Summary
이 프로토콜에 갇힌된 단백질 키 니 아 제 A (PKA), 셀룰러 신호 변환 bioeffector 나노 입자 표면에 움직일, cytosol에 microinjected 이었고 upconverted 근처-적외선 (NIR) 방사선에서 자외선에 의해 활성화 유도 다운스트림 스트레스는 cytosol에서 섬유 분해.
Abstract
업 나노 (UCNP)-중재 photoactivation 원격 제어 bioeffectors 훨씬 적은 phototoxicity와 깊은 조직 침투 하는 새로운 접근입니다. 그러나, 시장에 기존 계측 쉽게 업 응용 프로그램과 호환 되지 않습니다. 따라서, 상업적으로 이용 가능한 악기 수정이 연구에 대 한 필수적입니다. 이 논문에서는, 우리가 먼저 기존의 fluorimeter와 광자 업 실험에 대 한 호환 수 있도록 형광 현미경의 수정을 보여 줍니다. 다음 우리는 근처-적외선 (NIR)의 합성을 설명-갇힌된 단백질 키 니 아 제 A 촉매 소 단위 (PKA) UCNP 복합물에 움직일 트리거. Microinjection 및 NIR photoactivation 절차에 대 한 매개 변수는 또한 보고 했다. 갇힌된 PKA UCNP REF52 fibroblast 세포에 microinjected는, 후는 기존의 UV 방사선에 상당히 우수한, NIR 방사선 살아있는 세포에서 PKA 신호 변환 통로를 효율적으로 트리거합니다. 또한, 긍정적이 고 부정적인 제어 실험 스트레스 섬유의 해체에 지도 하는 PKA 유도 통로 적외선 조사에 의해 트리거됩니다 구체적으로 확인 합니다. 따라서, 단백질 수정 UCNP 사용 하 여 빛 변조 세포 실험, 자외선에 직접 노출 피해 야 한다를 원격으로 제어 하는 혁신적인 접근 방식을 제공 합니다.
Introduction
Photoactivated (예를 들면, PKA 갇힌 단백질)을 될 수 있는 화학적 수정된 단백질 화학 생물학 세포 생화학 프로세스1,2 비 접촉 조작 하는 신흥 분야로 개발 되었습니다. 3. 이 활성화할 때 우수한 spatiotemporal 해상도 제공 하는 자극으로 빛을 사용 하 여 단백질 갇힌. 그러나, UV 빛 원치 않는 형태학, apoptosis, 변화와 셀4,5에 DNA 손상을 일으킬 수 있습니다. 따라서, photocaging 그룹의 최근 개발 디자인에 phototoxicity, 또한 깊은 조직 침투6,7증가로 줄이기 위해 긴 파장 또는 2 광자 여기 시 photocleavage를 사용에 초점을. 배우면 그룹 있도록 적당 한 uncaging 파장 (즉, 채널)을 선택 하는 것을 선택적으로 더 긴 파장에 반응 활성화 bioeffectors 두 개 또는 더 배우면 그룹은 현재7. 이러한 유용한 기능을 감안할 때, 새로운 레드 라이트 photocaging 그룹 개발8세포 활동 제어 하는 반응의 메커니즘을 탐색에서 배열 하는 생물학 학문을 위한 광화학 방법론에서 매우 중요 한 상류 작업 이다. 그럼에도 불구 하 고, 2 광자 배우면 그룹 일반적으로 너무 소수 융합된 향기로운 반지 구조 때문 이며 가시광선 배우면 그룹은 일반적으로 유기, 향기로운 ligands. 이 소수 성/향기로운 속성은 bioeffector은 단백질 또는 효소, 효소/단백질의 활성화 사이트를 변성 하 고 활용 및 photolysis2 화학 수준에 아직도 작동 하는 경우에 함수의 손실이 발생 하는 경우 적합 하지 않습니다. ,9.
UCNPs는 UV에 적외선 여기 빛을 변환 하는 효율적인 트랜스듀서. 과제를 해결 하기 위해 현실적인 해상도 photoactivation와 관련 된 및 작은 분자, 엽 산10를 포함 하 여 cisplatin 파생 상품11의 제어 릴리스 트리거 UCNPs의이 독특하고 매혹적인 속성 제공 , DNA/siRNA12, 공중 합체의 소포13, 그리고 빈 입자14. 그러나, 우리의 지식의 최선을, 효소 또는 단백질의 UCNP를 이용한 photoactivation는 테스트 되지 지금까지. 사용 하 여 붉은 빛 또는 적외선 광 효소의 성공적인 경우 있기 때문에, 우리는 실리 카 코팅와 화학적 수정된 갇힌된 효소 복합물의 구성 하는 단백질/효소 구조의 NIR 트리거 활성화를 수행 하 라는 메시지가 표시 했다 란타넘족 실수로 UCNP15. 이 연구는 UCNP 갇힌된 PKA의 형태로 빠르게 반응 신호 변환 키로 활용 했다. PKA는 glycogen 합성 cytosol16순환 아데노신 인산 염 (야영지) 규제를 통해 외부 자극에 응답 하는 cytoskeletal 규칙을 제어 합니다. 우리는 적외선 방사선 조사 후 세포 실험에서 시간적, 공간적 매너에서 효소 활성화의 가능성을 공부 했습니다. 이 UCNP 기반 photoactivation 플랫폼 photoactivate에 새로운 방법론 NIR를 사용 하 여 효소 이며 기존의 UV 방사선 조사2,4로 인 한 세포에서 원하지 않는 신호 변환 응답을 피 한다.
그것은 매우 어려운 큰 bioeffectors를 이동 (예를 들어, 단백질) 세포 활동을 제어 하는 세포 막에 걸쳐. 단백질 입자 움직일 수 있지만 쉽게 하는 cytosol로 endocytosis를 통해 이동, endocytosis 손상 또는 endosomal 함정 및 필연적인 lysosomal 저하2,4통해 저하 수 있습니다. 갇힌된 단백질은 막 전 후 여전히 기능, 경우에 translocated 금액 세포질 응답2,17를 일으킬 정도로 되지 않을 수 있습니다. 예리한 대조에서는, microinjection 세포의 세포질에 큰 bioeffectors를 제공 하는 직접적이 고 양적 접근 이다. 또한, UCNP 움직일 bioeffector upconverted 빛을 활성화 해야 합니다. 따라서, 광학 계측 해야 추가 측정, 시각화, 업 라이트를 활용 하는 수정을 합니다. 이 작품에서는, NIR photoactivation에 대 한 microinjection 및 다음 필수 분광학과 현미경 수정을 사용 하 여 셀에 갇힌된 PKA UCNP 복합물의 배달 자세히 설명 합니다.
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Protocol
참고: 프로토콜 업 기반 photoactivation에 대 한 자세한 계측 수정, 생성 하는 합성 절차 갇힌 PKA-UCNP, 실리 카 코팅 UCNP의 전송 전자 현미경 (TEM) 그리고 갇힌 PKA UCNP 샘플, 자외선과 NIR photolysis 설치, 셀 준비, PKA-UCNP microinjection, photoactivation 연구 및 REF52 세포의 스트레스 섬유 얼룩.
1. 업 스펙트럼 측정을 위한 Fluorimeter 설치
- 레이저는 베트의 중간에 초점을 맞추고 형광 분석기의 베트 홀더 옆 4 X 객관적 렌즈 설치.
- 가변 0.5-8 W 980 nm 레이저 다이오드는 렌즈에 대 한 90 ° 장소.
주의: 연산자 레이저 안전 지식을 하 고 NIR 레이저 고글을 착용 해야. - 렌즈와 레이저의 빛 경로 교차점에 전체 반사율 거울을 설치합니다. 검은 anodized 금속 접시 분광학의 여기 창 차단 하 고 내부 부품을 보호 하기 위해 배치.
- 실리 카 코팅 UCNP 솔루션 (0.2-0.6 mg/mL)의 멧을 베트 홀더 에서도 밝은 업 컨버전 빔 구상 될 수 있다 고 거울 설치에 대 한 최고의 빛 정렬을 조정 하는 데 사용할 수 있습니다.
- 최저 PMT 전압 설정으로 발광 모드는 분광학 전환 (신호가 너무 약한 경우 더 높은 설정을 조정). 멧의 중간에 광속은 고는 PMT 강한 신호를 선택 최고의 맞춤 미러 조정.
- 맞춤 원하는 전원 설정 후 업 스펙트럼을 측정합니다. 열 더미 전력 측정기를 사용 하 여 레이저 전력 공급에 전기 현재 독서에 대 한 레이저 파워의 보정 곡선을 건설. 끊임없이 성능 보정된 범위 안에 있는지 확인 하기 레이저 성능 확인.
2. 현미경 설치
참고: 다음 설치 현미경 2 계층 광학 경로 갖춘 작품. 사용자가 다시 포트 적외선 레이저와 같은 포트를 공유 하는 할로겐 램프를 여기 광원 스위치를 설치 하고자 하는 경우 샘플 난방을 감소 하도록 설계 되었습니다 때문에 다시 포트에 겨냥 틀에는 NIR 차단 크게 됩니다. 사용자는 어려운 선택을 해야 합니다:는 겨냥 틀을 계속 매우 낮은 업 효율성에서 고통 또는 제거는 겨냥 틀 하 고 여기는 epifluorescence에 대 한 빛의 강도 희생.
참고: 수정 된 spectrofluorometer, 업 발광 및 NIR photolysis 모드와 epifluorescence 및 UV photolysis 모드, 그리고 실험 설정에 대 한 현미경 검사 법에 대 한 가벼운 경로 체계를 보여주는 장면 전환 다이어그램 이 실험을 위해 사용 하는 그림 2에 나와 있습니다.
- 가이드, 뒤에 지시 포트
참고:이 상위 계층 빛 경로에서 큐브 포 탑은, 하나의 큐브 위치 NIR 낮은 계층 빛 경로에서 오는 수 있도록 비어 있어야
참고:이 10 X 객관적 렌즈 사용 하는 경우는 레이저 빛 자리 약 500 µ m 직경에서 확대 합니다. 이 겨냥 틀 제거 마이크로미터 범위 빛 자리에 결과 그리고 NIR 셀 방사선을 허무 하 게. 이 겨냥 틀은 NIR-투명.
3. 준비 및 특성화의 갇힌 PKA UCNP 구성
- 품 재조합 PKA (9 µ M)에 1-2 h 25에 대 한 버퍼 (20 mM Tris HCl, 100 mM NaCl, 그리고 10 mM MgCl 2, pH 8.5)를 고른다면 2-nitrobenzylbromide (NBB) 0.5 m m와 ° C. 끄다 10 m m dthiothreitol (DTT)와 초과 NBB 다음에 대 한 4-(2-hydroxyethyl) dialyze 고 piperazine-1-ethanesulfonic 산 (HEPES) 버퍼 (10 m m, pH 7.5) 초과 시 약 및 염 분 제거.
참고: 배우면 솔루션의 pH는 인하 8.5에서 7.5 HEPES ph 7.5 후속 동원 정지 반응에 대 한 투 석 중. - 믹스 란타넘족 소금-Y(CH3CO2) 3 수화물 (99.9%, 0.4527 g, 1.38 mmol), Yb (채널 3 CO 2) 3 수화물 (99.9%, 0.2533 g, 0.60 mmol)과 Tm (채널 3 CO 2) 3 수화물 (99.9%, 0.0168 g, 0.02 m m o l)-octadecene (30 mL), 올레산 (12 mL)에서 30 분 동안 115 ° C에 혼합물을가 열 하 고 50 ° c.에 멋진 다음, NaOH 펠 릿의 0.2 g (5.0 m m o l)와 methanolic 솔루션 (20 mL)에 반응 혼합물을 녹이 고 0.2964 g (8 mmol) 쥡니다 15 분 대에 의해 염화 불 화물의 증가 (β-NaYF 4 UCNP 코어를 300 ° C에 반응 온도 : 1.0 %Tm 3 + / 30 %Yb 3 +) 나노.
- 는 코어 나노 입자 (25mg) 공동-520 (0.5 mL)와 cyclohexane (10 mL)에 녹. 암모니아 (wt 30 %v / v, 0.08 mL)와 tetraethylorthosilicate (TEOS, 0.04 mL)을 추가 하 고 적용 하는 실리 카 코팅 β-NaYF 4를 실 온에서 12 h에 대 한 지속적인 교 반: 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + 코어 nanoparticles.
- 는 PKA를 품 어 (6 nmol) 또는 갇힌 PKA (6 nmol) HEPES buffer (10 m m, pH 7.5) 3 h 정전기 상호 작용을 통해 UCNP 실리 카 코팅에 PKA 무력화를 위한 4 ° C에서에서 UCNP (1 mg) 15.
- 는 PVDF 필터 (0.45 μ m), 4 ° C에서 10 분 동안 17000 x g에서 원심 분리기를 사용 하 여 혼합물을 필터 및 정화 PKA UCNP 복잡 한을 얻으려면 HEPES (50 µ L, 10 m m, pH 7.5) 포함 0.1% 단백질 안정제에 펠 릿을 redisperse. 4 ° C에서 10 분 동안 17000 x g에서 원심과 1.5 mL 튜브에 Bradford 분석 실험에 대 한 상쾌한 수집.
- 분석 UCNP 입자에 PKA 대체 수준을 다시 계산을 상쾌한 단계 3.5 Bradford 분석 실험에서에서 저장에 무제한 PKA는 일반적으로의 대체 수준을 ~ 입자의 밀리 그램 당 PKA의 4.5 nmol.
참고: Bradford 분석 실험 밝혀 탈 착 없이 높은 수준과 안정적인 단백질의 동원 정지를 건의 하는 펠 릿에는 강한 파란 색깔의 표면에 뜨는 분수 갇힌 PKA UCNP 솔루션 보여준다 색상 HEPES 버퍼 (비슷한 그림 4 c-4e).
4. 특성화
참고: 니 분석 결과 특정 pyruvate 키 니 아 제 활동을 계량 하는 데 사용 됩니다. 간단히, pyruvate 키 니 아 제 및 젖 산 효소를 결합 하 여 펩 티 드의 인 산화에서 NADH의 산화 결과. 후자의 형성은 340 NADH의 흡 광도 감소를 측정 하 여 모니터링 nm.
- KCl (100mm), phosphoenolpyruvate (흠, 1 m m), 아데노신 3 인산 염 (ATP, 1 m m), β- 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 형태 (NADH, 0.8 m m), 염화 마그네슘 (MgCl 2, 1 m m), kemptide (0.4 m m), 그리고 pyruvate 키 니 아 제/젖 산 효소 혼합물 (PK/LDH의 30/40 대) 감소.
5. Photolysis 설치
- Measure는 빛의 모든 힘 열 더미의 센서를 사용 하 여 및 전력량 계산 (PD = 전력 (W) / 지역 (cm 2)) 18 빛 반점 지역에 따라.
- Photolysis 실험에서 체 외에 UV 365 nm LED (200 mW/cm 2) 15 상업 시스템에 수행.
- 현미경 스테이지에 대 한 UV photoactivation 조명 상업 큐브 15 필터링 여기 빛 PKA UCNP 솔루션.
참고: 전원 밀도 ~ 15 mW/cm 2, 렌즈 초점 없이. - 생체 외에서 NIR photoactivation 현미경 무대에,에 대 한 조명 아래 계층 빛 경로, dichroic 거울 (850 nm 짧은 패스)에 설치 사용자 지정된 업 컨버전 필터/미러 설정으로 980 nm 레이저를 사용 하 여 PKA UCNP 솔루션 및 여기 필터 (950 nm 긴 패스).
참고: 출력 전력 밀도 4 X 렌즈 초점 전에 5 W/c m 2입니다. 전력 밀도 추정 됩니다 ~ 4 렌즈 초점 X 후 68 W/c m 2.
6. 샘플 준비 및 Microinjection의 PKA UCNP 단지 셀
- 0.45 μ m 필터를 통해 PKA 동원 정지 (3.5 단계) 후 샘플을 미리 필터링.
- 품 어 L-15 매체를 포함 하는 인큐베이터에 밖에 서 안정적인 pH 컨트롤에 대 한 microinjection 기간 동안 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)에 셀.
참고: microinjection 완료 확인, 공동 투입 네이티브 PKA-UCNP, UCNP-갇힌된 PKA, 또는 PEGylated UCNP (7.5 mg/mL) 15 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA)와 (10 µ M)에 셀. - 조정 PKA UCNP 입자의 농도, microinjection, 후 cytosolic 농도 1-3 μ M PKA-PKA 셀, 가정 주사 볼륨 세포 볼륨의 1/10에에서 대 한 생리 적인 농도 범위 .
- 셀 (6.2 단계)로 microinjection를 수행 1 축 유압 micromanipulator ( 그림 3)와 결합 하는 microinjector 장치를 사용 하 여.
- 사용 디지털 압력 게이지는 microinjector에 의해 적용 압력을 모니터링 하는 동작 범위 (~ 50-200 hPa) microinjection에 대 한 보상 압력을 제공 하기 위해 사용자 지정 된 압박 챔버에 분배기 밸브를 봉인. 철수는 끌어당기는 사람을 사용 하 여 바늘.
- 50 및 75 hPa, 200-300 ms와 모 세관 작용에 의해 바늘으로 문화 매체 역류를 방지 하기 위해 15 hPa에서 보상 압력 주입 시간 사이 사출 압력 유지.
- 있도록 그들은 40 x 객관적 렌즈를 사용 하 여 이미지를 복용 하 여 확인 될 수 있는 1.3 및 1.5 µ m, 외부 직경 바늘의 팁 채용 검사.
- L-15 매체 포함 하는 10%의 2 mL로 세포 세척에서 microinjection 후 FBS. 5 (6)-carboxytetramethyl-rhodamine (TAMRA) microinjection 완료 확인에서 세포 형광 이미징 관찰.
7. Photoactivation의 갇힌 PKA UCNP를 사용 하 여 UV 또는 생활 세포에서 NIR 빛
PKA UCNP microinjection 후- UV에 대 한 photoactivation 3.5 µ m 접시 REF52 셀 성장 하 고 현미경 스테이지에 배치 하 고, 자외선에 의해 필터링과 그들을 비추는 렌즈 초점 없이 3 분에 대 한 큐브.
참고: 셀에 10% 포함 된 DMEM 유지 되었다 REF52 5% CO 2 배양 기 및 셀에서 37 ° C에서 FBS 했다 subcultured는 confluency에 도달 하면 90%를 2-3 일 마다. - PKA UCNP microinjection 후에 NIR photoactivation 조명 낮은 계층 필터/미러 설정에서 980 nm 레이저에 셀 5.4 단계에서 설명한 대로.
참고: 출력 밀도 5 W/c m 2 렌즈 초점 X 10 전에 이며 렌즈 초점 x 10 후 300 W/c m 2을 것으로 추정 된다. 업은 anti-Stoke 교대 큰 필요한 경우에 특히 높은 광자 밀도 요구 하는 프로세스입니다. 따라서, photoactivation 동안 필요한 초점. - 큰 백색 반점 (650 µ m x 520 µ m) 필요한 경우, NIR을 난방을 피하기 위해 모든 5 분 방사선 조사 후 5 분 어두운 간격 15 분 허용에 대 한 겨냥 틀을 10 배 대물 렌즈에 의해 집중 된 이러한 셀을 비추는.
참고: 때 높은 공간 해상도 (subcellular 백색 반점) 필요, 라이트 가이드의 출구 끝에 설치 된 작은 구멍으로 40 X 객관적 렌즈를 사용 하 여 subcellular 차원 빛 자리 (5 µ m x 4 µ m)를 생성 합니다. 이 경우, 1 s 방사선의 NIR photoactivation 광자의 높은 유출 때문에 충분 하다. - 후 자외선 또는 적외선 photolysis는 5% CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 h 세포 응답을 생성 하는 완전 한 매체에 대 한 복구를 셀 수 있습니다. 그 후, 4 %paraformaldehyde / 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 20 분의 1 mL에 추가 얼룩이 지기 전에 수정.
주의: Paraformaldehyde은 매우 독성; 피부, 눈, 또는 점 막과의 접촉을 피하십시오. 측정 하 고 준비 하는 동안 분말을 호흡 하지 마십시오.
8. 스트레스 섬유 해체 기인 NIR Photoactivation의 시각화
- 고정, 후 알 렉 사 594-phalloidin 사용 (얼룩에 대 한 PBS의 200 µ L를 6.6 µ M 재고 솔루션의 5 µ L를 추가, 실내 온도에 25 분 동안 품 어) 얼룩과 스트레스 섬유를 시각화 합니다. 필터 집합을 사용 하 여 알 렉 사 594-phalloidin (전 581 nm/Em 609 nm)의 이미지를 시각화.
- 4에서 5 분에 대 한 셀을 품 어 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 실내 온도에. 얼룩, 후 PBS로 샘플을 세척 하 고 스트레스 섬유와 핵의 형광 이미지를 별도로 받아.
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Representative Results
갇힌된 효소 UCNP 구조물의 디자인은 그림 1에 나와 있습니다. PKA 효소는 먼저 비활성 갇힌된 PKA를 생성 하기 위해 2-nitrobenzyl 브 로마 이드와 반응 하 고 UCNP의 표면에 정전 움직일 다음 이었다. UCNPs는 upconverted 빛을 방출 하 고 결과적으로 photolytically o nitrobenzyl 그룹 199 Cys Cys 343, 활성화 된 PKA를 생성에 쪼개 다. 가장 이미지와 Bradford 분석 실험 확인 PKA와 갇힌된 PKA UCNPs의 표면에 움직일 수 있었다 고 갇힌된 PKA UCNP 솔루션 후 UV photoactivation의 키 니 아 제 활동 분석 (그림 4). PKA immobilization, 후 동적 산란 악기 크기와 제타 잠재력 PKA 입자 복합체의 120을 공개 및-16.0 mV, 각각. PKA UCNP 솔루션의 Bradford 분석 실험 강한 자주색 색상에 나타났다 입자, 높은 수준과 안정적인 단백질의 동원 정지를 제안.
REF52 쥐 미 발달 섬유 아 세포 세포 세포 실험에서 photoactivation의 연구에 대 한 선정 됐다. 이 실험 생 PKA 활성화 (세포 투과성 8 CPT 캠프의 외피에 의해 트리거되는) 또는 활성 또는 트리거 PKA의 microinjection PKA 통로 설정할 수 있습니다. (또는 입자 동원 정지 없이) 활성화 PKA 스트레스 섬유를 분해 하 고 더 filamentous 말라 (F-말라) 표면 및 그러므로 fluorophore 표시 phalloidin, F-말라, 저조한 높은 착 색 신호를 강하게 묶는 노출. 8-CPT-캠프 외피 또는 무료 PKA, UCNP-활성 PKA, 또는 UV 활성화 PKA-UCNP (긍정적인 제어 실험)으로 microinjection, 후 우리는 강한 스트레스 섬유 분해 PKA 통로 활성화 (그림 5)으로 인 한의 존재를 확인 했다. 추가 내 생 PKA와 microinjected PKA 연구 쇼 microinjection 사이트에만 PKA (활성 PKA-UCNP 및 UV 활성화 PKA UCNP) 디스플레이 스트레스 섬유 분해 입자 움직일 동안 전체 셀 스트레스 섬유 분해 PKA는 UCNPs에의 안정 되어 있는 동원 정지를 제안. NIR photoactivation 실험 갇힌된 PKA UCNP과 적외선 방사선의 microinjection 후 UCNPs upconverted 빛을 방출 하 고 199 Cys Cys 343에 o-nitrobenzyl 그룹을 쪼개 다. 따라서, 그들은 생성 활성화 PKA, 스트레스 섬유를 분해 하 고 fluorophore 표시 phalloidin 얼룩 (그림 6)에 의해 높은 신호를 얻을. REF52 셀에 음수 제어 실험 조사, 스트레스 섬유 무결성에는 영향을 주지 않습니다 보였다의 부재에 갇힌된 PKA-UCNP와 REF52 세포로 서 갇힌된 PKA와 다음 NIR 반구, UCNP microinjected.
그림 1 . 갇힌된 PKA-UCNP 디자인과 업 기반 PKA Uncaging의 일러스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 밝은 경로 체계를 보여주는 장면 전환 다이어그램. (a) 수정 된 spectrofluorometer 및 (b) 현미경 업 발광 및 NIR photolysis 모드 (왼쪽) 및 epifluorescence 및 UV photolysis 모드 (오른쪽), 뿐만 아니라 그들의 실험적인 체제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Microinjection에 대 한 실험적인 체제. 주입 홀더 사이 30 ° 및 45 ° 각도에서 1 축 오일 유압 micromanipulator와 결합 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: UCNP에 PKA 동원 정지의 확인. TEM 이미지 (a)의 실리 카 코팅 UCNP 및 (b) 갇힌 PKA 움직일 UCNP; (C) HEPES 버퍼, (d) 펠 릿 분수 물의 resuspension의 갇힌된 PKA UCNP 솔루션, 그리고 갇힌된 PKA UCNP 솔루션;의 (e)는 상쾌한 분수의 Bradford 분석 실험 그리고 UV photoactivation 후 갇힌된 PKA UCNP 솔루션의 (f) 키 니 아 제 활동 분석 결과. 이 그림에서가 오, H. D. 재현 되었습니다. 외. 후 명시적 권한 게시자, 미국 화학 학회에서에서 얻은 했다. 눈금 막대 = 20 nm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 스트레스 섬유 얼룩 (녹색)와 DAPI REF52 세포의 핵 (파란색)의 얼룩, 스트레스 섬유 분해 및 형태학 상 변화 다른 PKA 활성화에 의해 실행의 형광 이미지. (한) Untreated 셀, (b) 8-(4-Chlorophenylthio) 아데노신 3', 5'-주기적인 monophosphate (8-CPT-캠프)-셀, (c) 활성 PKA microinjected 셀, (d) 활성 PKA UCNP microinjected 세포, 및 ( 처리 e) UV 방사선 조사 후 세포 PKA UCNP microinjected 갇힌. (f-j) 광학 밀도 (마약) 사진을 각각 (a-e)에서 파생. (k-o) 파란색 화살표를 따라 해당 강도 곡선입니다. 흰색 화살표는 microinjected 셀을 나타냅니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: REF52 세포의 형광 이미지 다양 한 PKA 형태와 Microinjected. 셀 (a)와 microinjected NIR 방사선 조사 후, (b) 못 투입 UCNP NIR 조사에서 PKA UCNP 갇힌 그리고 (c) 방사선 조사 없이 PKA UCNP 갇힌. (d f) (-C)에 대 한 (점선된 상자)에서 UCNP의 upconverted 방출. (g-i) 스트레스 섬유 (녹색), 복잡 한, UCNP의 업 방출 (적색) 및 DAPI (파란색) 핵의 얼룩의 병합 된 이미지. 셀의 랜드 photoactivation 650 µ m의 조명 지역에서 실시 했다 x520 µ m 10 X 객관적 렌즈를 사용 하 여입니다. 형광 이미지는 40 X 렌즈를 사용 하 여 인수 했다. 따라서, 적외선 조사 면적 파선된 빨간 상자에 표시 된 대로 150 µ m x 120 µ m로 감소 되었다. 업 발광 (c)에서 볼 수 있습니다. ImageJ를 사용 하 여 정량화 연구, 마약과 사진 (j-패)에서 파생 되었다 (a-c), 각각. (J-패)에 표시 된 파란색 화살표를 따라 강도 곡선 (남-오)에 그릴 했다. 높은 신호 대 잡음 비율 (S/N)이이 시스템에 대 한 관찰 했다 하 고 긍정적인 반응으로 간주 됩니다. 이 접근은 모든 알 렉 사 594-phalloidin 착 quantifications에 대 한 적용 했다. 흰색 화살표는 microinjected 셀을 나타냅니다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이전에 호프만 및 동료 발견 극적인 형태 변화 무료 PKA19의 microinjection 후 REF52 세포에서 관찰 되었다. 또 다른 연구에서는 로렌스 그룹 갇힌된 PKA 형태학 변화 및 스트레스 섬유 때 UV photolysis20의 해체를 활성화 vivo에서, 될 수 있는 시연 했다. 이전 이용 upconverted 자외선은 photoactivation 여러 UCNP 지원, 감 금, 작은 분자 bioeffectors21,,2223의 활성화를 보여 보고 합니다. 그러나, bioeffector, 효소의 가장 중요 한 클래스에 UCNP 기반 photoactivation를 사용 하는 프로토콜은 아직도 개발 될 필요가 있다. 따라서, 본이 연구에서는 우리 UCNPs를 사용 하 여 갇힌된 PKA의 NIR photoactivation를 포함 하는 세포 실험 프로토콜을 설명 합니다. 이 NIR photoactivation 플랫폼에서 갇힌된 PKA20 UCNPs 실리 카 코팅의 표면에 움직일 수 제어 하는 트리거로 NIR를 사용 하 여 셀의 신호 변환 통로의 타당성을 설명 하기 위해 사용 되었다. 갇힌된 PKA-UCNP와 microinjected REF52 세포 구성 하 고 NIR 셀 내에서 스트레스 섬유 분해, 형태학 적 변화에 영향을 보여주으로 반구. 또한, 긍정 및 네거티브 제어 실험 수행 되었고 입증 스트레스 섬유의 해체에 지도 하는 PKA 유도 통로 적외선 조사에 의해 트리거됩니다.
악기 수정이이 원고에서 설명, PKA는 동안 화학 수정 문서화 다른15. 잘 설계 된 실험에서 문제 해결 하는 경우 먼저 확인 여부 문제에서 생성 됩니다: (i)는 단백질 UCNP 복잡 한, (ii) microinjection, 또는 (iii) 광학 계측. 단백질 photoactivation 문제가 있을 때: (1) 확인 확실히는 PKA 활성 상태인, (2) 확인 갇힌된 PKA는 잔여 활동은 < 그것의 원래 값의 5% (3) UV uncaged PKA는 (4) 확인 복원, 그 활동의 50% 이상에서 확실히 확인 갇힌된 PKA UCNP 표면에 움직일 수 있는 (Bradford 분석 실험 수행), 그리고 (5) 갇힌된 PKA UCNP 또한 복원 (UV 조사를 수행) 하 여 그 활동의 적어도 50%는 보장. Microinjection 문제에 대 한: (1) 확인 확실히 그 바늘 팁 오픈 이며 단백질 UCNP 솔루션 제대로 로드 됩니다. NIR 여기 채널 현미경에 로드 된 바늘 (팁)를 놓습니다. 업 형광을 관찰 하는 경우 로드가 맞습니다. (2) 세포 내 단백질 UCNP 주입 하 고 공동 주입된 5 carboxytetramethylrhodamine (TAMRA)-(6) 염료, 그리고 업 입자의 형광 강도 관찰 합니다. 적절 한 주입 셀에 강렬한 TAMRA 및 업 컨버전 입자 형광 발생 합니다. 현미경 광학 수정 문제 해결에 대 한: (1) 제거 목적 렌즈, 적외선 레이저, 설정 하 고 부적절 한 설정에 의해 차단 되지 해야 NIR 측정 현미경 스테이지 열 더미 파워 미터 센서를 넣어. (2) 대물 렌즈를 설치 하 고 투명 하단 베트 현미경 스테이지에 10 mg/mL UCNP 솔루션으로 가득 넣어. 솔루션에 날카로운 블루 빔 광학 모두 설치 된 경우 제대로 볼 것입니다.
Microinjection만 분석을 위해 제한 된 수의 셀을 제공할 수 있습니다. 주입 성공률은 연산자 (또는 경험)-의존,이 기술의 주요 한계입니다. 그러나, 지금까지 그것을 무시 하도록 다른 방법이 있다. 많은 과학자 들은 입자 세포 외피의 사용 수 이해 셀 입자 것이 좋습니다. 그러나, 이것은 가능한 접근이 아니다. 경우에 발생 하는 세포질 입자 통풍 관 통풍 관은 충분히는 cytosol에만 endosomes/리소좀 축적 됩니다. 이 특정 신호 전달 효소 cytosol, 하지 endosomes 효과에서 위치 해야 합니다. 또한, PKA는 37 ° C에서 완벽 한 스토리지 버퍼에 녹아 있는 때 그것의 활동 하룻밤 저장 후 지속 되지 않습니다. 세포 배양 매체에서 효소 안정성도 짧은 이며 부 화 접근 허무 하 게.
이 경 음악 설정, microinjection, 및 키 NIR photoactivation 프로토콜 뿐만 아니라 다른 단백질 또는 효소 클래스에 대 한 화학적 수정된 키, 뿐만 아니라 일반적으로 적용 되어야 했다. 또한, 그것은 유용할 것 이다 세포 연구에 직접적인 자외선 노출은 바람직하지 않다. 또한, 갇힌된 bioeffector UCNP 복잡 한 막 수용 체, 세포내 배달 문제를 방지 하 고 플랫폼 vivo에서 이용에 적용 가능한 막 단백질 등 세포 외 대상 작용할 수 있습니다. I.V. 주입 후 갇힌된 단백질 호르몬 또는 치료 단백질은 bioeffector의 활성화 된 형태 NIR 반구 지역에만 있을 것 이다.
Microinjection는이 프로토콜의 가장 중요 한 단계입니다. 정확한 주입, 바늘 로드 하는 동안 거품을 피하십시오. 후, 즉시 인젝터에 바늘을 설치 하 고 막힘 하면 건조에서 바늘 팁을 방지 하기 위해 중간에 바늘 끝을 담가. Microinjection 연산자 스킬이 높은 성공적인 주입 속도 대 한 중요 합니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리는 자금 (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2)에 대 한 나노 과학 및 기술 프로그램의 학계 Sinica 사역의 과학 및 기술의 대만 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Ammonium hydroxide (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
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