Summary
En este protocolo, jaula de la proteína quinasa A (PKA), un bioeffector de transducción de señal celular, fue inmovilizada en una superficie de nanopartículas, microinyectado en el citosol y activado por producir UV luz de radiación de infrarrojo cercano (NIR), induciendo desintegración de la fibra de estrés aguas abajo en el citosol.
Abstract
Upconversion nanopartículas (UCNP)-mediada de la fotoactivación es un nuevo enfoque a distancia control bioeffectors con mucho menos fototoxicidad y con una penetración más profunda del tejido. Sin embargo, la instrumentación existente en el mercado no es fácilmente compatible con la aplicacion de upconversion. Por lo tanto, modificar el instrumento disponible en el mercado es esencial para esta investigación. En este artículo ilustramos primero las modificaciones de un Fluorímetro convencional y microscopio de fluorescencia para hacerlos compatibles para los experimentos de upconversion del fotón. A continuación se describe la síntesis de un infrarrojo cercano (NIR)-desencadenó la jaula de la proteína kinase A subunidad catalítica (PKA) inmovilizada en un complejo UCNP. Parámetros para la microinyección y NIR fotoactivación procedimientos también se divulgan. Después de la PKA-UCNP enjaulado es microinyectado en células de fibroblastos REF52, la irradiación NIR, que es significativamente superior a la irradiación UV convencional, eficientemente activa la vía de transducción de señal PKA en las células vivas. Además, experimentos de control positivos y negativos confirma que la vía inducida por la PKA llevando a la desintegración de las fibras de estrés se activa específicamente por la irradiación NIR. Así, el uso de proteína modificada UCNP proporciona un enfoque innovador para remotamente controlar experimentos celulares luz modulada, en la que debe evitarse la exposición directa a los rayos UV.
Introduction
Proteínas químicamente modificadas que pueden ser fotoactivado (por ejemplo, proteínas PKA enjaulado) se han desarrollado como un campo emergente en Biología química a manipular no invasiva los procesos bioquímicos intercelulares1,2 ,3. Usando la luz como un estímulo ofrece excelente resolución espaciotemporal al activar estos enjaulado proteínas. Sin embargo, la luz UV puede causar no deseados cambios morfológicos, apoptosis y daño en el ADN a las células4,5. Por lo tanto, los acontecimientos recientes en el diseño de grupos de photocaging se centran en que fotorrotura sobre excitación de longitud de onda más largas o dos fotones para reducir fototoxicidad, así como para aumentar la penetración de tejido profundo6,7. Grupos de jaulas que responden a la longitud de onda más largo permitiendo elegir convenientes uncaging las longitudes de onda (es decir, canales) selectivamente activan bioeffectors cuando dos o más grupos de jaulas son presente7. Teniendo en cuenta estas características útiles, desarrollar nuevos grupos de photocaging de la luz roja es muy importante trabajo aguas arriba en fotoquímicas metodologías para estudios biológicos, que van desde los mecanismos de las reacciones para controlar las actividades celulares8de sondeo. Sin embargo, un grupo de jaulas de dos fotones es normalmente demasiado hidrofóbico debido a la estructura de anillo aromático fusionado, y un grupo de jaulas de luz visible es normalmente organometálicos con ligandos aromáticos. Esta propiedad hidrofóbica/aromático no es adecuada cuando la bioeffector es una proteína o enzima, ya que desnaturaliza el sitio de activación de la enzima/proteína y causa pérdida de la función, aunque la conjugación y fotólisis todavía trabajan en el nivel químico2 ,9.
UCNPs son eficaces transductores que convierten la luz de excitación NIR a los rayos UV. Esta propiedad única y fascinante de UCNPs ha ofrecido resoluciones realistas para enfrentar los retos asociados con fotoactivación y desencadena la liberación controlada de moléculas pequeñas, incluyendo ácido fólico10, derivados del cisplatino11 , ADN/siRNA12copolímero vesículas13y partículas huecos14. Sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento, la fotoactivación UCNP asistida de enzimas o proteínas no ha sido probado hasta ahora. Porque no hay ningún caso exitoso de usar luz roja o NIR a fotoactivos enzima, nos impulsó a realizar la activación activa NIR de una construcción de la proteína/enzima compuesta por complejos de enzima enjaulado químicamente modificado con una cubierta de sílice, dopados con lantánidos UCNP15. En este estudio, el UCNP fue conjugado con una quinasa de transducción de señal rápidamente reaccionando en forma de PKA enjaulado. PKA controla la síntesis de glicógeno y citoesqueleto Reglamento que responde a los estímulos externos vía regulación del fosfato (campo) de adenosina cíclica en el citosol16. Se estudió la viabilidad de la activación de la enzima de formas temporales y espaciales en un experimento de celular después de la irradiación NIR. Esta plataforma asistida UCNP fotoactivación es una nueva metodología para Fotoactivar enzima usando NIR y evita la respuesta de transducción de señal no deseada de las células causadas por convencionales UV irradiación2,4.
Es muy difícil que translocan grande bioeffectors (p. ej., proteínas) a través de la membrana de la célula para controlar la actividad celular. Aunque la proteína inmovilizada de partícula puede ser más fácil que translocan a través de endocitosis en el citosol, endocitosis pueden dañarse o degradarse vía endosomal atrapamiento y la consiguiente degradación lisosomal2,4. Aunque la proteína enjaulada es todavía funcional después de translocación de membrana, las cantidades translocadas pueden no ser suficiente para desencadenar la respuesta celular2,17. En contraste, microinyección es un acercamiento directo y cuantitativo para ofrecer grandes bioeffectors al citoplasma de la célula. Además, bioeffector inmovilizado UCNP requiere producir luz para activarse. Por lo tanto, la instrumentación óptica adicional requiere modificación para medir, visualizar y utilizar la luz de upconversion. En este trabajo, la entrega de un complejo de PKA UCNP enjaulado en una celda utilizando microinyección y las siguientes modificaciones esenciales, microscopia y espectroscopia de NIR fotoactivación se describen en detalle.
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Protocol
Nota: el protocolo describe una modificación de la instrumentación detallada de fotoactivación asistida de upconversion, un procedimiento sintético para generar enjaulado PKA-UCNP, microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la UCNP recubierto de silicona y enjaulado PKA UCNP muestras, configuración de fotólisis UV y NIR, preparación celular, microinyección de PKA UCNP, un estudio de fotoactivación y la fibra de estrés tinción de células REF52.
1. configuración de Fluorímetro para la medición de espectro de Upconversion
- instalar un objetivo X 4 junto al titular de la cubeta del espectrómetro de fluorescencia de modo que el láser se concentra en el centro de la cubeta.
- Colocar un diodo láser sintonizable de 980 nm 0.5 - 8 W 90° contra el objetivo.
PRECAUCIÓN: El operador debe tener conocimiento de seguridad láser y NIR láser gafas. - Instalar un espejo completo de la reflectancia en la intersección de la trayectoria de la luz de la lente del objetivo y láser. Colocar una placa de metal anodizada negro para bloquear la ventana de la excitación de la espectroscopia y a proteger las partes interiores.
- Coloque la cubeta de sílice recubiertas solución UCNP (0.2 - 0.6 mg/mL) en el portacubetas para que un haz luminoso upconversion puede visualizarse y puede utilizarse para ajustar la mejor alineación de luz para la instalación de espejo.
- Cambiar la espectroscopia al modo de luminiscencia con ajuste de voltaje más bajo de PMT (ajuste para un ajuste más alto si la señal es demasiado débil). Ajuste el espejo a la mejor alineación, donde la viga está en el centro de la cubeta y el PMT recoge la señal más fuerte.
- Medir el espectro de conversión ascendente, después de la alineación, con la configuración deseada. Utilice un medidor de potencia térmica de la pila para construir una curva de calibración de potencia del láser contra la lectura corriente eléctrica en la alimentación del láser. Controlar constantemente el rendimiento del láser para asegurarse de que el rendimiento está dentro del rango calibrado.
2. Configuración del microscopio
Nota: la siguiente configuración funciona para microscopios equipados con un camino óptico de dos niveles. Si el usuario tiene la intención de instalar un interruptor de la fuente de luz de excitación en el puerto trasero para que el láser NIR y la lámpara de haluro de compartir el mismo puerto, el colimador en el puerto trasero significativamente bloqueará el NIR, porque está diseñado para reducir el calentamiento de la muestra. El usuario debe hacer una elección difícil: mantener el colimador y sufren de upconversion muy baja eficacia, o quitar el colimador y sacrificar la intensidad de la excitación de la epifluorescencia.
Nota: un diagrama de corte que muestra el esquema de la trayectoria de la luz para un spectrofluorometer modificado, la microscopia para luminiscencia upconversion y modo de fotólisis NIR y epifluorescencia y modo de fotólisis UV y la configuración experimental utilizado para este experimento se ilustra en la figura 2.
Guía- Equip el microscopio de fluorescencia con una luz de halogenuros metálicos, dirigido en la parte trasera Puerto
Nota: en este camino de luz de nivel superior donde hay una torreta de cubo, una posición de cubo debe estar vacía para permitir NIR desde el reinado de luz de menor nivel - Instalar un diodo de láser sintonizable de 0.5 a 8.0 W 980 nm en el puerto del lado derecho, con el colimador de puerto lateral abierto.
Nota: Esto aumenta el láser luz punto a alrededor de 500 μm de diámetro cuando se utiliza un objetivo de 10 X. Este colimador resulta en un punto ligero de la gama del micrómetro y hace impracticable la irradiación celular NIR. Este colimador es NIR transparente. - Instale un espejo dicroico (corto-pase de 850 nm) y un filtro de la excitación (paso largo 950 nm) en el reinado de luz de menor nivel
- Use una solución UCNP para visualizar el punto de luz NIR. Ajuste la posición del láser el haz de luz NIR en el campo de visión para terminar la alineación del centro.
3. Preparación y caracterización de enjaulado PKA UCNP construcción de
- PKA recombinante incubar (9 μm) con 0,5 mM 2-nitrobenzylbromide (NBB) en jaulas de búfer (20 mM Tris-HCl, NaCl 100 mM y 10 mM de MgCl 2, pH 8,5) durante 1-2 h a 25 ° C. Quench el NBB exceso con 10 mM dthiothreitol (DTT) y luego dializarse contra 4-(2-hidroxietil) buffer ácido piperazina-1-(n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido (HEPES) (10 mM, pH 7.5) para eliminar el exceso reactivos y sales.
Nota: El pH de la solución de jaulas se baja de 8.5 a 7.5 durante diálisis con pH HEPES 7,5 para la reacción de inmovilización posterior. - Mix el lantánido Y(CH3CO2) sales 3 hydrate (99.9%, g 0,4527, 1.38 mmol), Yb (CH 3 CO 2) 3 hidrato (99.9%, g 0,2533, 0.60 mmol) y Tm (CH 3 CO 2) 3 hidrato (99.9%, g 0,0168, 0.02 mmol)-Octadeceno (30 mL) y ácido oleico (12 mL), la mezcla a 115 ° C durante 30 minutos y enfriar a 50 ° C. A continuación, disolver la mezcla de reacción en una solución metanólica (20 mL) con 0,2 g (5,0 mmol) de NaOH pellet y 0,2964 g (8 mmol) de fluoruro de amonio por sonicación durante 15 minutos subir la temperatura de reacción a 300 ° C para obtener la base UCNP (β-NaYF 4 : 1.0% Tm 3 + / 30% Yb 3 +) nanopartículas.
- Disolver las nanopartículas núcleo (25 mg) con CO-520 (0,5 mL) en ciclohexano (10 mL). Agregar amoníaco (wt 30% v/v, mL 0,08) y tetraethylorthosilicate (TEOS, 0,04 mL) y aplicar agitación constante durante 12 h a temperatura ambiente para obtener el β-NaYF recubierto de silicona 4: 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + base nanopartículas.
- Incubar el PKA (6 nmol) o enjaulado PKA (6 nmol) con UCNP (1 mg) 15 en tampón HEPES (10 mM, pH 7,5) a 4 ° C por 3 h para inmovilizar la PKA en el revestimiento de sílice UCNP mediante interacciones electrostáticas.
- Filtra la mezcla utilizando filtro de PVDF (0.45 μm), centrifugar a 17.000 x g por 10 min a 4 ° C y redisperse el pellet en estabilizador de proteínas 0,1% que contienen HEPES (50 μL, 10 mM, pH 7.5) para obtener el complejo PKA UCNP purificado. Centrifugue a 17.000 x g por 10 min a 4 ° C y recoger el sobrenadante para un ensayo de Bradford en un tubo de 1,5 mL.
- Analizar la PKA ilimitada en sobrenadante salvado de paso 3.5 con un ensayo de Bradford para espalda-para calcular el nivel de sustitución de PKA en las partículas UCNP, que normalmente tienen un nivel de sustitución de ~ 4.5 nmol de PKA por mg de partículas.
Nota: El ensayo de Bradford revela un fuerte color azul en las pelotillas, que sugiere una inmovilización de proteínas nivelada y estable sin la desorción, mientras que la fracción sobrenadante del enjaulado PKA UCNP solución muestra un color similar a () buffer HEPES figura 4 c-4e).
4. Caracterización
Nota: el ensayo de quinasa se utiliza para cuantificar la actividad específica de la cinasa del piruvato. En Resumen, la fosforilación del péptido, que se acopla a la piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa, resulta en la oxidación de NADH. Formación de este último se controla midiendo la disminución de absorbancia del NADH a 340 nm.
- Determine la actividad de la PKA y PKA UCNP en un volumen total de 60 μL de mezcla de ensayo que contiene ácido 4-morpholinepropanesulfonic (MOPS, 100 mM, pH 7.5), KCl (100 mM), fosfoenolpiruvato (PEP, 1 mM), trifosfato de adenosina (ATP, 1 mM), β - nicotinamida adenina dinucleótido reducido forma (NADH, 0,8 mM), cloruro de magnesio (MgCl 2, 1 mM), kémptido (0,4 mM) y una mezcla de deshidrogenasa de piruvato cinasa/lactato (30/40 unidades de PK/LDH).
- Medir la disminución de absorbancia del NADH en el tiempo después de la adición de solución PKA (2 μL) a la mezcla de ensayo. Calcular la pendiente de la línea para reflejar directamente la actividad de la quinasa se mide.
- Medir la actividad de PKA UCNP 15 y la actividad general, que debe combinarse bien con el producto de la multiplicación de la actividad de PKA-específicas nativa y la cantidad de superficie cubierta de PKA calculada.
5. Configuración de fotólisis
Meas- URE toda la energía de la luz fuentes usando un sensor termal de la pila y calcular densidades de potencia (PD = potencia (W) / área (cm 2)) 18 según la luz spot.
- Realizar los experimentos en vitro UV fotólisis en un sistema comercial con 365 nm LED (200 mW/cm 2) 15.
- UV para la fotoactivación en la platina del microscopio, iluminar la solución UCNP PKA con la excitación de luz filtrada por un cubo comercial 15.
Nota: La densidad de energía es ~ 15 mW/cm 2, sin objetivo concentrarse. - Para en vitro fotoactivación NIR en la platina del microscopio, iluminar la solución de PKA UCNP utilizando láser 980 nm con la configuración de filtro/espejo upconversion personalizado instalado en el menor nivel de paso de luz, un espejo dicroico (850 nm corta pasa), y un filtro de la excitación (950 nm paso largo).
Nota: La densidad de potencia de salida es 5 W/cm 2 antes de 4 X objetivo enfocar. Se estima la densidad de energía ~ 68 W/cm 2 4 X objetivo enfoque.
6. Preparación de la muestra y microinyección de PKA UCNP complejos de la célula
- prefiltro las muestras a través de un filtro de 0.45 μm después de la inmovilización de PKA (paso 3.5).
- Incubar las células en 10% de suero bovino fetal (FBS) que contiene L-15 medio durante el período de microinyección para control del pH estable fuera de la incubadora.
Nota: para confirmar la realización de la microinyección, conjuntamente inyectar el PKA-UCNP nativo enjaulado PKA-UCNP y PEGylated UCNP (7.5 mg/mL) 15 6 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) (10 μm) en células. - Ajustar la concentración de las partículas de PKA UCNP tal que, después de la microinyección, la concentración citosólica es 1-3 μM PKA - un rango de concentración fisiológica de PKA en una celda, con la suposición de que el volumen de inyección es 1/10 del volumen celular .
- Realizar la microinyección en células (paso 6.2) usando un dispositivo microinyector acoplado con un micromanipulador hidráulico de un eje ( figura 3).
- Usar un calibrador de presión digital para controlar la presión ejercida por la microinyectora es en el rango de operación (~ 50-200 hPa) y sello de la válvula de dispensador en una cámara ejerciendo presión sobre personalizada para proporcionar presión de compensación para la microinyección. Tire hacia atrás la aguja utilizando un extractor.
- Mantener la presión de inyección entre 50 y 75 hPa, con un tiempo de inyección de 200-300 ms y la presión de compensación en 15 hPa para evitar el reflujo del medio de cultivo en aguja por acción capilar.
- Examinar los orificios de la punta de las agujas para asegurar que tienen un diámetro exterior entre 1,3 y 1,5 μm, que puede confirmarse al tomar imágenes con una lente objetivo de 40 x.
- Lavar las células con 2 mL de medio de L-15 que contiene 10% FBS después de la microinyección. Observar la proyección de imagen de fluorescencia celular desde 5 (6) - carboxytetramethyl - rodamina (TAMRA) para confirmar la realización de la microinyección.
7. Fotoactivación de enjaulado PKA UCNP usando UV o luz NIR en células viven
fotoactivación- de UV después de la microinyección de PKA UCNP, crecen las células REF52 en un plato de 3,5 μm, los coloca en la platina del microscopio e irradiar con luz ultravioleta filtrada por el cubo por 3 min sin objetivo concentrarse.
Nota: REF52 células fueron mantenidas en DMEM con 10% SBF a 37 ° C en un incubador de 5% CO 2 y las células fueron subcultivadas cuando la confluencia alcanza a un 90% cada 2-3 días. - NIR para la fotoactivación después de la microinyección de PKA UCNP, iluminar las células en un láser de 980 nm de configuración de filtro/espejo de menor nivel, como se describe en el paso 5.4.
Nota: La potencia de la densidad es 5 W/cm 2 antes de 10 X objetivo centrado y se estima que 300 W/cm 2 después de 10 x objetivo centrado. Conversión ascendente es un proceso que requiere una densidad de fotones alta, especialmente cuando es necesario un cambio de anti-Stoke más grande. Por lo tanto, enfocarse es necesario durante la fotoactivación. - Cuando es necesario un punto de luz más grande (650 μm x 520 μm), irradiar estas células con NIR enfocado por una lente objetivo de 10 x con un colimador para permitir a 15 minutos para un intervalo oscuro de 5 min después de la irradiación de cada de 5 min para evitar el calentamiento.
Nota: Cuando una alta resolución espacial (punto ligero subcelular) es necesario, utilizar el objetivo de 40 X con un agujero de alfiler instalado en el extremo de salida de la guía de luz para generar un punto de luz dimensión subcelular (5 μm x 4 μm). En este caso, 1 s de irradiación es suficiente para la fotoactivación NIR por el alto flujo de fotones. - Fotólisis UV después o NIR, permiten a las células a recuperar en una 5% CO 2 incubadora a 37 ° C por 1 h en medio completo para generar respuestas celulares. Posteriormente, fijar en 1 mL de 4% paraformaldehido/fosfato-buffer salina (PBS) por 20 min antes de la tinción más.
PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es altamente tóxico; Evite el contacto con la piel, ojos o membranas mucosas. Evite respirar el polvo durante la preparación y medición.
8. Visualización de estrés fibra desintegración causada por fotoactivación de NIR
- después de la fijación, utilizar Alexa 594-phalloidin (Añadir 5 μl de la solución madre de 6.6 μm a 200 μL de PBS para tinción, incubar durante 25 min a temperatura ambiente) a la mancha y visualizar las fibras de estrés. Visualizar las imágenes de Alexa 594-phalloidin (Ex 581 nm/Em 609 nm) usando un sistema de filtro.
- Incubar las células por 5 min en 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a temperatura ambiente. Después de teñir, lavar las muestras con PBS y tomar por separado imágenes fluorescentes de las fibras de estrés y núcleos.
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Representative Results
El diseño de la construcción de la enzima-UCNP enjaulado se ilustra en la figura 1. La enzima PKA se reaccionó primero con 2-Nitrobencilo bromuro para generar un PKA inactiva enjaulado, y luego fue electrostático inmovilizada en la superficie de UCNP. UCNPs emitir la luz convertida y en consecuencia photolytically hienden los grupos Nitrobencilo o Cys 199 y Cys 343, generando la PKA activada. Imágenes TEM y el análisis de Bradford confirman que el PKA y el PKA enjaulado fueron inmovilizadas sobre la superficie del UCNPs, y la actividad quinasa de enjaulado solución PKA UCNP después de fotoactivación UV analizadas (figura 4). Después de la inmovilización de la PKA, un instrumento de difusión de luz dinámica reveló el tamaño y el potencial zeta del complejo PKA-partícula que 120 nm y-16.0 mV, respectivamente. Análisis de Bradford de la solución de PKA UCNP mostró un fuerte color púrpura en las partículas, lo que sugiere una inmovilización de proteínas nivelada y estable.
Células de fibroblastos embrionarios de rata REF52 fueron seleccionadas para el estudio de fotoactivación en el experimento de celular. En este experimento, puede activarse la vía PKA por activación de PKA endógena (que se activa mediante la incubación de permeable a la célula 8-CPT-cAMP) o la microinyección de la PKA activa o triggerable. PKA activada (con o sin inmovilización de partículas) desintegra las fibras de estrés y expone la superficie más filamentos de actina (F-actina) y phalloidin fluoróforo por lo tanto, que se une fuertemente a F-actina, produciendo una señal de tinción más alta. Después de incubación de 8-CPT-cAMP o microinyección del PKA gratis, activa PKA-UCNP o UV-activa PKA-UCNP (como control positivo de experimentos), se confirmó la presencia de la desintegración de la fibra de estrés fuerte causada por la activación de la vía PKA (figura 5). PKA endógeno y microinyectados estudios PKA Mostrar desintegración de la fibra de estrés celulares, mientras la partícula inmovilizado el PKA (PKA-UCNP activo y UV activa PKA-UCNP) muestra estrés de los de fibra desintegración sólo en el lugar de la microinyección, más sugiriendo la inmovilización estable de PKA en el UCNPs. Para el experimento de fotoactivación NIR, después de la microinyección de la PKA-UCNP enjaulado y la irradiación NIR, UCNPs emiten luz convertida y hienden los grupos Nitrobencilo o Cys 199 y Cys 343. En consecuencia, generan la PKA activada, desintegrado de las fibras de estrés y cede una señal mayor phalloidin fluoróforo tinción (figura 6). Experimentos de control negativo en las células REF52 microinyectados con UCNP sin el PKA enjaulado y luego irradiadas por NIR, así como las células REF52 con PKA-UCNP enjaulado en la ausencia de irradiación, no mostró ningún efecto sobre la integridad de la fibra de estrés.
Figura 1 . Ilustración de diseño enjaulado PKA-UCNP y PKA Upconversion asistido Uncaging. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Un diagrama de corte que muestra el esquema de la trayectoria de la luz. (un) modificado spectrofluorometer y (b) microscopio de luminiscencia upconversion y NIR fotólisis modo (izquierda) y epifluorescencia y modo de fotólisis UV (derecha), así como su disposición experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Disposición experimental para microinyección. El soporte de inyección está acoplado con un micromanipulador hidráulico de aceite de un eje en un ángulo entre 30° y 45°. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Confirmación de inmovilización de PKA en UCNP. Imágenes TEM de (un) UCNP recubierto de silicona y (b) enjaulados UCNP inmovilizada de PKA; Ensayo de Bradford (c) HEPES buffer, (d) la pelotilla fracción resuspensión de solución PKA UCNP enjaulado y fracción (e) el sobrenadante de la solución de PKA UCNP enjaulado; y (f) ensayo de actividad de cinasa de enjaulado solución de PKA UCNP después de la fotoactivación de la UV. Esta figura se ha reproducido de Gao, H. D. et al. después se obtuvo permiso explícito del editor, la sociedad americana de química. Barra de escala = 20 nm haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Imágenes de fluorescencia de estrés fibra coloración (verde) y DAPI tinción de los núcleos (azul) de las células REF52, mostrando la desintegración de la fibra de estrés y cambios morfológicos desencadenados por la activación de la PKA diferentes. las células de (un) no tratado, (b) 8-(4-Chlorophenylthio) adenosina 3', 5'-cíclico monofosfato (8-CPT-cAMP)-trataron células, (c) activa PKA microinyectados células, células de PKA-UCNP microinyectados activas (d) y ( e) enjaulados PKA-UCNP microinyectados células después de la irradiación UV. (f-j) Las imágenes de densidad óptica (O.D.) derivan de (e), respectivamente. (k-n) Las correspondientes curvas de intensidad a lo largo de la flecha azul. La flecha blanca indica la celda microinyectada. La barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Imágenes de fluorescencia de células REF52 microinyectados con diversas formas PKA. Las células microinyectadas con (un) enjaulados PKA UCNP después de la irradiación NIR, (b) UCNP PEG-injertado bajo irradiación NIR, y (c) enjaulados PKA UCNP sin irradiación. (d-f) La emisión de convertida de UCNP (en la caja punteada) (- c). (g-i) Imágenes combinadas de las fibras de estrés (verde), upconversion emisiones (rojo) de la UCNP complejo y DAPI tinción de los núcleos (azul). NIR de fotoactivación de las células se llevó a cabo en una zona reflectante de 650 μm x520 μm utilizando un objetivo de 10 X. Las imágenes de fluorescencia fueron adquiridas con un objetivo de X 40. Por lo tanto, el área de irradiación NIR fue reducido a 150 μm μm x 120, como se indica en la caja roja discontinua. La luminiscencia de la conversión ascendente puede verse en (c). Estudios de cuantificación mediante ImageJ, D.E. cuadros (j-l) se derivan (c), respectivamente. Se trazaron las curvas de intensidad a lo largo de la flecha azul que se muestra en (j-l) (m-o). Un alto cociente de relación señal a ruido (S/N) fue observado para este sistema y se considera una respuesta positiva. Este enfoque se aplicó para todos Alexa 594 phalloidin tinción cuantificaciones. La flecha blanca indica la celda microinyectada. La barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Previamente, Hofmann y compañeros de trabajo encontraron que cambios morfológicos dramáticos fueron observados en células REF52 después de la microinyección de la PKA gratis19. En otro estudio, el grupo de Lawrence demostró que PKA enjaulado puede ser activado en vivo, lleva a cambios morfológicos y la desintegración de las fibras de estrés cuando es expuesto a UV fotólisis20de. Anteriores informes sobre explotación de UV de producir luz por fotoactivación demostrada la activación de la bioeffectors molecular asistida UCNP, enjaulado, pequeño varios21,22,23. Sin embargo, un protocolo para utilizar fotoactivación UCNP asistida en la clase más importante de bioeffector, la enzima, todavía necesita ser desarrollada. Por lo tanto, en este estudio, se describe un protocolo de experimento celular que incluye la fotoactivación NIR de PKA enjaulado con UCNPs. En esta plataforma de fotoactivación NIR, enjaulado PKA20 inmovilizada en la superficie de UCNPs recubierto de silicona fue utilizado para demostrar la viabilidad de controlar la vía de transducción de la señal de la célula usando NIR como un disparador. Las células REF52 microinyectadas con un PKA-UCNP enjaulado construirán y se irradiaron con NIR mostró un efecto de desintegración de la fibra de estrés, así como cambios morfológicos en las células. Además, realizaron experimentos control positivo y negativo y probó que la vía inducida por la PKA llevando a la desintegración de las fibras de estrés se desencadena por la irradiación NIR.
En este manuscrito se describe la modificación del instrumento, mientras que el PKA modificación química documentado en otra parte15. Si un experimento bien diseñado requiere solución de problemas, en primer lugar identificar si los problemas son generados a partir de: (i) el complejo proteína-UCNP, (ii) microinyección o instrumentación (iii) óptica. En caso de problemas de fotoactivación de proteína: (1) Asegúrese de Asegúrese de que la PKA está activo, (2) confirmar que el PKA enjaulado tiene actividad residual que es < 5% de su valor original, (3) comprobar que el PKA UV uncaged tiene por lo menos el 50% de su actividad restaurada, (4) Asegúrese de que que el PKA enjaulado es inmovilizada en la superficie UCNP (realizar un ensayo de Bradford) y (5) Asegúrese de que el PKA-UCNP enjaulado también tiene al menos el 50% de su actividad restaurada (mediante la realización de la irradiación UV). Para problemas de microinyección: (1) Asegúrese de que esa punta de la aguja esté abierta y la solución de proteína UCNP está cargada correctamente. Coloque la aguja cargada (punta) en un microscopio con un canal de excitación NIR. Si se observa la fluorescencia de upconversion, la carga es correcta. (2) inyectar el UCNP proteína en las células y observar la intensidad de fluorescencia de co-inyección tinte 5 de 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) y partículas de upconversion. Inyección adecuada resultará en intensa fluorescencia TAMRA y upconversion partículas en las células. Para microscopio óptico modificación resolución de problemas: (1) Retire la lente del objetivo, encender el láser NIR y poner el sensor de medidor de energía pila térmica sobre la platina del microscopio para medir la IRC, que no debe ser bloqueado por un ajuste inadecuado. (2) Instale la lente del objetivo y poner una cubeta transparente fondo llenada de 10 mg/mL de solución de UCNP sobre la platina del microscopio. Un fuerte rayo azul en la solución se verá si la óptica está todo instalada correctamente.
Microinyección sólo puede proporcionar un número limitado de células para análisis. La tasa de éxito de la inyección es operador (o experiencia)-dependiente, que es una limitación importante de esta técnica. Sin embargo, no hay ninguna otra manera de eludir hasta ahora. Muchos científicos sugieren que el uso de la incubación de células de partículas permite las células para la absorción de las partículas. Sin embargo, esto no es un acercamiento factible. Incluso si se produce la absorción celular de la partícula y la cantidad de absorción es suficiente, se acumulará en los endosomas/lisosomas, pero no en el citosol. Esta enzima de transducción de señal específica necesita que se encuentra en el citosol, no endosomas, para ser eficaz. Por otra parte, cuando PKA se disuelve en un buffer de almacenamiento perfecto a 37 ° C, su actividad no dura después de almacenamiento durante la noche. La estabilidad de la enzima en el medio de cultivo celular es aún más corta, y es el enfoque de incubación práctico.
Esto informó instrumental configuración, microinyección y quinasa NIR fotoactivación Protocolo debería ser generalmente aplicable, no sólo para la quinasa químicamente modificado, sino también para otras clases de proteína o enzima. Por otra parte, sería útil en estudios celulares donde está indeseable la radiación UV directa. Además, el complejo bioeffector-UCNP enjaulado puede interactuar con objetivos extracelulares, proteínas de membrana como receptores de membrana, evitando el problema de transporte intracelular y haciendo de la plataforma aplicable al uso de en vivo . Después de la inyección I.V., hormonas proteicas enjaulado o proteínas terapéuticas tienen la forma activada de la bioeffector sólo en las regiones irradiadas por NIR.
Microinyección es el paso más crítico en este protocolo. Para la inyección precisa, evitar burbujas durante la carga de la aguja. Después de la carga, inmediatamente Instale la aguja en el inyector y sumerja la punta de la aguja en el medio para evitar que la punta de la aguja de la sequedad, que causa la obstrucción. Habilidad del operador de microinyección es crítico para una mayor tasa de éxito de la inyección.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Agradecemos a la Nano Ciencia y tecnología programa de Academia Sinica y el Ministerio de ciencia y tecnología de Taiwán por los fondos (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Ammonium hydroxide (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
