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Neuroscience

성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달

doi: 10.3791/55770 Published: July 13, 2017

Summary

본 연구의 목적은 성인 생쥐에서 새로운 subpial 유전자 전달 기술을 사용하여 척수 adeno-associated virus 9 (AAV9) 매개 유전자 전달의 효능과 안전성을 개발하고 검증하는 것이었다.

Abstract

성인 래트 및 돼지에서 아포 - 관련 바이러스 9 (AAV9) 벡터 전달 기술의 성공적 개발이 이전에보고되었다. AAV9 전달을 위해 subpially-placed 폴리에틸렌 카테터 (PE-10 또는 PE-5)를 사용하여, subpially-injection 척추 분절에서 척수 실질 (흰색 및 회색 물질)를 통한 강력한 형질 도입 유전자 발현이 입증되었습니다. 신경 퇴행성 질환의 광범위한 형질 전환 마우스 모델 때문에 성인 마우스에서 강력한 중추 신경계 (CNS) 표적화 된 벡터 전달 기술의 개발에 대한 강한 열망이 있습니다. 따라서, 본 연구는 성인 C57BL / 6J 마우스에서 안전하고 효과적인 척추 AAV9 전달을 허용하는 척추의 서브 벡터 전달 장치 및 기술의 개발을 기술한다. 척추 고정 및 마취 마우스에서, 피임 장치 (자궁 경부 1 및 척추 1-2 척수 분절 수준)를 XYZ 조작기를 사용하여 날카로운 34G 바늘로 절개 하였다. 두 번째 XYZ manipulator는 그 다음에 둔감한 36G 바늘을 요추 및 / 또는 자궁 경부 지방 공간으로 전진시키는 데 사용되었습니다. 녹색 형광 단백질 (GFP)을 인코딩 AAV9 벡터 (3-5 μL, 1.2 X 10 13 게놈 복사 (gc)) subpially 다음 주입되었다. 주사 후, 신경 학적 기능 (운동 및 감각)을 주기적으로 평가하고, 4 % 파라 포름 알데히드로 AAV9 전달 후 동물을 관류 고정시켰다. 수평 또는 횡단 척수 절편의 분석은 회색 및 흰 물질 모두에서 전체 척수를 통한 전이 유전자 발현을 보였다. 또한, 심한 역행위 매개 GFP 발현은 운동 피질, 핵 ruber, 및 formio reticularis에 내림차순 모터 축삭과 뉴런에서 보였다. 어떤 동물에서도 신경 학적 장애는 관찰되지 않았다. 이 데이터는 대식 성 벡터 전달 기술이 프로 시저 관련 척수 손상을 일으키지 않으면 서 성숙한 생쥐에서 성공적으로 사용될 수 있고 매우 강력한 전이 유전자 발현과 관련이 있음을 보여줍니다척추 신경근을 통한 시온.

Introduction

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다양한 척수 및 CNS 신경 퇴행성 질환을 치료하기위한 AAV 벡터의 사용은 관심 유전자의 발현을 효과적으로 상향 조절하거나 침묵시키는 잘 받아 들여지는 플랫폼이되고있다. CNS / 척수 장애를 치료하기위한이 기술의보다 효과적인 활용에 대한 주요 제한 사항 중 하나는 성인 포유류의 심부 뇌 또는 척수 실질에 AAV 벡터를 전달하는 능력이 제한적이라는 것입니다.

그것은 성인 쥐, 고양이, 또는 인간이 아닌 영장류에서 AAV9의 전신 배달 뇌와 척수 1, 2, 3의 신경 세포에서 유전자의 발현을 유도에서만 적당히 효과가 있음을 예를 들어 설명되었다. 해부학 적으로 정의 된 뉴런 풀에서 제한된 도입 유전자 발현만을 유도하는 것으로 AAV9 벡터의보다 효과적인 척수강 내 전달이 또한 나타났다. 더 구체적으로, 그것은 악마들이었습니다.비인간 영장류, 돼지 또는 설치류에서 cisternal 또는 lumbo-sacral intrathecal AAV9 전달이 척수 α 운동 신경 세포 및 분절 지느러미 뿌리 신경절 뉴런에서 높은 수준의 전이 유전자 발현을 유도한다. 그러나 척추 신경 계통 또는 백질의 오름차순 또는 내림차순 축삭에서는 최소한 또는 전혀 발현이 4 , 5 , 6 , 7로 나타난다. 종합적으로, 이러한 데이터는 매우 효과적인 생물학적 - 해부학 적 장벽이 존재한다는 것을 보여 주며, 척수 내에서 전달 된 AAV가 더 깊은 척추 실질로 확산되는 것을 방지합니다.

성인 쥐와 돼지를 사용하여 이전 연구에서 새로운 subpial 벡터 전달 기술은 8 개발되었다. 이 접근법을 사용하여 single-bolus subpial AAV9 전달 후 매우 강력하고 다 분절 형질 전환 유전자 발현이 입증되었습니다. 강렬한 GFP 발현이 지속적으로 나타남교감 신경절 세포, 신경 교세포, 하강 / 상행 축삭에서 주입 된 척추 분절을 통해 관찰되었다. 이 연구는 피 아게트가 척수 실질 내로의 효과적인 AAV9 확산을 막을 수있는 주요 장벽임을 나타냈다. 이 이전에 개발 된 기술과 subpial 주입 장치는 대형 설치류 (쥐와 같은) 또는 성인 돼지에서 비교적 사용하기 쉽지만,이 시스템은 성인 마우스와 같은 작은 동물에서 사용하기에 적합하지 않습니다. 다양한 신경 퇴행성 장애의 이용 가능한 트랜스 제닉 마우스 모델이 매우 많기 때문에, 마우스에서 효과적인 척추 - 실질 세포 전달 기술의 개발이 분명한 필요성이있다. 이러한 기술의 이용 가능성은 세포 비 특이성 ( 예, 사이토 메갈로 바이러스 -MVV 또는 유비퀴틴) 또는 세포 특이 적 ( 예, 시냅스 또는 글라 이알)을 사용하는 특정 유전자 사일런 싱 ( 예 : shRNA 사용) 또는 상향 조절의 효과를 연구 할 수있다 섬유 성 산성단백질 (GFAP)) 프로모터를 포함한다.

따라서, 현재 연구에서, 우리는 성인 생쥐에서 효과적으로 사용할 수있는 소형 subpial 벡터 전달 시스템을 개발하고 검증했다. 유사하게, 이전의 쥐 및 돼지 연구에서와 마찬가지로,이 연구는 쥐에서 단일 - 볼 러스 서브 피알 AAV9 전달 후 척수 실질 전반에 걸쳐 강력한 전이 유전자 발현을 입증한다. 이 접근법의 단순성, subpial AAV9 전달에 주입 된 마우스의 아주 좋은 내성 및 척수 실질에서의 형질 전환 유전자 발현의 높은 효능은이 기술이 실험실 환경에서 효과적으로 수행되고 척추 유전자 발현을 목표로하는 실험에 사용됨을 시사한다.

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Protocol

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이 연구는 샌디에고 캘리포니아 대학의 동물 동물 보호 및 사용위원회의 승인을받은 프로토콜에 따라 수행되었으며 동물 실험을위한 실험실 동물 관리 지침 평가 협회를 준수했습니다. 모든 연구는 집단 크기와 동물의 고통을 최소화하는 방식으로 수행되었다.

1. 일반 동물 및 외과 준비

  1. 수술 절차를 시작하기 전에 바이러스 (AAV9 - UBI - GFP, 5 μL aliquots) 8 해동. 덱스 트란 분말을 증류수에 혼합하여 5 % 덱스 트란 (10,000 MW) 용액을 준비한다. 바이러스 용액을 5 % 덱스 트란 용액 1 : 1과 혼합하여 최종 덱스 트란 농도 2.5 %로 만든다.
    1. 바이러스 용액을 얼음에 보관하십시오 (4 ° C).
  2. 성인 C57BL / 6J 마우스 (남녀, 20-30 g)를 사용하십시오. 5 % isoflurane (O 2 , 1 L / 분)을 사용하여 마우스를 마취하고 2 에서 그들을 유지호흡 률과 발의 협착 정도에 따라 3 % 흡입 한 isoflurane (O 2 , 1 L / min).
  3. 면도 면도기로 동물의 등을 면도하고 2 % chlorhexidine으로 피부를 닦으십시오.
  4. 만성 회복 연구에서 엄격한 무균 기술을 따릅니다.
  5. 요추 subpial 주사가 수행되어야하는 경우, 메스로 Th8 - L1 척추를 덮고 Tha - 12 척추에서 paravertebral 근육을 분리 피부를 잘라 가위를 사용합니다.
    1. 마우스 척추 클램프를 사용하여 표준 stereotaxic 프레임에 동물을 탑재하십시오.
    2. 균열이 나타날 때까지 치과 용 드릴 (드릴 비트 : 0.9mm, 속도 : 20,000rpm)을 사용하여 Th10-12 척추의 얇은 판의 양 측면을 면도하십시오.
    3. 포셉로 금이 간 뼈 조각을 제거하고 요추 척수의 척수 표면을 노출.
    4. 30G 스테인레스 스틸 바늘과 포셉을 사용하여 약 1cm의 경질 뚜껑을 자르십시오.
  6. 23G 스테인레스 스틸 바늘과 집게를 사용하여 cisterna magna의 atlanto-occipital 막을 제거합니다.
  7. 면봉으로 조직 및 뼈 파편의 절개 부위를 닦으십시오.
  8. 30G 스테인레스 스틸 바늘과 포셉을 사용하여 약 2 ~ 3mm의 경질 뚜껑을 자르십시오.

2. Pial Membrane을 열고 AAV9 Delivery를위한 Subpial Needle 삽입

  1. 유리 모세관 홀더 ( 그림 1AB )를 사용하여 XYZ 조작기의 Z-arm에 34G 피아 관통 바늘을 장착합니다.
    참고 : 피어 침투 바늘을 제조하려면 34G 바늘의 원래 경 사진 팁을 다이아몬드 연마 판이있는 유리 모세관 베벨러 (거친 모서리 크기 (5.0 μm ~ 50 μm 팁 크기) 및 연삭 각도)로 날카롭게합니다.15 - 20 °. 바늘 끝 (길이 1mm, 끝에서부터 측정)은 약 90 °로 부드럽게 구부립니다 ( 그림 1B , 왼쪽 삽입).
  2. 8-10 X 배율로 설정된 외과 해부 범위를 사용하여 피아 관통 바늘로 X 암을 사용하여 약 1 mm ( 그림 1C )로 피어를 관통시킵니다.
    1. 5 ~ 10 °의 조직 표면에 침투하는 바늘의 각도를 유지하십시오.
  3. pia가 열린 후, X-arm을 사용하여 관 공 공간 ( 그림 1 D)에서 피아 관통 바늘을 수평으로 제거합니다.
    참고 : 관통 된 부위는 혈관과 같은 랜드 마크로 기억하십시오.
  4. PE - 10 또는 PE - 20 튜빙과 주사 바늘에 연결된 50 μL microsyringe를 사용하여 AAV9 - UBI - GFP 바이러스와 무딘 36G 주사 바늘을로드합니다.
  5. 두 번째 XYZ 조작기의 Z- 아암에 바늘을 장착하십시오 ( 그림 1A B )를 유리 모세관 홀더 ( 그림 1B , 오른쪽 삽입물)를 사용하여 제거합니다.
    참고 : subpial AAV9 주사 바늘을 제조하려면 36G 바늘의 둔각 팁을 다이아몬드 연마 판이있는 유리 모세관 베벨러 (거친 모서리 (5.0 μm ~ 50 μm 팁 크기))로 닦아서 날카로운 모서리를 제거합니다. 바늘 끝 (2-3 mm 길이, 끝에서부터 측정)을 약 90 °로 부드럽게 구부립니다. pia-penetrating 및 subpial 주입 바늘은 1-2cm 길이의 20G 슬레이브 스테인레스 스틸 튜브 (바늘 끝에서 10mm)에 삽입하고 에폭시로 붙입니다. 유리 모세관 홀더에 안전하게 부착하려면 20G (직경 0.91mm) 튜빙을 사용해야합니다.
  6. 두 번째 매니퓰레이터의 X, Y 및 Z 암을 조작하여 AAV9 주사 바늘의 팁을 피아 삽입 부위에 위치시킨 다음 이전의 pial 멤브레인 구멍을 통해 약 2 ~ 3mm 정도를 엑스 팔( 도 1EF ).
    참고 : 1) AAV9-UBI-GFP는 이전에보고 된 프로토콜 9 , 10 에 따라 준비되고 최종 역가는 1.2 x 10 13 게놈 복사 / mL (gc / mL)로 조정됩니다. 2) 쉽게 확인할 수 있기 때문에 병 입구의 위치를 ​​표시 할 필요가 없습니다 ( 그림 1D ).
  7. 50 μL microsyringe를 사용하여 AAV9 - UBI - GFP (1.5, 3 또는 5 μL)를 subpial 공간에 주입하십시오 (실험 그룹에 대해서는 표 1 참조).
  8. AAV9 - UBI - GFP 주입이 완료되면 subpial 공간에서 주사 바늘을 제거합니다.
  9. 4.0 모노 필라멘트 봉합사와 외과 용 클립을 사용하여 근육과 피부를 닫습니다.
    참고 : 열린 척추를 봉할 필요가 없습니다.
  10. 동물이 가열 패드에서 회복되도록하십시오.
  11. 통증 조절을 위해 Buprenorphine 0.05 mg / kg / sc을 12 시간마다 주사하십시오.수술 후 2 ~ 3 일.

3. 관류 고정, 조직 Cryoprotection 및 Immunofluorescence 얼룩

  1. subpial AAV9 주사 후 미리 정해진 시점에서, 안락사 솔루션 ( 재료 참조, 0.3 ML)과 transecially 20 ML heparinized 생리 식염수와 PBS에서 4 % paraformaldehyde 20 ML 다음으로 그들을 쥐를 깊이 마취.
  2. 뼈 rongeur를 사용하여 척수와 두뇌를 해부하고 4 ° C에서 밤새 PBS에 4 % 포름 알데히드에서 사후 수정.
  3. 최소 5-7 일 동안 PBS에 30 % 자당으로 척수와 뇌를 동결 보관하십시오.
  4. 저온 유지 장치 (cryostat)에서 코로 날, 횡단 또는 세로 / 가로 동결 절편 (30 μm 두께)을 잘라내어 PBS 4 ° C에 보관하십시오.

4. 척수 및 뇌 절편의 면역 형광 염색 (표 참조)

  1. 자유롭게 떠 다니는 섹션을 primar로 배양하십시오.y 항체를 하룻밤.
  2. 일차 항체와 부화 후, PBS에서 세 번 섹션을 씻어 형광 결합 당나귀 안티 토끼, 당나귀 안티 치킨, 그리고 당나귀 안티 염소 보조 항체와 함께 품어.
  3. 현미경 슬라이드에 섹션을 마운트, 상온에서 건조하고, 안티 페이드 매체로 그들을 커버.
  4. epifluorescence 형광 현미경 (목표 : 10X, NA-0.3, 20X, NA-0.8 및 63X, NA-1.4)를 사용하여 이미지를 캡처하십시오.

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Representative Results

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하위 AAV9 주사 분획에서의 강력한 전이 유전자 발현 :
AAV9 전달 후 14 일째 척수 절편에서 transgene (GFP) 발현을 분석 한 결과, 척수 실질 전반에 AAV9- 의존성 GFP 발현이 나타났다. 첫째, 요추 하부 공간에 주입 된 AAV9-UBI-GFP의 2 회 양측 3 μL 주사는 전체 흉추 부위의 백색 및 회색 물질의 거의 완전한 감염과 연관되어 상부 흉부 분절까지 확장되었다 ( 그림 2A2B , 왼쪽 및 중간 열). 요추 하부 공간에 AAV9-UBI-GFP를 양측에 1.5 μL 주사 한 결과 요추 전체의 백색 및 회색 물질이 거의 유사하게 감염되었다 (3 μL 주입 후 나타남). 그러나, 흉부 중간 뼈는 때때로 감염된 뉴런만을 나타 냈습니다 (ass = "xfig"> 그림 2B, 오른쪽 열). α-motoneuron 특이 적 (ChAT) 및 신경 세포 특이 적 (NeuN) 항체로 염색 한 결과, 요추 α-motoneurons ( 그림 2C ) 및 후각 ( 그림 2D ) 중간 구역에 국한된 interneurons 전체 인구에서 일관된 GFP 발현을 보였다 그림 2E ) 및 복부 호른 ( 그림 2F ). 둘째, 양측 자궁 경부 주사 인 AAV9 (각 주사에 대해 5 μL)는 자궁 경부 척수 (회색 및 흰 물질)와 상부 흉부 세그먼트 ( 그림 3A3B )의 백색 및 회색 물질에서 유사한 GFP 발현을 유도했다 . 같은 동물에서 요추 척수 절편의 분석은 요추 GFP 음성 α 운동 신경 세포와 신경계 부근에서 종결되는 GFP + 하행 축삭의 고밀도를 보여 주었다 ( 그림 3C3D ). AAV9 (양 주사 각각 5 μL)의 두개의 양측 자궁 경부 및 두 개의 양측 상부 요추 주사의 전달은 상부 경추에서 천골 분절까지 전체 척수에서의 GFP 발현과 관련이 있었고 백색 및 회색 물질에 균질하게 존재 하였다 ( 도 3E- 3H ).

상완 신경 모터 및 감각 센터에서의 역행 및 전이 수송 매개 형질 전환 유전자 발현 :
subpial AAV9 전달 후 요추 또는 자궁 경부 척수의 광범위한 GFP 발현은 supraspinal 하강 axons과 그들의 예상 뉴런과 axons과 오름차순 지역 ( 그림 4 )의 터미널에서 강력한 역행 및 anterograde 감염 GFP 양성과 관련이 있었다. 따라서, 강렬한 GFP 양성은 망상 형성 (RF)에 국한 신경 세포에서 보였고,, 핵 ruber (NR) 및 모터 피질 (MC) ( 그림 4B - 4D ). 유사하게, 명확한 GFP 면역 반응성은 척수 뼈 대뇌 (SCT), spinoreticular 및 spinothalamic tracts (STT) ( 그림 4B - 4D )의 터미널에서 보였다.

그림 1
그림 1 : 성숙한 마우스에서 척추 Subpial 주사를 수행하기위한 실험 설치. ( A ) 성숙 마우스에서 척추 subpial 주사를 수행하기 위해 두 개의 별도 XYZ 조작기가 사용됩니다 (I 및 II). ( B ) 각 조작기의 Z-arm에는 유리 모세관 홀더가있다. 하나의 모세관 홀더는 피어 - 관통 34 G 바늘을 보유하고, 두 번째 모세관 홀더는 무딘 36 G 서브 파이어 주사 바늘을 보유합니다. ( C , D , EF) 피아 침투 바늘 ( C ; 경질 물질이 이미 제거 된 후), 피아 - 침투 바늘 ( D )의 제거 후, 피하 주사 바늘의 팁 삽입 후 피아 - 침투 바늘의 위치를 ​​묘사 한 이미지 E ), 그리고 3 mm 바늘 대치침을 바늘 아래 공간 ( F )으로 전진시킨 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 성체 쥐에서 요추 자궁 경부 AAV9-UBI-GFP 전달 후 유능한 척추 Parenchymal GFP 표현. ( A ) AAV9 - UBI - GFP (각각 1.5 또는 3 μL 주사)의 두 번 양측 주사는 상단 요추ubpial 공간, 동물은 AAV9 전달 14 일 후 관류 고정되었다. ( B ) 회색 (점선 영역 내부)과 요추에서 흉부 상부로 이어지는 흰 물질은 3 + 3 μL의 AAV9 (좌측 및 중간 컬럼)가 주입 된 동물에서 강하게 나타납니다. (C, D, E 및 F) 거의 모든 채트 (α-motoneuron 마커)에 표시 AAV9 3 + 3 μL GFP 발현 주입 동물에서 척추 확대 찍은 횡 척수 부의 공동 염색 양성 α- motoneurons ( CF )와 NeuN 양성 뉴론 ( D )과 중간 구역 ( E )의 신경 세포. 스케일 바 = 1,000 μm (B); 30 ㎛ (C); 100 μm (DF). DH : 지느러미 혼; LV : 얇은 판 V; VH : 복부 호른. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.이 그림의 rsion.

그림 3
그림 3 : 척추 Subpial Cervical 척추 Subparent Cypical Lumbar AAV9-UBI-GFP 전달 후 Spinal GFP 발현 비교 이전에 AAV9 - UBI - GFP (5 + 5 μL)의 자궁 경부 subpial 주사를받은 동물의 척수의 전체 길이를 잘라 수평 섹션 ( A, B, CD ). 자궁 경부의 백색 및 회색 물질에서의 강렬한 GFP 발현이 관찰 될 수있다 ( B ). 요추 척수에서 고 측밀도의 GFP + 하 외측 축삭 (LF)과 NeuN 양성이지만 GFP 음성 뉴런 사이의 회색 물질 ( CD )을 확인할 수 있습니다. ( E, F, GH 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 rong> : 뇌 모터 및 감각 센터에서 강력한 역행 및 정량적 AAV9-UBI-GFP 매개 GFP 발현 ( A ) 자궁 경부 척수, 척수강 내, 소뇌 및 운동 피질 (MC)에서 강렬한 GFP 양성의 존재를 묘사 한 저전력 이미지. ( B ) 화살 모양의 뇌 섹션에서 찍은 더 높은 전력 이미지와 망막 형성 (RF), 핵 ruber (NR), 그리고 척수 소뇌 지방 (SCT)의 축삭에서 뉴런에 GFP 형광의 존재를 보여주는. ( C ) 모터 피질 (MC)의 피라미드 뉴런과 망막 시상 핵 영역 (STT)의 spinothalamic 관 말단의 GFP 형광의 존재를 보여주는 코로나 뇌 절편에서 가져온 낮은 전력의 이미지. ( D ) 모터 피질의 피라미드 뉴런에서 강렬한 GFP 표현을 보여주는 고출력 이미지. 스케일 바 = 2,000 μm (A); 1,000 ㎛ (B 및 C); 60 ㎛ (D).csource.jove.com/files/ftp_upload/55770/55770fig4large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

실험 그룹 AAV9 배달 사이트 / 레벨 (*) AAV9 주사액의 양, 주입 속도 생존 시간 조직 분석
그룹 A (n = 7) C2 (양측) 5 μL / 5 분 14 일 뇌 + 척수
B 군 (n = 12) L1-L2 (양측) 1.5 μL 또는 3 μL, 60 μS / μL 14 일 뇌 + 척수
그룹 C (n = 6) C2 + L1-L2 (각 레벨에서 양측) 5 μL / 5 분 14 일 척수
* - 양국= 주입 된 세그먼트 (들)의 오른쪽으로 1 개 및 왼쪽으로 1 개의 서브 스페이스까지 전달되는 2 개의 소급 주입이 수행됩니다.

표 1 : 실험 그룹. 모든 실험은 성인 C57BL / 6J 마우스에서 수행되었다.

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Discussion

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이번 연구는 성체 마우스에서 subpial vector (AAV9) 전달 기술에 대해 설명합니다. 첨부 된 비디오에서 설명한 바와 같이,이 접근법과 기술은 필요한 장비와 피어 - 침투 바늘 및 서브 피알 주사 바늘이 적절하게 제조되고 제조되고 테스트 된 사양에 따라 제공되는 경우 효과적으로 사용할 수 있습니다.

생쥐에서 일관되고 안전하게 자궁 내 주사를 시행 할 때의 중요한 기술적 변수 :
실증 된 바와 같이, 자궁 경부 또는 요추 laminoplomy 후 성인 마취 마우스에서 subpial 주사는 쉽게 수행 할 수 있습니다. 서브 파이어 인젝션 기술의 성공을 정의하는 몇 가지 중요한 기술 변수가 있습니다. 첫째, 34 G 피아 관통 바늘의 끝은 피아의 부드러운 천공을 보장하기 위해 베벨 러를 사용하여 지속적으로 날카롭게해야합니다. 바늘을 날카롭게하는 방법에 대한 기술의 불일치로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다.피아 침투 동안 및 / 또는 피어를 구멍 내기에 너무 많은 힘을 사용하여 척수 손상을 일으킬 수 있습니다. 정상적인 상황에서는 ( 그림 1CD 에서 비디오와 같이) 피아 열리는 부위에는 척수 손상 또는 조혈 출혈의 징후가 보이지 않습니다. 어떤 경우에는 약간의 출혈이 보일 수 있지만, 이것은 AAV9 전달 후 신경 학적 장애 또는 유전자 발현 변화와 관련이없는 것으로 나타났습니다. 둘째, electrocautery를 사용하여 경질을 제거한 후 수술 부위에 혈액이 없도록 유지하는 것이 중요합니다. 외과 용 현미경이 사용 되더라도, 피가 섞인 여드름이 있으면 pia 표면의 확실한 식별이 흐려질 수 있습니다. 도 1C-F에 도시 된 바와 같이, 무혈 절제술 부위는 작은 절개 된 척추 및 주변 연조직을 덮기 위해 작은 겔 - 발포체 조각을 사용하여 효과적으로 유지 될 수있다. 셋째, 마취 된 동물을 동물에게 적절하게 배치하기 위해서는 특별한주의가 필요하다.척추 골격 및 척추 클램프를 이용한 척주 고정에 관한 것이다. 척추 클램프를 배치하는 동안 너무 많은 압력을 가하면 척추가 파열 될 수 있습니다. 불충분 한 압력을 사용하면 고정식 척추골의 점진적인 풀림이 발생할 수 있습니다. 고정식 척추골은 전형적으로 치과 용 드릴을 사용하여 절제술을 시행 할 때 일반적으로 발생합니다.

subpially - 주입 AAV9의 볼륨은 연지 - 꼬리 transgene 표현의 크기와 상관 관계가 있습니다. 따라서 2 개의 요추 양측 대성 AAV9 주사 (3 + 3 μL 또는 5 + 5 μL)의 사용은 전체 흉부 회색 및 백질에서 일관된 GFP 발현과 연관되어 상부 흉부 분절까지 확장되었다. 사용 된 동물 간에는 최소한의 가변성이있었습니다. 1.5 + 1.5 μL의 AAV9 주입 부피는 주사 부근에서 국부 화 된 부분에서 유사한 GFP 발현을 유도 하였다; 그러나, 바이러스의 확산 및 결과 GFP 발현은 흉부에서 제한적이었다 (

Subpial 유전자 전달 기술의 한계 :
관절 내 주사 기술 (척수강 내 전달과 비교하여)의 상대적 제한 중 하나는 척수의 등면에 접근 할 수 있도록 척추 절제술을 시행해야 할 때이 접근법의 침해 성이 더 크다. 그러나, 척수 및 척수강 내 두뇌 중심에서 관찰 된 강력한 형질 전환 유전자 발현은 α-motoneurons 및 1 차적 구 심성 세포의 subpopulation에서 선택적인 형질 전환 유전자 발현을 특징으로하는 뇌척수 내 AAV 전달에 대한 명백한 이점을 입증하는 것으로 보인다. 더 깊은 척수 층의 뉴런에서) 8 .

Subpi의 향후 응용 프로그램알 유전자 전달 기법 :
유사하게, 성숙한 쥐 및 돼지에 대한 이전의 연구에서 입증 된 바와 같이, 성숙한 마우스의 척추 백색 및 회색질 물질에서, 아중 계 AAV9 전달을 사용하여 매우 효과적인 형질 전환 유전자 발현을 얻을 수있다. 또한, 마우스 척수의 상대적으로 작은 치수 (특히 길이) 때문에, 단지 두 척수 수준 (상부 자궁 경부 및 상부 요추)에서 AAV9의 전달은 거의 완전한 척수 감염을 유도하기에 충분하다. 이 특성은 표적 유전자 침묵 또는 상향 조절에 의한 특정 질병 - 수정 치료 접근법을 설계 할 때 중요한 함의를 가질 수있다.

예를 들어, shRNA- 침묵 화 벡터를 사용함으로써, 돌연변이 유전자 ( 예를 들어, ALS의 유전 된 형태의 경우에 SOD)의 발현의 매우 효과적인 감소가 척수뿐만 아니라 척수에서도 달성 될 것으로 기대된다 - 뇌 모터 핵을 방출. 둘째,척추 흰 물질 axons의 매우 효과적인 감염 때문에 치료 유전자 ( 예 : 성장 인자를 암호화하는)가 척수 외상 손상 동물에서 축삭 발아를 촉진하기 위해 상향 조절 될 수 있습니다. 셋째, 부갑상선 호르몬뿐만 아니라 부갑상선 호르몬의 부피 또는 역가를 조작함으로써, 트랜스 진의 발현은 척수의 불연속 영역 ( 예를 들어, 일 측성 후각)으로 표적화 될 수있다. 국소화 된 전이 유전자 발현은 억제 성 신경 전달 물질 시스템 ( 예 : GABA)을 조절하거나 흥분성 시스템 ( 예 : 글루타메이트 결합 수용체 시스템)을 억제함으로써 통증 또는 근육 경련 - 수정 치료에 잠재적으로 사용될 수 있습니다. 넷째, AAV 전달 이외에, 혈액 - 뇌 장벽 투과성이 불량한 다른 분자 또는 벡터 ( 예, 마이크로 RNA)는 미세 전달 후 척수 실질로보다 효과적으로 전달 될 것이다. 이들은 효과적으로 테스트 할 수 있습니다 usin이 원고에 기술 된 기술. 마지막으로, 현재 연구에서 입증 된 바와 같이, 서브 바디 기술은 평균 체중 (BW)이 20 ~ 30 g 인 성충 마우스에서 성공적으로 사용될 수 있습니다. 따라서 동일한 기술과 실험 장치가 유사한 BW ( 예 : Sprague-Dawley (SD) 쥐)와 다른 동물 종에서 사용될 수있다. P6 및 P21 SD 쥐의 BW는 각각 약 17 g 및 62 g입니다. 산후 발달의 초기 단계에서 래트 새끼를 사용하는 것은 척추 신경 회로 및 감각 및 운동 처리의 발달에서 특정 유전자의 상향 조절 또는 하향 조절의 역할을 연구하는 유용한 도구가 될 수있다.

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Disclosures

Martin Marsala는 Neurgain Technologies, Inc. (San Diego, USA)의 공동 설립자입니다.

Acknowledgments

이 연구는 SANPORC 및 ALSA 재단 보조금 (Martin Marsala)에 의해 지원되었습니다. 국가 지속 가능성 프로그램, 프로젝트 번호 LO1609 (체코 교육 청소년 스포츠부); 및 RVO : 67985904 (Stefan Juhas 및 Jana Juhasova).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J Mice Jackson Labs 664
Lab Standard Stereotaxic for Mice Harvard Apparatus 72-9568
Mouse Spinal Adaptor Harvard Apparatus 72-4811
XYZ Manipulator Stoelting 51604
Manual Infusion Pump Stoelting 51218
34G Beveled Nanofill Needle World Precision Instruments NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle World Precision Instruments NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane MWI Veterinary Supply 502017
Chlorhexidine Solution MWI Veterinary Supply 501027
20G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305175
23G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305145
30G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305128
Cotton Tipped Applicator MWI Veterinary Supply 27426
Glass Capillary Beveller  Narishige International SM-25B
Slide Microscope Superfrost Leica Microsystems M80
50 μL Microsyringe  Hamilton 81242
BD Intramedic PE-20 Tubing Becton, Dickinson 427406
BD Intramedic PE-10 Tubing Becton, Dickinson 427401
4-0 monofilament suture VetOne V1D397
Glass Capillary Beveller  Narishige Pipet Micro Grinder EG-40 
5 min Epoxy (Epoxy Clear) Devcon 14310
Euthanasia Solution MWI Veterinary Supply 11168
Heparin Inj 1,000 U/mL MWI Veterinary Supply 54254
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Anti NeuN Antibody EMD-Millipore ABN78 Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody EMD-Millipore AB144P Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody Aves Labs GFP-1020 Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A21207 Secondary Antibody, 1:1000
 Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 ThermoFisher Scientific A10043 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Jackson Immunoresearch Labs 703-545-155 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 Abcam ab150131 Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost Fisher Scientific 12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant Fisher Scientific P36930
Epifluorescence Microscope Zeiss Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope Olympus Olympus FV1000
Dextran Polysciences, Inc 19411
AAV9-UBC-GFP UCSD Viral Vector Core Laboratory

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References

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성인 쥐의 Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) 벡터 전달
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Cite this Article

Tadokoro, T., Miyanohara, A., Navarro, M., Kamizato, K., Juhas, S., Juhasova, J., Marsala, S., Platoshyn, O., Curtis, E., Gabel, B., Ciacci, J., Lukacova, N., Bimbova, K., Marsala, M. Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice. J. Vis. Exp. (125), e55770, doi:10.3791/55770 (2017).More

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