Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Hücre içi sinyal iletimi Upconversion nanopartikül aracılı kinaz Photoactivation tarafından uzaktan tetiklemek için entegre bir sistem

Published: August 30, 2017 doi: 10.3791/55769

Summary

Bu protokol için Kafesli protein kinaz A (PKA), hücresel sinyal iletim bioeffector bir nanopartikül yüzey üzerine immobilize sitozol microinjected ve upconverted UV yakın kızılötesi (Nur) ışınlama ışığı sayesinde inducing aşağı akım stres fiber dağılma sitozol içinde.

Abstract

Upconversion nanopartikül (UCNP)-aracılı photoactivation için uzaktan kontrol bioeffectors derin doku penetrasyon ile çok daha az fototoksisite ile yeni bir yaklaşımdır. Ancak, piyasada mevcut araçları kolayca upconversion uygulama ile uyumlu değildir. Bu nedenle, ticari araç değiştirerek bu araştırma için esastır. Bu yazıda, ilk geleneksel fluorimeter ve floresan mikroskop foton upconversion deneyler için uyumlu olmaları için değişiklikler göstermektedir. Biz o zaman bir yakın kızılötesi (Nur) sentezi tarif-UCNP kompleksi immobilize Kafesli protein kinaz A katalitik alt birimi (PKA) tetiklenir. Mikroenjeksiyon ve Nur photoactivation yordamlar için parametre de raporlanır. Kafesli PKA UCNP REF52 fibroblast hücreleri microinjected sonra geleneksel UV ışınlama için önemli ölçüde üstün olduğunu, NIR ışınlama PKA sinyal iletim yolu canlı hücreler içinde etkili bir şekilde tetikler. Buna ek olarak, pozitif ve negatif kontrol deneyleri stres lifleri dağılması için önde gelen PKA kaynaklı yolu özellikle NIR ışınlama tarafından tetiklenir onaylayın. Böylece, UCNP protein-modified kullanımı UV ışığı doğrudan maruz kaçınılmalıdır ışık modülasyonlu hücresel deneyler uzaktan denetlemek için yenilikçi bir yaklaşım sağlar.

Introduction

Photoactivated (Örneğin, Kafesli PKA proteinler) olabilir kimyasal olarak değiştirilmiş proteinlerin kimyasal Biyolojide invaziv olmayan hücreler arası biyokimyasal süreçler1,2 işlemek için gelişmekte olan bir alanı olarak geliştirilmiştir ,3. Bunlar aktif hale getirildiğinde bir uyarıcı mükemmel kronolojik zamanmekansal çözünürlük sağlar gibi ışık kullanarak proteinler Kafesli. Ancak, UV ışığı istenmeyen morfolojik değişiklikler, Apoptozis ve DNA hasarı hücreleri4,5' e neden olabilir. Bu nedenle, tasarım son gelişmeler photocaging gruplarının photocleavage fototoksisite, de derin doku penetrasyonu6,7artırmak olarak azaltmak için dalga boyu daha uzun veya İki fotonlu uyarma üzerine etkinleştirme hakkında odaklan. Bioeffectors iki uzun dalgaboyu bize uygun uncaging dalga boylarında (Yani, kanalları) seçmek seçime bağlı olarak izin verdiği yanıt caging grupları etkinleştirmek veya mevcut7daha fazla caging gruplarıdır. Bu yararlı özellikleri göz önüne alındığında, yeni kırmızı ışık photocaging grupları ters yönde çalışmalarında çok önemli biyolojik araştırmalar reaksiyonlar hücresel aktiviteler8denetleme mekanizmalarının sondalama arasında değişen fotokimyasal yöntemleri geliştiriyor. Yine de, bir iki fotonlu caging normalde erimiş Aromatik halka yapısı nedeniyle çok hidrofobik grubudur ve görünür ışık caging ile aromatik ligandlar normalde Organometalik grubudur. Bu hidrofobik/aromatik özelliği etkinleştirme sitesi enzim/protein denatures ve fiil ve photolysis hala kimyasal düzeyde2 işe bile işlevi, kaybolmasına bioeffector bir protein veya enzim, ne zaman uygun değil ,9.

UCNPs Nur uyarma ışık UV için dönüştürmek etkili dönüştürücüler vardır. UCNPs bu benzersiz ve ilginç özelliği sorunları ele almak üzere gerçekçi kararlar photoactivation ile ilişkili ve kontrollü serbest bırakmak-in küçük moleküller, sisplatin türevleri11 folik asit10, dahil tetiklenen teklif etti , DNA/siRNA12, kopolimer veziküller13ve içi boş parçacıklar14. Ancak, bizim bilgi en iyi şekilde, proteinler ve enzimler UCNP destekli photoactivation defa test edilmemiştir. Kırmızı ışık veya NIR fotoaktif için bir enzim kullanarak başarılı bir dava yok çünkü biz kimyasal olarak değiştirilmiş Kafesli enzim kompleksi silis kaplı ile oluşan bir protein/enzim yapısı NIR tetiklemeli aktivasyonu gerçekleştirmek için istemde, UCNP15lanthanide katkılı. Bu çalışmada, UCNP bir hızla tepki sinyal iletim kinaz Kafesli PKA şeklinde ile Birleşik. PKA glikojen sentez ve siklik adenozin fosfat (kampı) yönetmelik sitozol16üzerinden dış uyaranlara yanıt hücre iskeleti düzenlenme denetler. Biz NIR ışınlama sonra hücresel bir deneyde zamansal ve mekansal davranış enzim harekete geçirmek fizibilite okudu. Bu photoactivation UCNP destekli platform photoactivate için yeni bir yöntem NIR kullanarak bir enzimdir ve geleneksel UV ışınlama2,4tarafından neden olduğu hücre istenmeyen sinyal iletim yanıtından önler.

Çok büyük bioeffectors translocate zordur (örneğin, proteinler) hücresel hareketlilik denetlemek için hücre zarı arasında. Parçacık immobilize protein endositoz ile sitozol translocate daha kolay olabilir, ancak endositoz bozulabilir veya endosomal tuzak ve bunun sonucunda lizozomal bozulması2,4yolu ile bozulmuş. Kafesli protein membran translocation sonra hala işlevsel olsa bile, translocated tutarları hücresel yanıt2,17tetiklemek için yeterli olmayabilir. Keskin aksine, mikroenjeksiyon büyük bioeffectors hücre sitoplazma için teslim etmek için bir doğrudan ve nicel bir yaklaşımdır. Ayrıca, UCNP etkisiz hale bioeffector upconverted ışık etkinleştirilmesini gerektirir. Bu nedenle, optik araçları daha fazla ölçmek, görselleştirmek ve upconversion ışık yararlanmak için değişiklik gerektirir. Bu çalışmada, kafese kapatılmış bir PKA-UCNP kompleksi teslim mikroenjeksiyon ve aşağıdaki temel spektroskopisi ve mikroskopi değişiklikleri için NIR photoactivation kullanarak bir hücreye ayrıntılı olarak açıklanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: detaylı alt yapısı değiştirilmek üzere upconversion destekli photoactivation protokolünü açıklar, sentetik bir yordam oluşturmak için PKA-UCNP, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) silis kaplı UCNP Kafesli ve PKA-UCNP örnekleri, UV ve Nur photolysis Kur, hücre hazırlık, PKA-UCNP mikroenjeksiyon, photoactivation çalışma ve stres fiber REF52 hücreleri boyama Kafesli.

1. Fluorimeter Kur Upconversion spektrum ölçümü için

  1. lazer küvet orta üzerinde odaklanmıştır Floresans Spektrometre küvet sahibinin yanında 4 X objektif lens yükleyin.
  2. Yer tunable 0,5 - 8 W 980 nm lazer diyot karşı objektif lens 90°.
    Dikkat: Operatör lazer Emanet bilgiye sahip ve NIR lazer gözlük giymek gerekiyor.
  3. Tam Yansıma ayna objektif lens ve lazer ışık yolu kavşak yükleyin. Bir siyah anodize metal plaka spektroskopisi uyarma pencerenin engellemek için ve iç parçaları korumak için yerleştirin.
  4. Bir parlak upconversion ışın görüntülenmeyecektir ve ayna yükleme için en iyi ışık hizalamayı ayarlamak için kullanılabilecek şekilde yer silis kaplı UCNP çözüm (0.2 - 0.6 mg/mL) küvet küvet tutucu içinde.
  5. Düşük Devresel_ödeme voltaj ayar moduyla ışıldama spektroskopisi geçin (sinyal çok zayıf ise bir daha yüksek ayarı ayarlayın). Aynaya burada ışın küvet orta ve Devresel ödeme en güçlü sinyali alır en iyi hizalama ayarlamak.
  6. İstenen güç ayarı ile uyum sonra upconversion spektrum ölçmek. Bir termal kazık güç ölçüm kalibrasyon eğrisi üzerinde lazer güç kaynağı elektrik geçerli okumaya karşı lazer güç oluşturmak için kullanın. Sürekli lazer performans performans kalibre edilmiş Aralık içinde olduğundan emin olmak için kontrol edin.

2. Mikroskop kurulum

Not: aşağıdaki Kurulum mikroskoplar iki katmanlı optik yol ile donatılmış için çalışır. Kullanıcı bir uyarma ışık kaynağı anahtarı NIR lazer ve aynı bağlantı noktasını paylaşan halide lamba yapmak için geri limanda yüklemeye çalışırsa, örnek Isıtma azaltmak için tasarlandığından Kolimatör arka limanda önemli ölçüde NIR engeller. Kullanıcı zor bir seçim yapmak zorundadır: Kolimatör aklında bulunsun ve çok düşük upconversion verimlilik acı veya Kolimatör kaldırmak ve uyarma için epifluorescence ışık yoğunluğunu kurban.

Not: ışık yolunu düzeni değiştirilmiş spectrofluorometer mikroskobu upconversion ışıma ve Nur photolysis modu ve epifluorescence ve UV photolysis modu ve deneysel kurulum için gösteren bir kesit diyagram Bu deneme için kullanılan Şekil 2 ' de gösterilmiştir.

  1. Equip Floresans mikroskobu ile metal halide ışık Kılavuzu, arkasına yönetmen limanda
    Not: Bu yoldaki üst katmanlı hafif olduğu yerde bir küp taret, bir küp konum alt katmanı ışık yolu gelen NIR için izin vermek için boş olması gerekir
  2. Açık yan-port kolimatör ile sağdaki Port bir akort 8,0 0,5 W 980 nm lazer diyot yükleyin.
    Not: 10 X objektif lens kullanıldığında bu lazer ışık spot için yaklaşık 500 µm çapında büyütür. Bu Kolimatör kaldırma bir mikrometre menzilli hafif yerinde olur ve NIR hücre ışınlama pratik yapar. Bu Kolimatör NIR-saydamdır.
  3. Dikroik ayna (850-nm kısa-pass) ve alt katmanı ışık yolunu bir uyarma filtresi (950 nm uzun-pass) yüklemek
  4. Bir UCNP çözüm Nur ışık spot görselleştirmek için kullanın. Lazer NIR hizalama bitirmek için görüş alanı içinde ışık demeti ortalamak için konumunu ayarlamak.

3. Hazırlanması ve karakterizasyonu, Kafesli PKA-UCNP inşa

  1. Incubate rekombinant PKA (9 µM) ile 0,5 mM 2-1-2 h 25 için arabellek (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl ve 10 mM MgCl 2; pH 8,5) caging içinde nitrobenzylbromide (NBB) ° C. yavaşlaması 10 mM dthiothreitol (DTT) ile aşırı NBB ve sonra karşı 4-(2-hydroxyethyl) diyaliz piperazin-1-ethanesulfonic asit (HEPES) arabellek (10 mM, pH 7.5) aşırı reaktifler ve tuzları kaldırmak için.
    Not: Caging çözüm pH 8.5 için 7,5 HEPES pH 7.5 için sonraki immobilizasyon tepki ile diyaliz sırasında indirilir.
  2. Mix lanthanide tuzları-Y(CH3CO2) 3 hidrat (% 99.9, 0.4527 g, 1.38 mmol), Yb (CH 3 CO 2) 3 hidrat (% 99.9, 0.2533 g, 0.60 mmol) ve Tm (CH 3 CO 2) 3 hidrat (% 99.9, 0.0168 g, 0,02 mmol)-octadecene (30 mL) ve oleik asit (12 mL), 115 ° C 30 dk için karışım ısı ve onları 50 ° c için serin Daha sonra methanolic bir çözüm (20 mL) 0.2 g (5.0 mmol) tepki karışımı NaOH Pelet dağıtılması ve 0.2964 g (8 mmol) sonication 15 dakika süreyle tarafından amonyum florür artırmak reaksiyon ısısı UCNP çekirdeği (β-NaYF 4 almak için 300 ° c : %1.0 Tm 3 + / %30 Yb 3 +) nano tanecikleri.
  3. Çekirdek nano tanecikleri (25 mg) CO-520 (0.5 mL) ile Siklokekzan (10 mL) içinde çözülür. Amonyak (wt % 30 v/v, 0,08 mL) ve tetraethylorthosilicate (TEOS, 0,04 mL) ekleyin ve oda sıcaklığında silis kaplı β-NaYF 4 12 h için sürekli karıştırmaya uygulayın: 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + çekirdek nano tanecikleri.
  4. PKA kuluçkaya (6 nmol) veya PKA Kafesli (6 nmol) ile UCNP (1 mg) 15 PKA Elektrostatik etkileşimler yoluyla UCNP silika kaplı üzerinde hareketsiz 3 h için 4 ° C'de HEPES tampon (10 mM, pH 7.5).
  5. PVDF filtre (0,45 µm), 4 ° C'de 10 dakika için 17.000 x g, santrifüj kullanarak karışımı filtre ve Pelet HEPES (50 µL, 10 mM, pH 7.5) kapsayan %0,1 protein sabitleyici arıtılmış PKA-UCNP kompleksi elde etmek için yapılan redisperse. Santrifüj kapasitesi 17.000 x g 4 ° C'de 10 dakika ve süpernatant 1.5 mL tüp içinde Bradford tahlil için toplamak.
  6. Analiz UCNP parçacıklar PKA ikame düzeyde geri hesaplamak için sınırsız PKA adım 3.5 Bradford tahlil ile kaydedilen süpernatant içinde hangi normalde sahip bir ikame düzeyde ~ PKA 4,5 nmol parçacık mg başına.
    Not: Bradford tahlil granül, yüksek düzey ve istikrarlı protein immobilizasyon desorpsiyon olmadan öneriyor bir güçlü mavi renk ortaya çıkarır, süpernatant kısmını Kafesli iken PKA-UCNP çözüm bir renk benzer HEPES tampon () gösterir şekil 4 c-4e).

4. Karakterizasyonu

Not: kinaz tahlil pyruvate kinaz belirli etkinliğini ölçmek için kullanılır. Kısacası, pyruvate kinaz ve laktat dehidrogenaz bağlandı, peptid, fosforilasyon NADH oksidasyon içinde sonuçlanır. İkinci oluşumu, NADH Absorbans 340 azalma ölçerek izlenir nm.

  1. Belirleme etkinlik PKA ve PKA-UCNP 4-morpholinepropanesulfonic asit (BEZLERİ, 100 mM, pH 7.5), içeren tahlil karışımı 60 µL toplam birimindeki KCl (100 mM), phosphoenolpyruvate (PEP, 1 mM), adenozin trifosfat (ATP, 1 mM), β - Nikotinamid adenin dinükleotit, azaltılmış formu (NADH, 0.8 mM), magnezyum klorür (MgCl 2, 1 mM), kemptide (0.4 mM) ve pyruvate kinaz/laktat dehidrogenaz karışımı (30/40 birim PK/karaciğer).
  2. NADH Absorbans PKA çözüm (2 µL) tahlil karışıma ilavesi sonra zamanla azalma ölçmek. Doğrudan ölçülen kinaz etkinliği yansıtmak üzere çizgisinin eğimini hesaplayın.
  3. PKA-UCNP 15 aktivite ve yerel PKA özel etkinlik ve hesaplanan PKA tutar kaplı yüzey çarpma ürün ile de uyumlu olması genel faaliyet ölçmek.

5. Photolysis kurulum

  1. banaışığın tüm gücü termal kazık sensör kullanarak kaynakları ve güç yoğunluğunu hesaplamak ure (PD = güç (W) / alan (cm 2)) 18 dayalı ışık spot alan üzerine.
  2. Bir 365 nm LED (200 mW/cm 2) 15 ile ticari bir sistemde vitro UV photolysis deneyler yapmak.
  3. İçin UV photoactivation mikroskop sahnede aydınlatmak uyarma hafif ticari küp 15 tarafından filtre ile PKA-UCNP çözüm.
    Not: Güç yoğunluğu objektif lens odak olmadan ~ 15 mW/cm 2 ' dir.
  4. Mikroskop sahnede vitro NIR photoactivation için özelleştirilmiş upconversion filtre/ayna ayarları alt katmanı ışık yolu üzerinde dikroik ayna (850 nm kısa-pass), yüklü ile 980 nm lazer kullanarak PKA-UCNP çözüm aydınlatmak ve bir uyarma filtresi (950 nm uzun-pass).
    Not: 4 X objektif lens odaklanan önce 5 W/cm 2 çıkış güç yoğunluğu azalır. Güç yoğunluğu olduğu tahmin edilmektedir ~ 68 W/cm 2 4 X objektif lens odak sonra.

6. Numune hazırlama ve mikroenjeksiyon PKA-UCNP kompleksi hücre

  1. örnekler 0,45 µm filtreden PKA immobilizasyon (Adım 3.5) sonra ön filtre.
  2. Kuluçkaya L-15 Orta kuluçka makinesi dışında istikrarlı pH denetimi için mikroenjeksiyon döneminde bulunduğu hücreleri % 10 fetal sığır serum (FBS).
    Not: mikroenjeksiyon tamamlama onaylamak için yerel PKA-UCNP, Kafesli PKA-UCNP veya pegile UCNP (7,5 mg/mL) 15 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine ile (TAMRA) Co enjekte (10 µM) içinde hücrelere.
  3. Mikroenjeksiyon sonra sitozolik konsantrasyonu 1-3 mikron PKA - fizyolojik konsantrasyon aralığı PKA enjeksiyon Cilt 1/10 hücresel birimin varsayım ile bir hücre için öyle ki, konsantrasyon PKA-UCNP parçacıkların
  4. ayarlamak .
  5. (Adım 6.2) hücreye mikroenjeksiyon gerçekleştirmek bir microinjector aygıtı kullanarak tek eksenli hidrolik micromanipulator ( şekil 3) ile birleştiğinde.
  6. Kullanmak microinjector tarafından uygulanan basınç izlemek için dijital bir basınç göstergesi çalışma aralığı (~ 50-200 inç) ve mikroenjeksiyon için tazminat basınç sağlamak için özelleştirilmiş bir baskı odası dağıtıcı valf mühür. Geri bir çektirmenin kullanarak İğneyi çek.
  7. 200-300 ms ve kültür orta geri tepme iğne kılcal eylem tarafından önlemek için 15 inç tazminat basınçta bir enjeksiyon süresi ile 50 ila 75 hPa arasında enjeksiyon basıncı korumak.
  8. Bir dış çapı 40 x objektif lens ile fotoğraf çekmek tarafından onaylanabilir 1,3 ve 1,5 µm arasında olması için iğne ucu açıklıklar inceleyin.
  9. Yıkama 2 mL % 10 içeren L-15 Orta hücrelerle FBS mikroenjeksiyon sonra. Hücresel Floresans görüntüleme mikroenjeksiyon tamamlama onaylamak için 5 (6) - carboxytetramethyl - rodamine (TAMRA) üzerinden gözlemlemek.

7. Photoactivation, Kafesli PKA-UCNP kullanarak UV veya Nur ışık yaşayan hücrelerde

  1. için UV photoactivation PKA-UCNP mikroenjeksiyon sonra 3,5 µm çanak üzerinde REF52 hücrelerin büyümesine, onları mikroskop sahnesinde yerini ve onlara göre filtre UV ışığıyla ışınlatayım küp için objektif lens odak olmadan 3 dak.
    Not: confluency 2-3 günde 90 %'e ulaştığımızda hücrelerin % 10 içeren DMEM muhafaza REF52 FBS %5 CO 2 kuluçka ve hücreleri 37 ° C'de subcultured.
  2. İçin NIR photoactivation PKA-UCNP mikroenjeksiyon sonra aydınlatmak 980 nm lazer alt katmanı filtre/ayna ayarlardan hücrelerdeyse 5,4 adımda anlatıldığı gibi.
    Not: Güç yoğunluğu çıkışı 10 X objektif lens odak 5 W/cm 2 öncedir ve 10 x objektif lens odak sonra 300 W/cm 2 olduğu tahmin edilmektedir. Upconversion yüksek foton yoğunluğu, özellikle büyük bir anti-Stoke kayma gerektiğinde gerektiren bir süreçtir. Bu nedenle, odaklanan photoactivation sırasında gereklidir.
  3. Daha büyük bir ışık yer (650 µm x 520 µm) gerektiğinde,
  4. Nur ile 15 dk. izin ver bir kolimatör ile 10 x objektif lens tarafından her 5 dk ışınlama sonra 5 dk karanlık aralığı için odaklı Isıtma önlemek için bu hücreleri ışınlatayım.
    Not: bir yüksek uzaysal çözünürlüklü (hücre altı ışık spot) gerektiğinde, 40 X objektif lens ışık Kılavuzu çıkış sonunda yüklü bir iğne deliği ile bir hücre altı boyut ışık yer (5 µm x 4 µm) oluşturmak için kullanın. Bu durumda, 1 s radyoterapi NIR photoactivation fotonlar yüksek akı nedeniyle yeter.
  5. Sonra UV veya Nur photolysis, hücreleri 37 ° C'de kuluçka %5 CO 2 hücresel yanıt-e doğru oluşturmak için tam orta 1 h için yeniden elde etmek için izin verir. Daha sonra 1 ml % 4 paraformaldehyde/fosfat-tamponlu tuz (PBS) 20 dk için daha fazla boyama önce düzeltmek.
    Dikkat: Paraformaldehyde çok zehirli olduğunu; Cilt, göz veya müköz membranlarda temasından kaçının. Ölçme ve hazırlık sırasında toz nefes kaçının.

8. Görselleştirme stres Fiber dağılmasına neden NIR Photoactivation yanında

  1. sonra fiksasyon, Alexa 594-phalloidin kullanın (boyama için PBS 200 µL için 5 µL 6.6 µM hisse senedi çözüm Ekle; oda sıcaklığında 25 min için kuluçkaya) leke ve stres lifleri görselleştirin. Alexa 594-phalloidin (Ex 581 nm/Em 609 nm) görüntülerini bir filtre seti kullanarak görselleştirmek.
  2. 4 5 min için hücreleri kuluçkaya ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) oda sıcaklığında. Boyama sonra PBS ile örnekleri yıkama ve stres lifleri ve çekirdekleri floresan görüntülerini de ayrı ayrı vurmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kafesli enzim-UCNP yapı tasarım şekil 1' de gösterilmiştir. PKA enzim 2-nitrobenzyl bromür ile etkin olmayan bir kafese kapatılmış PKA oluşturmak için ilk tepki gösterdi ve sonra Elektrostatik UCNP yüzeyinde immobilize. UCNPs upconverted ışık yayarlar ve sonuç olarak photolytically o-nitrobenzyl grupları Cys 199 ve Cys 343, aktif PKA üreten ayırmak. TEM görüntüleri ve Bradford tahlil PKA ve Kafesli PKA UCNPs yüzey immobilize ve UV photoactivation sonra Kafesli PKA-UCNP çözüm kinaz aktivitesinin (şekil 4) denetlesinler doğruladı. PKA immobilizasyon sonra bir dinamik ışık saçılma enstrüman boyutu ve 120 olmak için zeta potansiyel PKA-parçacık kompleks ortaya nm ve-16.0 mV, anılan sıraya göre. Bradford tahlil PKA-UCNP çözüm güçlü bir mor renk parçacıkları üzerinde bir yüksek düzey ve istikrarlı protein immobilizasyon öneriyor gösterdi.

REF52 fare embriyonik fibroblast hücreleri hücresel deneyinde photoactivation incelenmesi için seçildi. Bu deneyde, PKA yolu (hangi hücre geçirgen 8-CPT-kampı kuluçka tarafından tetiklenir) endojen PKA harekete geçirmek ya da etkin veya triggerable PKA mikroenjeksiyon tarafından açılabilir. Aktif PKA (ile ya da ezelî parçacık immobilizasyon) stres lifleri dağılır ve daha ipliksi aktin (F-aktin) yüzey ve F-aktin için daha yüksek bir boyama sinyal verimli, güçlü bağlar dolayısıyla fluorophore etiketli phalloidin ortaya çıkarır. 8-CPT-kampı kuluçka veya mikroenjeksiyon ücretsiz PKA, etkin PKA-UCNP veya UV-harekete geçirmek PKA-UCNP (olarak pozitif kontrol deneyleri) sonra biz güçlü stres fiber dağılma PKA yolu etkinleştirmeye (şekil 5) tarafından neden varlığını doğruladı. Endojen PKA ve microinjected PKA çalışmalar parçacık immobilize PKA (etkin PKA-UCNP ve UV-harekete geçirmek PKA-UCNP) görüntüler stres fiber dağılma mikroenjeksiyon sitesinde yalnızca süre bütün hücreli stres fiber dağılma göstermek daha fazla PKA UCNPs üzerinde istikrarlı immobilizasyon düşündüren. NIR photoactivation deneyden sonra mikroenjeksiyon Kafesli PKA UCNP ve NIR ışınlama için UCNPs upconverted ışık yayarlar ve Cys 199 ve Cys 343 o-nitrobenzyl gruplarında ayırmak. Sonuç olarak, onlar aktif PKA oluşturmak, stres lifleri dağıldı ve daha yüksek bir sinyal tarafından fluorophore etiketli phalloidin (şekil 6) Boyama verim. REF52 hücreleri üzerinde negatif kontrol deneyleri UCNP Kafesli PKA olmadan ve sonra NIR ışınlanmış yanı sıra ışınlama stres fiber bütünlük etkisi gösterdi, yokluğunda Kafesli PKA UCNP hücrelerle REF52 ile microinjected.

Figure 1
Resim 1 . İllüstrasyon kafes PKA-UCNP tasarım ve PKA Upconversion destekli Uncaging. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Işık yolunu düzenini gösteren bir kesit diyagram. (bir) modifiye spectrofluorometer ve (b) mikroskop upconversion ışıma ve Nur photolysis modu (solda) ve epifluorescence ve UV photolysis modu (sağda) yanı sıra deneysel kendi kurulum. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Deneysel Kur mikroenjeksiyon için. Enjeksiyon sahibi arasında 30 ° ile 45 ° açılı bir eksen yağ hidrolik micromanipulator ile birleştirilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: UCNP üzerinde PKA immobilizasyon onayı. Silis-UCNP kaplı TEM görüntülerini (bir) ve (b) PKA immobilize UCNP Kafesli; (C) HEPES tampon, (d) Pelet kesir resuspension Kafesli PKA-UCNP çözüm ve Kafesli PKA-UCNP çözüm kısmını (e) süpernatant Bradford tahlil; ve (f) kinaz aktivitesi tahlil Kafesli PKA-UCNP çözüm UV photoactivation sonra. Bu rakam Gao, ö. H. çoğaltılamaz vd. sonra açık izni Amerikan Kimya Birliği yayımcıdan elde edildi. Ölçek çubuğu = 20 nm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : (Yeşil) Boyama stres Fiber ve REF52 hücrelerinin çekirdekleri (mavi) Boyama, stres Fiber parçalanma sonucu ve morfolojik değişiklikler farklı PKA etkinleştirme tarafından tetiklenen gösterilen DAPI Floresans görüntülerini. (bir) Untreated hücreleri, (b) 8-(4-Chlorophenylthio) adenozin 3', 5'-siklik monofosfattır (8-CPT-kampı)-tedavi hücreleri, (c) etkin PKA microinjected hücreleri, (d) etkin PKA-UCNP-microinjected hücreleri ve ( e) Kafesli PKA-UCNP-microinjected hücreleri sonra UV radyasyon vermeliyiz. (f-j) Optik yoğunluk (OD) resimleri (a-e), sırasıyla türetilmiş. (k-o) Karşılık gelen yoğunluğu eğrileri boyunca mavi ok. Beyaz ok microinjected hücre gösterir. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: REF52 hücreleri floresan görüntüleri çeşitli PKA formlarıyla Microinjected. NIR ışınlama, (b) UCNP PEG aşılı NIR ışınlama altında sonra PKA-UCNP (birile) microinjected hücreleri Kafesli ve (c) PKA-UCNP ışınlama Kafesli. (d-f) UCNP (kesik kutusunda) upconverted emisyon (a-c). (g-ı) Stres lifleri (yeşil), karmaşık UCNP emisyonları upconversion (kırmızı) ve DAPI çekirdekleri (mavi) Boyama birleştirilmiş görüntüler. NIR photoactivation hücrelerin 650 µm aydınlatıcı bir bölgede gerçekleştirilmiştir x520 µm 10 X objektif lens kullanarak. Floresans görüntüleri 40 X objektif lens ile elde. Bu nedenle, NIR ışınlama alanının kesik çizgili kırmızı kutusunda belirtildiği gibi 150 µm x 120 µm için düşürüldü. Upconversion ışıldama (c) görülebilir. ImageJ kullanarak miktar çalışmaları için O.D. resimler (j-l) (a-c), anılan sıraya göre elde edilmiştir. Yoğunluğu eğrileri boyunca (j-l) gösterilen mavi ok (m-o) çizildi. Yüksek sinyal gürültü oranı (S/N) bu sistem için gözlendi ve olumlu bir yanıt olarak kabul edilir. Bu yaklaşım tüm Alexa 594-phalloidin boyama quantifications için uygulandı. Beyaz ok microinjected hücre gösterir. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Daha önce Hofmann ve iş arkadaşlarınızla dramatik morfolojik değişiklikler ücretsiz PKA19mikroenjeksiyon sonra REF52 hücrelerde gözlendi buldum. Başka bir çalışmada, Lawrence grup Kafesli PKA vivo içindeharekete geçirmek, morfolojik değişiklikler ve UV photolysis20' ye tabi ne zaman stres lifleri dağılması olabilir gösterdi. Daha önce upconverted UV ışığı birkaç UCNP destekli, kafes, küçük moleküler bioeffectors21,22,23aktivasyonu gösterdi photoactivation için istismar bildirir. Ancak, UCNP destekli photoactivation bioeffector, enzim, en önemli sınıf üzerinde kullanmak için bir iletişim kuralı hala gelişmiş olması gerekiyor. Bu nedenle, bu çalışmada, Kafesli PKA UCNPs kullanarak NIR photoactivation içeren bir hücresel deney Protokolü açıklar. Bu Nur photoactivation platform UCNPs silika kaplı yüzeyinde immobilize Kafesli PKA20 sinyal iletim yolu NIR tetikleyici olarak kullanarak hücre kontrol fizibilite göstermek için kullanıldı. Kafesli PKA UCNP ile microinjected REF52 hücreler oluşturmak ve hücrelerin içinde stres fiber dağılma yanı sıra morfolojik değişiklikler üzerinde bir etki gösterdi NIR ile ışınlanmış. Buna ek olarak, pozitif ve negatif kontrol deneyleri gerçekleştirilen ve stres lifleri dağılması için önde gelen PKA kaynaklı yolu NIR ışınlama tarafından tetiklenir kanıtladı.

Araç değişikliği bu el yazması anlatılan, PKA kimyasal değişiklik başka bir yerde iyi belgelenmiş olduğunu15. İyi tasarlanmış bir deney sorun giderme gerektiriyorsa, sorunları oluşturulan olup olmadığını tanımlar: (i protein-UCNP kompleksi, (ii) mikroenjeksiyon veya (iii) optik araçları. Protein photoactivation sorunlar durumunda: (1) yapmak Elbette PKA etkin olan, (2) Kafesli PKA kalan etkinliğini hakkı olduğundan emin olun < özgün değeri, % 5 (3) tespit UV Kokulum PKA emin geri, kendi faaliyet (4) yapmak en az % 50 olan Bu kafes PKA UCNP yüzeyinde immobilize (Bradford tahlil yapmak) ve (5) Kafesli PKA UCNP da faaliyete (UV ışınlama gerçekleştirerek) geri en az % 50 sahip olduğundan emin olun. Mikroenjeksiyon sorunlar için: (1) yapmak emin o iğne ucu açık ve protein-UCNP çözüm düzgün yüklü. Mikroskop NIR uyarma kanalına sahip yüklü iğne (tıp) yerleştirin. Upconversion Floresans gözlem yapılırsa doğru yüklenmesidir. (2) enjekte protein UCNP hücrelere ve ortak enjekte 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) boya ve upconversion parçacık floresan yoğunluğu gözlemlemek. Uygun enjeksiyon hücrelerdeki yoğun TAMRA ve upconversion parçacık Floresans neden olur. Mikroskop optik değişiklik sorun giderme: (1) Kaldır objektif lens, NIR lazer açın ve termal kazık güç ölçer sensör tarafından yanlış bir ayar engellenmelidir değil NIR ölçmek için mikroskop sahneye koymak. (2) objektif lens yükleyin ve mikroskop Sahne Alanı'nda 10 mg/mL UCNP solüsyon ile dolu bir alt şeffaf küvet koymak. Optik tüm düzgün yüklü değilse bir keskin mavi ışın çözüm içinde görülecektir.

Mikroenjeksiyon yalnızca sınırlı sayıda hücre analizi için sağlar. Operatör (veya deneyim) enjeksiyon başarı oranı olduğunu-bağımlı, hangi bir büyük bu teknik kısıtlamasıdır. Ancak, bu defa atlamak için başka bir yol yoktur. Pek çok bilim adamı sağlar alımı hücrelere partiküller parçacık hücreli kuluçka kullanımı öneririz. Ancak, bu uygun bir yaklaşım değildir. Hücresel parçacık alımını oluşur ve Alım tutarı yeter bile, endosomes/organellerin ama sitozol birikir. Bu belirli sinyal iletim enzim sitozol, değil etkili olduğu endosomes, bulunması gerekiyor. PKA 37 ° C'de mükemmel depolama arabellekte çözüldüğünde, Ayrıca, kendi faaliyet sonra gece depolama son değil. Hücre kültürü ortamında enzim istikrar bile daha kısa ve kuluçka yaklaşım pratik hale getirir.

Bu enstrümantal Kur, mikroenjeksiyon ve kinaz NIR photoactivation Protokolü genellikle sadece için değil, aynı zamanda diğer protein veya enzim sınıfları için kimyasal olarak değiştirilmiş kinaz uygulanabilir olmalıdır bildirdi. Ayrıca, doğrudan UV Işınlarına maruz kalma istenmeyen nerede hücresel çalışmalarda yararlı olacaktır. Ayrıca, Kafesli bioeffector-UCNP kompleksi membran proteinlerinin veya membran reseptörleri, hücre içi teslimat sorun kaçınarak ve platform vivo içinde kullanım için geçerli yapmak gibi hücre dışı hedefleri olan etkileşim kurabilirsiniz. Damardan enjeksiyon sonra Kafesli protein hormonlar veya tedavi amaçlı proteinleri bioeffector aktif formu sadece NIR ışınlanmış bölgelerde olacaktır.

Mikroenjeksiyon bu protokolü en önemli adımdır. Hassas enjeksiyon için kabarcıklar iğne yükleme sırasında kaçının. Yükleme sonra hemen enjektör iğne yükleyin ve iğne ucu tıkanma neden olacak kurutma,--dan belgili tanımlık iğne uç önlemek için orta bırakın. Mikroenjeksiyon Operatör beceri için daha yüksek bir başarılı enjeksiyon oranı önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Biz Nano bilim ve teknoloji programı Academia Sinica ve Bilim Bakanlığı ve Tayvan teknoloji finansman için (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2) teşekkür ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma 154563
Magnesium chloride hexahydrate Sigma M9272
MOPS Sigma M1254
HEPES Sigma H4034
Sodium chloride  Sigma 31434
Potassium chloride Sigma 12636
Yttrium acetate hydrate Sigma 326046 Y(C2H3CO2)3 · xH2O
Thulium(III) acetate hydrate Alfa Aesar 14582 Tm(CH3CO2)3 · xH2O
Ytterbium(III) acetate tetrahydrate Sigma 326011 Yb(C2H3O2)3 · 4H2O
1-Octadecene Sigma O806
Oleic acid Sigma 364525
Methanol  macron 304168
Sodium hydroxide Sigma 30620
Ammonium fluoride J.T.Baker 69804
IGEPAL CO-520 Sigma 238643
Cyclohexane J.T.Baker 920601
Ammonium hydroxide (28% - 30%) J.T.Baker 972101 Ammonia
Tetraethyl orthosilicate (TEOS) Sigma 8658
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma D0632
N-hydroxymaleimide (NHM) Sigma 226351 PKA activity blocking reagent
Prionex protein stabilizer solution from hog collagen Sigma 81662 Protein stabilizer solution
2-nitrobenzyl bromide (NBB) Sigma 107794 PKA caging reagent
8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt Sigma C3912 8-CPT-cAMP
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma P0294 PK/LDH
Adenosine 5'-triphosphate disodium Sigma A2387 ATP
β-NADH reduced from dipotassium Sigma N4505
Phosphoenolpyruvate Sigma P7127 PEP
Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL Thermo Scientific 23200 Bradford assay reagent
cAMP-dependent protein kinase Promega V5161 PKA activity control
pET15b-PKACAT plasmid Addgene #14921
pKaede-MC1 plasmid CoralHue AM-V0012
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Thermo Scientific 10010023
DMEM, high glucose, pyruvate Gibco 12800-017 Cell culture medium
Leibovitz L-15 Medium Biological Industries 01-115-1A Cell culture medium
Fetal Bovine Serum Biological Industries 04-001-1A
Paraformaldehyde ACROS 416785000
DAPI Invitrogen D1306 Nucleus staining dye
Alexa 594-phalloidin Invitrogen A12381 F-actin staining dye
5(6)-Carboxytetramethylrhodamine  Novabiochem 8.51030.9999
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Scientific 23200
CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da Membrane Filtration Products, Inc. 1430-33 Dialysis membrane
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized EMD Milipore SLHVX13NL
Equipment
Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS Malvern M104
Transmission Electron Microscope JEOL JEM-1400
Fluorescence Spectrophotometer Agilent Technologies 10075200 Cary Eclipse 
UV-Vis Spectrophotometer Agilent Technologies 10068900 Cary 50 
Fluorescence Microscope Olympus IX-71
950 nm longpass filter  Thorlabs FEL0950
850 nm dichroic mirror shortpass Chroma NC265609
RT3 color CCD system SPOT RT2520
Fluorescence Illumination PRIOR Lumen 200
980 nm Infra-red diode laser CNI MDL-N-980-8W
UV LED Spot Light Source UVATA UVATA-UPS412 With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2
Thermal pile sensor OPHIR 12A-V1-ROHS
Picospritzer III Parker Hannifin 052-0500-900 Intracellular Microinjection Dispense Systems
PC-10 Needle puller Narishige PC-10
MANOMETER Digital pressure gauge Lutron PM-9100
One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator Narishige MMO-220A
Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated Thermo Scientific 75002421

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
  2. Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
  3. Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
  4. Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
  5. Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
  6. Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
  7. Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
  8. Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
  9. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
  10. Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
  11. Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
  12. Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
  13. Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
  14. Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
  15. Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
  16. Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
  17. Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
  18. Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
  19. Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
  20. Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
  21. Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
  22. Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
  23. Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).

Tags

Biyomühendislik sayı: 126 Kafesli enzim hücre tepkisini mikroenjeksiyon photolysis protein kinaz A upconversion nano tanecikleri photoactivation
Hücre içi sinyal iletimi Upconversion nanopartikül aracılı kinaz Photoactivation tarafından uzaktan tetiklemek için entegre bir sistem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gao, H. D., Thanasekaran, P., Chen,More

Gao, H. D., Thanasekaran, P., Chen, T. H., Chang, Y. H., Chen, Y. J., Lee, H. M. An Integrated System to Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction by Upconversion Nanoparticle-mediated Kinase Photoactivation. J. Vis. Exp. (126), e55769, doi:10.3791/55769 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter