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Neuroscience

Subito Adeno associato Virus 9 (AAV9) Consegna vettoriale nei topi adulti

doi: 10.3791/55770 Published: July 13, 2017

Summary

L'obiettivo del presente studio è stato quello di sviluppare e convalidare la potenza e la sicurezza del recettore genico mediato dal virus 9 associato ad adeno associato a spina (AAV9) utilizzando una nuova tecnica di somministrazione del gene subpiale nei topi adulti.

Abstract

Lo sviluppo efficace di una tecnica sub-adenosa associata a virus 9 (AAV9) in ratti e suini adulti è stata riportata in precedenza. Utilizzando cateteri in polietilene (PE-10 o PE-5) posizionati subpiamente per la consegna AAV9, è stata dimostrata un'espressione potente di transgene attraverso il parenchima spinale (materia bianca e grigia) nei segmenti spinali sottomarmente iniettati. A causa della vasta gamma di modelli di topi transgenici delle malattie neurodegenerative, esiste un forte desiderio per lo sviluppo di una tecnica di erogazione del vettore per il sistema nervoso centrale (CNS) potente nei topi adulti. Di conseguenza, il presente studio descrive lo sviluppo di un dispositivo di erogazione del subpiale spinale e la tecnica per consentire una consegna sicura ed efficace della AAV9 spinale in topi adulti C57BL / 6J. Nei topi spinalmente immobilizzati e anestetizzati, il pia mater (livello segmentale spinale 1 e lombare 1-2) è stato inciso con un ago tagliente a 34 G utilizzando un manipolatore XYZ. Un secondo XYZ maIl nipulatore è stato quindi usato per avanzare un ago a punta 36G nello spazio subpiale lombare e / o cervicale. Il vettore AAV9 (3-5 μL; 1,2 x 10 13 copie genomiche (gc)) che codifica la proteina verde fluorescente (GFP) è stato quindi iniettato subpially. Dopo le iniezioni, la funzione neurologica (motoria e sensoriale) è stata valutata periodicamente e gli animali sono stati perfezionati 14 giorni dopo la consegna di AAV9 con 4% di paraformaldeide. L'analisi delle sezioni spinali orizzontali o trasversali ha mostrato un'espressione transgena in tutto il midollo spinale, sia in materia grigia che bianca. Inoltre, l'espressione di GFP mediata retrogradely-mediata è stata osservata negli assoni e nei neuroni del motore discendente nella corteccia del motore, nucleo ruber e formio reticularis. Nessun disfunzione neurologica è stata osservata in tutti gli animali. Questi dati mostrano che la tecnica di somministrazione del vettore subpiale può essere utilizzata con successo in topi adulti, senza causare lesioni del midollo spinale correlate alla procedura ed è associata ad un espresso transgene altamente potenteSione per tutta la neurazzia spinale.

Introduction

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L'uso di vettori AAV per il trattamento di una varietà di disturbi neurodegenerativi del midollo spinale e del CNS sta diventando una piattaforma ben accolta per aumentare o distogliere in modo efficace l'espressione di gene di interesse. Una delle limitazioni fondamentali per l'utilizzo più efficace di questa tecnologia per trattare i disturbi del midollo spinale è la limitata capacità di fornire vettori AAV al cervello profondo o al parenchima del midollo spinale nei mammiferi adulti.

È stato dimostrato, ad esempio, che la somministrazione sistemica di AAV9 nei roditori adulti, nei gatti o nei primati non umani è solo moderatamente efficace nell'indurre l'espressione di transgeni nei neuroni nel cervello e nel midollo spinale 1 , 2 , 3 . Inoltre, è stato dimostrato che l'erogazione intratheca più efficace dei vettori AAV9 porta ad un'espressione limitata di transgeni nelle piscine anatomicamente definite di neuroni. Più in particolare, sono stati demoniLa consegna intratraca AAV9 cisternica o lumbo-sacrale in primati, maiali o roditori non umani porta ad un elevato livello di espressione di transgene nei motonieuronali spinali e nei neuroni gangliari della radice dorsale segmentale. Tuttavia, espressione minima o nessuna espressione di interneuroni spinali o assoni ascendenti o discendenti nella materia bianca è visto 4 , 5 , 6 , 7 . Complessivamente, questi dati mostrano che esiste una barriera biologico-anatomica altamente efficace, che impedisce la diffusione di AAV intrathecalmente erogato in un parenchima spinale più profondo.

In uno studio precedente che ha utilizzato ratti e suini adulti, è stata sviluppata una nuova tecnica di somministrazione del vettore subpiale 8 . Utilizzando questo approccio, è stata dimostrata un'espressione di transgene altamente potente e multi-segmentale dopo la somministrazione sub-AAV9 a singolo bolus. L'espressione intensa di GFP è stata osservata in modo coerenteNei neuroni, nelle cellule gliali e negli assi discendenti / ascendenti attraverso i segmenti spinali iniettati. Questo studio ha dimostrato per la prima volta che il pia mater rappresenta la barriera primaria che limita la diffusione efficace AAV9 nel parenchima spinale dallo spazio intrathecale. Mentre questa tecnica sviluppata in precedenza e il dispositivo di iniezione subpiale è relativamente facile da usare in grandi roditori (come ratti) o suini adulti, il sistema non è adatto per l'uso in piccoli animali, ad esempio adulti. A causa dell'elevato numero di modelli di topi transgenici disponibili di una varietà di disturbi neurodegenerativi, esiste una chiara necessità di sviluppare un'efficace tecnica di erogazione del vettore spinale-parenchimale nei topi. La disponibilità di tale tecnica permetterebbe lo studio dell'effetto di silenziamento specifico del gene ( ad esempio, utilizzando shRNA) o upregulation utilizzando cellule non specifiche ( ad es. Citomegalovirus-CMV o Ubiquitina) o cellule-specifiche ( ad es., Synapsin o glial Fibrillare acidoProteine ​​(GFAP)) durante uno sviluppo postnatale precoce o in condizioni malate.

Di conseguenza, nel presente studio abbiamo sviluppato e convalidato un sistema di somministrazione subpiale in miniatura che può essere effettivamente utilizzato nei topi adulti. Allo stesso modo, come in precedenti studi su ratti e suini, questo lavoro dimostra un'espressione potente di transgene in tutto il parenchima spinale dopo la somministrazione subpiale AAV9 a singolo bolus nei topi. La semplicità di questo approccio, la buona tollerabilità dei topi iniettati alla consegna subpiale AAV9 e l'alta potenza dell'espressione di transgene nel parenchima spinale suggeriscono che questa tecnica può essere effettivamente implementata in qualsiasi ambiente di laboratorio e utilizzata in esperimenti che mirano all'espressione genica spinale.

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Protocol

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Questi studi sono stati eseguiti con un protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della California, San Diego, e sono stati conformi all'Associazione per la valutazione delle linee guida per l'animale da laboratorio per l'uso degli animali. Tutti gli studi sono stati eseguiti in modo da ridurre al minimo le dimensioni del gruppo e le sofferenze degli animali.

1. Preparazione generale degli animali e chirurgici

  1. Prima di iniziare la procedura chirurgica, scongelare il virus (AAV9-UBI-GFP; 5 μL aliquote) 8 . Preparare una soluzione al 5% di dextran (10.000 MW) mescolando la polvere di dextran in acqua distillata. Mescolare la soluzione di virus con soluzione al 5% di dextran 1: 1 ad una concentrazione finale di dextran del 2,5%.
    1. Conservare la soluzione di virus sul ghiaccio (4 ° C).
  2. Usi i topi adulti C57BL / 6J (maschio e femmina, 20-30 g). Anestetizzare i topi usando 5% isoflurano (in O 2 , 1 L / min) e mantenerli a 2-3% isoflurano inalato (in O 2 , 1 L / min) con il cono del naso durante l'intervento chirurgico, a seconda della frequenza respiratoria e della risposta a pizzicotto.
  3. Bagnare la parte posteriore degli animali con tagliatori da barba e pulire la pelle con 2% di clorexidina.
  4. Negli studi di recupero cronico seguire una stretta tecnica sterile.
  5. Se si devono eseguire iniezioni subaliali lombari, tagliare la pelle sovrapponendo le vertebre Th8-L1 con un bisturi e staccare il muscolo paravertebrale dalle vertebre spinale Th10-12 usando le forbici.
    1. Montare l'animale in un telaio stereotatico standard usando i morsetti spinali del mouse.
    2. Rasare entrambi i lati della lamina delle vertebre Th10-12 usando un trapano dentale (bit di trapano: 0,9 mm, velocità: 20.000 giri / min) finché non appaiono crepe.
    3. Rimuovere i frammenti ossei crepati con le pinze e esporre la superficie dorsale del midollo spinale lombare.
    4. Tagliare la dura circa 1 cm utilizzando un ago in acciaio inossidabile da 30 G e pinze.
  6. Rimuovere la membrana atlanto-occipitale della cisterna magna usando un ago e pinze in acciaio inox 23G.
  7. Pulire il sito di incisione di qualsiasi tessuto e residui di ossa utilizzando tamponi di cotone.
  8. Tagliare il duro circa 2-3 mm utilizzando un ago in acciaio inossidabile da 30 G e pinze.

2. Apertura della membrana pialla e inserimento dell'ago secondario per la consegna AAV9

  1. Montare l'ago penetrante 34 g nel braccio Z di un manipolatore XYZ usando un porta-capillare in vetro ( Figura 1A e B ).
    NOTA: Per produrre l'ago penetrante, la punta smussata originale dell'ago 34G viene affilata usando un piattello capillare in vetro con piastra abrasiva diamantata - grossolani (da 5,0 a 50 μm) e angolo di macinazione15 - 20 °. La punta dell'ago (lunghezza da 1 mm, misurata dalla punta) è quindi leggermente piegata a circa 90 ° ( figura 1B , inserto sinistro).
  2. Utilizzando un campo di dissezione chirurgico, impostato su 8-10 ingrandimenti X, penetrare nel pia con l'ago penetrante da circa 1 mm ( figura 1C ) usando il braccio X.
    1. Tenere l'angolo dell'ago penetrante alla superficie del tessuto a 5-10 °.
  3. Dopo l'apertura del piede, rimuovere l'ago penetrante orizzontalmente dallo spazio subpiale ( Figura 1 D) utilizzando il braccio X.
    NOTA: Ricorda il sito penetrato da un punto di riferimento, come un vaso sanguigno.
  4. Caricare un ago iniettabile a 36G con il virus AAV9-UBI-GFP usando una microsiringa da 50 μl connessa all'ago iniettore con tubi PE-10 o PE-20.
  5. Montare l'ago nel braccio Z di un secondo manipolatore XYZ ( Figura 1A B ) utilizzando un supporto capillare in vetro ( figura 1B , inserimento destro).
    NOTA: Per produrre l'ago ad iniezione subpiale AAV9, la punta aperta di un ago da 36 G viene lucidata utilizzando un piattello capillare in vetro con piastra abrasiva diamanti - grossi (da 5,0 a 50 μm) per rimuovere i bordi taglienti. La punta dell'ago (lunghezza da 2-3 mm, misurata dalla punta) viene quindi dolcemente piegata a circa 90 °. Gli aghi di iniezione penetranti e subpiali vengono inseriti in tubi in acciaio inossidabile da 20 g di 20 cm di lunghezza 1-2 cm (10 mm dalla fine dell'ago) e incollati con epossidica. L'impiego di tubi da 20 G (diametro 0,91 mm) è necessario per un fissaggio sicuro al porta capillare in vetro.
  6. Maneggiando i bracci X, Y e Z del secondo manipolatore, posizionare la punta dell'ago iniezione AAV9 nel sito penetrato dal piombo e quindi avanzare di circa 2-3 mm nello spazio subpiale attraverso la precedente apertura della membrana del piolo utilizzando il X-braccio( Figura 1E e F ).
    NOTA: 1) L'AAV9-UBI-GFP è preparato secondo protocolli precedentemente riportati 9, 10, ei titoli finali vengono regolati a 1,2 x 10 13 copie di genoma per ml (GC / mL). 2) Non è necessario segnare il sito dell'apertura del piolo perché è facilmente identificabile ( Figura 1D ).
  7. Iniettare l'AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 o 5 μL) nello spazio subpiale usando una microsiringa da 50 μL (vedere tabella 1 per gruppi sperimentali).
  8. Rimuovere l'ago di iniezione dallo spazio subpiale dopo che l'iniezione AAV9-UBI-GFP è completa.
  9. Chiudere il muscolo e la pelle usando la sutura monofilamento 4,0 e le clip chirurgiche.
    NOTA: Non è necessario sigillare la vertebra aperta.
  10. Lasciare riposare gli animali su un tappetino.
  11. Per il controllo del dolore iniettare Buprenorfina 0,05 mg / kg / sc ogni 12 ore per2-3 giorni dopo la chirurgia.

3. Fusione di perfusione, Cryoprotection del tessuto e colorazione dell'immunofluorescenza

  1. A un punto di tempo predeterminato dopo le iniezioni subpial AAV9, profondamente anestetizzano i topi con soluzione di eutanasia (vedere la tabella dei materiali , 0,3 ml) e li perfusione transcardialmente con 20 ml di salina eparinizzata seguita da 20 ml di 4% di paraformaldeide in PBS.
  2. Disseccare i cavi e i cervelli spinali usando un osso rungare e post-fissarli in 4% di formaldeide in PBS durante la notte a 4 ° C.
  3. Cryoprotect le corde spinali e il cervello con 30% di saccarosio in PBS per un minimo di 5-7 giorni.
  4. Tagliare le sezioni congelate coronali, trasversali o longitudinali / orizzontali (30 μm di spessore) su un criostato e memorizzarle in PBS a 4 ° C.

4. La colorazione immunofluorescenza delle sezioni del cavo spinale e del cervello (vedi tabella dei materiali)

  1. Incubare le sezioni galleggianti libere in primariaY anticorpi durante la notte.
  2. Dopo l'incubazione con anticorpi primari, lavare le sezioni tre volte in PBS e incubare con anticorpi anti-coniglio, anti-pollo d'asino e asina anti-capra.
  3. Montare le sezioni sulle diapositive a microscopio, asciugarle a temperatura ambiente e coprirle con un mezzo antifumo.
  4. Cattura immagini utilizzando microscopio a fluorescenza epifluorescenza (obiettivi: 10X, NA-0.3; 20X, NA-0.8; e 63X, NA-1.4).

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Representative Results

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Potente espressione di transgene nei segmenti iniettati Subpially AAV9:
L'analisi dell'espressione di transgene (GFP) nelle sezioni del midollo spinale a 14 giorni dopo la somministrazione di AAV9 ha mostrato un'espressione GFP dipendente dalla dose di AAV9 in tutto il parenchima spinale. In primo luogo, due iniezioni bilaterali di 3 μL di AAV9-UBI-GFP iniettate nello spazio subpiale lombare superiore sono state associate all'infezione quasi completa della materia bianca e grigia in tutto il midollo spinale lombare, estendendosi ai segmenti toracici superiori ( Figura 2A E 2B , colonne di sinistra e mezza). Due iniezioni bilaterali di 1,5 μL di AAV9-UBI-GFP nello spazio subpiale lombare superiore erano associate ad una simile infezione quasi completa della materia bianca e grigia in tutto il midollo spinale lombare (come visto dopo le iniezioni di 3 μL); Tuttavia, i segmenti mid-toracici mostravano solo alcuni neuroni infetti (Ass = "xfig"> Figura 2B, colonna di destra). La colorazione con anticorpi specifici α-motoneuron-specifici (ChAT) e neuron-specifici (NeuN) ha mostrato un'espressione costante di GFP in tutta la popolazione di α-motoneuroni lombari ( Figura 2C ) e interneuroni localizzati nel corno dorsale ( Figura 2D ) Figura 2E ), e corno ventrale ( Figura 2F ). In secondo luogo, due iniezioni cervicali bilaterali di AAV9 (5 μL per ogni iniezione) hanno determinato un'espressione GFP simile nella materia bianca e grigia in tutto il midollo spinale cervicale (grigio e bianco) e nei segmenti toracici superiori ( Figura 3A e 3B ) . L'analisi delle sezioni del midollo spinale lombare negli stessi animali ha mostrato un'elevata densità di assoni discendenti di GFP + terminanti in prossimità delle α-motoneuroni e interneuroni negativi GFP-lombari ( Figura 3CE 3D ). La somministrazione di due iniezioni lombari bilaterali bilaterali di AAV9 (5 μL per ogni iniezione) è stata associata all'espressione di GFP in tutto il midollo spinale, dai segmenti superiori della cervice a quella sacrale ed è stata omogeneamente presente nella materia bianca e grigia ( Figura 3E- 3H ).

Espressione del transgene retrogrado e anterogrado nel trasporto nei centri superspinalici e sensoriali:
L'espressione diffusa del GFP nel midollo spinale lombare o cervicale dopo la somministrazione subpiale AAV9 è stata associata a una positività robusta di GFP mediata dall'infrazione retrograda e anterogena negli assi discendenti sovraspinali e nei loro neuroni sporgenti e negli assi e nei terminali dei tratti ascendenti ( Figura 4 ). Pertanto, una positività intensa di GFP è stata osservata nei neuroni localizzati nella formazione reticolare (RF), Nucleo ruber (NR) e corteccia motore (MC) ( Figura 4B- 4D ). Analogamente, è stata osservata un'immunoreattività reattiva di GFP nei terminali dei tratti spinocerebellari (SCT), spinoreticolari e spinotalamici (STT) ( Figura 4B- 4D ).

Figura 1
Figura 1 : Impostazione sperimentale per eseguire iniezioni subpiali spinali in un mouse adulto. ( A ) Per eseguire iniezioni subpiali spinali in topi adulti, vengono utilizzati due manipolatori XYZ separati (I e II). ( B ) Il braccio Z di ogni manipolatore contiene un portacampione di vetro. Un porta capillare tiene l'ago penetrante 34 g e la seconda contiene l'ago ad iniezione sottile 36 G. ( C , D , E e F) Immagini raffiguranti la posizione dell'ago pia-penetrazione subito dopo la puntura pia (C; dura madre è già stato rimosso), dopo la rimozione del pia-penetrante dell'ago (D), dopo l'inserimento della punta dell'ago iniezione sottopiale ( E ) e dopo aver avanzato l'ago di iniezione subpiale 3 mm nello spazio subpiale ( F ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2 : Potente espressione GFP parenchimale spinale dopo somministrazione subpiale lombare AAV9-UBI-GFP Consegna nei topi adulti. ( A ) Due iniezioni bilaterali di AAV9-UBI-GFP (1,5 o 3 μl iniezioni ciascuna) sono state consegnate nei lombari superioriLo spazio umpial e gli animali sono stati perfusi-fissati 14 giorni dopo la consegna di AAV9. ( B ) L'espressione intensa di GFP nel grigio (all'interno della zona punteggiata) e la materia bianca, che si estende dal lombare ai segmenti toracici superiori, può essere osservata in animali iniettati con 3 + 3 μL di AAV9 (colonne di sinistra e mezza). ( C, D, E e F ) La co-colorazione delle sezioni trasversali del midollo spinale prelevata dall'allargamento lombare in animali iniettati con 3 + 3 μL di AAV9 mostra l'espressione di GFP in quasi tutti i marker ChAT (a-motoneuron marker) Motoneuroni ( C e F ) e interneuroni NeuN positivi nel corno dorsale ( D ) e nella zona intermedia ( E ). Barre di scala = 1000 μm (B); 30 μm (C); 100 μm (DF). DH: corno dorsale; LV: lamina V; VH: corno ventrale. Clicca qui per vedere un ve più grandeRsion di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Confronto di Spinal Espressione GFP Dopo spinale cervicale subpiale Versus spinale cervicale subpiale più subpiale lombare AAV9-UBI-GFP Consegna in topi adulti. ( A, B, C e D ) Sezione orizzontale tagliata per tutta la lunghezza del midollo spinale in un animale che in precedenza aveva ricevuto iniezioni subpiali cervicali superiori di AAV9-UBI-GFP (5 + 5 μL). Si può vedere un'espressione intensa di GFP nella materia bianca e grigia nella regione cervicale ( B ). Nel cordone spinale lombare si possono individuare un'elevata densità di assoni discendenti GFP + nel funiculus laterale (LF) e la materia grigia tra neuroni negativi NeuN positivi ma GFP ( C e D ). ( E, F, G e H Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4 Rong>: Potente retrogrado e Anterograde espressione GFP mediata da AAV9-UBI-GFP in centri ausiliari e sensoriali. ( A ) Un'immagine a basso potere che raffigura la presenza di una positività intensa di GFP nel midollo spinale cervicale, oblungata midollare, cervelletto e corteccia motoria (MC). ( B ) Un'immagine più potente prelevata da una sezione sagittale del cervello e mostrando la presenza di fluorescenza GFP nei neuroni nella formazione reticolare (RF), nel nucleo ruber (NR) e negli assoni del tratto spin-cerebellare (SCT). ( C ) Un'immagine a basso potere prelevata da sezioni coronali del cervello che mostrano la presenza di fluorescenza GFP nei neuroni piramidali nella corteccia del motore (MC) e nei terminali del tratto spinotalamico in aree del nucleo thalamic reticolare (STT). ( D ) Un'immagine ad alta potenza che dimostra un'espressione intensa di GFP nei neuroni piramidali nella corteccia del motore. Barre di scala = 2.000 μm (A); 1.000 μm (B e C); 60 μm (D).Csource.jove.com/files/ftp_upload/55770/55770fig4large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gruppi sperimentali Sito / livello di consegna AAV9 (*) Volume dell'infezione AAV9, tasso di infusione Tempo di sopravvivenza Analisi del tessuto
Gruppo A (n = 7) C2 (bilaterale) 5 μL / 5 min 14 giorni Cervello + midollo spinale
Gruppo B (n = 12) L1-L2 (bilaterale) 1,5 μL o 3μL, 60 sec / μL 14 giorni Cervello + midollo spinale
Gruppo C (n = 6) C2 + L1-L2 (bilaterale ad ogni livello) 5 μL / 5 min 14 giorni Midollo spinale
* - bilaterale= Due iniezioni subpialiane che vengono erogate a destra e uno a quello subpiale sinistro dei segmenti iniettati.

Tabella 1: Gruppi sperimentali. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in topi adulti C57BL / 6J.

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Discussion

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Lo studio in corso descrive una tecnica di somministrazione subpiale (AAV9) in topi adulti. Come dimostrato nel video di accompagnamento, questo approccio e tecnica possono essere utilizzati in modo efficace, a condizione che gli strumenti necessari e l'ago a penetrazione del piombo e dell'iniettore subpiale siano correttamente fabbricati, secondo le specifiche stabilite e testate.

Variabili tecniche critiche nell'esecuzione di un'iniezione sottomessa consistente e sicura nei topi:
Come dimostrato, una iniezione subpiale può essere facilmente eseguita in topi anestetici adulti dopo una laminectomia dorsale cervicale o lombare. Ci sono diverse variabili tecniche critiche che definiscono il successo della tecnica di iniezione subpiale. Innanzitutto, la punta dell'ago penetrante di 34 G deve essere affilata costantemente utilizzando un piattello per assicurare la foratura liscia del piatto. Qualsiasi incongruenza nella tecnica di affilatura dell'ago può portare a difficuDurante la penetrazione di pia e / o può causare lesioni spinali usando troppa forza per forare il pia. Nelle circostanze normali (come mostrato nel video e in Figura 1C e D ), il sito dell'apertura di pia non mostra alcun segno di lesione del midollo spinale o sanguinamento subpiale. In alcuni casi si può vedere qualche emorragia subpiale, ma questo non è stato associato con disfunzione neurologica o alterazione dell'espressione genica dopo la consegna di AAV9. In secondo luogo, è importante mantenere il sito chirurgico esente da sangue dopo che la dura viene rimossa usando l'elettrochirurgia. Qualunque residuo di sangue macchiato può oscurare l'identificazione affidabile della superficie piana, anche se viene utilizzato un microscopio chirurgico. Come mostrato nella Figura 1C-F , un sito di laminactomia sanguigna può essere effettivamente mantenuto usando piccoli pezzi di gel-schiuma per coprire la vertebra laminamitica e il tessuto molle circostante. In terzo luogo, occorre prestare particolare attenzione al corretto posizionamento degli animali anestetizzati nellaTelaio spinale e all'immobilizzazione della colonna vertebrale mediante morsetti spinali. Usando troppa pressione durante il posizionamento delle pinze spinali può causare rottura vertebrale; Usando una pressione insufficiente può portare ad una progressiva allentamento della vertebra immobilizzata, che avviene in genere quando una trivella dentale viene utilizzata per eseguire la laminatteria.

Il volume di AAV9 subpially iniettato è correlato alla grandezza dell'espressione di transgene rostro-caudale. Pertanto, l'uso di due iniezioni lombari bilaterali subpial AAV9 (3 + 3 μL o 5 + 5 μL) è stato associato all'espressione costante di GFP in tutta la grigia lombare e la materia bianca, estendendosi fino ai segmenti toracici superiori. C'è stata una variabilità minima per gli animali utilizzati. I volumi di iniezione AAV9 di 1,5 + 1,5 μl hanno portato ad un'espressione simile di GFP nei segmenti localizzati nelle vicinanze di iniezioni; Tuttavia, la diffusione del virus e l'espressione risultante del GFP erano limitate nei segmenti toracici (

Limitazione della tecnica di somministrazione del gene subpiale:
Una delle limitazioni relative della tecnica di iniezione subpiale (rispetto alla consegna intrateleale) è la natura più invasiva di questo approccio quando si deve eseguire una laminectomia dorsale per consentire l'accesso alla superficie dorsale del midollo spinale. Tuttavia, la potente espressione transgena osservata in tutto il midollo spinale e nei centri cerebrali supraspinal sembra dimostrare il chiaro vantaggio rispetto alla consegna intratraca AAV, caratterizzata da espressione selettiva di transgene in una sottopopolazione di α-motoneuroni e di afferenti primarie (ma non presente Nei neuroni nelle lamelle più profonde del midollo spinale) 8 .

Applicazioni future dei SubpiTecnica di consegna di al gene:
Analogamente, come dimostrato negli studi precedenti in ratti e suini adulti, l'espressione di transgene altamente efficace può essere ottenuta nella materia spinale bianca e grigia nei topi adulti usando la somministrazione subpiale AAV9. Inoltre, a causa delle dimensioni relativamente più piccole (in particolare della lunghezza) del midollo spinale del mouse, la consegna di AAV9 a soli due livelli del midollo spinale (cervicale superiore e superiore lombare) è sufficiente a portare a quasi completa infezione del midollo spinale. Questa caratteristica può avere un'importante implicazione nella progettazione di approcci specifici di trattamento che modificano la malattia da un silenziamento genico mirato o da un upregulation.

Ad esempio, utilizzando vasi di silenziamento shRNA, si prevede che una diminuzione altamente efficace nell'espressione di geni mutati ( ad es., SOD nel caso della forma ereditaria di ALS) sarà raggiunta per tutto il midollo spinale come pure in spinale -progetto dei nuclei del cervello. Secondo,A causa dell'infezione altamente efficace degli assoni della materia bianca spinale, i geni terapeutici ( ad es., I fattori di crescita codificanti) possono essere regolati per promuovere l'espansione assonale in animali feriti da trauma spinale. In terzo luogo, manipolando il volume o il titolo del virus somministrato subpiamente, nonché il sito di iniezione subpiale, l'espressione del transgene può essere mirata ad una regione discreta del midollo spinale ( ad esempio, il corno dorsale unilaterale). L'espressione di transgene localizzata può essere potenzialmente impiegata nel trattamento del dolore o nel modificare la spasticità muscolare mediante l'aumento dei sistemi neurotrasmettitori inibitori ( ad esempio, GABA) o l'inibizione di sistemi eccitatori ( ad es . Il sistema di recettori associato al glutammato). Quarto, oltre alla consegna di AAV, altre molecole o vettori con una scarsa permeabilità della barriera emato-sangue ( ad es. Micro RNA) saranno probabilmente più efficaci nel parenchima spinale dopo la somministrazione subpiale. Questi possono essere effettivamente testati da usinLa tecnica descritta in questo manoscritto. Infine, come dimostrato nello studio attuale, la tecnica subpiale può essere usata con successo in topi adulti con peso corporeo medio (BW) compreso tra 20 e 30 g. Pertanto, è probabile che la stessa tecnica e la configurazione sperimentale possano essere impiegate in altre specie animali con simili BW ( ad esempio, cuccioli di ratto di Sprague-Dawley (SD)). Il BW di P6 e P21 SD ratti è rispettivamente di 17 e 62 g. L'utilizzo dei cuccioli di ratto durante la fase iniziale dello sviluppo post-natalizio può essere uno strumento utile per studiare il ruolo di regolazione specifica o ridotta del gene nello sviluppo di circuiti neurali spinali e di processi sensoriali e motori.

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Disclosures

Martin Marsala è co-fondatore di Neurgain Technologies, Inc. (San Diego, USA).

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione della Fondazione SANPORC e ​​ALSA (Martin Marsala); Il Programma Nazionale di Sostenibilità, numero di progetto LO1609 (Ministero della Pubblica Istruzione, Gioventù e Sport); E RVO: 67985904 (Stefan Juhas e Jana Juhasova).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J Mice Jackson Labs 664
Lab Standard Stereotaxic for Mice Harvard Apparatus 72-9568
Mouse Spinal Adaptor Harvard Apparatus 72-4811
XYZ Manipulator Stoelting 51604
Manual Infusion Pump Stoelting 51218
34G Beveled Nanofill Needle World Precision Instruments NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle World Precision Instruments NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane MWI Veterinary Supply 502017
Chlorhexidine Solution MWI Veterinary Supply 501027
20G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305175
23G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305145
30G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305128
Cotton Tipped Applicator MWI Veterinary Supply 27426
Glass Capillary Beveller  Narishige International SM-25B
Slide Microscope Superfrost Leica Microsystems M80
50 μL Microsyringe  Hamilton 81242
BD Intramedic PE-20 Tubing Becton, Dickinson 427406
BD Intramedic PE-10 Tubing Becton, Dickinson 427401
4-0 monofilament suture VetOne V1D397
Glass Capillary Beveller  Narishige Pipet Micro Grinder EG-40 
5 min Epoxy (Epoxy Clear) Devcon 14310
Euthanasia Solution MWI Veterinary Supply 11168
Heparin Inj 1,000 U/mL MWI Veterinary Supply 54254
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Anti NeuN Antibody EMD-Millipore ABN78 Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody EMD-Millipore AB144P Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody Aves Labs GFP-1020 Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A21207 Secondary Antibody, 1:1000
 Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 ThermoFisher Scientific A10043 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Jackson Immunoresearch Labs 703-545-155 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 Abcam ab150131 Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost Fisher Scientific 12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant Fisher Scientific P36930
Epifluorescence Microscope Zeiss Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope Olympus Olympus FV1000
Dextran Polysciences, Inc 19411
AAV9-UBC-GFP UCSD Viral Vector Core Laboratory

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References

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Subito Adeno associato Virus 9 (AAV9) Consegna vettoriale nei topi adulti
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Tadokoro, T., Miyanohara, A., Navarro, M., Kamizato, K., Juhas, S., Juhasova, J., Marsala, S., Platoshyn, O., Curtis, E., Gabel, B., Ciacci, J., Lukacova, N., Bimbova, K., Marsala, M. Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice. J. Vis. Exp. (125), e55770, doi:10.3791/55770 (2017).More

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