Summary
Dans ce protocole, "cage" protéine kinase A (PKA), un bioeffector de transduction du signal cellulaire, a été immobilisé sur une surface de nanoparticules, micro dans le cytosol et activé par l’upconvertis UV lumière par irradiation de proche infrarouge (NIR), induisant désintégration de fibre stress en aval dans le cytosol.
Abstract
Nanoparticules de conversion ascendante (UCNP)-médiation photoactivation est une nouvelle approche de contrôle à distance des bioeffectors beaucoup moins phototoxicité et avec une pénétration plus profonde des tissus. Toutefois, les instruments existants sur le marché ne sont pas difficilement compatibles avec l’application de conversion ascendante. Par conséquent, modifier l’instrument disponible dans le commerce est essentiel pour cette recherche. Dans cet article, nous illustrons tout d’abord les modifications d’un fluorimètre conventionnel et le microscope à fluorescence pour les rendre compatibles pour des expériences de conversion ascendante de photon. Nous décrivons ensuite la synthèse d’un proche infrarouge (NIR)-a déclenché la sous-unité catalytique kinase A (PKA) de "cage" protéine immobilisé sur un complexe UCNP. On rapporte également les paramètres pour microinjection et procédures de photoactivation NIR. Après que la "cage" PKA-UCNP est microinjected dans les cellules de fibroblaste de REF52, l’irradiation de NIR, qui est nettement supérieure à une irradiation UV classique, déclenche efficacement la voie de transduction de signal PKA dans les cellules vivantes. En outre, les expériences positives et négatives de témoins confirment que la voie induite par la PKA menant à la désintégration des fibres de stress est spécifiquement déclenchée par une irradiation NIR. Ainsi, l’utilisation de protéines modifiées UCNP fournit une approche novatrice pour contrôler à distance les expériences cellulaires lumière modulée, dans lequel une exposition directe aux rayons ultraviolets doit être évitée.
Introduction
Modifiés chimiquement les protéines qui peuvent être photoactivées (par exemple, les protéines PKA en cage) ont été développés dans un domaine émergent en biologie chimique à manipuler non invasive des processus biochimiques intercellulaire1,2 ,3. En utilisant la lumière comme un stimulus offre une résolution spatio-temporelle excellente lors de l’activation de ces protéines mis en cage. Toutefois, lumière UV peut causer intempestif des changements morphologiques, l’apoptose et dommages à l’ADN de cellules4,5. Par conséquent, des développements récents dans la conception des groupes photocaging se concentrent sur permettant photoclivage à excitation biphotonique ou de plus longues longueurs d’onde pour réduire la phototoxicité, ainsi qu’à accroître la pénétration profonde des tissus6,7. Mise en cage des groupes qui répondent aux plus longue longueur d’onde, ce qui nous permet de choisir adaptés libération longueurs d’onde (c.-à-d., canaux) à sélectivement activer bioeffectors lorsque deux ou plus groupes mise en cage sont présents7. Compte tenu de ces caractéristiques utiles, développer de nouveaux groupes de feux rouges photocaging est très important travail en amont des méthodes photochimiques pour des études biologiques allant de sonder les mécanismes des réactions à la maîtrise des activités cellulaires8. Néanmoins, un groupe de mise en cage de deux photons est normalement trop hydrophobe en raison de la structure de fondu aromatique et un groupe de mise en cage de lumière visible est normalement organométallique, avec des ligands aromatiques. Cette propriété hydrophobe/aromatique n’est pas adaptée quand le bioeffector est une protéine ou une enzyme, car elle dénature le site de l’activation de l’enzyme/protéines et provoque une perte de fonction, même si la conjugaison et la photolyse fonctionnent toujours sur le plan chimique2 ,,9.
UCNPs sont des transducteurs efficaces qui convertissent la lumière d’excitation NIR aux UV. Cette propriété unique et fascinante de UCNPs a offert des résolutions réalistes pour relever les défis associés à photoactivation et déclenchement la libération contrôlée de petites molécules, dont10de l’acide folique, cisplatine, dérivés11 ,12, copolymère vésicules13et particules creuses14ADN/siARN. Cependant, au meilleur de nos connaissances, la photoactivation UCNP assistée d’enzymes ou protéines n'a pas été testée jusqu'à présent. Parce qu’il n’y a aucun cas de réussite de l’utilisation de lumière rouge ou NIR à photoactifs une enzyme, nous a invités à procéder à l’activation déclenchée NIR d’une structure de protéine/enzyme composée de complexes enzyme "cage" chimiquement modifiée avec un enrobées de silice, lanthanide dopé UCNP15. Dans cette étude, la UCNP était conjugué avec une kinase de transduction de signal rapidement réagir sous forme de "cage" PKA. PKA contrôle la synthèse du glycogène et la régulation du cytosquelette qui répond à des stimuli externes par l’intermédiaire de règlement de phosphate (cAMP) de l’adénosine cyclique dans le cytosol16. Nous avons étudié la faisabilité de l’activation de l’enzyme dans les mœurs temporelles et spatiales dans une expérience cellulaire après irradiation NIR. Cette plate-forme de photoactivation assistée par UCNP est une nouvelle méthodologie pour photoactivate une enzyme à l’aide de NIR et évite la réponse de transduction de signal indésiré de cellules causés par conventionnel UV irradiation2,4.
Il est très difficile d’effectuer des transferts bioeffectors grand (p. ex., protéines) à travers la membrane cellulaire pour contrôler l’activité cellulaire. Bien qu’immobilisé particule protéique peut être plus facile d’effectuer des transferts par endocytose dans le cytosol, endocytose peut-être être endommagé ou dégradé via endosomale provocation policière et la dégradation lysosomiale conséquente2,4. Même si la protéine "cage" fonctionne toujours après la translocation de la membrane, les montants transférés ne suffisent pas pour déclencher la réaction cellulaire2,17. Contraste, microinjection est une approche directe et quantitative pour livrer des grands bioeffectors dans le cytoplasme de la cellule. En outre, bioeffector UCNP-immobilisé nécessite upconvertis lumière d’être activé. Par conséquent, l’instrumentation optique nécessite encore une modification de mesurer, visualiser et d’utiliser la lumière upconversion. Dans ce travail, la livraison d’un complexe de PKA-UCNP en cage dans une cellule à l’aide de la microinjection et les modifications essentielles suivantes en microscopie et spectroscopie pour NIR photoactivation sera décrite en détail.
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Protocol
Remarque : le protocole décrit une modification d’instrumentation détaillée de photoactivation upconversion assistée, une méthode de synthèse pour générer avec cage PKA-UCNP, microscopie électronique à transmission (TEM) de la UCNP enrobées de silice et mis en cage d’échantillons de PKA-UCNP, installation de photolyse UV et NIR, préparation de cellules, microinjection PKA-UCNP, une étude de photoactivation et la coloration de fibres de stress des cellules REF52.
1. fluorimètre Setup pour la mesure du spectre Upconversion
- installer un objectif 4 X à côté de la titulaire de la cuvette du spectromètre fluorescence afin que le laser est axé sur le milieu de la cuve.
- Placer une diode laser accordable de 980 nm 0,5 - 8 W 90° contre le porte-objectif.
ATTENTION : L’opérateur doit avoir des connaissances en sécurité laser et porter des lunettes de protection laser NIR. - Installer un miroir de réflectance complet à l’intersection de trajet optique de la lentille de l’objectif et le laser. Placez une plaque de métal anodisée noire pour bloquer la fenêtre de l’excitation de la spectroscopie et de protéger les parties intérieures.
- Placer la cuve de solution UCNP enrobées de silice (0,2 – 0,6 mg/mL) dans le porte-cuvette afin qu’un faisceau lumineux upconversion peut être visualisé et peut être utilisé pour régler l’alignement lumineux meilleur pour installation miroir.
- Passer la spectroscopie de luminescence mode avec réglage de tension plus bas PMT (ajuster à un réglage plus élevé si le signal est trop faible). Ajuster le miroir pour l’orientation optimale, où le faisceau se trouve au milieu de la cuvette et le PMT capte le signal le plus fort.
- Mesurer le spectre de la conversion ascendante, après mise en conformité, avec le réglage de la puissance désirée. Utiliser un mesureur de puissance thermique de pile pour construire une courbe d’étalonnage de la puissance du laser contre la lecture de courante électrique sur l’alimentation du laser. Vérifier constamment la performance laser pour s’assurer que la performance se situe entre calibré.
2. Configuration de microscope
Remarque : la configuration suivante fonctionne pour microscopes équipés de deux niveaux de trajet optique. Si l’utilisateur a l’intention d’installer un commutateur de source lumineuse d’excitation dans le port arrière pour faire le laser NIR et la lampe haloïde partager le même port, le collimateur dans le port arrière se bloque significativement le RNI parce qu’il est conçu pour réduire le chauffage de l’échantillon. L’utilisateur doit faire un choix difficile : garder le collimateur souffrent d’upconversion très faible efficacité, ou enlever le collimateur et sacrifier l’intensité d’excitation lumineuse pour l’épifluorescence.
Remarque : un schéma en coupe montrant le schéma de trajet optique pour un spectrofluorimètre modifié, la microscopie pour upconversion luminescence et NIR photolyse mode et épifluorescence mode de photolyse UV et expérimental utilisé pour cette expérience sont illustrées à la Figure 2.
Guide- Equip le microscope à fluorescence avec un halogénure en métal léger, dirigée vers l’arrière port.
Remarque : dans ce chemin de lumière de palier supérieur où il y a une tourelle de cube, un cube position doit être vide pour permettre NIR venant de la couche basse lumière chemin. - Installer une diode de laser accordable pour 0,5 à 8,0 W 980 nm dans le port de droite, avec le collimateur orifice ouvert.
Remarque : Cela agrandit le laser lumière spot à environ 500 µm diamètre lorsqu’un objectif de 10 X est utilisé. Enlever ce collimateur se traduit par une tache lumineuse-micromètre et fait irradiation cellule NIR est impossible. Ce collimateur est transparent NIR. - Installer un miroir dichroïque (850 nm court-pass) et un filtre d’excitation (long-col de 950 nm) dans la couche basse lumière chemin d’accès.
- Utiliser une solution UCNP pour visualiser le spot lumineux de NIR. Ajustez la position du laser pour centrer le faisceau lumineux de NIR dans le champ de vision à la fin de l’alignement.
3. Préparation et caractérisation de PKA-UCNP avec cage construire
- incuber PKA recombinante (9 µM) avec 0,5 mM 2-nitrobenzylbromide (BNB) dans la mise en cage tampon (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl et 10 mM MgCl 2 ; pH 8,5) pendant 1-2 h à 25 ° C. Quench la BNB excès avec 10 mM dthiothreitol (TNT) et puis dialyser contre 4-(2-hydroxyéthyl) tampon (10 mM, pH 7,5) pour enlever l’excès réactifs et sels de pipérazine-1-ethanesulfonic acide (HEPES).
Nota : Le pH de la solution mise en cage est abaissé de 8,5 à 7,5 pendant la dialyse dont le pH est HEPES 7.5 pour la réaction d’immobilisation ultérieure. - Mix le lanthanide sels-Y(CH3CO2) 3 l’hydrate (99,9 %, 0,4527 g, 1,38 mmol), Yb (CH 3 CO 2) 3 hydrate (99,9 %, 0,2533 g, 0,60 mmol) et Tm (CH 3 CO 2) 3 hydrate (99,9 %, 0,0168 g, 0.02 mmol)-octadecene (30 mL) et en acide oléique (12 mL), chauffer le mélange à 115 ° C pendant 30 minutes et refroidir à 50 ° C. Ensuite, dissoudre le mélange réactionnel dans une solution méthanolique (20 mL) avec 0,2 g (5,0 mmol) de NaOH pellet et 0,2964 g (8 mmol) de fluorure d’ammonium par sonication pendant 15 min. Augmentez la température de réaction à 300 ° C pour obtenir le noyau UCNP (β-Chana 4 : 1,0 % Tm 3 + / 30 % Yb 3 +) nanoparticules.
- Dissoudre les nanoparticules de base (25 mg) avec CO-520 (0,5 mL) dans le cyclohexane (10 mL). Ajouter orthosilicate (TEOS, 0,04 mL) et l’ammoniac (wt 30 % v/v, 0,08 mL) et appliquer une agitation constante pendant 12 h à température ambiante pour obtenir le β-Chana enrobées de silice 4 : 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + noyau nanoparticules.
- Incuber le PKA (6 nmol) ou mis en cage de PKA (6 nmol) avec UCNP (1 mg) 15 dans un tampon HEPES (10 mM, pH 7,5) à 4 ° C pendant 3 h immobiliser le PKA sur enrobées de silice UCNP via des interactions électrostatiques.
- Filtrer le mélange à l’aide de filtre PVDF (0,45 µm), centrifuger à 17 000 x g pendant 10 min à 4 ° C et redisperse le culot dans HEPES (50 µL, 10 mM, pH 7,5) contenant 0,1 % protéines stabilisantes pour obtenir le complexe purifié de la PKA-UCNP. Centrifuger à 17 000 x g pendant 10 min à 4 ° C et recueillir le surnageant pour un dosage de Bradford dans un tube de 1,5 mL.
- Analyser le PKA illimité dans le surnageant sauvé de l’étape 3.5 avec un dosage de Bradford pour dos-calculer le degré de substitution de PKA sur les particules UCNP, qui ont normalement un niveau de substitution de ~ 4,5 nmol de PKA par mg de particule.
Remarque : L’analyse de Bradford révèle une forte couleur bleue sur les pellets, qui suggère une immobilisation de teneur élevée en protéines de niveau et stable sans la désorption, tandis que la fraction surnageante du caged solution PKA-UCNP montre une couleur semblable à (tampon HEPES figure 4 c-4F).
4. Caractérisation
Remarque : l’analyse de la kinase est utilisée pour quantifier l’activité spécifique de la pyruvate kinase. En bref, la phosphorylation du peptide, qui est couplé à la kinase de pyruvate et de lactate déshydrogénase, entraîne l’oxydation du NADH. La formation de ce dernier est surveillée en mesurant la diminution de l’absorption du NADH à 340 nm.
- Déterminer l’activité de la PKA et PKA-UCNP dans un volume total de 60 µL du mélange d’essai contenant de l’acide 4-morpholinepropanesulfonic (MOPS, 100 mM, pH 7,5), KCl (100 mM), phosphoénolpyruvate (PEP, 1 mM), l’adénosine triphosphate (ATP, 1 mM), β - nicotinamide adénine dinucléotide, réduit la forme (NADH, 0,8 mM), le chlorure de magnésium (MgCl 2, 1 mM), kemptide (0,4 mM) et un mélange de déshydrogénase pyruvate kinase/lactate (30/40 unités de PK/LDH).
- Mesurer la diminution de l’absorbance de NADH au fil du temps après l’addition de solution de PKA (2 µL) au mélange de dosage. Calculer la pente de la ligne pour refléter directement l’activité de la kinase mesurée.
- Mesurent l’activité de la PKA-UCNP 15 et l’activité globale, qui devrait être s’alliant parfaitement avec le produit de la multiplication des indigène activité PKA-spécifique et le montant calculé de revêtu de PKA.
5. Photolyse Setup
- ameURE toute puissance de la lumière des sources à l’aide d’un capteur thermique de pile et calculer des densités de puissance (PD = puissance (W) / zone (cm 2)) 18 basé sur la zone de lumière spot.
- Effectuer des expériences de photolyse en vitro UV sur un système commercial avec un 365 nm LED (200 mW/cm 2) 15.
- Pour UV photoactivation sur la platine du microscope, illuminer la solution PKA-UCNP avec l’excitation lumière filtrée par un cube commercial 15.
Remarque : La densité de puissance est ~ 15 mW/cm 2, sans objectif concentrer. - Pour in vitro photoactivation NIR sur la platine du microscope, illuminer la solution PKA-UCNP à l’aide d’un laser à 980 nm avec des paramètres de filtre/miroir upconversion personnalisé installés sur le parcours lumineux de palier inférieur, un miroir dichroïque (850 nm court-pass), et un filtre d’excitation (950 nm de long-pass).
Remarque : La densité de puissance de sortie est de 5 W/cm 2 avant 4 X objectif axé. La densité de puissance est estimée à ~ 68 W/cm 2 après 4 X objectif objectif mise au point.
6. Cellule de préparation des échantillons et Complexes de la Microinjection de PKA-UCNP
- préfiltrer les échantillons à travers un filtre de 0,45 µm après immobilisation PKA (étape 3.5).
- Incuber les cellules contenant le support de L-15 pendant la période de microinjection pour contrôle du pH stable à l’extérieur de l’incubateur 10 % sérum fœtal (SVF).
NOTE : pour confirmer l’achèvement de la microinjection, co injecter le PKA-UCNP native, PKA-UCNP en cage ou PEGylated UCNP (7,5 mg/mL) 15 avec 5 6-carboxytetramethylrhodamine (Lion) (10 µM) en cellules. - Ajuster la concentration des particules PKA-UCNP telle que, après la microinjection, la concentration cytosolique est de 1 à 3 μM PKA - une plage de concentrations physiologiques de PKA dans une cellule, avec l’hypothèse que le volume d’injection est de 1/10 du volume cellulaire .
- Effectuer la microinjection dans les cellules (étape 6.2) à l’aide d’un dispositif de microinjector couplé avec un micromanipulateur hydraulique d’un axe ( Figure 3).
- Utiliser un manomètre numérique pour surveiller la pression appliquée par le microinjector est dans la plage de fonctionnement (~ 50-200 hPa) et sceller la valve distributeur dans une chambre de pressurisation personnalisée pour fournir une pression de compensation pour la microinjection. Tirez l’aiguille à l’aide d’un extracteur.
- Maintenir la pression d’injection entre 50 et 75 hPa, avec un temps d’injection de 200-300 ms et la pression de compensation à 15 hPa pour empêcher les reflux de milieu de culture en aiguille par capillarité.
- Examiner les ouvertures de la pointe des aiguilles pour s’assurer qu’ils ont un diamètre extérieur entre 1,3 et 1,5 µm, ce qui peut être confirmé en prenant des images à l’aide d’une lentille d’objectif 40 x.
- Laver les cellules avec 2 mL de milieu de L-15 contenant 10 % de FBS après la microinjection. Observer l’imagerie de fluorescence cellulaire de 5 (6) - carboxytetramethyl - rhodamine (TAMRA) pour confirmer l’achèvement de la microinjection.
7. Photoactivation de cage PKA-UCNP en utilisant les UV ou lumière NIR dans les cellules vivant
- pour UV photoactivation après la microinjection de PKA-UCNP, cultiver les cellules REF52 sur un plat de 3,5 µm, placez-les sur la platine du microscope et les irradier avec lumière UV filtré par le cube pendant 3 min sans objectif concentrer.
Remarque : REF52 cellules ont été maintenues en DMEM contenant 10 % FBS à 37 ° C dans une étuve à 2 CO 5 % et les cellules étaient repiquages lorsque la confluence atteint à 90 % tous les jours 2-3. - Pour NIR photoactivation après microinjection de PKA-UCNP, éclairer les cellules sur un laser 980 nm de paramètres de filtre/miroir de palier inférieur, comme indiqué au point 5.4.
Remarque : La densité de puissance est 5 W/cm 2 avant 10 X objectif objectif mise au point et est estimée à 300 W/cm 2 après 10 x objectif objectif mise au point. Conversion ascendante est un processus qui exige une densité élevée de photon, surtout quand un plus grand déplacement d’anti-Stoke est nécessaire. Par conséquent, mise au point est nécessaire au cours de photoactivation. - Quand il faut un plus gros spot lumineux (650 µm x 520 µm), irradier ces cellules avec NIR concentré par une lentille d’objectif 10 x avec un collimateur pendant 15 min. autoriser pour un intervalle de 5 min sombre après chaque irradiation 5 min pour éviter un échauffement.
Remarque : Lorsqu’une haute résolution spatiale (spot lumineux subcellulaire) est nécessaire d’utiliser l’objectif X 40 avec un sténopé, installé à l’extrémité de sortie de la lumière guide pour générer un spot lumineux subcellulaires-dimension (5 µm x 4 µm). Dans ce cas, 1 s de l’irradiation est suffisant pour la photoactivation NIR en raison du haut flux de photons. - Photolyse après UV ou NIR, laissez les cellules récupérer dans un incubateur à CO 5 % 2 à 37 ° C pendant 1 h dans un milieu complet pour générer des réponses cellulaires. Par la suite, fixez-les dans 1 mL de 4 % paraformaldéhyde/tampon phosphate salin (PBS) pendant 20 min avant la coloration plus.
ATTENTION : Paraformaldéhyde est hautement toxique ; éviter tout contact avec la peau, les yeux ou les muqueuses. Éviter de respirer la poudre au cours de la mesure et de préparation.
8. Visualisation du Stress fibre désintégration causée par Photoactivation NIR
- après la fixation, utiliser Alexa 594-phalloïdine (ajouter 5 µL de la solution mère de 6,6 µM à 200 µL de PBS pour souiller ; incuber pendant 25 minutes à température ambiante) sur la tache et visualiser les fibres de stress. Visualiser les images de Alexa 594-phalloïdine (Ex 581 nm/Em 609 nm) à l’aide d’un ensemble de filtre à.
- Incuber les cellules pendant 5 min dans 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à température ambiante. Après coloration, laver les échantillons avec du PBS et prendre séparément les images fluorescentes des fibres de stress et noyaux.
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Representative Results
La conception de la construction de la "cage" enzyme-UCNP est illustrée à la Figure 1. L’enzyme PKA a été tout d’abord réagir avec bromure de 2-nitrobenzyle pour générer un PKA inactif "cage", et il a été immobilisé puis électrostatiquement sur la surface du UCNP. UCNPs émettent de la lumière upconvertis et par conséquent photolyse cliver les groupes o-nitrobenzyle sur 199 Cys et 343 Cys, générant la PKA activé. Images TEM et analyse de Bradford a confirmé que le PKA et PKA en cage ont été immobilisés sur la surface de UCNPs, et l’activité de la kinase de "cage" solution de PKA-UCNP après que photoactivation UV a été dosé (Figure 4). Après l’immobilisation de la PKA, un instrument de diffusion dynamique de la lumière a révélé la taille et le potentiel zêta du complexe PKA-particule à 120 nm et -16,0 mV, respectivement. Analyse de Bradford de la solution de PKA-UCNP a montré une forte couleur pourpre sur les particules, ce qui suggère une immobilisation de la teneur élevée en protéines de stable et de niveau.
Cellules de fibroblastes embryonnaires de rat REF52 ont été sélectionnés pour l’étude de photoactivation dans l’expérience cellulaire. Dans cette expérience, la voie de la PKA peut être allumée par activation PKA endogène (qui est déclenchée par l’incubation des cellules perméables 8-CPT-cAMP) ou la microinjection de la PKA active ou -triggerable. PKA activé (avec ou sans immobilisation de la particule) désagrège les fibres de stress et expose la surface d’actine (actine-F) plus filamenteuse et donc marqués au fluorophore phalloïdine, qui se lie fortement à l’actine F, ce qui donne un signal de meilleure coloration. Après incubation de 8-CPT-cAMP ou microinjection des gratuit PKA, PKA-UCNP active ou PKA-UCNP UV-activé (comme des expériences de contrôle positif), nous avons confirmé la présence de désintégration de fibre de fortes sollicitations provoquée par l’activation de voie PKA (Figure 5). Les deux PKA endogène et micro-injection PKA études montrent désintégration de fibre stress cellule entière, tandis que particule immobilisée PKA (PKA-UCNP active et PKA-UCNP UV-activé) affiche stress fibre désintégration que sur le site de microinjection, plus ce qui suggère l’immobilisation stable de PKA sur les UCNPs. Pour l’expérience de photoactivation NIR, après la microinjection de la "cage" PKA-UCNP et l’irradiation de NIR, UCNPs émettent de la lumière upconvertis et s’attacher les groupes o-nitrobenzyle sur 199 Cys et Cys 343. En conséquence, ils génèrent le PKA activé, désintégration des fibres de stress et donnent un signal plus élevé par la phalloïdine marquée fluorophore coloration (Figure 6). Contrôle négatif des expériences sur des cellules de REF52 micro avec UCNP sans le PKA en cage et puis irradiées NIR, ainsi que des cellules REF52 avec cage PKA-UCNP en l’absence d’irradiation, montrée aucun effet sur l’intégrité de fibres de stress.
Figure 1 . Illustration de la "cage" PKA-UCNP Design et assistée par Upconversion PKA Uncaging. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Un schéma de coupe montrant le schéma du trajet de la lumière. (un) mise à jour le spectrofluorimètre) et (b) microscope upconversion luminescence et NIR la photolyse du mode (à gauche) et à épifluorescence et mode de photolyse UV (à droite), ainsi que leur montage expérimental. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Montage expérimental pour Microinjection. Le titulaire de l’injection est couplé avec un micromanipulateur hydraulique huile d’un axe incliné de 30° à 45°. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Confirmation de l’immobilisation de la PKA sur UCNP. Images TEM de (un) de silice-enduit UCNP et (b) avec cage immobilisée PKA UCNP ; Analyse de Bradford de tampon (c), HEPES, remise en suspension de fraction (d) le culot de "cage" solution PKA-UCNP et (e), le surnageant fraction de "cage" solution PKA-UCNP ; et analyse de l’activité kinase (f) de "cage" solution PKA-UCNP après photoactivation UV. Ce chiffre a été reproduit de Gao, H.-D. et al. après avait obtenu l’autorisation explicite de l’éditeur, l’American Chemical Society. Echelle = 20 nm s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Images de fluorescence des fibres de Stress (Green) la coloration et DAPI coloration des noyaux des cellules REF52 (bleu), montrant la désintégration de fibres de Stress et les changements morphologiques déclenchées par Activation PKA différents. (a) traitement des cellules, (b) 8-(4-chlorophénylthio) l’adénosine 3', 5'-monophosphate cyclique (8-CPT-cAMP)-traité de cellules, cellules de PKA-micro actifs (c), les cellules de PKA-UCNP-micro actifs (d) et ( e) avec cage PKA-UCNP-micro cellules après irradiation UV. (FJ) Les photos de densité optique (O.D.) dérivé (a à e), respectivement. (k-o) Les courbes d’intensité correspondant le long de la flèche bleue. La flèche blanche indique la cellule microinjectée. La barre d’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Images de fluorescence des cellules REF52 micro avec diverses formes PKA. Les cellules micro avec (un) avec cage PKA-UCNP après irradiation NIR, (b) UCNP PEG-greffés sous irradiation NIR, et (c) avec cage PKA-UCNP sans irradiation. (d-f) L’émission d’upconvertis de UCNP (dans la zone en pointillés) pour (a-c). (g-i) Fusion d’images des fibres de stress (verts), des émissions d’upconversion (rouges) de la UCNP complexe et DAPI coloration des noyaux (bleu). NIR photoactivation des cellules a été réalisée à une surface éclairante de 650 µm x520 µm en utilisant un objectif de 10 X. Les images de fluorescence ont été recueillies à l’aide d’un objectif de 40 X. Par conséquent, la zone d’irradiation NIR a été réduite à 150 µm x 120 µm, comme il est indiqué dans la zone rouge en pointillés. La luminescence de conversion ascendante peut être vu en (c). Pour les études de quantification à l’aide de ImageJ, D.E. images (j-l) provenaient de (a-c), respectivement. Courbes d’intensité le long de la flèche bleue montré (j-l) ont été tracées à (m-o). Un rapport signal sur bruit élevé (S/N) a été observé pour ce système et est considéré comme une réponse positive. Cette approche a été appliquée pour toutes les analyses quantitatives coloration Alexa 594-phalloïdine. La flèche blanche indique la cellule microinjectée. La barre d’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Auparavant, Hofmann et ses collaborateurs ont trouvé que des changements morphologiques spectaculaires ont été observés dans les cellules de REF52 après la microinjection des PKA libre19. Dans une autre étude, le groupe de Lawrence a démontré que le PKA en cage peut être activé en vivo, conduisant à des changements morphologiques et la désintégration des fibres de stress lorsqu’ils sont soumis aux UV photolyse20. Rapports précédents sur l’exploitation de lumière pour la photoactivation ont montré l’activation de plusieurs UCNP assistée, en cage, petit bioeffectors moléculaire21,22,23upconvertis UV. Toutefois, un protocole à utiliser photoactivation assistée par UCNP sur la classe la plus importante de bioeffector, l’enzyme, doit encore être développée. Par conséquent, dans cette étude, les auteurs décrivent un protocole d’expérience cellulaire qui inclut la photoactivation NIR de PKA en cage à l’aide de UCNPs. Dans cette plate-forme de photoactivation NIR, "cage" PKA20 immobilisé sur la surface de UCNPs enrobées de silice servait a démontré la possibilité de contrôler la voie de transduction de signal de la cellule à l’aide de NIR comme déclencheur. REF52 cellules micro avec un PKA-UCNP "cage" construire et irradié avec NIR ont montré un effet sur la désintégration de fibres de stress, ainsi que des changements morphologiques dans les cellules. En outre, des expériences de positif et négatif de contrôle a eu lieu et s’est avérés que la voie induite par la PKA menant à la désintégration des fibres de stress est déclenchée par l’irradiation NIR.
La modification de l’instrument est décrit dans ce manuscrit, tandis que le PKA modification chimique est bien documentée ailleurs15. Si une expérience bien conçue nécessite dépannage, tout d’abord déterminer si les problèmes sont générés à partir : (i) le complexe protéine-UCNP, microinjection (ii) ou (iii) optique instrumentation. En cas de problèmes de photoactivation de protéine : (1) Vérifiez bien sûr que la PKA est actif, (2) confirme que le PKA "cage" possède une activité résiduelle qui est < 5 % de sa valeur d’origine (3) vérifier que le PKA UV-uncaged a au moins 50 % de son activité restauré, (4) Assurez-vous bien sûr que le PKA "cage" est immobilisé sur la surface UCNP (effectuer une analyse de Bradford) et (5) faire en sorte que le PKA-UCNP "cage" a également au moins 50 % de son activité restauré (en effectuant l’irradiation UV). Pour les problèmes de microinjection : (1) s’assurer que l’extrémité de cette aiguille est ouverte et la solution de protéine-UCNP est chargée correctement. Placer l’aiguille chargé (tip) sur un microscope avec une voie d’excitation NIR. Si la fluorescence upconversion est observée, le chargement est correct. (2) injecter la protéine-UCNP dans les cellules et observer l’intensité de la fluorescence de co injecté 5 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) colorant et upconversion particule. Injection bonne se traduira par fluorescence TAMRA et conversion ascendante à particule intense dans les cellules. Pour le dépannage de modification optique du microscope : (1) enlever la lentille de l’objectif, allumer l’appareil NIR et mettre le capteur de compteur de puissance thermique pile sur la platine du microscope pour mesurer le NIR, qui ne devrait pas être bloqué par un paramètre incorrect. (2) installer la lentille d’objectif et de mettre une cuvette fond transparent remplie de 10 mg/mL de solution d’UCNP sur la platine du microscope. On verra un faisceau pointu bleu dans la solution si les optiques sont tous installés correctement.
Microinjection peut seulement fournir un nombre limité de cellules pour l’analyse. Le taux de réussite d’injection est opérateur (ou expérience)-personne à charge, qui est une limitation majeure de cette technique. Cependant, il n’y a pas d’autre moyen de le contourner jusqu'à présent. De nombreux scientifiques suggèrent que l’utilisation de l’incubation de cellules particule permet aux cellules d’absorption les particules. Cependant, ce n’est pas une approche possible. Même si l’absorption des particules cellulaires se produit et la quantité d’absorption est suffisante, il s’accumule dans les endosomes/lysosomes, mais pas dans le cytosol. Cette enzyme de transduction de signal spécifique doit être situé dans le cytosol, pas des endosomes, pour être efficace. En outre, quand le PKA est dissoute dans un tampon de stockage parfait à 37 ° C, son activité ne dure pas après stockage pendant la nuit. La stabilité de l’enzyme dans le milieu de culture cellulaire est encore plus courte, et il fait la démarche de l’incubation est impossible.
Cela rapporté instrumental d’installation, microinjection et kinase NIR photoactivation le protocole devrait être généralement applicable, non seulement pour la kinase modifié chimiquement, mais aussi pour d’autres classes de protéines ou d’une enzyme. En outre, il serait utile dans les études cellulaires où une exposition UV directe n’est pas souhaitable. En outre, le complexe de "cage" bioeffector-UCNP peut interagir avec des cibles extracellulaires, telles que les protéines membranaires ou récepteurs membranaires, éviter le problème de la délivrance intracellulaire et assujettir la plate-forme usage in vivo . Après injection I.V., hormones protéiques en cage ou protéines thérapeutiques auront la forme allotropique de le bioeffector que dans les régions irradiées NIR.
Microinjection est l’étape la plus critique dans le présent protocole. Pour injection précise, éviter bulles lors du chargement de l’aiguille. Après le chargement, immédiatement installer l’aiguille dans l’injecteur et plonger l’extrémité de l’aiguille dans le milieu pour éviter la pointe de l’aiguille de l’évaporation, qui entraînera le colmatage. Microinjection opérateur compétence est essentielle à un taux plus élevé d’injection réussie.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous remercions la Nano sciences et technologie Programme de l’Academia Sinica et le ministère des sciences et de technologie de Taiwan pour le financement (101-2113-M-001-001-MY2 ; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Ammonium hydroxide (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
