pres mellem 50 og 75 hPa, med en injektion tid på 200-300 ms og kompensation pres på 15 hPa at forhindre næringssubstratet tilbagestrømning til nålen ved kapillaritet.
- Undersøge tip åbninger af nåle til at sikre, at de har en udvendig diameter mellem 1,3 og 1,5 µm, der kan bekræftes ved at tage billeder ved hjælp af en 40 x mål linse.
- Vaske cellerne med 2 mL af L-15 medium indeholdende 10% FBS efter mikroinjektion. Observere cellulære fluorescens imaging fra 5 (6) - carboxytetramethyl - rodamin (TAMRA) skal bekræfte fuldførelse af mikroinjektion.
7. Photoactivation af bur PKA-UCNP ved hjælp af UV- eller NIR lys i levende celler
- For UV photoactivation efter mikroinjektion PKA-UCNP vokse REF52 celler på en 3,5 µm parabol, placere dem på stadiet mikroskop og bestråle dem med UV-lys filtreret af cube i 3 min. uden objektive linse fokus.
Bemærk: REF52 celler blev opretholdt i DMEM som indeholder 10% FBS ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator, og celler var subcultured når confluency nået til 90% hver 2-3 dage. - I NIR photoactivation efter PKA-UCNP mikroinjektion, belyse celler på en 980-nm laser fra lower-tier filter/spejl indstillinger, som beskrevet i trin 5.4.
Bemærk: Tæthed effekt er 5 W/cm 2 før 10 X mål linse fokus og er anslået til at være 300 W/cm 2 efter 10 x mål linse fokus. Upconversion er en proces, der kræver en høj photon tæthed, især når et større skift i anti-Stoke er nødvendig. Derfor fokuserer er nødvendig under photoactivation. - Når der er behov for en større lys plet (650 µm x 520 µm) bestråle disse celler med NIR fokuseret af en 10 x mål linse med en kollimator for 15 min. Tillad for en 5 min mørke interval efter hver 5-min bestråling til at undgå opvarmning.
Bemærk: Når en høj rummæssige (subcellulært lys plet) er nødvendig, bruge 40 X mål linse med en pinhole installeret i exit slutningen af lys guide til at generere en subcellulært-dimension lys plet (5 µm x 4 µm). I dette tilfælde 1 s af bestråling er nok for NIR photoactivation på grund af den høje flux af fotoner. - Efter UV eller NIR fotolyse, tillader cellerne til at inddrive i en 5% CO 2 inkubator ved 37 ° C i 1 time i komplet medium til at generere cellulære svar. Senere ordne dem i 1 mL af 4% PARAFORMALDEHYD/fosfatbufferet saltopløsning (PBS) i 20 min. før yderligere farvning.
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er meget giftigt; undgå kontakt med hud, øjne og slimhinder. Undgå vejrtrækning pulveret under måling og forberedelse.
8. Visualisering af Stress Fiber nedbrydning forårsaget af NIR Photoactivation
- efter fiksering, bruge Alexa 594-phalloidin (tilføje 5 µL af 6,6 µM stamopløsning til 200 µL af PBS for farvning, inkuberes i 25 min ved stuetemperatur) at pletten og visualisere stress fibre. Visualisere de billeder af Alexa 594-phalloidin (Ex 581 nm/Em 609 nm) ved hjælp af et filtersæt.
- Ruger celler i 5 min i 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ved stuetemperatur. Efter farvning, vaske prøver med PBS og separat tage fluorescerende billeder af stress fibre og kerner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Design af bur enzym-UCNP konstruktion er illustreret i figur 1. PKA enzym blev først reagerede med 2-nitrobenzyl methylbromid til at generere en inaktiv bur PKA, og det blev derefter elektrostatisk immobiliseret på overfladen af UCNP. UCNPs udsender upconverted lys og derfor spaltes photolytically o-nitrobenzyl grupper på Cys 199 og Cys 343, genererer den aktiverede PKA. TEM billeder og Bradford assay bekræftet at PKA og bur PKA var immobiliseret på overfladen af UCNPs, og kinase aktiviteten af bur PKA-UCNP løsning efter UV photoactivation blev analyseret (figur 4). Efter PKA immobilisering, afslørede en dynamisk lysspredning instrument størrelse og zeta potentiale af PKA-partikel kompleks til at blive 120 nm og-16.0 mV, henholdsvis. Bradford assay af PKA-UCNP løsning viste en stærk lilla farve på partiklerne, hvilket tyder på et højt niveau og stabil protein immobilisering.
REF52 rotte embryonale fibroblastceller blev udvalgt til undersøgelse af photoactivation i de cellulære eksperiment. I dette eksperiment kan være tændt PKA pathway af endogene PKA aktivering (som er udløst af inkubation af celle-gennemtrængelige 8-CPT-cAMP) eller mikroinjektion af den aktive eller triggerable PKA. Aktiveret PKA (med eller uden partikel immobilisering) opløses stress fibre og udsætter mere trådformede actin (F-actin) overflade og dermed fluorophore-mærket phalloidin, som kraftigt binder til F-actin, hvilket giver en højere farvning signal. Efter 8-CPT-cAMP inkubation eller mikroinjektion af gratis PKA, aktive PKA-UCNP eller UV-aktiveret PKA-UCNP (som positiv-control forsøg) bekræftet vi tilstedeværelsen af stærke stress fiber nedbrydning forårsaget af PKA aktiveringsvej (figur 5). Både endogene PKA og microinjected PKA undersøgelser viser hele-cell stress fiber opløsning, mens partikel-immobiliseret PKA (aktive PKA-UCNP og UV-aktiveret PKA-UCNP) viser stress fiber opløsning kun på webstedet mikroinjektion yderligere at foreslå den stabile immobilisering af PKA på UCNPs. NIR photoactivation eksperiment, efter mikroinjektion af den bur PKA-UCNP og bestråling NIR UCNPs udsender upconverted lys og spaltes i o-nitrobenzyl grupper på Cys 199 og Cys 343. Derfor, de genererer den aktiverede PKA, opløst stress fibre, og give en højere signal ved fluorophore-mærket phalloidin farvning (figur 6). Negativ-control forsøg på REF52 celler microinjected med UCNP uden den bur PKA og derefter NIR-bestrålet, samt REF52 celler med bur PKA-UCNP i mangel af bestråling, viste ingen effekt på stress fiber integritet.
Figur 1 . Illustration af bur PKA-UCNP Design og Upconversion-assisteret PKA Uncaging. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: En Cutaway Diagram viser ordningen lys sti. (en) ændret spectrofluorometer og (b) mikroskop for upconversion luminescence og NIR fotolyse tilstand (til venstre) og epifluorescensmikroskop og UV fotolyse mode (til højre), såvel som deres eksperimentelle setup. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Eksperimentel opsætning for mikroinjektion. Indehaveren af injektion er kombineret med en one-akse olie hydrauliske micromanipulator i en vinkel mellem 30° og 45°. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Bekræftelse af PKA immobilisering på UCNP. TEM billeder af (en) silica-belagte UCNP og (b) bur PKA-ubevaegeligt UCNP; Bradford assay (c) HEPES buffer, (d) pelleten brøkdel ophvirvling af bur PKA-UCNP løsning, og (e) supernatanten brøkdel af bur PKA-UCNP løsning; og (f) kinase aktivitet assay af bur PKA-UCNP løsning efter UV photoactivation. Dette tal er blevet gengivet fra Gao, H.-D. et al. efter udtrykkelig tilladelse var indhentet fra publisher, American Chemical Society. Skalalinjen = 20 nm venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Fluorescens billeder af Stress Fiber farvning (grøn) og DAPI farvningen af kerner (blå) af REF52 celler, der viser Stress Fiber desintegration og morfologiske ændringer udløst af forskellige PKA aktivisering. (en) Untreated celler, (b) 8-(4-Chlorophenylthio) adenosin 3', 5'-cyklisk monophosphate (8-CPT-cAMP)-behandlede celler, (c) aktive PKA-microinjected celler, (d) aktive PKA-UCNP-microinjected celler og ( e) bur PKA-UCNP-microinjected celler efter UV-bestråling. (f-j) Optisk densitet (OD) billeder stammer fra (a-e), henholdsvis. (k-o) De tilsvarende intensitet kurver langs den blå pil. Den hvide pil viser cellen microinjected. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Fluorescens billeder af REF52 celler Microinjected med forskellige PKA former. Celler microinjected med (en) bur PKA-UCNP efter NIR bestråling, (b) PIND-podede UCNP under NIR bestråling, og (c) bur PKA-UCNP uden bestråling. (d-f) Upconverted emission af UCNP (i boksen stiplet) for (a-c). (g-i) Flettede billeder af stress fibre (grøn), upconversion emissioner (rød) af den komplekse UCNP og DAPI farvningen af kerner (blå). NIR photoactivation af celler blev udført på en lysende område på 650 µm x520 µm ved hjælp af en 10 X mål linse. Fluorescens billeder blev erhvervet ved hjælp af en 40 X mål linse. Derfor, NIR bestråling område var reduceret til 150 µm x 120 µm, som angivet i boksen stiplet rød. Upconversion luminescence kan ses i (c). For kvantificering undersøgelser ved hjælp af ImageJ, blev OD billeder (j-l) afledt fra (a-c), henholdsvis. Intensitet kurver langs den blå pil vises i (j-l) blev afbildet i (m-o). Et højt signal / støj-forhold (S/N) blev observeret for dette system og anses for at være et positivt svar. Denne tilgang blev anvendt for alle Alexa 594-phalloidin farvning kvantificeringer. Den hvide pil viser cellen microinjected. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere fandt Hofmann og kolleger, at dramatiske morfologiske ændringer blev observeret i REF52 celler efter mikroinjektion af den gratis PKA19. I en anden undersøgelse viste gruppen Lawrence at bur PKA kan være aktiveret i vivo, førende til morfologiske ændringer og opløsningen af stress fibre når de udsættes for UV fotolyse20. Tidligere rapporter om at udnytte upconverted UV lys til photoactivation viste aktivering af flere UCNP-assisteret, bur, små molekylære bioeffectors21,22,23. En protokol til at bruge UCNP-assisteret photoactivation på de vigtigste klasse af bioeffector, enzymet, bør imidlertid stadig skal udvikles. Derfor, i denne undersøgelse, vi beskriver en cellulær eksperiment protokol, der omfatter NIR photoactivation af bur PKA ved hjælp af UCNPs. I denne NIR photoactivation platform, blev bur PKA20 immobiliseret på overfladen af silica-belagt UCNPs brugt til at demonstrere muligheden for at kontrollere signaltransduktion pathway af cellen ved hjælp af NIR som en udløser. REF52 celler microinjected med et bur PKA-UCNP konstruere og bestrålet med NIR viste en effekt på stress fiber opløsning samt morfologiske forandringer i celler. Derudover var positiv og negativ kontrol eksperimenter udført og bevist at PKA-induceret vejen fører til nedbrydning af stress fibre er udløst af NIR bestråling.
Instrument ændring er beskrevet i dette manuskript, mens PKA kemiske modifikation er veldokumenteret andetsteds15. Hvis en veldesignet eksperiment kræver fejlfinding, først fastslå, om problemerne, der er genereret fra: (i) den protein-UCNP kompleks, (ii) mikroinjektion eller (iii) optisk instrumentation. I tilfælde af protein photoactivation problemer: (1) make sure at PKA er aktiv, (2) bekræfter, at den bur PKA har resterende aktivitet, der er < 5% af sin oprindelige værdi, (3) konstatere at UV-uncaged PKA har mindst 50% af dens aktivitet, restaureret, (4) make sure at den bur PKA er immobiliseret på UCNP overflade (udføre en Bradford assay), og (5) sikre, at den bur PKA-UCNP også har mindst 50% af dens aktivitet, restaureret (af udfører UV-bestråling). For mikroinjektion problemer: (1) Sørg for at nålen tip er åben og protein-UCNP løsning er indlæst korrekt. Placer den indlæste nål (tip) på et mikroskop med en NIR excitation kanal. Hvis upconversion Fluorescens er observeret, er lastning korrekte. (2) indsprøjtes protein-UCNP ind i cellerne og observere fluorescens-intensiteten af co injiceres 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) farvestof og upconversion partikel. Korrekt injektion medfører intens TAMRA og upconversion partikel fluorescens i cellerne. Til mikroskop optisk ændring fejlfinding: (1) fjerne mål linse, tænde NIR laser, og sætte termisk bunke power meter sensor på stadiet mikroskop til at måle NIR, som ikke bør blokeres af en forkert indstilling. (2) installere mål linse og sætte en gennemsigtig bund kuvette fyldt med 10 mg/mL UCNP løsning på stadiet mikroskop. En skarp blå stråle i løsningen vil ses, hvis optikken er alt installeret korrekt.
Mikroinjektion kan kun give et begrænset antal celler til analyse. Injektion succesrate er operatør (eller oplevelsen)-afhængige, hvilket er en stor begrænsning af denne teknik. Men der er ingen anden måde at omgå det hidtil. Mange forskere tyder på, at brugen af partikel-celle inkubation giver celler til optagelse af partikler. Dette er imidlertid ikke en realistisk tilgang. Selvom cellulære partikel optagelse opstår og optagelse er nok, vil det ophobes i endosomes/lysosomer, men ikke i cytosol. Denne specifikke signaltransduktion enzym skal være placeret i cytosol, ikke endosomes, at være effektiv. Desuden, når PKA er opløst i en perfekt opbevaring buffer ved 37 ° C, dens aktivitet ikke vare efter natten opbevaring. Enzym stabilitet i cellekulturmedium er endnu kortere, og det gør metoden inkubation upraktisk.
Dette rapporterede instrumentalt setup, mikroinjektion og kinase NIR photoactivation protokol bør generelt gældende, ikke kun for kemisk modificerede kinase, men også for andre protein eller enzym klasser. Det ville desuden være nyttigt i cellular undersøgelser hvor direkte UV-stråling er uønsket. Derudover kan bur bioeffector-UCNP-komplekset interagere med ekstracellulære mål, såsom Membranproteiner eller membranreceptorer, undgå intracellulære levering problem og at gøre platformen gældende i vivo brug. Efter I.V. injektion har bur protein hormoner eller terapeutiske proteiner aktiveret form af bioeffector kun i NIR-bestrålede områder.
Mikroinjektion er den mest afgørende skridt i denne protokol. For præcis injektion, undgå bobler under nålen lastning. Efter ladning, straks installere nålen i injektoren og fordybe needle-tip i medium at forhindre nål spidsen tørrer, som vil forårsage tilstopning. Mikroinjektion operatør dygtighed er afgørende for en vellykket injektion sats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Nano videnskab og teknologi Program af Academia Sinica og ministeriet for videnskab og teknologi i Taiwan for finansiering (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Ammonium hydroxide (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
