Summary
Het doel van de huidige studie was het ontwikkelen en valideren van de kracht en de veiligheid van de lever-adeno-geassocieerde virus 9 (AAV9) -gemedieerde genafgifte door gebruik te maken van een nieuwe subpiale genafgifte techniek bij volwassen muizen.
Abstract
De succesvolle ontwikkeling van een subsea adeno-geassocieerde virus 9 (AAV9) vectorleveringstechniek bij volwassen ratten en varkens is eerder gemeld. Met behulp van subliep-geplaatste polyethyleen katheters (PE-10 of PE-5) voor AAV9-afgifte is aangetoond dat krachtige transgene expressie via de spinale parenchyma (witte en grijze stof) in subpiaal geïnjecteerde spinale segmenten is. Vanwege het brede scala van transgene muismodellen van neurodegeneratieve ziekten, is er een sterk verlangen naar de ontwikkeling van een krachtige vectorbezorgingstechniek van het centraal zenuwstelsel (CNS) in volwassen muizen. Dienovereenkomstig beschrijft de onderhavige studie de ontwikkeling van een spinale subpiale vectorafgifte-inrichting en techniek om een veilige en effectieve spinale AAV9-afgifte in volwassen C57BL / 6J-muizen mogelijk te maken. Bij spinaal geïmmobiliseerde en verdoofde muizen werd de pia mater (cervicale 1 en lumbale 1-2 spinale segmentale niveau) ingehakt met een scherpe 34 G-naald met behulp van een XYZ-manipulator. Een tweede XYZ maNipulator werd vervolgens gebruikt om een stompe 36G-naald in de lumbale en / of cervicale subruimte te verplaatsen. De AAV9-vector (3-5 μl; 1,2 x 10 13 genoomkopieën (gc)) die coderende voor groen fluorescerend eiwit (GFP) werd vervolgens subliep geïnjecteerd. Na injecties werd de neurologische functie (motor en sensorisch) periodiek beoordeeld en werden dieren 14 dagen na AAV9-afgifte met 4% paraformaldehyde geperfuseerd. Analyse van horizontale of transversale ruggenmerg secties vertoonde transgen expressie door het hele ruggenmerg, zowel in grijs als wit. Daarnaast werd intense retrogradelie gemedieerde GFP expressie gezien in de dalende motoraxonen en neuronen in de motorcortex, nucleus ruber en formatio reticularis. Geen enkele neurologische dysfunctie werd opgemerkt bij dieren. Deze gegevens tonen aan dat de subpiavevector-afgifte techniek succesvol kan worden gebruikt in volwassen muizen zonder dat er sprake is van proceduregerelateerd ruggenmergletsel, en wordt geassocieerd met zeer krachtige transgene expressiesSion doorheen de ruggengraat neuraxis.
Introduction
Het gebruik van AAV-vectoren om een verscheidenheid aan ruggenmerg en CNS neurodegeneratieve aandoeningen te behandelen, wordt een goed geaccepteerd platform om de expressie van genen die van belang zijn, effectief te regelen of stil te maken. Een van de belangrijkste beperkingen voor het effectievere gebruik van deze technologie om CNS / ruggenmergstoornissen te behandelen, is het beperkte vermogen om AAV-vector (en) te leveren aan het diepe hersen- of ruggenmergparenchym bij volwassen zoogdieren.
Er werd aangetoond dat de systemische afgifte van AAV9 bij volwassen knaagdieren, katten of niet-menselijke primaten slechts matig effectief is om transgen expressie in neuronen in de hersenen en ruggenmerg 1 , 2 , 3 te induceren. De effectievere intrathecale afgifte van AAV9-vectoren is ook aangetoond dat het slechts beperkt transgene expressie in anatomisch gedefinieerde zwembaden van neuronen leidt. Meer specifiek is het duivels geweestDat de cisternal of lumbo-sacrale intrathecale AAV9-afgifte in niet-menselijke primaten, varkens of knaagdieren leidt tot een hoog niveau van transgene expressie in spinale a-motoneuronen en segmentale dorsale wortelganglionneuronen. Minimaal of geen expressie in spinale interneuronen of stijgende of dalende axonen in de witte materie is echter 4 , 5 , 6 , 7 gezien . Collectief tonen deze gegevens aan dat er een zeer effectieve biologische-anatomische barrière bestaat, die de diffusie van intrathecaal afgeleide AAV voorkomt in dieper parale wervelkolom.
In een eerdere studie waarbij volwassen ratten en varkens werden gebruikt, werd een nieuwe subpiëlevectoraflezingstechniek ontwikkeld 8 . Met behulp van deze aanpak werd zeer krachtige en multi-segmentale transgene expressie aangetoond na een single-bolus subpiale AAV9-afgifte. Intense GFP expressie werd consequent gezienIn neuronen, gliale cellen en dalende / stijgende axonen door de geïnjecteerde spinale segmenten. Deze studie heeft voor het eerst aangetoond dat de pia mater de primaire belemmering voor de effectieve AAV9 diffusie in het spinale parenchyma uit de intrathecale ruimte vertegenwoordigt. Hoewel deze techniek en subpiële-injectie-inrichting eerder ontwikkeld is, is het relatief gemakkelijk te gebruiken bij grote knaagdieren (zoals ratten) of volwassen varkens, is het systeem niet geschikt voor gebruik in kleine dieren, zoals volwassen muizen. Vanwege het hoge aantal beschikbare transgene muismodellen van een verscheidenheid van neurodegeneratieve stoornissen is er een duidelijke behoefte aan de ontwikkeling van een effectieve spin-parenchymale vectorafgifte techniek in muizen. De beschikbaarheid van een dergelijke techniek zou de studie van het effect van specifieke gendemping mogelijk maken ( bijvoorbeeld met behulp van shRNA) of upregulatie met behulp van cel-niet-specifieke ( bv. Cytomegalovirus-CMV of Ubiquitin) of celspecifieke ( bijvoorbeeld synapsine of glial Fibrillair zuurEiwit (GFAP) promotoren tijdens de vroege postnatale ontwikkeling of onder zieke omstandigheden.
Bijgevolg hebben we in het onderhavige onderzoek een miniatuur subpieel vectorafleersysteem ontwikkeld en gevalideerd dat effectief in volwassen muizen kan worden gebruikt. Net als bij vorige ratten- en varkenstudies demonstreert dit werk een sterke transgenexpressie door het ruggenmercymie na een single-bolus subpiale AAV9-afgifte in muizen. De eenvoud van deze aanpak, de zeer goede verdraagbaarheid van geïnjecteerde muizen naar subpiale AAV9-afgifte en de hoge potentie van transgene expressie in het ruggenmergheelkunde suggereren dat deze techniek effectief kan worden geïmplementeerd in elke laboratoriuminstelling en gebruikt in experimenten gericht op spinale genexpressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studies werden uitgevoerd volgens een protocol dat is goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van de Universiteit van Californië, San Diego, en was in overeenstemming met de Associatie voor de beoordeling van laboratoriumdiervriendelijke richtlijnen voor dierlijk gebruik. Alle studies werden uitgevoerd op een zodanige wijze dat de groepsgrootte en het dierlijk lijden beperkt werden.
1. Algemene dier- en chirurgische voorbereiding
- Voordat u de chirurgische procedure start, ontdooi het virus (AAV9-UBI-GFP; 5 μl aliquots) 8 . Bereid een oplossing van 5% dextran (10.000 MW) door dextranpoeder in gedestilleerd water te mengen. Meng de virusoplossing met 5% dextranoplossing 1: 1 tot een uiteindelijke dextranconcentratie van 2,5%.
- Bewaar de virusoplossing op ijs (4 ° C).
- Gebruik volwassen C57BL / 6J muizen (man en vrouw, 20-30 g). Verdoven muizen met 5% isofluraan (in O2, 1 l / min) en onderhouden 2-3% geïnhaleerd isofluraan (in O2, 1 l / min) van neusconus tijdens chirurgie, afhankelijk van de ademhaling en de poot knijpen respons.
- Scheer de achterkant van de dieren met scheerknipsels en maak de huid schoon met 2% chlorhexidine.
- Bij chronische herstelstudies volgt een strikte steriele techniek.
- Als er sprake is van lumbale subpale injecties, snij de huid over de Th8-L1-wervels met een scalpel en snijd de paravertebrale spier uit de wervelwervels van Th10-12 met behulp van een schaar.
- Monteer het dier in een standaard stereotaxisch frame met behulp van de ruggenklemmen van de muis.
- Scheer de beide zijden van de laminaat van de Th10-12 wervels met een tandborstel (boorstuk: 0,9 mm, snelheid: 20.000 tpm) totdat er sprake is van scheuren.
- Verwijder gebarsten botfragmenten met tang en laat het dorsale oppervlak van het ruggenmerg zien.
- Knip de dura ongeveer 1 cm door met een 30 G roestvrijstalen naald en tang.
- Verwijder het atlanto-occipitale membraan van de cisterna magna met behulp van een 23G roestvrijstalen naald en tang.
- Maak de snijplaats van het weefsel- en botafval schoon met behulp van katoenwatten.
- Maak de dura ongeveer 2-3 mm open met behulp van een 30 G roestvrijstalen naald en tang.
2. De pialmembraan openen en de subpaalnaald inbrengen voor AAV9-levering
- Monteer de 34 G pia-penetrerende naald in de Z-arm van een XYZ-manipulator met behulp van een glazen capillaire houder ( Figuur 1A en B ).
OPMERKING: Voor het vervaardigen van de pia-penetrerende naald wordt de originele afgeschuinde punt van de 34G-naald gescherpt met behulp van een glazen capillaire beveller met diamantschuurplaat - grof (5,0 μm tot 50 μm tipgroottes) en maalhoek van15 - 20 °. De punt van de naald (1 mm lengte, gemeten vanaf de punt) wordt dan voorzichtig gebogen tot ongeveer 90 ° ( Figuur 1B , linker inzet). - Door middel van een chirurgische dissectie scope, ingesteld op 8-10 X vergroting, penetreer de pia met de pia-penetrerende naald met ongeveer 1 mm ( figuur 1C ) met behulp van de X-arm.
- Houd de hoek van de penetrerende naald op het weefseloppervlak bij 5-10 °.
- Na de opening van de pia, verwijder de pia-penetrerende naald horizontaal van de subruimte ( figuur 1 D) met behulp van de X-arm.
OPMERKING: Onthoud de doordringende plaats door een oriëntatiepunt, zoals een bloedvat. - Laad een stompe 36G injectie naald met AAV9-UBI-GFP virus met behulp van een 50 μL microspuit verbonden met de injectienaald met PE-10 of PE-20 buizen.
- Monteer de naald in de Z-arm van een tweede XYZ-manipulator ( Figuur 1A B ) met behulp van een glazen capillaire houder ( figuur 1B , rechtsinleg).
OPMERKING: Voor het vervaardigen van de sub-injectie AAV9 injectienaald, wordt de stompe punt van een 36 G-naald gepolijst met een glazen capillaire beveller met diamantschuurplaat - grof (5,0 μm tot 50 μm tipformaten) om de scherpe randen te verwijderen. De punt van de naald (2-3 mm lengte, gemeten vanaf de punt) wordt dan voorzichtig gebogen tot ongeveer 90 °. De pia-penetrerende en subpiale injectie naalden worden in 1-2 cm lange 20G slaven roestvrijstalen buizen (10 mm vanaf het einde van de naald) ingepakt en met epoxy gelijmd. Het gebruik van 20 G (0.91 mm diameter) buizen is vereist voor een veilige bevestiging aan de glazen capillaire houder. - Door de X-, Y- en Z-armen van de tweede manipulator te manipuleren, plaatst u de punt van de AAV9-injectienaald in de door de pia penetrerende plaats en verplaatst u dan ongeveer 2-3 mm in de subruimte door de vorige opening van de pialmembraan met behulp van de X-arm( Figuur 1E en F ).
OPMERKING: 1) De AAV9-UBI-GFP is bereid volgens de eerder gemelde protocollen 9 , 10 en de uiteindelijke titers worden ingesteld op 1,2 x 10 13 genoomkopieën per ml (gc / ml). 2) Het is niet nodig om de site van de pialopening te markeren omdat het gemakkelijk herkenbaar is ( Figuur 1D ). - Spuit de AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 of 5 μL) in de subruimte door gebruik te maken van een 50 μL microsuur (zie tabel 1 voor experimentele groepen).
- Verwijder de injectienaald uit de subruimteruimte nadat de AAV9-UBI-GFP-injectie is voltooid.
- Sluit de spier en de huid met behulp van 4.0 monofilament hechting en chirurgische clips.
OPMERKING: Het open wervel is niet nodig. - Laat de dieren op een verwarmingsblok herstellen.
- Voor pijnbestrijding injecteer Buprenorphine 0,05 mg / kg / sc elke 12 uur voor2-3 dagen na de operatie.
3. Perfusie-fixatie, Weefselcryoprotectie en Immunofluorescentie Staining
- Bij een voorafbepaald tijdstip na de injectiespuit AAV9, verdoving de muizen met euthanasieoplossing (zie de Tabel van Materialen , 0,3 ml) en transcardiaal met 20 ml heparinezuuroplossing, gevolgd door 20 ml 4% paraformaldehyde in PBS.
- Dissecteer de wervelkolom en hersenen met behulp van een botrongeur en laat ze gedurende 4 ° C in 4% formaldehyde in PBS overnachten.
- Cryoprotect de ruggenmerg en hersenen met 30% sucrose in PBS gedurende minimaal 5-7 dagen.
- Snijd coronale, dwars- of longitudinale / horizontale bevroren secties (30 μm dik) op een cryostat en berg ze in PBS bij 4 ° C.
4. Immunofluorescentie Staining van ruggenmerg en hersensecties (zie de tabel van materialen)
- Incubate free-floating secties in primarY antilichamen 's nachts.
- Na incubatie met primaire antilichamen wassen de secties drie keer in PBS en incuberen met fluorescentie-geconjugeerde ezel anti-konijnen, eend-anti-kippen en anti-geiten secundaire antilichamen.
- Monteer de secties op microscopische dia's, droog ze bij kamertemperatuur en bedek ze met een anti-fade-medium.
- Vang beelden met behulp van epifluorescentie fluorescentiemicroscoop (doelstellingen: 10X, NA-0.3, 20X, NA-0.8 en 63X, NA-1.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Potentiële Transgen Expressie in Sub-AAV9-geïnjecteerde Segmenten:
De analyse van transgen (GFP) expressie in ruggenmerg secties op 14 dagen na de afgifte van AAV9 vertoonde AAV9-dosis-afhankelijke GFP expressie door het ruggenmerg. Ten eerste werden twee bilaterale injecties van 3 μL AAV9-UBI-GFP geïnjecteerd in de bovenste lumbale subruimteruimte geassocieerd met de bijna volledige infectie van de witte en grijze stof in het hele lumbale ruggenmerg, dat zich uitstrekt tot de bovenste borstelsegmenten ( Figuur 2A En 2B , links en midden kolommen). Twee bilaterale injecties van 1,5 μL AAV9-UBI-GFP in de bovenste lumbale subpiale ruimte werden geassocieerd met een soortgelijke bijna volledige infectie van de witte en grijze stof in het hele lumbale ruggenmerg (gezien na injecties van 3 μL); De mid-thoracale segmenten toonden echter slechts af en toe geïnfecteerde neuronen (Ass = "xfig"> Afbeelding 2B, rechter kolom). Staining met α-motoneuron-specifieke (ChAT) en neuron-specifieke (NeuN) antilichamen vertoonde een consistente GFP-expressie in de gehele populatie van lumbale α-motoneuronen ( Figuur 2C ) en interneuronen gelocaliseerd in de dorsale hoorn ( Figuur 2D ), intermediaire zone Figuur 2E ), en ventrale hoorn ( Figuur 2F ). Ten tweede leidden twee bilaterale cervicale injecties van AAV9 (5 μL voor elke injectie) tot een soortgelijke GFP-expressie in de witte en grijze stof in het hele cervicale ruggenmerg (grijze en witte stof) en in de bovenste thoracale segmenten ( Figuur 3A en 3B ) . Analyse van lumbale ruggenmertsecties in dezelfde dieren vertoonde een hoge dichtheid van GFP + dalende axonen die in de buurt van de lumbale GFP-negatieve α-motoneuronen en interneuronen eindigen ( Figuur 3CEn 3D ). De levering van twee bilaterale cervicale en twee bilaterale bovenlumbale injecties van AAV9 (5 μl voor elke injectie) was geassocieerd met GFP expressie in het hele ruggenmerg, van de bovenste cervicale tot de sacrale segmenten en was homogeen aanwezig in de witte en grijze stof ( Figuur 3E- 3H ).
Retrograde en Anterograde Transport-gemedieerde Transgene Expressie in Supraspinale Motor en Sensorische Centra:
Uitgebreide GFP expressie in de lumbale of cervicale ruggenmerg na subpiale AAV9 afgifte was geassocieerd met robuuste retrograde en anterograde infectie gemedieerde GFP positiviteit in de supraspinale aflopende axonen en hun projecterende neuronen en in axonen en terminals van stijgende tracten ( Figuur 4 ). Aldus werd intense GFP positiviteit gezien in neuronen gelokaliseerd in de reticulaire vorming (RF), Nucleus ruber (NR) en motor cortex (MC) ( Figuur 4B- 4D ). Op dezelfde manier werd duidelijke GFP immunoreactiviteit gezien in de terminals van de spinocerebellaire (SCT), spinoreticulaire en spinotalamische tracten (STT) ( Figuur 4B- 4D ).
Figuur 1 : Experimentele instelling voor het uitvoeren van spinale injectiespuiten in een volwassen muis. ( A ) Voor het uitvoeren van wervelkolom injecties in volwassen muizen worden twee aparte XYZ manipulators gebruikt (I en II). ( B ) De Z-arm van elke manipulator heeft een glazen capillaire houder. Eén capillair houder houdt de 34-pi-penetrerende naald en de tweede heeft de stompe injectiepen van 36 G. ( C , D , E en F) Beelden die de positie van de pia-penetratie naald net na de pia punctie (C; hard hersenvlies reeds verwijderd) na verwijdering van de pia binnendringende naald (D), na het inbrengen van de punt van de subpiale injectienaald ( E ) en na het verplaatsen van de subpaalinjectie naald 3 mm in de subruimte ( F ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 : Potentiële spinale parenchymale GFP Expression na Lumbar Subpial AAV9-UBI-GFP Levering in volwassen muizen. ( A ) Twee bilaterale injecties van AAV9-UBI-GFP (1,5 of 3 μL injecties elk) werden in de bovenste lumbale s geleverdUbpiale ruimte, en dieren werden perfusie-bevestigd 14 dagen na AAV9-afgifte. ( B ) Intense GFP-expressie in het grijze (binnen de gestippelde gebied) en witte stof, die zich uitstrekken van de lumbale naar de bovenste borstkanker, kan gezien worden bij dieren die geïnjecteerd worden met 3 + 3 μL AAV9 (linker- en middenkolommen). ( C, D, E en F ) Co-staining van transversale ruggenmerg secties uit de lumbale vergroting bij dieren geïnjecteerd met 3 + 3 μL AAV9 tonen GFP expressie in vrijwel alle ChAT (α-motoneuron marker) -positieve α- Motoneuronen ( C en F ) en NeuN-positieve interneuronen in de dorsale hoorn ( D ) en tussenzone ( E ). Schaalstaven = 1000 μm (B); 30 μm (C); 100 μm (DF). DH: dorsale hoorn; LV: lamina V; VH: ventrale hoorn. Klik hier om een grotere ve te bekijkenRsion van deze figuur.
Figuur 3: Vergelijking van spinale GFP-expressie na spinale subcervicale versus spinale subcale cervicale en subpiale lumbale AAV9-UBI-GFP-levering in volwassen muizen. ( A, B, C en D ) Horizontale doorsnede door de hele lengte van het ruggenmerg gesneden in een dier dat eerder boviene cervicale subpiële-injecties van AAV9-UBI-GFP (5 + 5 μL) heeft ontvangen. Intense GFP expressie in de witte en grijze stof in de cervicale regio kan worden gezien ( B ). In het lumbale ruggenmerg kan een hoge dichtheid van GFP + dalende axonen in de laterale funiculus (LF) en de grijze stof tussen NeuN-positieve maar GFP-negatieve neuronen worden geïdentificeerd ( C en D ). ( E, F, G en H Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4
| Experimentele groepen | Site / niveau van AAV9 bezorging (*) | Volume van AAV9 inj, infusiesnelheid | Overlevingstijd | Weefselanalyse |
| Groep A (n = 7) | C2 (bilaterale) | 5 μl / 5 min | 14 dagen | Brein + ruggengraat |
| Groep B (n = 12) | L1-L2 (bilaterale) | 1,5 μl of 3 μl, 60 sec / μl | 14 dagen | Brein + ruggengraat |
| Groep C (n = 6) | C2 + L1-L2 (bilateraal op elk niveau) | 5 μl / 5 min | 14 dagen | Ruggengraat |
| * - bilateraal= Twee subpiale injecties die in de rechter en een naar de linker subruimte van het geïnjecteerde segment (en) worden geleverd, worden uitgevoerd. | ||||
Tabel 1: Experimentele groepen. Alle experimenten werden uitgevoerd in volwassen C57BL / 6J muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige studie beschrijft een techniek van subpiale vector (AAV9) levering in volwassen muizen. Zoals aangetoond in de bijbehorende video, kan deze aanpak en techniek effectief worden gebruikt, mits de vereiste instrumenten en pia-penetrerende naald en subpaalinjectie naald op de juiste manier worden vervaardigd volgens de vastgestelde en geteste specificaties.
Critische technische variabelen bij het uitvoeren van een consistente en veilige subpuale injectie in muizen:
Zoals aangetoond, kan een subpiële injectie gemakkelijk uitgevoerd worden bij volwassen verdoofde muizen na een dorsale cervicale of lumbale laminectomie. Er zijn verschillende kritische technische variabelen die het succes van de subpiële injectietechniek bepalen. In de eerste plaats moet de punt van de 34 G pia-penetrerende naald consistent worden gescherpt met behulp van een beveller om de gladde doorlopen van de pia te verzekeren. Eventuele inconsistenties in de techniek op hoe de naald wordt gescherpt kan leiden tot difficuLties tijdens pia penetratie en / of kan leiden tot ruggengraat letsel door te veel kracht te gebruiken om de pia te punkteren. Onder normale omstandigheden (zoals getoond in de video en in Figuur 1C en D ), toont de site van de pia opening geen teken van ruggengraat letsel of subpiële bloedingen. In sommige gevallen kan sommige subpiële bloedingen worden gezien, maar dit bleek niet geassocieerd te zijn met neurologische dysfunctie of veranderde gen expressie na AAV9 afgifte. Ten tweede is het belangrijk om de chirurgische plaats vrij van bloed te houden nadat de dura verwijderd is door gebruik te maken van elektrocautery. Elk spottig bloedresiduum kan de betrouwbare identificatie van het pia oppervlak verduisteren, zelfs als een chirurgische microscoop wordt gebruikt. Zoals getoond in Figuur 1C-F , kan een bloedvrije laminectomieplaats effectief worden onderhouden door gebruik te maken van kleine gel-schuimstukken om het gelamineerde vertebra en omringend zacht weefsel te bedekken. Ten derde moet speciale aandacht worden besteed aan de juiste plaatsing van verdovende dieren in deRuggengraat en de immobilisatie van de wervelkolom met behulp van wervelklemmen. Het gebruik van teveel druk tijdens de plaatsing van de ruggenmerg kan vertebrale breuk veroorzaken; Het gebruik van onvoldoende druk kan leiden tot een progressieve loslating van het geïmmobiliseerde wervel, dat typisch gebeurt zodra een tandboor wordt gebruikt om de laminectomie uit te voeren.
Het volume van subpiaal geïnjecteerde AAV9 correleert met de grootte van rostro-caudale transgene expressie. Zo was het gebruik van twee lumbale bilaterale subpiale AAV9 injecties (3 + 3 μL of 5 + 5 μL) geassocieerd met consistente GFP expressie in de hele lumbale grijze en witte materie, die zich uitbreiden tot de bovenste borstelsegmenten. Er was minimale variabiliteit tussen de gebruikte dieren. AAV9 injectievolumes van 1,5 + 1,5 μL leidden tot vergelijkbare GFP expressie in de segmenten gelokaliseerd in de omgeving van injecties; De verspreiding van het virus en de resulterende GFP-expressie was echter beperkt in de thoracale segmenten ( Beperking van de Sub-Gene Gene Leveringstechniek: Toekomstige toepassingen van de SubpiAl Gene Delivery Technique: Bijvoorbeeld, door gebruik te maken van shRNA-silencing-vectoren, wordt verwacht dat een zeer effectieve afname in de expressie van gemuteerde genen ( bijvoorbeeld SOD in het geval van de geërfde vorm van ALS) in het ruggenmerg zal worden bereikt, alsmede in spinaal -projecterende hersenmotor kernen. Tweede,Door de zeer effectieve infectie van de wervelkolom-axons kunnen therapeutische genen ( bijv. Coderende groeifactoren) worden gereguleerd om axonale spruitjes te bevorderen bij spinaalschade-gewonde dieren. Ten derde, door het volume of de titer van subpiaal afgeleverd virus te manipuleren, evenals de plaats van subpiële injectie, kan de expressie van het transgeen worden gericht op een discreet gebied van het ruggenmerg ( bijvoorbeeld de eenzijdige dorsale hoorn). Lokale transgene expressie kan mogelijk worden gebruikt bij pijn- of spierspasticiteitsveranderende behandeling door upregulerende remmende neurotransmittersystemen ( bijvoorbeeld GABA) of remmende excitatoire systemen ( bijvoorbeeld het glutamaatgekoppelde receptorsysteem). Ten vierde, naast de AAV-afgifte, zullen andere moleculen of vectoren met een slechte bloeddrukbarrièrepermeabiliteit ( bijvoorbeeld micro-RNA) waarschijnlijk effectiever worden afgeleverd in het spinale parenchyma na subpiële-afgifte. Deze kunnen effectief door usin worden getestG de techniek beschreven in dit manuscript. Ten slotte, zoals aangetoond in de huidige studie, kan de subpiëtietechniek succesvol worden gebruikt bij volwassen muizen met gemiddelde lichaamsgewichten (BW) tussen 20 en 30 g. Zo is het waarschijnlijk dat dezelfde techniek en experimentele opstelling kan worden toegepast bij andere diersoorten met vergelijkbare BW ( bijv. Sprague-Dawley (SD) ratpups). De BW van P6 en P21 SD ratten is respectievelijk 17 en 62 g. Het gebruik van de ratpups tijdens het vroege stadium van de postnatale ontwikkeling kan een nuttig instrument zijn om de rol van specifieke gen up- of downregulatie in de ontwikkeling van ruggengraat neurale circuits en sensorische en motorische verwerking te bestuderen.
Een van de relatieve beperkingen van de subpiële-injectietechniek (in vergelijking met intrathecale afgifte) is de invasieve aard van deze aanpak wanneer een dorsale laminectomie moet worden uitgevoerd om toegang te geven tot het dorsale oppervlak van het ruggenmerg. De krachtige transgenexpressie die in het ruggenmerg en in de supraspinale hersencentra wordt gezien, lijkt echter het duidelijke voordeel te tonen ten opzichte van intrathecale AAV-afgifte, die wordt gekenmerkt door selectieve transgene expressie in een subpopulatie van α-motoneuronen en primaire afferenten (maar is niet aanwezig In neuronen in het dieper ruggengraatlijm) 8 .
Evenzo, zoals aangetoond in eerdere studies bij volwassen ratten en varkens, kan zeer effectieve transgene expressie worden bereikt in de ruggengraatwit en grijze stof bij volwassen muizen door middel van subpiale AAV9-afgifte. Bovendien, door de relatief kleinere afmetingen (met name de lengte) van het muis- ruggenmerg, is de afgifte van AAV9 bij slechts twee ruggenmergniveaus (bovenste cervicale en bovenste lumbaal) voldoende om tot bijna volledige ruggengraatinfectie te leiden. Dit karakteristiek kan een belangrijke implicatie hebben bij het ontwerpen van specifieke ziekteveranderende behandelingsbenaderingen door middel van gerichte gensturing of upregulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Martin Marsala is mede-oprichter van Neurgain Technologies, Inc. (San Diego, USA).
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de SANPORC en ALSA Foundation grant (Martin Marsala); Het nationale duurzaamheidsprogramma, projectnummer LO1609 (Tsjechisch Ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport); En RVO: 67985904 (Stefan Juhas en Jana Juhasova).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50 μL Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1,000 U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory |
References
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gray, S. J., et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).
- Passini, M. A., et al. Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy. Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).
- Bell, P., et al. Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).
- Miyanohara, A., et al. Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046 (2016).
- Xu, Q., et al. In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery. PLoS One. 7 (3), 32581 (2012).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).
