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Neuroscience

उपशोषक एडोनो-संबंधित वायरस 9 (एएवी 9) वयस्क चूहे में वेक्टर डिलिवरी

Published: July 13, 2017 doi: 10.3791/55770
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1, 1, 3, 3, 3, 4, 4, 1,4
1Neuroregeneration Laboratory, Department of Anesthesiology, University of California, San Diego, 2Institute of Animal Physiology and Genetics, Czech Academy of Sciences, 3Department of Neurosurgery, University of California, San Diego, 4Institute of Neurobiology, Slovak Academy of Sciences

Summary

वर्तमान अध्ययन का लक्ष्य प्रौढ़ चूहों में एक उपन्यास उप-जीन डिलीवरी तकनीक का उपयोग करके रीढ़ की हड्डी में एनोनो-जुड़े वायरस 9 (एएवी 9) -विभागीय जीन डिलीवरी की क्षमता और सुरक्षा को विकसित और मान्य करना था।

Abstract

वयस्क चूहों और सूअरों में एक उप-शासक एडीनो-संबंधित वायरस 9 (एएवी 9) वेक्टर डिलीवरी तकनीक का सफल विकास पहले ही दर्ज किया गया है। एएवी 9 वितरण के लिए उप-आधारित पॉलीथीन कैथेटर्स (पीई -10 या पीई -5) का प्रयोग करना, उप-इंजेक्शन वाले रीढ़ की हड्डी के क्षेत्रों में रीढ़ की हड्डी के पैरेन्काइमा (सफेद और ग्रे पदार्थ) के माध्यम से शक्तिशाली ट्रांसजेन अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया गया है। Neurodegenerative रोगों के ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला के कारण, एक शक्तिशाली केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के विकास के लिए एक मजबूत इच्छा है- प्रौढ़ चूहों में लक्षित वेक्टर वितरण तकनीक तदनुसार, वर्तमान अध्ययन में वयस्क C57BL / 6J चूहों में सुरक्षित और प्रभावी रीढ़ की हड्डी एएवी 9 डिलीवरी की अनुमति देने के लिए रीढ़ की हड्डी वाले उप-वैक्टर डिलीवरी डिवाइस और तकनीक के विकास का वर्णन किया गया है। मस्तिष्क में स्थिर और संवेदनाहारी चूहों में, पिया मेटर (गर्भाशय ग्रीवा 1 और कांच का 1-2 रीढ़ की हड्डी का स्तर) एक एक्सवाईजेड मैनिपुलेटर का उपयोग करके तेज 34 जी सुई के साथ छेड़ दिया गया था। एक दूसरा XYZ मानिपल्यूलर का उपयोग तो काठ और / या ग्रीवा उप-स्थान में एक कुंद 36 जी सुई को आगे बढ़ाने के लिए किया जाता था। एएवी 9 वेक्टर (3-5 μL; 1.2 x 10 13 जीनोम प्रतियां (जीसी)) हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग (जीएफपी) को तब उप-आंशिक रूप से अंतःक्षिप्त किया गया था। इंजेक्शन के बाद, न्यूरोलॉजिकल फंक्शन (मोटर और संवेदी) का समय-समय पर मूल्यांकन किया गया था, और एआरएवी डिलीवरी के 4 दिनों के पैराफॉर्मालाइहाइड के साथ 14 दिनों के बाद जानवरों को छिड़काव का निर्धारण किया गया था। क्षैतिज या अनुप्रस्थ रीढ़ की हड्डी के खंडों का विश्लेषण पूरे रीढ़ की हड्डी में, ग्रे और सफेद पदार्थ दोनों में, ट्रांसजीने अभिव्यक्ति दिखाया। इसके अलावा, तीव्र रेटाग्राइड-मध्यस्थता वाली जीएफपी अभिव्यक्ति मोटर कार्टेक्स, न्यूक्लियस रूबर में अवरोही मोटर एक्सॉन और न्यूरॉन्स में देखी गई थी, और फॉर्मेटियो रिकिक्युलरिस। किसी भी जानवरों में कोई न्यूरोलॉजिकल डिसफंक्शन नहीं देखा गया था। ये आंकड़े बताते हैं कि उपशीर्षक वेक्टर डिलीवरी तकनीक सफलतापूर्वक वयस्क चूहों में इस्तेमाल कर सकती है, बिना किसी प्रक्रिया से संबंधित रीढ़ की हड्डी की चोट के कारण, और अत्यधिक शक्तिशाली ट्रांसजीने एक्सप्रेशनरीढ़ की हड्डी में न्यूरैक्सिस

Introduction

विभिन्न प्रकार की रीढ़ की हड्डी और सीएनएस न्यूरोड-जेनरेटिव विकारों के इलाज के लिए एएवी वैक्टरों का इस्तेमाल ब्याज की जीन (जी) की अभिव्यक्ति को प्रभावी ढंग से अपग्रेड करने या चुप्पी देने के लिए एक अच्छी तरह से स्वीकृत मंच बन रहा है। सीएनएस / रीढ़ की हड्डी के विकारों के इलाज के लिए इस तकनीक के अधिक प्रभावी उपयोग की प्रमुख सीमाओं में से एक है एएवी वेक्टर (एस) को वयस्क स्तनधारियों में गहरी मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के पैरेन्काइमा को देने की सीमित क्षमता।

उदाहरण के लिए, यह दर्शाया गया था कि वयस्क कृन्तकों, बिल्लियों, या गैर-मानव प्राइमेट में एएवी 9 की प्रणालीगत वितरण केवल मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी 1 , 2 , 3 में न्यूरॉन्स में ट्रांसजेन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने में मामूली प्रभावी है। एएवी 9 वैक्टर के अधिक प्रभावी इंट्रैथैलिक डिलीवरी को न्यूरॉन्स के शारीरिक-परिभाषित पूल में केवल सीमित ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के रूप में दिखाया गया है। अधिक विशेष रूप से, यह राक्षसों की गई हैगैर-मानव प्राइमेट, सूअर या कृन्तकों में cisternal या lumbo-sacral intrathecal एएवी 9 वितरण trated कि रीढ़ की हड्डी α-motoneurons और खंडीय पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स में transgene अभिव्यक्ति के एक उच्च स्तर की ओर जाता है। हालांकि, सफेद पदार्थों में रीढ़ की हड्डी के इंटर्न्यूरोन या आरोही या अवरोही अक्षों में न्यूनतम या कोई अभिव्यक्ति नहीं दिखती है 4 , 5 , 6 , 7 । सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों से पता चलता है कि एक अत्यधिक प्रभावी जैविक-संरचनात्मक बाधा मौजूद है, जो अंतर्निहित रूप से एएवी को गहरा रीढ़ की हड्डी वाले पैरेन्काइमा में वितरित करने से रोकती है।

वयस्क चूहों और सूअरों का उपयोग करते हुए पिछले एक अध्ययन में, उपन्यास उप-वैक्टर वितरण तकनीक 8 विकसित हुई थी। इस दृष्टिकोण का प्रयोग करके, एकल-बोल्ट उप-वास एएवी 9 वितरण के बाद अत्यधिक शक्तिशाली और बहु-खंडीय ट्रांसजीन अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया गया था। तीव्र GFP अभिव्यक्ति लगातार देखा थाइंजेक्शन रीढ़ की हड्डी वाले क्षेत्रों के माध्यम से न्यूरॉन्स, ग्लिअल कोशिकाएं और अवरोही / आरोही एशंस में यह अध्ययन पहली बार दिखाया गया है कि पिया मेटर प्राथमिक बाधा का प्रतिनिधित्व करता है जो कि एस्ट्रॉलिएक स्पेस से स्पाइनल पैरेन्काइमा में प्रभावी एएवी 9 प्रसार को सीमित करता है। हालांकि यह पहले से विकसित तकनीक और उप-इंजेक्शन डिवाइस बड़े कृन्तकों (जैसे चूहे) या वयस्क सूअरों में उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, तो सिस्टम छोटे जानवरों जैसे कि वयस्क चूहों में उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं है। विभिन्न प्रकार के न्यूरोड अभिकर्मक विकारों के उपलब्ध ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की वजह से, चूहों में एक प्रभावी रीढ़ की हड्डी-पैरेन्चैमिकल वेक्टर डिलीवरी तकनीक के विकास की स्पष्ट आवश्यकता है। इस तरह की तकनीक की उपलब्धता विशिष्ट जीन मुंह बंद करने के प्रभाव ( जैसे, एसआरएएनए का उपयोग कर) या सेल-गैर-विशिष्ट ( जैसे, साइटोमैगलवायरस-सीएमवी या यूबीइक्विटीन) या सेल-विशिष्ट ( जैसे, सिनापसिन या ग्लियाल तंतुमय अम्लीयप्रोटीन (जीएफएपी)) प्रारंभिक प्रसवपूर्व विकास के दौरान या बीमार रोगों के तहत प्रमोटरों।

तदनुसार, वर्तमान अध्ययन में, हमने एक लघु उपशास्त्रीय वेक्टर डिलीवरी सिस्टम विकसित और मान्य किया है जो प्रौढ़ चूहों में प्रभावी रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है। इसी तरह, पिछली चूहे और सुअर अध्ययनों के अनुसार, यह काम चूहों में एकल-बोल्ट उपायुक्त एएवी 9 डिलीवरी के बाद स्पाइनल पैरेन्काइमा में शक्तिशाली ट्रांसजीन अभिव्यक्ति दर्शाता है। इस दृष्टिकोण की सादगी, सुपारी एएवी 9 वितरण में इंजेक्शन चूहों की बहुत अच्छी सहनशीलता, और स्पाइनल पैरेन्काइमा में ट्रांसजेन अभिव्यक्ति की उच्च शक्ति का सुझाव है कि यह तकनीक प्रभावी ढंग से किसी भी प्रयोगशाला सेटिंग में लागू की जा सकती है और रीढ़ की हड्डी जीन अभिव्यक्ति

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Protocol

इन अध्ययनों को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन डिएगो की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित एक प्रोटोकॉल के तहत किया गया था और जानवरों के उपयोग के लिए प्रयोगशाला के पशु देखभाल दिशानिर्देशों के आकलन के लिए एसोसिएशन के अनुपालन में थे। सभी अध्ययन ऐसे तरीके से किए गए थे क्योंकि समूह के आकार और जानवरों के दुःख को कम करने के लिए

1. सामान्य पशु और सर्जिकल तैयारी

  1. 8; शल्य प्रक्रिया शुरू करने से पहले, (5 μL aliquots AAV9-यूबीआई-GFP) वायरस पिघलना। आसुत जल में डेक्सट्रान पाउडर मिश्रण करके 5% डेक्सट्रान (10,000 मेगावाट) का समाधान तैयार करें। वायरस समाधान को 5% डेक्सट्रान समाधान 1: 1 के साथ 2.5% के अंतिम डेक्सट्रान एकाग्रता में मिलाएं।
    1. बर्फ पर वायरस समाधान को स्टोर करें (4 डिग्री सेल्सियस)।
  2. प्रौढ़ C57BL / 6J चूहों (पुरुष और महिला, 20-30 ग्राम) का उपयोग करें 5% isoflurane (ओ 2 , 1 एल / मिनट) का उपयोग करके चूहों को एनेस्थेटेज़ करें और उन्हें 2 पर रखेंसाँस लेने की दर और पंजा की चुटकी प्रतिक्रिया के आधार पर शल्यक्रिया के दौरान नाक शंकु द्वारा -3% साँस आइसफ्लुरेन (ओ 2 , 1 एल / मिनट में)।
  3. शेविंग कतरनी वाले जानवरों के पीछे दाढ़ी और 2% क्लोरहेक्साइडिन युक्त त्वचा को साफ करें।
  4. पुरानी वसूली के अध्ययन में एक सख्त बाँझ तकनीक का पालन करें।
  5. यदि काठ के उप-इंजेक्शन का प्रदर्शन किया जाता है, तो त्वचा को स्केलपेल के साथ th8-L1 कशेरुकाओं को ओवरलेइंग करने में कटौती करें और पेवर्सटेब्रल मांसपेशियों को थै 12-12 रीढ़ की हड्डी में कैंची का उपयोग करके अलग करें।
    1. माउस की रीढ़ की हड्डी के दबाने का उपयोग करके एक मानक स्टिरियोटेक्सिक फ्रेम में पशु को माउंट करें।
    2. डैटल ड्रिल (ड्रिल बिट: 0.9 मिमी, स्पीड: 20,000 आरपीएम) का इस्तेमाल करते हुए थैले 12 कशेरुकाओं के लेमिना के दोनों किनारों को दाढ़ी जब तक कि दरारें दिखाई न दें।
    3. संदंश के साथ टूटने वाले हड्डी के टुकड़े निकालें और काठ का रीढ़ की हड्डी की पृष्ठीय सतह का पर्दाफाश करें।
    4. एक 30 जी स्टेनलेस स्टील सुई और संदंश का उपयोग कर 1 सेमी के बारे में ड्यूरा को काटें।
  7. 23 जी स्टेनलेस स्टील की सुई और संदंश का उपयोग करके cisterna magna के एटेंटो-ओसीसीपटल झिल्ली को निकालें।
  8. कपास झाड़ू का उपयोग कर किसी भी ऊतक और हड्डी मलबे की चीरा साइट को साफ करें।
  9. 30 जी स्टेनलेस स्टील सुई और संदंश का उपयोग करके 2-3 मिमी के बारे में ड्यूरा खोलें।

2. पीआईएल झिल्ली खोलना और एएवी 9 डिलिवरी के लिए सब्लिकियल सुई डालना

  1. एक गिलास केशिका धारक ( चित्रा 1 ए और बी ) का इस्तेमाल करते हुए एक XYZ मैनिपुलेटर के जेड-बाउंड में 34 जी पिया-मर्मज्ञ सुई को माउंट करें।
    नोट: पिया-मर्मज्ञ सुई का निर्माण करने के लिए, 34 ग सुई की मूल beveled टिप हीरा अपघर्षक प्लेट के साथ एक गिलास केशिका बेवेलर का उपयोग करके तेज होती है - मोटे (5.0 μm से 50 माइक्रोन टिप आकार) और पीस कोण15 - 20 डिग्री सुई की नोक (टिप से मापा जाने वाला 1 मिमी लंबाई) धीरे धीरे करीब 90 ° ( चित्रा 1 बी , बायां डालने) के लिए आती है ।
  2. सर्जिकल विदारक दायरे का प्रयोग करके, 8-10 एक्स बढ़ाई पर सेट करें, पिया-मर्मिटिंग सुई के साथ लगभग 1 मिमी ( चित्रा 1 सी ) एक्स-आर्म का उपयोग करके पिया को घुसना।
    1. ऊतक सतह पर घुसना करने वाली सुई का कोण 5-10 डिग्री पर रखें
  3. पिया खोलने के बाद, एक्स-आर्म का उपयोग करके उप-स्थान ( चित्रा 1 डी) से क्षैतिज रूप से पिया-मर्मज्ञ सुई को हटा दें।
    नोट: एक मील का पत्थर, जैसे रक्त वाहिका द्वारा घुस गई साइट को याद रखें
  4. पीई -10 या पीई -20 टयूबिंग के साथ इंजेक्शन सुई से जुड़े एक 50-माइक्रोन माइक्रोसेरिंग का उपयोग करके एएवी 9-यूबीआई-जीएफपी विषाणु के साथ एक कुंद 36 जी इंजेक्शन सुई लोड करें।
  5. दूसरी XYZ मैनिपुलेटर के Z-arm में सुई को माउंट करें ( चित्रा 1 ए बी ) ग्लास केशिका धारक ( चित्रा 1 बी , दायें डालें) का उपयोग कर।
    नोट: सुपारी एएवी 9 इंजेक्शन सुई का निर्माण करने के लिए, तेज किनारों को दूर करने के लिए मोटे (5.0 माइक्रोग्राम से 50 माइक्रोन टिप आकार) के साथ एक गिलास केशिका बेवेलर का उपयोग करके 36 जी सुई की कुंद की नोक पॉलिश किया जाता है। सुई की नोक (टिप से मापा जाने वाला 2-3 मिलीमीटर लंबाई) धीरे-धीरे करीब 90 डिग्री तक आती है। पिया-मर्मज्ञ और उप-इंजेक्शन सुइयों को 1-2 सेमी-लंबा 20 जी दास स्टेनलेस स्टील टयूबिंग (सुई के अंत से 10 मिमी) में डाला जाता है और एपॉक्सी के साथ चिपका जाता है। ग्लास केशिका धारक को सुरक्षित लगाव के लिए 20 जी (0.91 मिमी-व्यास) टयूबिंग का उपयोग करना आवश्यक है।
  6. द्वितीय मणिपुर के एक्स, वाई और जेड हथियार को छेड़छाड़ करके, एएवी 9 इंजेक्शन सुई की नोक को पिया-घुसने वाली जगह में रखें और उसके बाद पिछले पियाल झिल्ली खोलने के माध्यम से उप-स्थान में इसे 2-3 मिमी के बारे में आगे बढ़ाएं। एक्स-हाथ( चित्रा 1 ई और एफ )
    नोट: 1) एएवी 9-यूबीआई-जीएफपी पहले रिपोर्ट प्रोटोकॉल 9 , 10 के अनुसार तैयार किया गया है, और अंतिम टाइमर को प्रति एमएल (जीसी / एमएल) के अनुसार 1.2 x 10 13 जीनोम प्रतियां समायोजित किया गया है। 2) पिल खोलने की साइट को चिह्नित करने की कोई आवश्यकता नहीं है क्योंकि यह आसानी से पहचाने जाने योग्य है ( चित्रा 1 डी )।
  7. एएवी 9-यूबीआई-जीएफपी (1.5, 3, या 5 μL) को 50 μL माइक्रोसिरींज (प्रयोगात्मक समूहों के लिए तालिका 1 देखें) का उपयोग करके उप-अंतरिक्ष में डालें।
  8. एएवी 9-यूबीआई-जीएफपी इंजेक्शन पूरा होने के बाद इंजेक्शन सुई को उप-स्थान से निकालें।
  9. 4.0 मोनोफ़िलामेंट सीवन और सर्जिकल क्लिप का उपयोग कर मांसपेशियों और त्वचा को बंद करें
    नोट: खुले कशेरुकाओं को सील करने की कोई जरूरत नहीं है।
  10. जानवरों को एक हीटिंग पैड पर पुनर्प्राप्त करने दें
  11. दर्द नियंत्रण के लिए प्रत्येक 12 घंटे के लिए ब्यूपेरोनोफ़िन 0.05 मिलीग्राम / किग्रा / स्किच इंजेक्षनसर्जरी 2-3 दिनों के बाद

3. छिड़काव-निर्धारण, ऊतक क्रियोराफ्रैक्शन, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेंसिंग

  1. उप-एएवी 9 इंजेक्शन के बाद पूर्व निर्धारित समय बिंदु पर, ईसुथेन्सिया समाधान के साथ चूहों को गहराई से अनैस्टेटाइज़ करना ( सामग्री की तालिका देखें, 0.3 एमएल) और transcardially उन्हें 20 एमएल हेपरिनाइज्ड खारा के साथ पीबीएस में 4 एमएमएल 4 पैरा पैराडाल्डाहाइड के साथ छिड़काव करें।
  2. रीढ़ की हड्डी और दिमाग काटना एक हड्डी रंजन का उपयोग करें और पीबीएस में 4% formaldehyde में उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में ठीक कर दें।
  3. पीबीएस में 30% सूक्रोज के साथ रीढ़ की हड्डी और दिमाग को कम से कम 5-7 दिनों के लिए क्रायोरोफेट करें।
  4. एक क्रिस्टोस्ट पर राज्याभिषेक, अनुरुप, या अनुदैर्ध्य / क्षैतिज जमे हुए वर्ग (30 सुक्ष्ममापी) कट करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में संग्रहीत करें

4. रीढ़ की हड्डी और मस्तिष्क के अनुभागों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टैनिंग (सामग्रियों की तालिका देखें)

  1. प्राइमर में फ्री-फ्लोटिंग अनुभागों को सेते हैंY एंटीबॉडी रातोंरात
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बाद, पीबीएस में तीन बार वर्गों को धो लें और प्रतिदीप्ति संयुग्मित गधा विरोधी खरगोश, गधा विरोधी चिकन, और गधा विरोधी बकरी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं।
  3. सूक्ष्मदर्शी स्लाइड्स पर वर्गों को माउंट करें, उन्हें कमरे के तापमान पर शुष्क करें, और उन्हें एक विरोधी फीड माध्यम के साथ कवर करें।
  4. एफ़िफ्लोरेसेंस फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करने वाली छवियों को कैप्चर करें (उद्देश्य: 10 एक्स, एनए-0.3; 20 एक्स, एनए-0.8; और 63 एक्स, एनए -1.4)।

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Representative Results

एएवी 9-इंजेक्शन सेगमेंट में उप-पंसल में सक्षम ट्रांसजीने अभिव्यक्ति:
एएवी 9 डिलीवरी के 14 दिनों के बाद रीढ़ की हड्डी के खंडों में ट्रांसजीने (जीएफपी) अभिव्यक्ति का विश्लेषण स्पाइनल पैरेन्काइमा के दौरान एएवी 9-डोस आश्रित जीएफपी अभिव्यक्ति दिखाता है। सबसे पहले, एएवी 9-यूबीआई-जीएफपी के दो द्विपक्षीय 3 μL इंजेक्शन ऊपरी काठ का उप-स्थान में इंजेक्ट किया गया था, पूरे कंबल रीढ़ की हड्डी में सफेद और भूरे रंग के मस्तिष्क के लगभग पूर्ण संक्रमण से जुड़े थे, जो ऊपरी वक्षीय खंडों ( चित्रा 2 ए और 2 बी , बाएं और मध्य स्तंभ)। ऊपरी काठ का उप-स्थान में एएवी 9-यूबीआई-जीएफपी के दो द्विपक्षीय 1.5 μL इंजेक्शन पूरे कंबल रीढ़ की हड्डी में सफेद और भूरे रंग की एक समान पूर्ण-पूर्ण संक्रमण के साथ जुड़े थे (जैसा कि 3 μL के इंजेक्शन के बाद देखा गया है); हालांकि, मध्य-थोरैसिक सेगमेंट में केवल कभी-कभी संक्रमित न्यूरॉन्स दिखाई देते हैं (Ass = "xfig"> चित्रा 2 बी, सही स्तंभ)। Α-motoneuron- विशिष्ट (चाट) और न्यूरॉन-विशिष्ट (न्यूअन) एंटीबॉडी के साथ धुंधला रंगीन α-मोटिटोनुरों ( चित्रा 2 सी ) की पूरी आबादी और पृष्ठीय सींग ( चित्रा 2 डी ), मध्यवर्ती क्षेत्र में स्थानीयकृत इंटर्न्यूनों में लगातार जीएफपी अभिव्यक्ति से पता चला ( चित्रा 2 ई ), और उदर सींग ( चित्रा 2 एफ )। दूसरा, एएवी 9 (दो इंजेक्शन के लिए 5 μL) के दो द्विपक्षीय ग्रीवा इंजेक्शन ने पूरे ग्रीवा रीढ़ की हड्डी (ग्रे और सफेद पदार्थ) और ऊपरी छिद्रों ( चित्रा 3 ए और 3 बी ) में सफेद और भूरे रंग के मामले में समान जीएफपी अभिव्यक्ति को जन्म दिया। । एक ही जानवरों में काठ का रीढ़ की हड्डी के वर्गों का विश्लेषण, जीएफपी + घिरा हुआ घनत्व का घनत्व दिखाता है जो काठ का जीएफपी-नकारात्मक α-मोटेटेनुरों और इंटर्न्यूरन्स ( चित्रा 3 सी)और 3 डी )। एएवी 9 (दो इंजेक्शन के लिए 5 μL) के दो द्विपक्षीय ऊपरी कांच के इंजेक्शन की डिलीवरी पूरे रीढ़ की हड्डी में जीएफपी अभिव्यक्ति के साथ ऊपरी सरवाइकल से त्रस्त खंडों में जुड़ी हुई थी, और सफेद और भूरे रंग के मामले में समरूप रूप से मौजूद था ( चित्रा 3 ई -3 एच )।

सुपरप्राड्रैड और एंटरोग्रेट ट्रांसपोर्ट-मध्यस्थता वाले ट्रांसजीएन्टी एक्सप्रेशन इन सुपर स्पेशल मोटर और सेंसररी सेंटर:
उपप्रभावित एएवी 9 वितरण के बाद काठ या ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में व्यापक जीएफपी अभिव्यक्ति सुप्रासपंथी अवरोही ऐशंस और उनके प्रोजेक्टिंग न्यूरॉन्स और एक्सॉन्स और आरोही इलाकों के टर्मिनलों ( चित्रा 4 ) में मजबूत प्रतिगामी और एंटरोग्रेड संक्रमण-मध्यस्थता जीएफपी सकारात्मकता के साथ जुड़ा था। इस प्रकार, तीव्र GFP सकारात्मकता नेचुरल गठन (आरएफ) में स्थानीयकृत न्यूरॉन्स में देखा गया था, नाभिक रूबर (एनआर), और मोटर प्रांतस्था (एमसी) ( चित्रा 4 बी -4 डी )। इसी तरह, जीपीपी की स्पष्टता स्पीनोसेरेबेलर (एससीटी), स्पीनेरेटिक्युलर और स्पिनोथमैमिक ट्रेक्ट्स (एसटीटी) ( चित्रा 4 बी -4 डी ) के टर्मिनल में देखी गई।

आकृति 1
चित्रा 1 : एक वयस्क माउस में रीढ़ की हड्डी के उप-बाधाओं को लगाने के लिए प्रायोगिक सेटअप। ( ए ) वयस्क चूहों में रीढ़ की हड्डी के उप-इंजेक्शन को चलाने के लिए, दो अलग एक्सवाईजेड मैनिपुलेटर्स (I और II) का उपयोग किया जाता है। ( बी ) प्रत्येक मैनिपुलेटर के जेड-बांह एक गिलास केशिका धारक रखता है। एक केशिका धारक के पास 34 जी सुई की पिया-मर्मज्ञता है, और दूसरा वाला कुंद 36 जी सबपियाल इंजेक्शन सुई रखता है। ( सी , डी , ई , और एफ) उप-इंजेक्शन सुई की नोक के सम्मिलन के बाद, pia-penetrating सुई ( डी ) को हटाने के बाद, पिया पंचर ( सी ; ड्यूरा मामले को पहले ही हटा दिया गया है) के बाद पिया-प्रवेश सुई की स्थिति दर्शाती हुई छवियां ( ई ), और subpial अंतरिक्ष ( एफ ) में उप-इंजेक्शन सुई 3 मिमी आगे बढ़ने के बाद। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 : प्रौढ़ चूहों में लंबर सबिपियल एएवी 9-यूबीआई-जीएफपी डिलिवरी के बाद पावर स्पाइनल पेरेन्चिमल जीएफपी एक्सप्रेशन। ( ए ) एएवी 9-यूबीआई-जीएफपी (1.5 या 3 μL इंजेक्शन प्रत्येक) के दो द्विपक्षीय इंजेक्शन ऊपरी कंबल में दिए गए थेएएवी 9 डिलीवरी के 14 दिनों बाद यूपीियल स्पेस और जानवरों को छिड़काव तय किया गया था। ( बी ) ग्रे (डॉटेड क्षेत्र के अंदर) और सफेद पदार्थ में गहन जीएफपी अभिव्यक्ति, कंबल से ऊपरी छिद्रों तक फैली हुई जानवरों को 3 + 3 μL एएवी 9 (बाएं और मध्य कॉलम) के साथ इंजेक्शन लगाने वाले जानवरों में देखा जा सकता है। ( सी, डी, ई और एफ ) एएवी 9 के 3 + 3 μL के साथ इंजेक्ट किए गए जानवरों में काठ का आवरण से लिया गया अनुक्रमिक रीढ़ की हड्डी वाले अनुभागों के सह-धुंधलापन, लगभग सभी चाट (α-motoneuron मार्कर) में जीएफपी अभिव्यक्ति-β- मोटाइनूरॉन्स ( सी और एफ ) और न्यौएन-पॉजिटिव इंट्रॉर्न्यून्स पृष्ठीय सींग ( डी ) और इंटरमीडिएट ज़ोन ( ई ) में हैं। स्केल सलाखों = 1,000 माइक्रोन (बी); 30 माइक्रोन (सी); 100 माइक्रोन (डीएफ) DH: पृष्ठीय सींग; एलवी: लैमिना वी; वीएच: वेंट्रल सींग कृपया एक बड़ा ve देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का अनुकरण

चित्र तीन
चित्रा 3: स्पाइनल जीपीपी अभिव्यक्ति की तुलना स्पाइनल उपविकेशनल सरविकल बनाम स्पाइनल सबपीियल सरविक और प्लॉस्टिक कंबल एएवी 9-यूबीआई-जीएफपी एडल्ट माइस में डिलिवरी के बाद। ( ए, बी, सी और डी ) क्षैतिज खंड, एएवी 9-यूबीआई-जीएफपी (5 + 5 μL) के ऊपरी ग्रीवा उप-इंजेक्शन प्राप्त करने वाले जानवर में रीढ़ की हड्डी की पूरी लंबाई में कटौती करता है। ग्रीवा क्षेत्र में सफेद और भूरे रंग के मामले में गहन जीएफपी अभिव्यक्ति ( बी ) देखा जा सकता है। काठ का रीढ़ की हड्डी में, जीएफपी + घूमने वाले एपोन्स को पार्श्व फ़ैंकुलस (एलएफ) में रखा जाता है और नयूएन-पॉजिटिव लेकिन जीएफपी-नेगेटिव न्यूरॉन्स के बीच का मामला पहचाना जा सकता है ( सी और डी )। ( ई, एफ, जी, और एच इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4 रौंग>: ब्रेन मोटर और सेंसररी केंद्रों में संभावित प्रतिगामी और एंट्रोग्र्रेड एएवी 9-यूबीआई-जीपीपी-मध्यस्थता जीएफपी अभिव्यक्ति। ( ए ) गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में तीव्र जीएफपी पॉजिटिविटी की उपस्थिति का चित्रण एक कम-पावर वाली छवि, म्यूदूला आल्गोटाटा, सेरिबैलम और मोटर कॉर्टेक्स (एमसी)। ( बी ) एक उच्च-शक्ति वाली छवि जो कि बाण के मस्तिष्क खंड से ली जाती है और जातिगत संरचना (आरएफ), नाभिक रूबर (एनआर) में न्यूरॉन्स में जीएफपी प्रतिदीप्ति की उपस्थिति दिखा रही है, और स्पिनो-सेरेबेलर ट्रैक्ट (एससीटी) के एक्सॉन। ( सी ) कोरोनल मस्तिष्क वर्गों से ली गई एक कम-पावर की छवि, मोटर कार्टेक्स (एमसी) में पिरामिड न्यूरॉन्स में जीएफपी प्रतिदीप्ति और जातिगत थैमानिक नाभिक (एसटीटी) के क्षेत्रों में स्पिनोथमैमिक ट्रैक्ट के टर्मिनलों में उपस्थिति दिखाती है। ( डी ) मोटर कंटैक्स में पिरामिड न्यूरॉन्स में गहन जीएफपी एक्सप्रेशन प्रदर्शित करने वाली एक उच्च-शक्ति छवि। स्केल बार = 2,000 माइक्रोन (ए); 1,000 माइक्रोन (बी और सी); 60 माइक्रोन (डी)Csource.jove.com/files/ftp_upload/55770/55770fig4large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रायोगिक समूह एएवी 9 वितरण के साइट / स्तर (*) एएवी 9 इंजेक्शन की मात्रा, जलसेक दर उत्तरजीविता समय ऊतक विश्लेषण
समूह ए (एन = 7) सी 2 (द्विपक्षीय) 5 μL / 5 मिनट 14 दिन मस्तिष्क + रीढ़ की हड्डी
समूह बी (एन = 12) एल 1-एल 2 (द्विपक्षीय) 1.5 μL या 3μL, 60 सेकंड / μL 14 दिन मस्तिष्क + रीढ़ की हड्डी
समूह सी (एन = 6) सी 2 + एल 1-एल 2 (प्रत्येक स्तर पर द्विपक्षीय) 5 μL / 5 मिनट 14 दिन मेरुदण्ड
* - द्विपक्षीय= इंजेक्ट किए गए सेगमेंट (बाएं) के बाएं उप-वाहिनी क्षेत्र में दिए गए दो उप-आग्नेय इंजेक्शन और एक को सही में दिया जाता है।

तालिका 1: प्रायोगिक समूह सभी प्रयोग वयस्क C57BL / 6J चूहों में किया गया।

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Discussion

वर्तमान अध्ययन वयस्क चूहों में उप-वैक्टर (एएवी 9) डिलीवरी की एक तकनीक का वर्णन करता है। जैसा कि साथ वीडियो में दिखाया गया है, इस दृष्टिकोण और तकनीक को प्रभावी रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है, बशर्ते स्थापित और परीक्षण किए गए विशिष्टताओं के अनुसार आवश्यक उपकरण और पिया-मर्मज्ञ सुई और उप-इंजेक्शन सुई ठीक से निर्मित होते हैं।

चूहे में एक सुसंगत और सुरक्षित उपपद इंजेक्शन करने में महत्वपूर्ण तकनीकी चर:
जैसा कि दिखाया गया है, एक पृष्ठीय ग्रीवा या काठ के निचले लैनेनिटोमी के बाद एक उपशीर्षक इंजेक्शन आसानी से वयस्क संवेदनाहारी चूहों में किया जा सकता है। कई महत्वपूर्ण तकनीकी चर, जो कि उप-इंजेक्शन तकनीक की सफलता को परिभाषित करते हैं। सबसे पहले, 34 जी पिया-पेनिट्रेटिंग सुई की नोक को पिया के चिकनी छिद्र को आश्वस्त करने के लिए एक बेवेलियर का उपयोग करके लगातार तेज किया जाना चाहिए। सुई को कैसे तेज किया जाता है, इस तकनीक में कोई भी विसंगतियां अंतर की ओर ले सकती हैंपीएआई के दौरान लेटी और / या रीढ़ की हड्डी में चोट के कारण बहुत ज्यादा ताकत का उपयोग करके पिया को छिद्र कर सकता है। सामान्य परिस्थितियों में (जैसा कि वीडियो में और चित्र 1 सी और डी में दिखाया गया है), पिया उद्घाटन की साइट रीढ़ की हड्डी की चोट या उपशीर्ष रक्तस्राव का कोई संकेत नहीं दिखाती है। कुछ मामलों में, कुछ उपशीर्ष रक्तस्राव देखे जा सकते हैं, लेकिन एएवी 9 वितरण के बाद यह न्यूरोलोलॉजिकल डिसफंक्शन या बदलते जीन एक्सप्रेशन के साथ जुड़ा नहीं पाया गया। दूसरा, इलेक्ट्रोकार्टरी का उपयोग करके ड्यूरा हटा दिए जाने के बाद सर्जरी साइट को रक्त से मुक्त रखना महत्वपूर्ण है। किसी भी धब्बेदार रक्त अवशेषों को पिया की सतह की विश्वसनीय पहचान अस्पष्ट कर सकती है, भले ही एक शल्यक्रिया सूक्ष्मदर्शी का उपयोग किया हो। जैसा कि चित्रा 1 सी-एफ में दिखाया गया है, एक रक्त मुक्त लैमिनेक्टॉमी साइट को प्रभावी ढंग से छोटे जैल-फोम के टुकड़े का उपयोग करके रखरखाव किया जा सकता है ताकि लनाइकेक्टोमाइज्ड कशेरुका और आसपास के कोमल ऊतक को कवर किया जा सके। तीसरा, अनैतिकता वाले जानवरों की उचित नियुक्ति के लिए विशेष रूप से ध्यान देना चाहिएरीढ़ की हड्डी के फ्रेम और रीढ़ की हड्डी के clamps का उपयोग कर रीढ़ की हड्डी के स्तंभ के स्थिरीकरण के लिए। रीढ़ की हड्डी clamps के प्लेसमेंट के दौरान बहुत अधिक दबाव का प्रयोग कर कशेरुक टूटना पैदा कर सकता है; अपर्याप्त दबाव का उपयोग करने से अछूता हुआ कशेरुकाओं का एक प्रगतिशील ढीला हो सकता है, जो आम तौर पर एक बार होता है जब एक दंत चिकित्सा ड्रिल को लैमिनेक्टॉमी करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

उप-आक्षेप वाली एएवी 9 की मात्रा रॉस्ट्रो-क्वॉडल ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की परिमाण के साथ संबंध है। इस प्रकार, दो कांटेदार द्विपक्षीय द्विपक्षीय एएवी 9 इंजेक्शन (3 + 3 μL या 5 + 5 μL) का उपयोग ऊपरी छातीय खंडों तक फैली, पूरे काठ भूरे और सफेद पदार्थ में लगातार जीएफपी अभिव्यक्ति के साथ जुड़ा था। यहां इस्तेमाल किए गए जानवरों में न्यूनतम परिवर्तनशीलता थी एएवी 9 इंजेक्शन मात्रा 1.5 + 1.5 μL के इंजेक्शन के आस-पास के स्थानीय क्षेत्रों में इसी तरह की जीएफपी अभिव्यक्ति के कारण हुई; हालांकि, विषाणु का प्रसार और जिसके परिणामस्वरूप जीएफपी अभिव्यक्ति थोरैसिक सेगमेंट में सीमित थी (

उप-जीन डिलीवरी तकनीक की सीमा:
उप-इंजेक्शन तकनीक की सापेक्ष सीमाओं में से एक (इंट्राैथैक्स डिलिवरी के मुकाबले) इस दृष्टिकोण की अधिक आक्रामक प्रकृति है जब रीढ़ की हड्डी की पृष्ठीय सतह तक पहुंच की अनुमति देने के लिए एक पृष्ठीय laminectomy किया जाना चाहिए। हालांकि, रीढ़ की हड्डी में और सुप्रास्प्लिन मस्तिष्क केंद्रों में देखा जाने वाला शक्तिशाली ट्रांसजीन अभिव्यक्ति, इंट्राैथैलिक एएवी डिलीवरी पर स्पष्ट लाभ दिखाती है, जो कि α-मोटिटोन्योरन्स और प्राथमिक उपसर्गों (लेकिन वर्तमान में मौजूद नहीं है) में चयनात्मक ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की विशेषता है गहरे रीढ़ की हड्डी के लैमिना में न्यूरॉन्स में) 8

उपपि के भविष्य के अनुप्रयोगअल जीन डिलीवरी तकनीक:
इसी तरह, वयस्क चूहों और सूअरों के पिछले अध्ययनों में दिखाया गया है, अत्यधिक प्रभावी ट्रांसजेन अभिव्यक्ति को उपजी एएवी 9 वितरण का उपयोग करके वयस्क चूहों में रीढ़ की हड्डी में सफेद और भूरे रंग के मामले में प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, माउस रीढ़ की हड्डी के अपेक्षाकृत छोटे आयाम (विशेषकर लंबाई) के कारण, केवल दो रीढ़ की हड्डी के स्तर (ऊपरी सरवाइकल और ऊपरी काठ) पर एएवी 9 की डिलीवरी पर्याप्त-पूर्ण रीढ़ की हड्डी के संक्रमण को जन्म देने के लिए पर्याप्त है। इस विशेषता को विशिष्ट बीमारी के डिजाइन में एक महत्वपूर्ण निहितार्थ हो सकता है - या तो लक्षित जीन चुप्पी या अपरियोगण द्वारा इलाज के तरीकों को संशोधित किया जा सकता है।

उदाहरण के लिए, shRNA-silencing vectors का प्रयोग करके, यह उम्मीद की जाती है कि उत्परिवर्तित जीनों की अभिव्यक्ति ( जैसे, एएलएस के विरासत स्वरूप के मामले में एसओडी) में अत्यधिक प्रभावकारी कमी रीढ़ की हड्डी के साथ-साथ स्पिनली में भी प्राप्त की जाएगी -प्रभावित मस्तिष्क मोटर नाभिक दूसरा,क्योंकि रीढ़ की हड्डी में सफेद पदार्थ के एसिन्स के अत्यधिक प्रभावी संक्रमण के कारण, चिकित्सीय जीन ( उदाहरण के लिए, विकास कारकों को एन्कोडिंग) को रीढ़ की हड्डी के घावों वाले घायल जानवरों में अक्षीय अंकुरण को बढ़ावा देने के लिए अपग्रेड किया जा सकता है। तीसरा, मात्रा या उपशीर्षक रूप से वितरित वायरस के साथ-साथ उपशोषक इंजेक्शन की साइट को जोड़कर, ट्रांसजेन की अभिव्यक्ति को रीढ़ की हड्डी ( जैसे, एकतरफा पृष्ठीय सींग) के असतत क्षेत्र को लक्षित किया जा सकता है। स्थानीयकृत ट्रांसजीन अभिव्यक्ति का उपयोग संभवतः दर्द या मांसपेशियों में अस्थिरता-संशोधित निरोधक न्यूरोट्रांसमीटर सिस्टम ( उदाहरण के लिए, GABA) या उत्तेजित प्रणाली ( जैसे ग्लूटामेट-युग्मित रिसेप्टर सिस्टम) को रोकने के द्वारा किया जा सकता है। चौथा, एएवी डिलीवरी के अलावा, अन्य अणु या खराब रक्त-मस्तिष्क की बाधा के पारगम्यता ( जैसे, सूक्ष्म आरएनए) वाले वैक्टर को उप-डिलीवरी के बाद रीढ़ की हड्डी के पैरेन्काइमा में अधिक प्रभावी रूप से वितरित किया जाएगा। ये प्रभावी ढंग से usin द्वारा जांच की जा सकती हैजी इस पांडुलिपि में वर्णित तकनीक है। अंत में, जैसा कि वर्तमान अध्ययन में दिखाया गया है, उपशीघ्र तकनीक 20 से 30 ग्राम के बीच औसत बॉडीवीट्स (बीडब्ल्यू) के साथ वयस्क चूहों में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रकार, यह संभावना है कि समान तकनीक और प्रायोगिक सेटअप अन्य जानवरों की प्रजातियों में समान बीडब्ल्यू ( जैसे, स्प्रेग-दाऊली (एसडी) चूहे पिल्ले) के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। पी 6 और पी 21 एसडी चूहों की बीड्यू क्रमशः 17 और 62 ग्राम है। प्रसवोत्तर विकास के प्रारंभिक चरण के दौरान चूहे के पिल्ले का प्रयोग स्पाइनल तंत्रिका सर्किट और संवेदी और मोटर प्रसंस्करण के विकास में विशिष्ट जीन अप या रेडियोल्यूशन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है।

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Disclosures

मार्टिन मार्सला, नूरगेन टेक्नोलॉजीज, इंक। (सैन डिएगो, यूएसए) के एक सह-संस्थापक है।

Acknowledgments

इस अध्ययन का समर्थन SANPORC और ALSA फाउंडेशन अनुदान (मार्टिन मार्सला) द्वारा किया गया था; राष्ट्रीय स्थिरता कार्यक्रम, परियोजना संख्या LO1609 (चेक शिक्षा, युवा और खेल मंत्रालय); और आरवीओ: 67985904 (स्टीफन जुहास और जान जुहसोवा)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J Mice Jackson Labs 664
Lab Standard Stereotaxic for Mice Harvard Apparatus 72-9568
Mouse Spinal Adaptor Harvard Apparatus 72-4811
XYZ Manipulator Stoelting 51604
Manual Infusion Pump Stoelting 51218
34G Beveled Nanofill Needle World Precision Instruments NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle World Precision Instruments NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane MWI Veterinary Supply 502017
Chlorhexidine Solution MWI Veterinary Supply 501027
20G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305175
23G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305145
30G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305128
Cotton Tipped Applicator MWI Veterinary Supply 27426
Glass Capillary Beveller  Narishige International SM-25B
Slide Microscope Superfrost Leica Microsystems M80
50 μL Microsyringe  Hamilton 81242
BD Intramedic PE-20 Tubing Becton, Dickinson 427406
BD Intramedic PE-10 Tubing Becton, Dickinson 427401
4-0 monofilament suture VetOne V1D397
Glass Capillary Beveller  Narishige Pipet Micro Grinder EG-40 
5 min Epoxy (Epoxy Clear) Devcon 14310
Euthanasia Solution MWI Veterinary Supply 11168
Heparin Inj 1,000 U/mL MWI Veterinary Supply 54254
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Anti NeuN Antibody EMD-Millipore ABN78 Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody EMD-Millipore AB144P Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody Aves Labs GFP-1020 Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A21207 Secondary Antibody, 1:1000
 Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 ThermoFisher Scientific A10043 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Jackson Immunoresearch Labs 703-545-155 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 Abcam ab150131 Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost Fisher Scientific 12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant Fisher Scientific P36930
Epifluorescence Microscope Zeiss Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope Olympus Olympus FV1000
Dextran Polysciences, Inc 19411
AAV9-UBC-GFP UCSD Viral Vector Core Laboratory

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 125 माउस सबपीियल रीढ़ की हड्डी जीन वितरण एएवी 9 जीएफपी अभिव्यक्ति
उपशोषक एडोनो-संबंधित वायरस 9 (एएवी 9) वयस्क चूहे में वेक्टर डिलिवरी
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Tadokoro, T., Miyanohara, A.,… More

Tadokoro, T., Miyanohara, A., Navarro, M., Kamizato, K., Juhas, S., Juhasova, J., Marsala, S., Platoshyn, O., Curtis, E., Gabel, B., Ciacci, J., Lukacova, N., Bimbova, K., Marsala, M. Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice. J. Vis. Exp. (125), e55770, doi:10.3791/55770 (2017).

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