Summary
ב פרוטוקול זה, בכלובים קינאז A (PKA), bioeffector התמרה חושית אותות סלולריים, היה מרותק למיטה על משטח ננו-חלקיק microinjected לתוך ציטוזול, מופעל על ידי upconverted UV אור אינפרא אדום (ניר) הקרנה, גרימת מתח הזרם התפוררות סיבים ב ציטוזול.
Abstract
ננו-חלקיק Upconversion (UCNP)-photoactivation בתיווך היא גישה חדשה מרחוק שליטה bioeffectors עם הרבה פחות phototoxicity ועם חדירה לרקמות עמוקות יותר. עם זאת, המכשור הקיים בשוק אינה תואמת ברצון upconversion היישום. לכן, שינוי זמין מסחרית לכלי חיוני עבור מחקר זה. בנייר זה, אנו קודם ממחישים את השינויים של fluorimeter קונבנציונלי ו קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כדי להפוך אותם תואם לניסויים upconversion פוטון. לאחר מכן נתאר את הסינתזה של-סגול (ניר)-עוררה בכלובים קינאז A קטליטי יחידת משנה של חלבונים (PKA) ותשמרו על מתחם UCNP. פרמטרים עבור microinjection ונהלים photoactivation ניר מדווחים גם. לאחר בכלוב PKA-UCNP הוא microinjected לתוך תאי פיברובלסט REF52, ההקרנות ניר, אשר עדיפה משמעותית על-קונבנציונאלי הקרנת UV, מפעיל ביעילות מסלול התמרה חושית אות PKA בתאים חיים. בנוסף, ניסויים בקרה חיובית ושלילית לאשר כי מסלול PKA-induced שמוביל התפוררות של סיבי סטרס המופעלת באופן ספציפי על-ידי ניר הקרנה. לפיכך, השימוש של חלבון-השתנה UCNP מספק גישה חדשנית לשלוט מרחוק מאופנן אור הסלולר ניסויים, שבה יש להימנע חשיפה ישירה לאור UV.
Introduction
חלבונים ששונו כימית זה יכול להיות photoactivated (למשל, חלבונים PKA בכלוב) פותחו כשדה המתעוררים בביולוגיה כימי לטיפול לא פולשני תהליכים ביוכימיים המערכת1,2 ,3. באמצעות אור כמו גירוי מספק רזולוציה מעולה ייתכן בעת הפעלת אלה בכלוב חלבונים. אולם אור UV יכולה לגרום שינויים מורפולוגיים רצויה אפופטוזיס, נזק לדנ א תאים4,5. לפיכך, ההתפתחויות האחרונות בעיצוב של קבוצות photocaging מתמקדים הפעלת photocleavage על עירור הגל או שני הפוטונים כדי להפחית את phototoxicity, כמו גם כדי להגביר את רקמות עמוק חדירה6,7. קבוצות שכולאת המגיבות אורך גל ארוך יותר המאפשר לנו לבחור מתאימים אורכי של uncaging גל (קרי, ערוצי) באופן סלקטיבי להפעיל bioeffectors כאשר שני או יותר קבוצות caging נוכח7. בהינתן התכונות השימושיות הבאות, פיתוח קבוצות חדשות photocaging האורות האדומים היא עבודה מאד חשובה במעלה הזרם של מתודולוגיות פוטו אטמוספרי מחקרים ביולוגיים החל בודק את המנגנון של תגובות לשליטה פעילות הסלולר8. בכל זאת, קבוצת caging שני הפוטונים הוא בדרך כלל גם הידרופוביות בזכות מבנה הטבעת הארומטית מאוחה, קבוצה caging האור הוא בדרך כלל אורגנומתכתית, עם ליגנדים ארומטי. מאפיין זה הידרופובי/ארומטי אינה מתאימה כאשר bioeffector הוא חלבון או אנזים, כפי שהוא denatures באתר האקטיבציה של החלבון/האנזים גורם לאובדן של הפונקציה, אפילו אם ההטיה ואת פוטוליזה עדיין עובד ברמה הכימית2 ,9.
UCNPs הם מתמרים יעיל זה להמיר את האור עירור ניר UV. מאפיין זה ייחודי ומרתק של UCNPs הציע רזולוציות מציאותי להתייחס לאתגרים הקשורים photoactivation ועורר שחרור מבוקר של מולקולות קטנות, כולל חומצה פולית10, ציספלטין נגזרים11 , DNA/siRNA12קופולימר שלפוחית13, חלקיקים חלול14. עם זאת, לפי מיטב ידיעתנו, photoactivation UCNP בסיוע של אנזימים או חלבונים לא נבדקו עד כה. כי אין שום תיק מוצלח של שימוש באור אדום או ניר photoactive אנזים, לנו היו מתבקש לבצע את ההפעלה המופעלות ניר של מבנה חלבון/אנזים מורכב מתחמי ששונו כימית אנזים בכלוב עם סיליקה מצופים, לנתניד מסטול UCNP15. במחקר זה, היה UCNP מצומדת עם קינאז התמרה חושית מגיבים במהירות האות בצורה של PKA בכלובים. PKA שולט סינתזה הגליקוגן ורגולציה cytoskeletal המגיבה לגירויים חיצוניים באמצעות מחזורית אדנוזין פוספט (מחנה) תקנה ציטוזול16. למדנו את הכדאיות של הפעלת אנזים נימוסים הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית בניסוי הסלולר לאחר הקרנה ניר. פלטפורמה זו בסיוע UCNP photoactivation הוא מתודולוגיה חדשה photoactivate אנזים באמצעות ניר ומונעת את התגובה התמרה חושית אות בלתי רצויה מתאי הנגרמת על ידי קונבנציונאלי UV הקרנה2,4.
. זה קשה מאוד translocate גדול bioeffectors (למשל, חלבונים) על פני קרום התא כדי לשלוט פעילות תאית. למרות חלבון חלקיקים. מרותק למיטה עשוי להיות קל יותר translocate באמצעות אנדוציטוזה לתוך ציטוזול, ייתכן אנדוציטוזה פגום או מושפל באמצעות מלכודת endosomal ו-2,את הסוגר השפלה lysosomal4. גם אם החלבון בכלוב הוא עדיין מתפקד לאחר רוברטסונית ממברנה, הכמויות translocated אולי לא יהיה מספיק כדי לעורר תגובת תאי ה-2,17 בניגוד חריף, microinjection היא גישה ישירה ולא כמותיים כדי לספק bioeffectors גדולים אל הציטופלסמה של התא. יתר על כן, bioeffector UCNP. מרותק למיטה דורש אור upconverted להיות מופעל. לכן, מכשור אופטי דורש שינוי כדי למדוד באופן חזותי, לנצל את האור upconversion. בעבודה זאת, המסירה של מתחם PKA-UCNP בכלובים לתא באמצעות microinjection ו חיוניים ספקטרוסקופיה ו מיקרוסקופ השינויים הבאים עבור ניר photoactivation יתוארו בפרוטרוט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הפרוטוקול מתארת שינוי נתונים היסטוריים אינסטרומנטציה עבור photoactivation בסיוע upconversion, הליך סינתטיים כדי להפיק בכלוב PKA-UCNP, במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) של UCNP מצופה סיליקה ו בכלוב דגימות PKA-UCNP, UV ו ניר פוטוליזה, הכנה תא, PKA-UCNP microinjection, מחקר photoactivation הקמה מתח סיבים ההכתמה של תאים REF52.
1-Fluorimeter ההתקנה עבור מדידת ספקטרום Upconversion
- להתקין עדשה המטרה X 4 ליד cuvette האוחז ספקטרומטר פלורסצנטיות כך הלייזר ממוקדת אמצע cuvette.
- מקום tunable 0.5 - ל 8-W 980-ננומטר לייזר דיודה ב- 90° נגד העדשה המטרה.
התראה: המפעיל צריך ידע בטיחות לייזר ולחבוש משקפי לייזר ניר- - יש להתקין מראה השתקפות מלאה בצומת נתיב האור של העדשה אובייקטיבי, לייזר. המקום שחור בציפוי אנודייז לוח מתכת כדי לחסום את החלון עירור של ספקטרוסקופיה וכדי להגן על החלקים הפנימיים.
- המקום את cuvette של פתרון UCNP מצופה סיליקה (0.2 - 0.6 מ"ג/מ"ל) בהמחזיק cuvette כך קרן upconversion בהיר, ניתן לאבחן והוא יכול לשמש כדי להתאים את היישור אור הטוב ביותר עבור ההתקנה המראה.
- למצב ספקטרוסקופיה של הפריה חוץ גופית עם הנמוכה מתח PMT (להסתגל הגדרה גבוהה יותר אם האות חלש מדי). להתאים את המראה היישור הטוב ביותר, כאשר הקרן הוא על אמצע cuvette ו- PMT מרים את האות החזק ביותר.
- למדוד הקשת upconversion, לאחר יישור, עם הגדרת הכוח הרצוי. להשתמש מד כוח ערימת תרמית כדי לבנות את עקומת כיול של עוצמת הלייזר נגד הקריאה הנוכחית חשמל הזרם לייזר. כל הזמן לבדוק את ביצועי לייזר כדי לוודא הביצועים בטווח מכוילת.
2. מיקרוסקופ ההתקנה
הערה: ההתקנה הבאים מתאים מיקרוסקופים מצויד נתיב אופטי בשתי שכבות. אם המשתמש בכוונת התקן מתג מקור האור עירור היציאה האחורית כדי להפוך את הלייזר ניר את הליד לשתף אותה היציאה, קולימטור בנמל גב באופן משמעותי יחסום את ניר כי הוא נועד להפחית את הדגימה חימום. המשתמש חייב לעשות החלטה קשה: לשמור את קולימטור, סובלים יעילות upconversion נמוכה מאוד, או להסיר את קולימטור ולהקריב האינטנסיביות של עירור לאור epifluorescence.
הערה: דיאגרמה שוט הסחה מציג את שיטת נתיב האור ששונה מצלמות-דיגיטליות, מיקרוסקופיה עבור הפריה חוץ גופית upconversion ומצב פוטוליזה ניר ועבור epifluorescence UV פוטוליזה מצב, ואת את הגדרת הניסוי משמש את הניסוי הזה מומחשים איור 2-
מדריך- Equip המיקרוסקופ זריחה עם מטאל-הליד אור, ביים לחלק האחורי עם מסמרים
הערה: בנתיב זה מהשכבה העליונה אור איפה יש צריח קוביה, תנוחה קוביה אחת להיות ריקה כדי לאפשר ניר בא שביל אור מהשכבה התחתונה - להתקין לייזר דיודה tunable מסוג nm W 980 0.5 ל- 8.0 בנמל צד ימין, עם קולימטור הצדדית פתוח-
הערה: זה הגדלת מיקרומטר אור לייזר ספוט לבערך 500 בקוטר כאשר משתמשים בעדשה המטרה X 10. הסרת קולימטור זו יוצרת כתם אור מיקרומטר-טווח והופכת ניר תא הקרנה מעשית. קולימטור הזה הוא ניר-שקוף. - להתקין מראה ודיקרואיק זוהר (850 ננומטר קצר מעברים), מסנן עירור (950 nm זמן לעבור) בשביל אור מהשכבה התחתונה
- להשתמש פתרון UCNP כדי להמחיש את נקודת האור ניר. להתאים את מיקום לייזר כדי למרכז את אלומת האור ניר, שדה הראייה כדי לסיים את היישור.
3. הכנה ולבנות אפיון של כלואים PKA-UCNP
- Incubate PKA רקומביננטי (9 מיקרומטר) עם 0.5 מ מ 2-nitrobenzylbromide (NBB) ב שכולאת מאגר (20 מ מ טריס-HCl, MgCl של 100 מ מ NaCl, ו- 10 מ מ- 2; pH 8.5) עבור h 1-2-25 ° C. דובדבני NBB עודף עם 10 מ מ dthiothreitol (DTT), אז dialyze נגד 4-(2-hydroxyethyl) מאגר חומצה piperazine-1-ethanesulfonic (HEPES) (10 מ מ, pH 7.5) כדי להסיר עודפי ריאגנטים ומלח.
הערה: ה-pH של התמיסה caging היא יורדת מ- 8.5 7.5 במהלך דיאליזה עם HEPES pH 7.5 עבור התגובה הנייח עוקבות. - מיקס לנתניד מלחי-Y(CH3CO2) 3 הידרוקסיד (99.9%, 0.4527 g, mmol 1.38 אינץ), י. ב (CH 3 CO 2) 3 הידרוקסיד (99.9%, 0.2533 g, 0.60 mmol) ו- Tm (CH 3 CO 2) 3 הידרוקסיד (99.9%, 0.0168 g, mmol 0.02 נקודות)-octadecene (30 מ ל), חומצה אולאית (12 מ ל), מחממים את התערובת עד 115 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, וניתן עד 50 מעלות צלזיוס. הבא, לפזר את תערובת התגובה בפתרון methanolic (20 מ ל) עם 0.2 גרם (5.0 mmol) של NaOH גלולה, 0.2964 גר' (8 mmol) אמוניום פלואוריד על ידי sonication במשך 15 דקות ולהגדיל את טמפרטורת התגובה עד 300 ° C כדי לקבל את ליבת UCNP (β-NaYF 4 : Tm 1.0% 3 + / י. ב 30% 3 +) חלקיקים.
- להמיס את ליבה חלקיקים (25 מ ג) עם CO-520 (0.5 מ"ל) בציקלוהקסאן (10 מ"ל). הוספת אמוניה (wt 30% v/v, 0.08 mL) ו tetraethylorthosilicate (הפנסיון, 0.04 mL) ולהחיל בחישה מתמדת במשך 12 שעות בטמפרטורת החדר, כדי לקבל את מצופה סיליקה β-NaYF 4: 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + הליבה חלקיקים.
- דגירה של PKA (6 nmol) או בכלוב PKA (6 nmol) עם UCNP (מ ג 1) 15 מאגר HEPES (10 מ מ, pH 7.5) ב 4 ° C עבור 3 h כדי לשתק את PKA על מצופה סיליקה UCNP דרך אינטראקציות אלקטרוסטטית.
- לסנן את התערובת באמצעות מסנן PVDF (0.45 מיקרומטר), צנטריפוגה-17,000 x g 10 דקות ב 4 ° C, ו- redisperse בגדר ב- HEPES (50 µL, 10 מ מ, pH 7.5) 0.1% המכיל חלבון מייצב להשיג המתחם PKA-UCNP מטוהרים. צנטריפוגה-17,000 g x 10 דקות ב 4 ° C ולאסוף את תגובת שיקוע עבור וזמינותו ברדפורד צינור 1.5-mL-
- לנתח את PKA מאוגדות ב תגובת שיקוע הציל מכל שלב 3.5 עם שיטת ברדפורד הגב-לחשב את רמת החלפת PKA על החלקיקים UCNP, אשר בדרך כלל יש רמה החלפה של ~ nmol 4.5 של PKA לכל מ"ג של החלקיקים.
הערה: וזמינותו ברדפורד חושף צבע כחול חזק על כדורי, אשר מרמז על הנייח חלבון ברמה ויציבה ללא desorption, בעוד חלק מהיממה supernatant בכלוב PKA-UCNP פתרון מראה בצבע דומה (מאגר HEPES איור 4 c-4e).
4. אפיון
הערה: וזמינותו קינאז משמש לכמת את הפעילות הספציפי של פירובט קינאז. בקצרה, זירחון של פפטיד, אשר זה משולב פירובט קינאז, לקטט דהידרוגנאז, תוצאות החמצון של NADH. היווצרות של האחרונים מנוטרת על ידי מדידה של הפחתת ספיגת של NADH-340 nm.
- לקבוע הפעילות של PKA ו- PKA-UCNP ב- 60 µL הנפח הכולל של תערובת assay המכיל 4-morpholinepropanesulfonic חומצה (סחבות, 100 מ מ, pH 7.5), אשלגן כלורי (100 מ מ), phosphoenolpyruvate (עידוד, 1 מ מ), אדנוזין טריפוספט (ATP, 1 מ מ), β - nicotinamide אדנין dinucleotide, מופחתת טופס (NADH, 0.8 מ מ), מגנזיום כלוריד (MgCl 2, 1 מ מ), kemptide (0.4 מ מ), תערובת דהידרוגנאז קינאז/לקטט פירובט (30-40 יחידות של PK/LDH).
- למדוד של הפחתת ספיגת NADH לאורך זמן לאחר התוספת של PKA פתרון (2 µL) לתערובת וזמינותו. לחשב את השיפוע של קו שישקף את פעילות קינאז הנמדדים ישירות.
- מודדים את הפעילות של PKA-UCNP 15, את הפעילות הכללית, אשר צריכים להיות תואמים את המוצר כפל של פעילות ספציפית PKA יליד ואת הסכום המחושב משטח מצופה PKA.
5. פוטוליזה ההתקנה
- אותייור כל הכוח של האור מקורות באמצעות חיישן תרמי ערימת ולחשב כוח צפיפות (PD = כוח (W) / אזור (2 ס מ)) 18 בהתבסס על האזור ספוט אור.
- לבצע ניסויים במבחנה UV פוטוליזה על מערכת מסחרית עם 365 nm LED (200 mW/cm 2) 15-
- Photoactivation עבור UV על הבמה מיקרוסקופ, להאיר את הפתרון PKA-UCNP עם עירור אור המסוננות לפי הקוביה מסחרי 15.
הערה: צפיפות כוח היא ~ 15 mW/cm 2, בלי מטרה העדשה למקד. - עבור במבחנה ניר photoactivation על הבמה מיקרוסקופ, להאיר את הפתרון PKA-UCNP באמצעות לייזר nm 980 עם הגדרות מסנן/ראי upconversion מותאם אישית מותקן על השביל אור מהשכבה התחתונה, מראה ודיקרואיק זוהר (850 ננומטר קצר-מעבר), ו מסנן עירור (950 nm ארוך מעברים).
הערה: צפיפות כוח פלט הוא W/ס מ 5 2 לפני 4 X עדשה המטרה תוך התמקדות. צפיפות כוח מוערך ~ W/cm 68 2 אחרי 4 X עדשה המטרה תוך התמקדות.
6. התא הכנת הדוגמא Microinjection של מתחמי PKA-UCNP
- מראש לסנן את הדגימות דרך מסנן מיקרומטר 0.45 לאחר PKA הנייח (שלב 3.5).
- דגירה התאים ב- 10% סרום שור עוברית (FBS) המכילים L-15 בינוני במהלך תקופת microinjection לשליטה יציבה pH מחוץ החממה.
הערה: כדי לוודא השלמת microinjection, שותף להחדיר את PKA מקורי-UCNP, UCNP-PKA בכלוב או PEGylated UCNP (7.5 מ"ג/מ"ל) 15 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (טמרה) (10 מיקרומטר) ב לתאים. - להתאים את ריכוז החלקיקים PKA-UCNP כזה, לאחר microinjection, הריכוז cytosolic הוא 1-3 μM PKA - טווח הריכוז פיזיולוגי עבור PKA בתא, עם ההנחה כי אמצעי האחסון הזרקת הוא 1/10 של תאי האחסון .
- לבצע את microinjection לתוך התאים (שלב 6.2) באמצעות מכשיר microinjector יחד עם micromanipulator הידראולי ציר אחד ( איור 3).
- שימוש מד לחץ דיגיטלי לעקוב אחר למידת הלחץ המופעל על ידי microinjector נמצא טווח ההפעלה (~ 50-200 hPa) לאטום את השסתום מנפק בחדר לכאורה מותאמים אישית כדי לספק פיצוי לחץ microinjection. למשוך חזרה את המחט באמצעות של פולר.
- לשמור על הלחץ הזרקת בין 50 ו 75 hPa, עם מועד ההזרקה של 200-300 ms והלחץ פיצוי-hPa 15 כדי למנוע התרבות בינוני זרם אחורי לתוך מחט על ידי נימיות.
- לבחון את הפתחים עצה של המחטים כדי להבטיח כי יש להם קוטר חיצוני בין 1.3, 1.5 מיקרומטר, אשר יכול להיות מאושרות על ידי לקיחת תמונות באמצעות עדשה המטרה 40 x.
- לרחוץ את התאים עם 2 מ"ל של מדיום L-15 המכיל 10% FBS לאחר microinjection. להתבונן ההדמיה פלורסצנטיות הסלולר מ 5 (6) - carboxytetramethyl - rhodamine (טמרה) כדי לאשר השלמה microinjection.
7. Photoactivation של כלואים PKA-UCNP באמצעות UV או ניר אור בתאים חיים
photoactivation- עבור UV לאחר microinjection PKA-UCNP, לגדל את התאים REF52 בצלחת מיקרומטר 3.5, למקם אותם על הבמה מיקרוסקופ, להאיר אותם באור UV מסוננת על-ידי הקוביה למשך 3 דקות בלי מטרה העדשה למקד.
הערה: REF52 התאים היו בהשתתפות DMEM המכיל 10% FBS ב 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2, ואז התאים היו subcultured confluency הגיע ל- 90% כל 2-3 ימים. - Photoactivation עבור ניר לאחר PKA-UCNP microinjection, להאיר את התאים על לייזר 980-nm מההגדרות מהשכבה התחתונה מסנן/ראי, כפי שמתואר בשלב 5.4.
הערה: הפלט צפיפות כוח הוא W/ס מ 5 2 לפני 10 X עדשה המטרה תוך התמקדות, מוערך W/cm 300 2 לאחר 10 x עדשה המטרה תוך התמקדות. Upconversion הוא תהליך הדורש צפיפות הפוטונים גבוהה, במיוחד כאשר משמרת anti-Stoke גדולה יותר יש צורך. לפיכך, תוך התמקדות נדרש במהלך photoactivation. - כאשר נקודת אור גדולה יותר (650 מיקרומטר x 520 מיקרומטר) נדרשת, לעורר תאים אלה עם ניר ממוקד על ידי עדשה המטרה 10 x עם קולימטור במשך 15 דקות אפשר עבור מרווח כהה 5 דקות לאחר כל הקרנה 5-מין כדי למנוע חימום.
הערה: כאשר מרחבית-רזולוציה גבוהה (במקום אור subcellular) יש צורך, להשתמש העדשה המטרה X 40 עם הקדמוניות מותקן בסוף היציאה של המדריך אור כדי ליצור כתם אור subcellular-מימד (5 מיקרומטר x 4 מיקרומטר). במקרה זה, 1 s של הקרנה מספיקה ניר photoactivation עקב שטף גבוה של פוטונים. - פוטוליזה לאחר UV או ניר, לאפשר את התאים להתאושש ב CO 5% 2 החממה ב 37 ° C עבור h 1 בינוני מלא ליצירת תגובות הסלולר. לאחר מכן, לתקן אותם ב- 1 מ ל תמיסת 4% paraformaldehyde/פוספט-buffered (PBS) כעשרים דקות לפני עוד יותר להכתים.
התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל מאוד; להימנע ממגע עם העור, העיניים או הקרומים הריריים. להימנע נושם את האבקה במהלך מדידת והכנות.
8. ויזואליזציה של התפוררות סיבים מתח נגרמת על ידי ניר Photoactivation
- לאחר קיבוע, השתמש אלקסה 594-phalloidin (להוסיף µL 5 בפתרון מניות מיקרומטר 6.6 µL 200 ל- PBS עבור צביעת; תקופת דגירה של 25 דקות בטמפרטורת החדר) כתם ו דמיינו את סיבי סטרס. לדמיין את התמונות של אלקסה 594-phalloidin (לשעבר 581 nm/Em 609 ננומטר) באמצעות ערכת מסנן.
- דגירה את התאים עבור 5 דקות 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) בטמפרטורת החדר. לאחר צביעת, לשטוף את הדגימות עם PBS ולקחת בנפרד פלורסנט תמונות של סיבי סטרס, גרעינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
העיצוב של הבונה אנזים בכלוב-UCNP מודגם באיור1. האנזים PKA היה תחילה הגיבו 2-nitrobenzyl ברומיד ליצירת של PKA בכלוב אינו פעיל, זה היה אז electrostatically ללא יכולת תנועה על פני השטח של UCNP. UCNPs פולטים אור upconverted, וכתוצאה מכך photolytically קליב הקבוצות o-nitrobenzyl על Cys 199 ואת Cys 343, יוצר את PKA מופעל. TEM תמונות ואת וזמינותו ברדפורד אישר כי PKA של PKA בכלוב היו ותשמרו על פני UCNPs, פעילות קינאז בכלובים פתרון PKA-UCNP אחרי UV photoactivation לבדיקה (איור 4). לאחר PKA הנייח, נגינה פיזור אור דינאמי חשף את הגודל ואת פוטנציאל זטה של המתחם החלקיקים התת-PKA להיות 120 ננומטר,-16.0 mV, בהתאמה. ברדפורד וזמינותו של הפתרון PKA-UCNP הראו צבע סגול חזק על החלקיקים, שמצביע על הנייח של חלבון ברמה ויציב.
תאים עובריים פיברובלסט עכברוש REF52 נבחרו לחקר photoactivation לניסוי הסלולר. בניסוי זה, מסלול PKA יכולה להיות מופעלת על-ידי הפעלת PKA אנדוגני (אשר מופעלת על ידי הדגירה של התא-חדיר 8-CPT-מחנה) או את microinjection של PKA פעיל או triggerable. הפעלת PKA (עם או בלי בטקטיקות החלקיקים) יפורר את סיבי סטרס וחושף פני אקטין (F-אקטין) filamentous יותר, ומכאן fluorophore התווית על-ידי phalloidin, אשר נקשר בחוזקה F-אקטין, מניב אות מכתימים גבוה יותר. לאחר דגירה 8-CPT-מחנה או microinjection של PKA חופשי, PKA פעיל-UCNP, או UCNP PKA מופעל UV (כמו ניסויים חיובי-control), אישרנו זאת הנוכחות של התפוררות סיבים הלחץ חזק הנגרמת על ידי הפעלת מסלול PKA (איור 5). PKA אנדוגני והן microinjected PKA מחקרים מראים התפוררות סיבים מתח התא כולו, תוך חלקיק. מרותק למיטה PKA (PKA פעיל-UCNP ו- UV-הפעלת PKA-UCNP) מציג מתח סיבים התפוררות רק באתר microinjection, עוד יותר מציע את הנייח יציב של PKA-UCNPs. הניסוי photoactivation ניר, לאחר microinjection של PKA-UCNP בכלובים והקרנה ניר, UCNPs פולטים אור upconverted, קליב הקבוצות o-nitrobenzyl על Cys 199 ואת Cys 343. כתוצאה מכך, הם להפיק את PKA מופעל, התפוררה סיבי סטרס, תשואות אות גבוה יותר על-ידי התווית על-ידי fluorophore phalloidin מכתים (איור 6). שלילי-בקרת ניסויים בתאי REF52 microinjected עם UCNP ללא את PKA בכלוב, אז מוקרן ניר, כמו גם תאים REF52 עם PKA-UCNP בכלובים בהיעדרו של הקרנה, הראה אין השפעה על הלחץ סיבים שלמות.
איור 1 . איור של PKA בכלוב-UCNP עיצוב, בסיוע Upconversion PKA Uncaging. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: דיאגרמה שוט הסחה מציג את ערכת נתיב האור. () שונה מצלמות-דיגיטליות ו- (b) מיקרוסקופ על הפריה חוץ גופית upconversion ומצב ניר פוטוליזה (משמאל) ועל epifluorescence ומצב UV פוטוליזה (מימין), כמו גם הגדרת הניסוי שלהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הגדרת הניסוי עבור Microinjection. בעל הזרקה זה משולב עם micromanipulator הידראולי שמן אחד-ציר בזווית בין 30° 45°. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: אישור של PKA הנייח על UCNP. TEM תמונות של () סיליקה מצופים UCNP, (b) בכלוב PKA. מרותק למיטה UCNP; ברדפורד וזמינותו של מאגר (c) HEPES, (ד) בגדר שבר resuspension של פתרון PKA-UCNP בכלובים, שבר (e) תגובת שיקוע של פתרון בכלובים PKA-UCNP; ואת וזמינותו פעילות קינאז (f) של פתרון בכלובים PKA-UCNP לאחר UV photoactivation. איור זה שוחזר מגאו, ה-ממד. et al. לאחר אישור מפורש הושג מן המו ל, האגודה האמריקנית לכימיה. סרגל קנה מידה = 20 ננומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : זריחה תמונות של סיבים מתח מכתים (ירוק), דאפי מכתים של הגרעינים (כחול) של תאים REF52, מציג התפוררות סיבים מתח ושינויים מורפולוגיים המופעלות על-ידי הפעלת PKA שונה. תאים () Untreated, אדנוזין (b) 8-(4-Chlorophenylthio) 3', monophosphate 5'-מחזורית (8-CPT-מחנה)-מטופלים תאים, התאים PKA-microinjected פעיל (c), תאים פעילים PKA-UCNP-microinjected (d) ו- ( e) בכלוב תאי PKA-UCNP-microinjected ' לאחר הקרנת UV. (f-j) התמונות צפיפות אופטית (יתר) נגזר (-ה), בהתאמה. (k-o) העקומות בעצימות המתאימה לאורך החץ הכחול. החץ הלבן מציין את התא microinjected. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: קרינה פלואורסצנטית תמונות של REF52 תאים Microinjected עם צורות שונות של PKA. תאים microinjected עם () בכלוב PKA-UCNP לאחר ניר הקרנה, (b) UCNP הושתל פג תחת ניר הקרנה, ו- (ג) בכלוב PKA-UCNP ללא הקרנה. (d-f) הפליטה upconverted של UCNP (בתיבה מקווקו) עבור (ה-ז). (g-i) התמונות הממוזגות של סיבי סטרס (ירוק), upconversion פליטות (אדום) UCNP מורכבים, דאפי מכתים של גרעינים (כחול). ניר photoactivation של התאים נערך שטח זרחני של מיקרומטר 650 xמיקרומטר 520 משתמשים בעדשה המטרה X 10. הדימויים פלורסצנטיות נרכשו באמצעות עדשה המטרה X 40. לפיכך, אזור הקרנה ניר צומצם מיקרומטר מיקרומטר x 120 150, כפי שמצוין בתיבה אדום מקווקו. ניתן לראות את upconversion הפריה חוץ גופית (c). ללימודים כימות באמצעות ImageJ, יתר תמונות (j-l) נגזר (-ג), בהתאמה. עוצמת עקומות לאורך החץ הכחול באיור (j-l) שורטטו ב (m-o). יחס אות לרעש גבוה (S/N) נצפתה עבור מערכת זו, נחשבת לתגובה חיובית. גישה זו הוחלה על כל אלקסה quantifications 594-phalloidin מוכתמים. החץ הלבן מציין את התא microinjected. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעבר, הופמן ועמיתים מצא כי שינויים מורפולוגיים דרמטי נצפו בתאים REF52 לאחר microinjection של PKA חופשי19. במחקר אחר, קבוצת לורנס הוכיח כי PKA בכלוב יכול להיות מופעל ויוו, המוביל שינויים מורפולוגיים התפוררות של סיבי סטרס כאשר נתון UV פוטוליזה20. מוקדם יותר דיווח על ניצול אור עבור photoactivation הראה את ההפעלה של מספר bioeffectors מולקולרית בסיוע UCNP, בכלובים, קטן21,22,23upconverted UV. עם זאת, פרוטוקול להשתמש בסיוע UCNP photoactivation על המעמד החשוב ביותר של bioeffector, האנזים, עדיין צריך להיות מפותח. לפיכך, במחקר זה, נתאר את פרוטוקול הניסוי סלולרי הכולל את photoactivation ניר של PKA בכלוב בעזרת UCNPs. הפלטפורמה photoactivation ניר, בכלובים PKA20 ותשמרו על פני השטח של UCNPs מצופה סיליקה שימשה כדי להדגים את הכדאיות של שליטה מסלול האות התמרה חושית של התא באמצעות ניר כגורם מפעיל. התאים REF52 microinjected עם בכלוב PKA-UCNP לבנות, מוקרן עם ניר הראה השפעה על הלחץ סיבים התפוררות, כמו גם שינויים מורפולוגיים בתוך התאים. בנוסף, חיובי, שלילי-בקרת ניסויים היו שבוצעה, הוכיח כי מסלול PKA-induced שמוביל התפוררות של סיבי סטרס המופעלת על-ידי ניר הקרנה.
כלי השינוי המתואר בכתב היד, בעוד PKA שינוי כימי מתועד היטב במקום אחר15. אם ניסוי מתוכנן היטב דורשת פתרון בעיות, תחילה לזהות אם הבעיות נוצרות מתוך: קומפלקס חלבונים-UCNP (i), (ii) microinjection או מכשור אופטי (iii). במקרה של בעיות photoactivation חלבון: (1) יצירת בטח PKA פעילה, (2) לאשר כי PKA בכלוב יש פעילות שיורית זו < 5% מערכו המקורי, (3) לוודא כי PKA שברחה מכלוב-UV יש לפחות 50% של פעילותה שוחזר, (4) להפוך בטוח זה PKA בכלוב. הוא מרותק למיטה על פני UCNP (ביצוע וזמינותו של ברדפורד), ו- (5) לוודא PKA-UCNP בכלוב יש גם לפחות 50% של פעילותה משוחזרים (על-ידי ביצוע הקרנת UV). לבעיות microinjection: (1) יצירת בטוח את מחט הינה פתוחה, הפתרון חלבון-UCNP טעון כהלכה. מניחים את המחט טעון (tip) על מיקרוסקופ עם ערוץ עירור ניר. אם נצפית upconversion פלורסצנטיות, ההעמסה היא הנכונה. (2) להזריק את החלבון-UCNP לתוך התאים ולבחון את עוצמת קרינה פלואורסצנטית משותפת מוזרק צבע (6)-carboxytetramethylrhodamine (טמרה) 5, upconversion חלקיקים. ההזרקה הנכון יביא אינטנסיבי טמרה, upconversion חלקיקי קרינה פלואורסצנטית בתאים. מיקרוסקופ אופטי השינוי פתרון בעיות: הסרה (1) העדשה אובייקטיבי, להפעיל את הלייזר ניר, ולשים את חיישן מד כוח ערימת תרמי על הבמה מיקרוסקופ כדי למדוד את ניר, אשר לא צריכים להיחסם על-ידי הגדרה לא תקין. (2) להתקין את העדשה המטרה ולשים על cuvette שקוף-התחתון מלא עם פתרון UCNP 10 מ"ג/מ"ל על הבמה מיקרוסקופ. חד קרן כחול בפתרון יראו אם האופטיקה אינם מותקנים כראוי.
Microinjection רק יכול לספק מספר מצומצם של תאים לניתוח. שיעור ההצלחה ההזרקה הוא אופרטור (או ניסיון)-תלוי, אשר היא מגבלה עיקרית של טכניקה זו. עם זאת, יש דרך אחרת לעקוף את זה עד כה. מדענים רבים מראים כי השימוש של חלקיקים-תא הדגירה מאפשר לתאים ספיגת חלקיקי. עם זאת, זו אינה גישה אפשרית. גם אם מתרחשת ספיגת חלקיקים הסלולר כמות ספיגת מספיקה, יצטברו endosomes/lysosomes, אך לא את ציטוזול. התמרה חושית אות מסוים האנזים צריך להיות ממוקם ציטוזול, לא endosomes, להיות יעיל. יתר על כן, כאשר PKA הוא מומס מאגר אחסון מושלם ב 37 מעלות צלזיוס, פעילותה לא להימשך לאחר אחסון לילה. היציבות אנזים במדיום התרבות התא הוא אפילו יותר קצר, וזה גורם הגישה הדגירה מעשית.
זה דיווח פלייבק ההתקנה, microinjection וקינאז ניר photoactivation פרוטוקול צריך להיות חלים באופן כללי, לא רק עבור קינאז ששונו כימית, אלא גם עבור מחלקות אחרות חלבון או אנזים. יתר על כן, שזה יהיה שימושי במחקרים הסלולר איפה חשיפה UV ישירה אינה רצויה. יתר על כן, המתחם bioeffector בכלובים-UCNP יכול לקיים אינטראקציה עם מטרות חוץ-תאית, כגון קרום חלבונים או קולטני ממברנה, מתחמק מהבעיה משלוח תאיים ולהפוך את הפלטפורמה החלים על שימוש ויוו . לאחר הזרקת עירוי, הורמונים חלבון בכלוב או חלבונים טיפולית יהיה בצורת bioeffector מופעל רק באזורים מוקרן-ניר.
Microinjection היא השלב הקריטי ביותר של פרוטוקול זה. עבור הזרקה מדויקת, להימנע בועות במהלך טעינת המחט. לאחר הטעינה, מיד להתקין את המחט לתוך מזרק, לטבול את מחט לתוך האמצעי למנוע קצה המחט התייבשות, אשר תגרום סתימת. Microinjection מפעיל מיומנות הוא קריטי עבור שיעור גבוה יותר של הזרקת מוצלחת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים המדע ננו טכנולוגיה תוכנית של אקדמיה Sinica, משרד המדע ואת הטכנולוגיה של טייוואן לצורך מימון (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Ammonium hydroxide (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
