Summary
Målet med den foreliggende studien var å utvikle og validere styrken og sikkerheten til spinal adenoassosiert virus 9 (AAV9) -mediert genavgivelse ved bruk av en ny subpialgen-leveringsteknikk hos voksne mus.
Abstract
Den vellykkede utviklingen av en subpial adeno-assosiert virus 9 (AAV9) vektortilførselsteknikk hos voksne rotter og griser er tidligere rapportert. Ved bruk av subpielt anbragte polyetylenkateter (PE-10 eller PE-5) for AAV9-tilførsel, har potensielt transgenuttrykk gjennom spinalparenchyma (hvitt og grått stoff) i subpielt injiserte spinal-segmenter blitt påvist. På grunn av det brede spekteret av transgene musemodeller av neurodegenerative sykdommer, er det et sterkt ønske om å utvikle en kraftig sentralnervesystem (CNS) -targetet vektortilførselsteknikk hos voksne mus. Følgelig beskriver den foreliggende studien utviklingen av en spinal subpiavektoravgivningsanordning og teknikk for å tillate sikker og effektiv spinal AAV9-levering i voksne C57BL / 6J-mus. I spinalt immobiliserte og bedøvede mus ble pia materen (cervikal 1 og lumbal 1-2 spinal segmentnivå) innsnevret med en skarp 34 G nål ved hjelp av en XYZ manipulator. En andre XYZ maNipulator ble deretter brukt til å fremme en sløv 36G nål i lumbal og / eller cervical subpial plass. AAV9-vektoren (3-5 μL; 1,2 x 10 13 genomkopi (gc)) som koder for grønt fluorescerende protein (GFP) ble deretter injisert subpielt. Etter injeksjoner ble nevrologisk funksjon (motor og sensorisk) vurdert periodisk, og dyr ble perfusjonsfiks 14 dager etter AAV9-tilførsel med 4% paraformaldehyd. Analyse av horisontale eller transversale ryggmargseksjoner viste transgenuttrykk i hele ryggmargen, både i grå og hvitt materiale. I tillegg ble intenst retrogradel-mediert GFP-uttrykk sett i nedadgående motoraxoner og nevroner i motorcortexen, nuklearruber og formatio reticularis. Ingen nevrologisk dysfunksjon ble observert i noen dyr. Disse dataene viser at subpiavevektoroverføringsteknikken med hell kan brukes i voksne mus, uten å forårsake prosessrelatert ryggmargsskade, og er assosiert med svært potente transgene ekspresSion gjennom spinal neuraxis.
Introduction
Bruken av AAV vektorer til å behandle en rekke ryggmargen og CNS neurodegenerative lidelser blir en godt akseptert plattform for effektivt å oppregulere eller stille uttrykket av gen (er) av interesse. En av hovedbegrensningene til den mer effektive utnyttelsen av denne teknologien for behandling av CNS / ryggmargen er den begrensede evne til å levere AAV-vektor (er) til den dype hjernen eller ryggmargenparenchyma hos voksne pattedyr.
Det ble for eksempel demonstrert at den systemiske tilførsel av AAV9 hos voksne gnagere, katter eller ikke-humane primater kun er moderat effektiv ved å indusere transgenuttrykk i nevroner i hjernen og ryggmargen 1 , 2 , 3 . Den mer effektive intratekal levering av AAV9-vektorer har også vist seg å føre til bare begrenset transgenuttrykk i anatomisk definerte bassenger av nevroner. Nærmere bestemt har det vært demonerAt den cisternal eller lumbo-sacrale intratekale AAV9-leveransen i ikke-humane primater, griser eller gnagere fører til et høyt nivå av transgenuttrykk i spinal-α-motoneuroner og segmentale dorsale rotganglionneuroner. Imidlertid er minimal eller ingen uttrykk i spinalinterurons eller stigende eller synkende axoner i det hvite stoffet sett 4 , 5 , 6 , 7 . Samlet viser disse dataene at en høy effektiv biologisk-anatomisk barriere eksisterer, som forhindrer diffusjonen av intrathecalt levert AAV til dypere spinalparenchyma.
I en tidligere studie ved bruk av voksne rotter og griser ble en ny subpiavektortilførselsteknikk utviklet 8 . Ved bruk av denne tilnærmingen ble meget potensielt og multisegmentalt transgenuttrykk demonstrert etter en single-bolus subpial AAV9-tilførsel. Intenst GFP-uttrykk ble konsekvent settI nevroner, glialceller og nedadgående / stigende aksoner gjennom de injiserte spinal-segmentene. Denne studien demonstrerte for første gang at pia mater representerer den primære barrieren som begrenser effektiv AAV9 diffusjon i spinalparenchyma fra intratekalt rom. Selv om denne tidligere utviklede teknikken og subpell injeksjonsanordningen er relativt enkel å bruke hos store gnagere (som rotter) eller voksne griser, er systemet ikke egnet for bruk i små dyr, for eksempel voksne mus. På grunn av det høye antall tilgjengelige transgene musemodeller av en rekke neurodegenerative forstyrrelser er det et klart behov for utvikling av en effektiv spinalparenkymalvektortilførselsteknikk hos mus. Tilgjengeligheten av en slik teknikk vil tillate studier av effekten av spesifikt gentymping ( f.eks. Ved bruk av shRNA) eller oppregulering ved bruk av celle-ikke-spesifikk ( f.eks. Cytomegalovirus-CMV eller ubiquitin) eller celle-spesifikk ( f.eks. Synapsin eller glial Fibrillær sureProtein (GFAP)) promotorer under tidlig utvikling etter fødsel eller under sykdommer.
Følgelig har vi i den foreliggende studien utviklet og validert et miniatyr subpielt vektorleveringssystem som effektivt kan brukes i voksne mus. På samme måte, som i tidligere rotte- og grisstudier, demonstrerer dette arbeidet kraftig transgenuttrykk i hele spinalparenchyma etter en single-bolus subpial AAV9-levering i mus. Enkelheten i denne tilnærmingen, den meget gode toleransen for injiserte mus til subpell AAV9-levering og den høye potens for transgenuttrykk i spinalparenchymen antyder at denne teknikken effektivt kan implementeres i en hvilken som helst laboratorieinnstilling og brukes i eksperimenter som retter seg mot spinalgenekspresjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Disse studiene ble utført i henhold til en protokoll godkjent av Institutt for dyrepleie og bruk av Universitetet i California, San Diego, og var i samsvar med Foreningen for vurdering av laboratoriedyrpleie retningslinjer for dyrebruk. Alle studier ble utført på en slik måte som å minimere gruppestørrelse og dyre lidelse.
1. Generell dyr og kirurgisk preparat
- Før oppstart av kirurgisk prosedyre, tine viruset (AAV9-UBI-GFP; 5 μl alikvoter) 8 . Forbered en 5% dextran (10.000 MW) løsning ved å blande dextranpulver i destillert vann. Bland virusoppløsningen med 5% dextranoppløsning 1: 1 til en endelig dextrankonsentrasjon på 2,5%.
- Oppbevar virusoppløsningen på is (4 ° C).
- Bruk voksne C57BL / 6J mus (mann og kvinne, 20-30 g). Bedøve mus ved anvendelse av 5% isofluran (i O 2, 1 l / min) og opprettholde dem ved 2-3% inhalert isofluran (i O 2 , 1 L / min) ved nesekegle under operasjon, avhengig av pustefrekvensen og tannpinnenes respons.
- Barber baksiden av dyrene med barberklipper og rengjør huden med 2% klorhexidin.
- I kronisk gjenoppretting studier følger en streng steril teknikk.
- Hvis lumbal subpial injeksjoner skal utføres, kutte huden overlegget Th8-L1 vertebrae med en skalpell og løsne parvertebral muskel fra Th10-12 ryggvirveler ved hjelp av saks.
- Monter dyret i en standard stereotaksisk ramme ved hjelp av museklemmer.
- Barber begge sider av lamellen til Th10-12-ryggvirvelene ved hjelp av en tannbørste (borestreng: 0,9 mm, hastighet: 20.000 rpm) til det oppstår sprekker.
- Fjern knekkede beinfragmenter med tang og eksponere dorsaloverflaten på lumbale ryggmargen.
- Klipp åpne duraen rundt 1 cm ved hjelp av en 30 G rustfri stålnål og pincett.
- Fjern den atlanto-occipitale membranen i cisterna magna ved hjelp av en 23G rustfri stålnål og pincett.
- Rengjør snittstedet for vev og beinavfall ved bruk av bomullspinne.
- Klipp åpne duraen rundt 2-3 mm ved hjelp av en 30 G rustfri stålnål og pinn.
2. Åpne pialmembranet og sett inn undernålen for AAV9-levering
- Monter den 34 G pia-penetrerende nålen i Z-armen til en XYZ-manipulator ved hjelp av en glasskapillarholder ( figur 1A og B ).
MERK: For å fremstille den pia-penetrerende nålen skjerpenes den opprinnelige fasade spissen av 34G-nålen ved hjelp av en glasskapillarformator med diamantslipeplate - grov (5,0 μm til 50 μm spissstørrelser) og slipevinkel av15 - 20 °. Nålens spiss (1 mm lengde, målt fra spissen) bøyes forsiktig til ca. 90 ° ( figur 1B , venstre innsats). - Ved hjelp av et kirurgisk disseksjonsområde, satt til 8-10 X forstørrelse, penetrerer pia med den pia-penetrerende nålen med ca. 1 mm ( figur 1C ) ved hjelp av X-armen.
- Hold vinkelen på den penetrerende nålen til vevoverflaten ved 5-10 °.
- Etter pia-åpningen, fjern den pia-penetrerende nålen horisontalt fra underområdet ( Figur 1 D) ved hjelp av X-armen.
MERK: Husk det penetrerte stedet ved et landemerke, for eksempel et blodkar. - Legg en sløv 36G-injeksjonsnål med AAV9-UBI-GFP-virus ved hjelp av en 50 μl mikrosprøyte koblet til injeksjonsnålen med PE-10 eller PE-20-rør.
- Monter nålen i Z-armen til en andre XYZ-manipulator ( Figur 1A B ) ved hjelp av en glasskapillarholder ( figur 1B , høyre innsats).
MERK: For å fremstille den underliggende AAV9-injeksjonsnålen, blir den stumpe spissen av en 36 G-nål polert ved hjelp av en glasskapillarbeholder med diamantslipeplate - grov (5,0 μm til 50 μm spissstørrelser) for å fjerne skarpe kanter. Nålens spiss (2-3 mm lengde, målt fra spissen) bøyes forsiktig til ca. 90 °. Pia-penetrerende og subpiell injeksjon nåler settes inn i 1-2 cm lange 20G slave rustfritt stål rør (10 mm fra nålens ender) og limt med epoxy. Bruken av 20 G (0.91 mm diameter) rør er nødvendig for sikker festing til glasskapillarholderen. - Ved å manipulere X, Y og Z armene til den andre manipulatoren, plasser spissen av AAV9-injeksjonsnålen inn i det pia-penetrerte stedet og før det deretter 2-3 mm inn i underområdet gjennom den tidligere pialmembranåpningen ved hjelp av X-arm( Figur 1E og F ).
MERK: 1) AAV9-UBI-GFP er fremstilt i henhold til tidligere rapporterte protokoll 9 , 10 , og de endelige titrene er justert til 1,2 x 10 13 genomkopier per mL (gc / mL). 2) Det er ikke nødvendig å merke siden av pialåpningen fordi den er lett identifiserbar ( Figur 1D ). - Injiser AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 eller 5 μL) i underområdet med en 50 μl mikrosprøyte (se tabell 1 for eksperimentelle grupper).
- Fjern injeksjonsnålen fra underområdet etter at AAV9-UBI-GFP-injeksjonen er fullført.
- Lukk muskler og hud ved hjelp av 4,0 monofilament sutur og kirurgiske klips.
MERK: Det er ikke nødvendig å forsegle den åpne vertebraen. - La dyrene komme seg på en varmepute.
- For smertekontroll injiser buprenorfin 0,05 mg / kg / sc hver 12. time for2-3 dager etter operasjonen.
3. Perfusjon-fiksering, Tissue Cryoprotection og Immunofluorescence Staining
- På et forhåndsbestemt tidspunkt etter sub-AAV9-injeksjonene, bedøv de musene med eutanasi-oppløsning (se Materialetabell , 0,3 ml) og perfusjoner dem med 20 ml heparinisert saltløsning etterfulgt av 20 ml 4% paraformaldehyd i PBS.
- Disseksér spinal ledninger og hjerner ved hjelp av en ben rongeur og post-fix dem i 4% formaldehyd i PBS over natten ved 4 ° C.
- Kryopbeskytt spinalkablene og hjernene med 30% sukrose i PBS i minst 5-7 dager.
- Klipp koronale, tverrgående eller langsgående / horisontale frosne seksjoner (30 μm tykk) på en kryostat og lagre dem i PBS ved 4 ° C.
4. Immunofluorescens Staining av ryggmargen og hjernesnitt (Se Materialebordet)
- Inkuber frittflytende seksjoner i primarY antistoffer over natten.
- Etter inkubering med primære antistoffer vaskes seksjonene tre ganger i PBS og inkuberes med fluorescens-konjugert esel-anti-kanin, eple-anti-kylling og eple-anti-geit sekundære antistoffer.
- Monter delene på mikroskopisk lysbilder, tørk dem ved romtemperatur og dekk dem med et anti-fade medium.
- Ta bilder med epifluorescensfluorescensmikroskop (mål: 10X, NA-0.3, 20X, NA-0.8, og 63X, NA-1.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Potensielt transgenuttrykk i subnaventalt AAV9-injiserte segmenter:
Analysen av transgen (GFP) ekspresjon i ryggmargseksjoner ved 14 dager etter AAV9-leveranse viste AAV9-dose-avhengig GFP-ekspresjon gjennom spinalparenchyma. For det første ble to bilaterale 3 μL injeksjoner av AAV9-UBI-GFP injisert i det øvre lumbal subpialområdet forbundet med nesten fullstendig infeksjon av det hvite og grå materiale i hele lumbale ryggmargen, som strekker seg til de øvre thorax-segmentene ( Figur 2A Og 2B , venstre og midtre kolonner). To bilaterale 1,5 μL injeksjoner av AAV9-UBI-GFP i det øvre lumbal subpialområdet var forbundet med en lignende nesten fullstendig infeksjon av den hvite og grå substansen i hele lumbale ryggmargen (sett etter injeksjoner av 3 μl); Mid-thoracic segmentene viste imidlertid bare sporadisk infiserte neuroner (Ass = "xfig"> Figur 2B, høyre kolonne). Staining med α-motoneuronspesifikke (ChAT) og nevonspesifikke (NeuN) antistoffer viste konsistent GFP-ekspresjon i hele populasjonen av lumbale α-motoneuroner ( Figur 2C ) og interneuroner lokalisert i dorsalhornet ( Figur 2D ), mellomsone ( Figur 2E ) og ventralhorn ( figur 2F ). For det andre førte to bilaterale livmorhalske injeksjoner av AAV9 (5 μl for hver injeksjon) til lignende GFP-uttrykk i den hvite og grå substansen i hele cervikal ryggmargen (grå og hvit substans) og i de øvre thorax-segmentene ( Figur 3A og 3B ) . Analyse av lumbale ryggmargseksjoner i de samme dyrene viste høy tetthet av GFP + synkende aksoner som avsluttet i nærheten av lumbale GFP-negative α-motoneuroner og interneuroner ( Figur 3COg 3D ). Leveransen av to bilaterale livmorhals- og to bilaterale øvre lumbale injeksjoner av AAV9 (5 μl for hver injeksjon) var assosiert med GFP-ekspresjon i hele ryggmargen, fra den øvre cervikal til sakrale segmenter og var homogent tilstede i den hvite og grå substansen ( Figur 3E- 3H ).
Retrograd og anterograd Transport-mediert transgenuttrykk i supraspinal motor og sensoriske sentre:
Utbredt GFP-uttrykk i lumbale eller livmorhalskreft etter sub-AAV9-leveranse var assosiert med robust retrograd og anterograde-infeksjonsmidlet GFP-positivitet i de supraspinale nedadgående axonene og deres fremspringende nevroner og i axoner og terminaler av stigende kanaler ( figur 4 ). Således ble intens GFP positivitet sett i nevroner lokalisert i retikulær formasjon (RF), Nucleus Ruber (NR) og Motor Cortex (MC) ( Figur 4B- 4D ). På samme måte ble klar GFP immunoreaktivitet sett i terminaler av spinocerebellar (SCT), spinoretikulære og spinotalamiske kanaler (STT) ( Figur 4B- 4D ).
Figur 1 : Eksperimentell oppsett for å utføre spinal subpial injeksjoner i en voksen mus. ( A ) For å utføre spinal subpial injeksjoner i voksne mus, er to separate XYZ manipulatorer brukt (I og II). ( B ) Z-armen til hver manipulator har en glasskapillarholder. En kapillærholder holder den pia-penetrerende 34 G nålen, og den andre holder den stumpe 36 G subpiell injeksjonsnål. ( C , D , E og F) Bilder som viser posisjonen til pia-penetrasjonsnålen like etter pia-punkteringen ( C ; dura-stoffet er allerede fjernet), etter fjerning av den pia-penetrerende nålen ( D ), etter innsetting av spissen av subpiellinjektionsnålen ( E ), og etter å ha ført subpulsinjektionsnålen 3 mm inn i underområdet ( F ). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Potent spinalparenchymal GFP-ekspresjon etter lumbar subpial AAV9-UBI-GFP-levering i voksne mus. ( A ) To bilaterale injeksjoner av AAV9-UBI-GFP (1,5 eller 3 μl injeksjoner hver) ble levert inn i øvre lumbale sUbspialt rom, og dyr ble perfusjonsfiks 14 dager etter AAV9-tilførsel. ( B ) Intensivt GFP-uttrykk i det grå (innenfor det prikkede området) og det hvite stoffet, som strekker seg fra lumbalen til de øvre thorax-segmentene, kan ses hos dyr injisert med 3 + 3 μL AAV9 (venstre og midtre kolonner). ( C, D, E og F ) Co-farging av transversale ryggseksjoner tatt fra lumbalforstørrelsen hos dyr injisert med 3 + 3 μL AAV9 viser GFP-ekspresjon i praktisk talt alle ChAT- (a-motoneuronmarkør) -positive α- Motoneuroner ( C og F ) og NeuN-positive interneuroner i dorsalhornet ( D ) og mellomsonen ( E ). Skalestenger = 1000 μm (B); 30 μm (C); 100 μm (DF). DH: dorsal horn; LV: lamina V; VH: ventral horn. Vennligst klikk her for å se en større veRsion av denne figuren.
Figur 3: Sammenligning av spinal GFP-ekspresjon etter spinal subpial cervical versus spinal subpial cervical plus subpial lumbar AAV9-UBI-GFP-levering i voksne mus. ( A, B, C og D ) Horisontal del skåret gjennom hele lengden av ryggmargen i et dyr som tidligere har mottatt øvre cervikal subpial injeksjoner av AAV9-UBI-GFP (5 + 5 μL). Intenst GFP-uttrykk i hvitt og grått stoff i livmorhalsområdet kan ses ( B ). I lumbale ryggmargen kan en høy tetthet av GFP + synkende axoner i lateral funiculus (LF) og den grå saken mellom NeuN-positive, men GFP-negative neuroner, identifiseres ( C og D ). ( E, F, G og H Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4
| Eksperimentelle grupper | Nettsted / nivå av AAV9 levering (*) | Volum av AAV9 inj, infusjonshastighet | Overlevelsestid | Vevsanalyse |
| Gruppe A (n = 7) | C2 (bilateral) | 5 μl / 5 min | 14 dager | Hjerne + ryggmargen |
| Gruppe B (n = 12) | L1-L2 (bilateral) | 1,5 μl eller 3 μl, 60 sek / μl | 14 dager | Hjerne + ryggmargen |
| Gruppe C (n = 6) | C2 + L1-L2 (bilateralt på hvert nivå) | 5 μl / 5 min | 14 dager | Ryggmarg |
| * - bilateral= To subpial injeksjoner en levert til høyre og en til venstre subpial plass av injisert segment (er) utføres. | ||||
Tabell 1: Eksperimentelle grupper. Alle eksperimenter ble utført i voksne C57BL / 6J mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreliggende studien beskriver en teknikk for subpial vektor (AAV9) levering i voksne mus. Som vist i den medfølgende videoen, kan denne tilnærmingen og teknikken effektivt brukes, forutsatt at de nødvendige instrumenter og pia-penetrerende nål og subpiell injeksjonsnål er riktig produsert i henhold til de etablerte og testede spesifikasjonene.
Kritiske tekniske variabler i å utføre en konsekvent og sikker subpial injeksjon i mus:
Som vist kan en subpell injeksjon lett utføres i voksne bedøvede mus etter en dorsal cervikal eller lumbale laminektomi. Det er flere kritiske tekniske variabler som definerer suksessen til subpial injeksjonsteknikken. Først må spissen av 34 G pia-penetrerende nål bli konsistent skarpgjort ved hjelp av en beveller for å sikre jevn punktering av pia. Eventuelle uoverensstemmelser i teknikken på hvordan nålen skjerpes kan føre til difficuLettes under pia penetrasjon og / eller kan forårsake ryggskade ved å bruke for mye kraft til å punktere pia. Under normale omstendigheter (som vist i videoen og i Figur 1C og D ), viser stedet for piaåpningen ingen tegn på ryggmargsskader eller sub-blødning. I noen tilfeller kan det forekomme en del blødning, men dette ble funnet ikke å være forbundet med nevrologisk dysfunksjon eller endret genuttrykk etter AAV9-tilførsel. For det andre er det viktig å holde kirurgisk tomt fri for blod etter at dura er fjernet ved hjelp av elektrocautery. Enhver flammende blodrest kan tyde på pålitelig identifisering av piaoverflaten, selv om et kirurgisk mikroskop brukes. Som vist i figur 1C-F , kan et blodfritt laminektomi-område effektivt opprettholdes ved bruk av små gelskumstykker for å dekke den laminektomiserte vertebra og det omkringliggende myke vev. For det tredje må det tas hensyn til riktig plassering av bedøvede dyr iSpinalramme og til immobilisering av ryggsøylen ved hjelp av spinalklemmer. Bruk av for mye trykk under plassering av spinalklemmer kan forårsake vertebral ruptur; Ved å bruke utilstrekkelig trykk kan det føre til en progressiv løsning av den immobiliserte vertebraen, som vanligvis skjer når en tannbørste brukes til å utføre laminektomi.
Volumet av subpially-injisert AAV9 korrelerer med størrelsen av rostro-kaudalt transgenuttrykk. Bruken av to lumbal bilaterale subavial AAV9 injeksjoner (3 + 3 μL eller 5 + 5 μL) var således assosiert med konsekvent GFP-ekspresjon i hele lumbalgrå og hvitt stoff, som strekker seg opp til de øvre thorax-segmentene. Det var minimal variasjon mellom dyrene som ble brukt. AAV9 injeksjonsvolumer på 1,5 + 1,5 μl førte til tilsvarende GFP-ekspresjon i segmentene lokalisert i nærheten av injeksjoner; Spredningen av viruset og det resulterende GFP-uttrykket var imidlertid begrenset i thoraksegmentene ( Begrensning av underleverandeteknikk: Fremtidige applikasjoner av SubpiAl Gene Leveringsteknikk: For eksempel, ved bruk av shRNA-silerende vektorer, er det forventet at en svært effektiv reduksjon i uttrykket av muterte gener ( f.eks. SOD i tilfelle av arvelig form av ALS) vil oppnås gjennom ryggmargen så vel som i spinalt -projiserende hjernemotor kjerner. Sekund,På grunn av den høye effektive infeksjonen av spinalhviteaksonene, kan terapeutiske gener ( f.eks. Kodende vekstfaktorer) oppreguleres for å fremme aksonal spiring i spinaltraume-skadede dyr. For det tredje, ved å manipulere volumet eller titeren til subpielt levert virus så vel som stedet for subpulsinjeksjon, kan uttrykket av transgenet målrettes til et diskret område av ryggmargen ( f.eks. Det ensidige dorsalhornet). Lokalisert transgenuttrykk kan potensielt brukes i smerte- eller muskelspastisitetsmodifiserende behandling ved oppregulerende hemmende neurotransmittersystemer ( f.eks. GABA) eller hemmerende excitatoriske systemer ( f.eks. Glutamatkoplet reseptorsystem). For det fjerde, i tillegg til AAV-leveranse, vil andre molekyler eller vektorer med dårlig blod-hjernebarrierepermeabilitet ( f.eks. Mikro-RNA) sannsynligvis bli mer effektivt levert inn i spinalparenchyma etter subpiallevering. Disse kan effektivt testes av usinG teknikken beskrevet i dette manuskriptet. Endelig, som demonstrert i den nåværende studien, kan subpialteknikken vellykket brukes i voksne mus med gjennomsnittlig kroppsvekt (BW) mellom 20 og 30 g. Således er det sannsynlig at samme teknikk og eksperimentelle oppsett kan brukes i andre dyrearter med lignende BW ( f.eks. Sprague-Dawley (SD) rottepupper). BW av P6 og P21 SD rotter er henholdsvis 17 og 62 g. Bruk av rottepups i tidlig stadium av postnatal utvikling kan være et nyttig verktøy for å studere rollen som spesifikt gen opp- eller nedregulering i utviklingen av spinal nevrale kretser og sensorisk og motorisk behandling.
En av de relative begrensningene i subpial injeksjonsteknikken (i forhold til intratekal levering) er den mer invasive karakteren av denne tilnærmingen når en dorsal laminektomi skal utføres for å tillate tilgang til ryggmargens dorsale overflate. Imidlertid synes det potensielle transgenuttrykket sett over ryggmargen og i de supraspinale hjerne-sentrene å demonstrere den klare fordelen over intratekal AAV-tilførsel, som er preget av selektiv transgenekspressjon i en subpopulasjon av a-motoneuroner og primære afferenser (men er ikke tilstede I nevroner i dypere ryggmargen laminae) 8 .
På samme måte, som demonstrert i tidligere studier i voksne rotter og griser, kan høyt effektivt transgenuttrykk oppnås i spinalhvitt og grått stoff i voksne mus ved bruk av subpiel AAV9-tilførsel. I tillegg er på grunn av de relativt mindre dimensjonene (spesielt lengden) av musen ryggmargen, tilførselen av AAV9 ved kun to ryggradsnivåer (øvre livmorhalskreft og øvre lumbale) tilstrekkelig til å føre til nesten fullstendig ryggmargsinfeksjon. Denne egenskapen kan ha en viktig implikasjon i å designe spesifikke sykdomsmodifiserende behandlingsmetoder ved enten målrettet genavstenging eller oppregulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Martin Marsala er medstifter av Neurgain Technologies, Inc. (San Diego, USA).
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av SANPORC og ALSA Foundation grant (Martin Marsala); Nasjonalt bærekraftig program, prosjektnummer LO1609 (tsjekkisk utdanningsdepartement, ungdom og idrett); Og RVO: 67985904 (Stefan Juhas og Jana Juhasova).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50 μL Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1,000 U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory |
References
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gray, S. J., et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).
- Passini, M. A., et al. Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy. Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).
- Bell, P., et al. Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).
- Miyanohara, A., et al. Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046 (2016).
- Xu, Q., et al. In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery. PLoS One. 7 (3), 32581 (2012).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).
