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Neuroscience

Vedação subjugada Adeno-associada do vírus 9 (AAV9) em ratos adultos

doi: 10.3791/55770 Published: July 13, 2017

Summary

O objetivo do presente estudo foi desenvolver e validar a potência e a segurança da entrega de genes mediada pelo vírus adeno-associado à coluna vertebral (AAV9) usando uma nova técnica de entrega de genes subpial em camundongos adultos.

Abstract

O desenvolvimento bem-sucedido de uma técnica de entrega do vetor de adeno-associado subpial 9 (AAV9) em ratos adultos e porcos foi relatado anteriormente. Utilizando cateteres de polietileno colocados subpialmente (PE-10 ou PE-5) para a entrega de AAV9, demonstrou-se uma expressão potente do transgene através do parênquima espinhal (substância branca e cinzenta) em segmentos espinhais injetados subpialmente. Devido à ampla gama de modelos de ratos transgênicos de doenças neurodegenerativas, há um forte desejo pelo desenvolvimento de uma técnica de entrega de vetor segmentado do sistema nervoso central potente (SNC) em camundongos adultos. Consequentemente, o presente estudo descreve o desenvolvimento de um dispositivo de entrega de vetor subpial da coluna vertebral e técnica para permitir a administração segura e eficaz de AAV9 espinhal em ratos C57BL / 6J adultos. Nos ratinhos imobilizados e anestesiados, o pia mater (nível cervical 1 e segmentar 1-2) foi inciso com uma agulha afiada de 34 G usando um manipulador XYZ. Um segundo XYZ maO nipulador foi então usado para avançar uma agulha 36G brusca no espaço subpial lombar e / ou cervical. O vetor AAV9 (3-5 μL; 1,2 x 10 13 cópias do genoma (gc)) que codificam a proteína fluorescente verde (GFP) foi então injetado subpialmente. Após as injeções, a função neurológica (motor e sensorial) foi avaliada periodicamente, e os animais foram fixados por perfusão 14 dias após a administração de AAV9 com paraformaldeído a 4%. A análise das seções da corda espinal horizontal ou transversal mostrou expressão do transgene em toda a medula espinhal, tanto em matéria cinza quanto em substância branca. Além disso, observou-se uma intensa expressão de GFP mediada por retrogradabilidade nos axônios motores descendentes e nos neurônios no córtex motor, no núcleo e na formatio reticular. Não foi observada nenhuma disfunção neurológica em nenhum animal. Esses dados mostram que a técnica de entrega do vetor subpial pode ser usada com sucesso em camundongos adultos, sem causar lesão da medula espinhal relacionada ao procedimento, e está associada a expressões de transgênese altamente potentesDurante toda a neuraxis da coluna vertebral.

Introduction

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O uso de vetores de AAV para tratar uma variedade de distúrbios neurodegenerativos da medula espinhal e do SNC está se tornando uma plataforma bem aceita para efetivamente aumentar ou silenciar a expressão dos genes de interesse. Uma das principais limitações para a utilização mais efetiva desta tecnologia para o tratamento de distúrbios do SNC / medula espinhal é a capacidade limitada de fornecer vetores AAV para o cérebro profundo ou parênquima da medula espinhal em mamíferos adultos.

Foi demonstrado, por exemplo, que a distribuição sistêmica de AAV9 em roedores adultos, gatos ou primatas não humanos é apenas moderadamente eficaz para induzir a expressão do transgene nos neurônios do cérebro e da medula espinhal 1 , 2 , 3 . A administração intratecal mais efetiva de vetores AAV9 também mostrou que leva a apenas expressão limitada de transgenes em conjuntos de neurônios anatomicamente definidos. Mais especificamente, tem sido demôniosQue o fornecimento de AAV9 intracelular cisterno ou lumbo-sacral em primatas, porcos ou roedores não humanos leva a um alto nível de expressão do transgene nos motoneurônios α da espinha e neurônios ganglionares da raça dorsal segmentar. No entanto, observa-se uma expressão mínima ou nenhuma em interneurônios espinhais ou axônios ascendentes ou descendentes na matéria branca 4 , 5 , 6 , 7 . Coletivamente, esses dados mostram que existe uma barreira biológico-anatômica altamente efetiva, o que impede a difusão do AAV entregue por via intratéfica no parênquima espinhal mais profundo.

Em um estudo anterior, utilizando ratos e porcos adultos, desenvolveu-se uma nova técnica de entrega de vetor subpial 8 . Ao usar essa abordagem, a expressão de transgene altamente potente e multi-segmentar foi demonstrada após uma entrega de AAV9 subpial de bolus único. A expressão GFP intensa foi consistentemente vistaNos neurônios, células gliais e axônios descendentes / ascendentes através dos segmentos espinhais injetados. Este estudo demonstrou pela primeira vez que a pia mater representa a barreira principal que limita a difusão efetiva de AAV9 no parênquima espinhal do espaço intratecal. Embora esta técnica previamente desenvolvida e o dispositivo de injeção subpial sejam relativamente fáceis de usar em roedores grandes (como ratos) ou porcos adultos, o sistema não é adequado para uso em animais pequenos, como ratos adultos. Devido ao elevado número de modelos de ratos transgênicos disponíveis de uma variedade de distúrbios neurodegenerativos, existe uma necessidade clara de desenvolvimento de uma técnica efetiva de parto espinhal parenquimatoso em camundongos. A disponibilidade de tal técnica permitiria o estudo do efeito de silenciamento de genes específicos ( por exemplo, usando shRNA) ou upregulation usando células não específicas ( por exemplo, citomegalovírus-CMV ou Ubiquitin) ou específicas de células ( por exemplo, sinapsina ou glial Ácido fibrilarProteína (GFAP)) durante o desenvolvimento pós-natal inicial ou em condições doentes.

Conseqüentemente, no presente estudo, desenvolvemos e validamos um sistema de entrega de vetor subpial em miniatura que pode ser efetivamente usado em camundongos adultos. Da mesma forma, como em estudos anteriores de ratos e porcos, este trabalho demonstra uma expressão de transgênese potente ao longo do parênquima espinhal após uma entrega de AAV9 subpial de bolus único em camundongos. A simplicidade desta abordagem, a tolerabilidade muito boa dos ratos injetados à entrega de AAV9 subpial e a alta potência da expressão do transgene no parênquima espinal sugerem que esta técnica pode efetivamente ser implementada em qualquer configuração de laboratório e utilizada em experimentos visando a expressão do gene espinhal.

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Protocol

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Esses estudos foram realizados sob um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal da Universidade da Califórnia, em San Diego, e estavam em conformidade com a Associação para Avaliação de diretrizes de Cuidados com animais de laboratório para uso em animais. Todos os estudos foram realizados de forma a minimizar o tamanho do grupo e o sofrimento dos animais.

1. Preparação geral de animais e cirurgiões

  1. Antes de iniciar o procedimento cirúrgico, descongelar o vírus (AAV9-UBI-GFP, alíquotas de 5 μL) 8 . Prepare uma solução de 5% de dextrano (10 000 MW), misturando pó de dextrano em água destilada. Misture a solução de vírus com 5% de solução de dextrano 1: 1 até uma concentração final de dextrano de 2,5%.
    1. Armazene a solução de vírus em gelo (4 ° C).
  2. Use ratos adultos C57BL / 6J (macho e fêmea, 20-30 g). Anestesiar os ratos usando 5% de isoflurano (em O 2 , 1 L / min) e mantê-los aos 2-3% de isoflurano inalado (em O 2 , 1 L / min) pelo cone do nariz durante a cirurgia, dependendo da taxa de respiração e da resposta da pitada da pata.
  3. Raspar a parte de trás dos animais com cortadores de barbear e limpar a pele com 2% de clorhexidina.
  4. Nos estudos de recuperação crônica, segue uma técnica estéril rigorosa.
  5. Se as injeções subpiais lombares devem ser realizadas, corte a pele sobrepondo as vértebras Th8-L1 com um bisturi e separe o músculo paravertebral das vértebras espinhais Th10-12 usando uma tesoura.
    1. Monte o animal em uma armação estereotáxica padrão usando pinças espinhal de rato.
    2. Raspar os dois lados da lâmina das vértebras Th10-12 usando uma broca dental (broca: 0,9 mm, velocidade: 20,000 rpm) até aparecerem fissuras.
    3. Remova fragmentos de ossos rachados com fórceps e exponha a superfície dorsal da medula espinal lombar.
    4. Corte a duraçao de aproximadamente 1 cm usando uma agulha de aço inoxidável de 30 G e fórceps.
  6. Remova a membrana atlanto-occipital da cisterna magna usando uma agulha de aço inoxidável 23G e fórceps.
  7. Limpe o local da incisão de qualquer tecido e detritos ósseos usando cotonetes de algodão.
  8. Corte a duraçao dura aproximadamente 2-3 mm usando uma agulha de aço inoxidável de 30 G e fórceps.

2. Abrindo a Membrana Pial e Inserindo a Agulha Subpial para AAV9 Delivery

  1. Monte a agulha penetrante de 34 G no braço Z de um manipulador XYZ usando um suporte capilar de vidro ( Figura 1A e B ).
    NOTA: Para fabricar a agulha pia-penetrante, a ponta chanfrada original da agulha 34G é afiada usando um beveller capilar de vidro com placa abrasiva de diamante - grossa (tamanhos de ponta de 5,0 μm a 50 μm) e ângulo de moagem de15 - 20 °. A ponta da agulha (comprimento de 1 mm, medida a partir da ponta) é então dobrada suavemente para cerca de 90 ° ( Figura 1B , inserção esquerda).
  2. Usando um escopo de dissecção cirúrgica, ajustado para ampliação 8-10 X, penetre a pia com a agulha penetrante pia em cerca de 1 mm ( Figura 1C ) usando o X-braço.
    1. Mantenha o ângulo da agulha penetrante na superfície do tecido a 5-10 °.
  3. Após a abertura da pia, remova horizontalmente a agulha pia do espaço subpial ( Figura 1 D) usando o braço X.
    NOTA: Lembre-se do site penetrado por um marco, como um vaso sanguíneo.
  4. Coloque uma agulha de injeção 36G com vírus AAV9-UBI-GFP utilizando uma micro-fenda de 50 μL conectada à agulha de injeção com tubos PE-10 ou PE-20.
  5. Monte a agulha no braço Z de um segundo manipulador XYZ ( Figura 1A B ) usando um suporte capilar de vidro ( Figura 1B , inserção direita).
    NOTA: Para fabricar a agulha de injeção subaural AAV9, a ponta sem corte de uma agulha 36 G é polida usando um beveller capilar de vidro com placa abrasiva de diamante - grosso (tamanhos de ponta de 5,0 μm a 50 μm) para remover as bordas afiadas. A ponta da agulha (2-3 mm de comprimento, medida a partir da ponta) é então dobrada suavemente para cerca de 90 °. As agulhas de injeção pia-penetrantes e subpiais são inseridas em tubos de aço inoxidável escravo 20G de 2 cm de comprimento (10 mm da extremidade da agulha) e colados com epóxi. O uso de tubos de 20 G (0,91 mm de diâmetro) é necessário para uma fixação segura ao suporte capilar de vidro.
  6. Ao manipular os braços X, Y e Z do segundo manipulador, posicione a ponta da agulha de injeção AAV9 no local pia-penetrado e avance-o cerca de 2-3 mm para dentro do espaço subpial através da abertura anterior da membrana do pial usando o X-braço( Figura 1E e F ).
    NOTA: 1) O AAV9-UBI-GFP é preparado de acordo com os protocolos 9 , 10 , previamente relatados, e os títulos finais são ajustados para 1,2 x 10 13 cópias do genoma por mL (gc / mL). 2) Não há necessidade de marcar o site da abertura do pial porque é facilmente identificável ( Figura 1D ).
  7. Injecte o AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 ou 5 μL) no espaço subpial usando uma micro-microfira de 50 μL (ver Tabela 1 para grupos experimentais).
  8. Remova a agulha de injeção do espaço subpial depois que a injeção de AAV9-UBI-GFP estiver completa.
  9. Feche o músculo e a pele usando sutura monofilamento 4.0 e clipes cirúrgicos.
    NOTA: Não é necessário selar a vértebra aberta.
  10. Permitir que os animais se recuperem em uma almofada de aquecimento.
  11. Para o controle da dor, injete Buprenorfina 0,05 mg / kg / sc a cada 12 h para2-3 dias após a cirurgia.

3. Fixação por perfusão, crioproteção de tecido e coloração por imunofluorescência

  1. Em um ponto de tempo predeterminado após as injeções de AAV9 subpial, anestesiar profundamente os camundongos com solução de eutanásia (ver Tabela de Materiais , 0,3 mL) e perfundir transcardialmente com 20 mL de solução salina heparinizada seguida de 20 mL de paraformaldeído a 4% em PBS.
  2. Dissecar as cordas espinhais e os cérebros usando um rongeur ósseo e depois corrigi-los em 4% de formaldeído em PBS durante a noite a 4 ° C.
  3. Cryoprotect as cordas espinhais e os cérebros com 30% de sacarose em PBS por um período mínimo de 5-7 dias.
  4. Cortar secções congeladas coronal, transversal ou longitudinal / horizontal (30 μm de espessura) em um criostato e armazená-las em PBS a 4 ° C.

4. Coloração por imunofluorescência das secções da medula espinhal e do cérebro (ver tabela de materiais)

  1. Incubar secções flutuantes em primarAnticorpos durante a noite.
  2. Após a incubação com anticorpos primários, lave as secções três vezes em PBS e incuba com anticorpos secundários anti-coelho, burro anti-frango e burro anti-cabra conjugados com fluorescência.
  3. Montar as seções em lâminas de microscopia, secá-las à temperatura ambiente e cobri-las com um meio anti-fade.
  4. Capture imagens usando microscópio de fluorescência de epifluorescência (objetivos: 10X, NA-0.3; 20X, NA-0.8 e 63X, NA-1.4).

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Representative Results

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Expressão Transgene Potente em Subpialmente Segmentos Injetados com AAV9:
A análise da expressão de transgene (GFP) nas secções da medula espinhal aos 14 dias após a administração de AAV9 apresentou expressão de GFP dependente de AAV9 ao longo do parênquima espinhal. Primeiro, duas injeções bilaterais de 3 μL de AAV9-UBI-GFP injetadas no espaço subpial lombar superior foram associadas à infecção quase completa da matéria branca e cinzenta em toda a medula espinal lombar, estendendo-se para os segmentos torácicos superiores ( Figura 2A E 2B , colunas esquerda e meio). Duas injeções bilaterais de 1,5 μL de AAV9-UBI-GFP no espaço subpial lombar superior foram associadas a uma infecção quase completa completa da matéria branca e cinzenta em toda a medula espinal lombar (como observado após injeções de 3 μL); No entanto, os segmentos médio-torácico mostraram apenas neurônios ocasionalmente infectados (Ass = "xfig"> Figura 2B, coluna direita). A coloração com anticorpos específicos de α-motoneurão (ChAT) e neurônio específico (NeuN) mostrou expressão consistente de GFP em toda a população de α-motoneurônios lombares ( Figura 2C ) e interneurônios localizados no chifre dorsal ( Figura 2D ), zona intermediária ( Figura 2E ) e chifre ventral ( Figura 2F ). Em segundo lugar, duas injeções cervicais bilaterais de AAV9 (5 μL para cada injeção) levaram a expressão GFP semelhante na matéria branca e cinzenta em toda a medula espinhal cervical (matéria cinza e branca) e nos segmentos torácicos superiores ( Figura 3A e 3B ) . A análise das seções da coluna vertebral lombar nos mesmos animais mostrou uma alta densidade de axônios descendentes de GFP + que terminam na vizinhança dos motoneurônios α-motoneurônicos e interneurônios LFP negativos ( Figura 3CE 3D ). A entrega de duas injeções bilaterais bilaterais cervical e duas lombares superiores de AAV9 (5 μL para cada injeção) foi associada à expressão de GFP em toda a medula espinhal, dos segmentos cervical e sacro superior e estava homogêneamente presente na matéria branca e cinzenta ( Figura 3E- 3H ).

Expressão transgênica retratada e anterógrada transportada em centros de motores e sensoriais de Supraspinal:
A expressão de GFP generalizada na medula espinal lombar ou cervical após o parto da AAV9 subpial foi associada a positividade robusta de GFP mediada por infecção retrógrada e anterógrada nos axônios descendentes supraspínicos e seus neurônios projetados e em axônios e terminais de trilhos ascendentes ( Figura 4 ). Assim, a positividade intensa de GFP foi observada em neurônios localizados na formação reticular (RF), Nucleus ruber (NR) e córtex motor (MC) ( Figura 4B- 4D ). Da mesma forma, foi observada uma imunorreatividade de GFP clara nos terminais dos tratamentos espinocerebelosos (SCT), spinoreticular e espinotalâmico (STT) ( Figura 4B- 4D ).

figura 1
Figura 1 : Configuração Experimental para Realizar Injeções Subfoliais Espinhais em um Mouse Adulto. ( A ) Para realizar injeções subpiais espinhais em camundongos adultos, são utilizados dois manipuladores XYZ separados (I e II). ( B ) O braço Z de cada manipulador contém um suporte capilar de vidro. Um suporte de capilar mantém a agulha de 34 G pia-penetrante, e a segunda segura a agulha de injeção subpial frouxa de 36 G. ( C , D , E e F) Imagens que retratam a posição da agulha de pia-penetração logo após a punção pia ( C , duraçao já é removida), após a remoção da agulha pia-penetrante ( D ), após a inserção da ponta da agulha de injeção subpial ( E ), e depois de avançar a agulha de injeção subpial 3 mm para o espaço subpial ( F ). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 2
Figura 2 : Expressão de GFP Parenquimatosa Espinhal Potente após Envio Subpial Lombar AAV9-UBI-GFP em Ratos Adultos. ( A ) Duas injeções bilaterais de AAV9-UBI-GFP (1,5 ou 3 μL de injeções cada) foram entregues na parte superior lombarO espaço local e os animais foram fixados por perfusão 14 dias após a entrega da AAV9. ( B ) A expressão intensa de GFP no cinza (dentro da área pontilhada) e a substância branca, que se estendem dos segmentos lombares para os toráxis superiores, podem ser observadas em animais injetados com 3 + 3 μL de AAV9 (colunas do lado esquerdo e do meio). ( C, D, E e F ) A co-coloração das seções transversais da medula espinhal tiradas do aumento lombar em animais injetados com 3 + 3 μL de AAV9 mostram expressão de GFP em praticamente todos os α-motoneurônicos de ChAT (α- Motoneurônios ( C e F ) e interneurônios NeuN-positivos no chifre dorsal ( D ) e na zona intermediária ( E ). Barras de escala = 1000 μm (B); 30 μm (C); 100 μm (DF). DH: chifre dorsal; LV: lâmina V; VH: chifre ventral. Clique aqui para ver um maiorRsion desta figura.

Figura 3
Figura 3: Comparação da Expressão Espinal de GFP Após Colágeno Espinhal Subpial Cervical Versus Spiral Subpial Cervical plus Subpial Lombar AAV9-UBI-GFP Entrega em Ratos Adultos. ( A, B, C e D ) A seção horizontal cortou todo o comprimento da medula espinhal em um animal que recebeu previamente injeções subpiais cervicais superiores de AAV9-UBI-GFP (5 + 5 μL). É possível observar uma expressão intensa de GFP na matéria branca e cinzenta na região cervical ( B ). Na medula espinal lombar, pode-se identificar uma alta densidade de axônios descendentes GFP + no funiculo lateral (LF) e a matéria cinzenta entre neurônios NeuN-positivos, mas GFP-negativos ( C e D ). ( E, F, G e H Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 4
Figura 4 Rong>: Expressão de GFP mediada por AAV9-UBI-GFP, retrógrada e anterógrada potente em Centros de Motor e Sensorial Cerebrais. ( A ) Uma imagem de baixa potência que retrata a presença de intensa positividade de GFP na medula espinhal cervical, medula oblongada, cerebelo e córtex motor (MC). ( B ) Uma imagem de maior potência tirada de uma seção sagital do cérebro e mostrando a presença de fluorescência GFP em neurônios na formação reticular (RF), nucleus ruber (NR) e axônios do trato espino-cerebelar (SCT). ( C ) Uma imagem de baixa potência tirada de seções de cérebro coronal que mostra a presença de fluorescência de GFP em neurônios piramidais no córtex motor (MC) e nos terminais do trato espinotalâmico em áreas dos núcleos talâmicos reticulares (STT). ( D ) Uma imagem de alta potência que demonstra uma intensa expressão de GFP em neurônios piramidais no córtex motor. Barras de escala = 2,000 μm (A); 1000 μm (B e C); 60 μm (D).Csource.jove.com/files/ftp_upload/55770/55770fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Grupos Experimentais Site / nível de entrega AAV9 (*) Volume de AAV9 inj, taxa de infusão Tempo de sobrevivência Análise de tecidos
Grupo A (n = 7) C2 (bilateral) 5 μL / 5 min 14 dias Cérebro + medula espinhal
Grupo B (n = 12) L1-L2 (bilateral) 1,5 μL ou 3 μL, 60 seg / μL 14 dias Cérebro + medula espinhal
Grupo C (n = 6) C2 + L1-L2 (bilateral em cada nível) 5 μL / 5 min 14 dias Medula espinhal
* - bilateral= Duas injeções subpiais, uma entregue à direita e um espaço subpial esquerdo do segmento (s) injetado (s).

Tabela 1: Grupos Experimentais. Todas as experiências foram realizadas em ratos C57BL / 6J adultos.

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Discussion

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O presente estudo descreve uma técnica de entrega de vector subpial (AAV9) em camundongos adultos. Conforme demonstrado no vídeo acompanhante, esta abordagem e técnica podem ser efetivamente utilizadas, desde que os instrumentos necessários e a agulha pia penetrante e a agulha de injeção subpial sejam devidamente fabricadas, de acordo com as especificações estabelecidas e testadas.

Variáveis ​​técnicas críticas na realização de uma injeção subpial consistente e segura em ratos:
Conforme demonstrado, uma injeção subpial pode ser prontamente realizada em camundongos adultos anestesiados após uma laminectomia dorsal cervical ou lombar. Existem várias variáveis ​​técnicas críticas que definem o sucesso da técnica de injeção subpial. Primeiro, a ponta da agulha penetrante pia de 34 G precisa ser afiada com um biselador para assegurar a punção lisa da pia. Qualquer inconsistência na técnica sobre como a agulha é afiada pode levar a dificuldadesDurante a penetração da pia e / ou pode causar lesões medulares usando muita força para perfurar a pia. Em circunstâncias normais (como mostrado no vídeo e na Figura 1C e D ), o local da abertura da pia não mostra nenhum sinal de lesão da medula espinhal ou sangramento subpial. Em alguns casos, pode-se observar algum sangramento subpial, mas isso não foi encontrado como associado a disfunção neurológica ou alteração da expressão gênica após a administração de AAV9. Em segundo lugar, é importante manter o local cirúrgico livre de sangue após a dupla extrair usando eletrocautério. Qualquer resíduo de sangue irregular pode obscurecer a identificação confiável da superfície pia, mesmo que seja utilizado um microscópio cirúrgico. Conforme mostrado na Figura 1C-F , um local de laminectomia sem sangue pode ser efetivamente mantido usando pequenos pedaços de espuma de gel para cobrir a vértebra laminectomizada e os tecidos moles circundantes. Em terceiro lugar, deve ser dada especial atenção à colocação adequada de animais anestesiados naQuadro espinhal e à imobilização da coluna vertebral usando pinças espinhais. Usar muita pressão durante a colocação de pinças espinhais pode causar ruptura vertebral; O uso de pressão insuficiente pode levar a um afrouxamento progressivo da vértebra imobilizada, o que normalmente acontece quando uma broca dental é usada para realizar a laminectomia.

O volume de AAV9 subtilmente injetado correlaciona-se com a magnitude da expressão do transgene rostro-caudal. Assim, o uso de duas injeções bilaterais de AAV9 subpial lombar (3 + 3 μL ou 5 + 5 μL) foi associado com expressão consistente de GFP em toda a matéria lombar cinzenta e branca, estendendo-se até os segmentos torácicos superiores. Houve variabilidade mínima entre os animais utilizados. Os volumes de injeção de AAV9 de 1,5 + 1,5 μL levaram a expressão de GFP semelhante nos segmentos localizados na proximidade de injeções; No entanto, a propagação do vírus e a expressão GFP resultante foi limitada nos segmentos torácicos (

Limitação da técnica de entrega de genes Subpial:
Uma das limitações relativas da técnica de injeção subpial (em comparação com o parto intratecal) é a natureza mais invasiva dessa abordagem quando uma laminectomia dorsal deve ser realizada para permitir o acesso à superfície dorsal da medula espinhal. No entanto, a expressão de transgênese potente observada em toda a medula espinhal e nos centros de cérebro supraspinal parece demonstrar a clara vantagem sobre a distribuição de AAV intratecal, caracterizada pela expressão seletiva do transgene na subpopulação de α-motoneurônios e aferentes primários (mas não está presente Nos neurônios nas lâminas da medula espinhal mais profundas) 8 .

Futuras Aplicações do SubpiTécnica de entrega de Gene:
Da mesma forma, como demonstrado em estudos anteriores em ratos adultos e suínos, pode-se obter uma expressão de transgênese altamente eficaz na matéria branca e cinzenta da raça em camundongos adultos usando o parto de AAV9 subpial. Além disso, devido às dimensões relativamente menores (particularmente o comprimento) da medula espinal do mouse, a entrega de AAV9 em apenas dois níveis de medula espinhal (lombar cervical superior e superior) é suficiente para levar a uma infecção da medula espinal quase completa. Esta característica pode ter uma implicação importante na concepção de abordagens específicas de tratamento modificadoras de doenças por meio de silenciamento de genes ou de upregulation direcionados.

Por exemplo, usando vetores de silenciamento de shRNA, espera-se que uma diminuição altamente efetiva na expressão de genes mutados ( por exemplo, SOD no caso da forma hereditária de ALS) seja alcançada em toda a medula espinhal, bem como em espessura - projetando núcleos motores cerebrais. Segundo,Por causa da infecção altamente eficaz dos axônios da substância branca da coluna vertebral, os genes terapêuticos ( por exemplo, codificando fatores de crescimento) podem ser regulados para promover o surgimento axonal em animais traumatisados ​​na coluna vertebral. Em terceiro lugar, manipulando o volume ou o título do vírus entregue subitamente, bem como o local da injeção subpial, a expressão do transgene pode ser direcionada para uma região discreta da medula espinhal ( por exemplo, o chifre dorsal unilateral). A expressão de transgene localizada pode ser utilizada na dor ou no tratamento modificador da espasticidade muscular mediante a regulação positiva de sistemas neurotransmissores inibitórios ( por exemplo, GABA) ou inibindo sistemas excitatórios ( por exemplo, o sistema de receptor acoplado ao glutamato). Em quarto lugar, além da administração de AAV, outras moléculas ou vetores com permeabilidade barreira hematoencefálica ( por exemplo, micro-RNA) provavelmente serão mais efetivamente entregues no parênquima espinhal após o parto subpial. Estes podem efetivamente ser testados por USINA técnica descrita neste manuscrito. Finalmente, conforme demonstrado no presente estudo, a técnica subpial pode ser utilizada com sucesso em camundongos adultos com peso corporal médio (BW) entre 20 e 30 g. Assim, é provável que a mesma técnica e configuração experimental possam ser empregadas em outras espécies animais com BW similar ( por exemplo, filhotes de ratos Sprague-Dawley (SD)). O BW de ratos P6 e P21 SD é de cerca de 17 e 62 g, respectivamente. O uso de filhotes de ratos durante o estágio inicial do desenvolvimento pós-natal pode ser uma ferramenta útil para estudar o papel de genes específicos de regressão ou downregulation no desenvolvimento de circuitos neurais espinhais e processamento sensorial e motor.

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Disclosures

Martin Marsala é co-fundador da Neurgain Technologies, Inc. (San Diego, EUA).

Acknowledgments

Este estudo foi apoiado pela bolsa SANPORC e ​​ALSA Foundation (Martin Marsala); Programa Nacional de Sustentabilidade, número de projeto LO1609 (Ministério da Educação, Juventude e Desporto); E RVO: 67985904 (Stefan Juhas e Jana Juhasova).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J Mice Jackson Labs 664
Lab Standard Stereotaxic for Mice Harvard Apparatus 72-9568
Mouse Spinal Adaptor Harvard Apparatus 72-4811
XYZ Manipulator Stoelting 51604
Manual Infusion Pump Stoelting 51218
34G Beveled Nanofill Needle World Precision Instruments NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle World Precision Instruments NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane MWI Veterinary Supply 502017
Chlorhexidine Solution MWI Veterinary Supply 501027
20G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305175
23G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305145
30G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305128
Cotton Tipped Applicator MWI Veterinary Supply 27426
Glass Capillary Beveller  Narishige International SM-25B
Slide Microscope Superfrost Leica Microsystems M80
50 μL Microsyringe  Hamilton 81242
BD Intramedic PE-20 Tubing Becton, Dickinson 427406
BD Intramedic PE-10 Tubing Becton, Dickinson 427401
4-0 monofilament suture VetOne V1D397
Glass Capillary Beveller  Narishige Pipet Micro Grinder EG-40 
5 min Epoxy (Epoxy Clear) Devcon 14310
Euthanasia Solution MWI Veterinary Supply 11168
Heparin Inj 1,000 U/mL MWI Veterinary Supply 54254
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Anti NeuN Antibody EMD-Millipore ABN78 Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody EMD-Millipore AB144P Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody Aves Labs GFP-1020 Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A21207 Secondary Antibody, 1:1000
 Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 ThermoFisher Scientific A10043 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Jackson Immunoresearch Labs 703-545-155 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 Abcam ab150131 Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost Fisher Scientific 12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant Fisher Scientific P36930
Epifluorescence Microscope Zeiss Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope Olympus Olympus FV1000
Dextran Polysciences, Inc 19411
AAV9-UBC-GFP UCSD Viral Vector Core Laboratory

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References

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Vedação subjugada Adeno-associada do vírus 9 (AAV9) em ratos adultos
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Tadokoro, T., Miyanohara, A., Navarro, M., Kamizato, K., Juhas, S., Juhasova, J., Marsala, S., Platoshyn, O., Curtis, E., Gabel, B., Ciacci, J., Lukacova, N., Bimbova, K., Marsala, M. Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice. J. Vis. Exp. (125), e55770, doi:10.3791/55770 (2017).More

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