Summary
Целью настоящего исследования было разработать и обосновать потенцию и безопасность доставки гена, опосредованного спинным адено-ассоциированным вирусом 9 (AAV9), с использованием новой технологии доставки субпиальных генов у взрослых мышей.
Abstract
Ранее сообщалось об успешной разработке метода доставки векторов аденоассоциированного вируса 9 (AAV9) у взрослых крыс и свиней. Было продемонстрировано использование субпиализированных полиэтиленовых катетеров (PE-10 или PE-5) для доставки AAV9, продемонстрирована мощная экспрессия трансгена через спинномозговую паренхиму (белое и серое вещество) в субпиально-инъецированных спинномозговых сегментах. Из-за широкого спектра трансгенных мышечных моделей нейродегенеративных заболеваний существует сильное желание разработать мощную систему доставки центральной нервной системы (ЦНС) для взрослых мышей. Соответственно, настоящее исследование описывает развитие устройства для доставки вектора позвоночной линии и метода для обеспечения безопасной и эффективной доставки спинального AAV9 у взрослых мышей C57BL / 6J. У пациентов с иммобилизованными и обезболиваемыми мышами пиама (шейный 1 и поясничный 1-2 спинальный сегментный уровень) была разрезана с помощью острого иглы 34 G с использованием манипулятора XYZ. Второй XYZ maNipulator затем использовали для продвижения тупой иглы 36G в поясничное и / или цервикальное субпиальное пространство. Затем подкожно вводили вектор AAV9 (3-5 мкл, 1,2 х 10 13 геномных копий (gc)), кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP). После инъекций периодически оценивали неврологическую функцию (моторную и сенсорную), а животных фиксировали перфузией через 14 дней после доставки AAV9 с 4% параформальдегидом. Анализ горизонтальных или поперечных участков спинного мозга показал трансгенную экспрессию по всему спинному мозгу, как в сером, так и в белом веществе. Кроме того, интенсивная ретроградно-опосредованная экспрессия GFP наблюдалась в нисходящих моторных аксонах и нейронах в моторной коре, ядре ruber и formatio reticularis. Никаких неврологических дисфункций не было отмечено у любых животных. Эти данные показывают, что метод доставки субпиальной вектора может успешно использоваться у взрослых мышей, не вызывая травмы спинного мозга, связанные с процедурой, и связан с высокоэффективными трансгенными экспрессиямиВо всей спинальной нейраксии.
Introduction
Использование векторов AAV для лечения различных нейродегенеративных заболеваний спинного мозга и ЦНСН становится хорошо принятой платформой для эффективного усиления или молчания экспрессии интересующего гена (генов). Одним из ключевых ограничений для более эффективного использования этой технологии для лечения расстройств ЦНС / спинного мозга является ограниченная способность доставлять вектор (ы) AAV в паренхиму глубокого мозга или спинного мозга у взрослых млекопитающих.
Было продемонстрировано, например, что системная доставка AAV9 у взрослых грызунов, кошек или не-человеческих приматов лишь умеренно эффективна при индуцировании экспрессии трансгена в нейронах головного и спинного мозга 1 , 2 , 3 . Было показано, что более эффективная интратекальная доставка векторов AAV9 приводит к только ограниченной экспрессии трансгена в анатомически определенных пулах нейронов. В частности, это были демоныЧто цистернальная или пояснично-крестцовая интратекальная доставка AAV9 у нечеловеческих приматов, свиней или грызунов приводит к высокому уровню экспрессии трансгена в спинальных α-мотонейронах и сегментных нейронах ганглиозного сегментарного дорсального корня. Однако минимальное или отсутствующее выражение в спинальных интернейронах или восходящих или нисходящих аксонах в белом веществе показано 4 , 5 , 6 , 7 . В совокупности эти данные показывают, что существует высокоэффективный биологически-анатомический барьер, который предотвращает диффузию интратекально поставленного ААВ в более глубокую спинальную паренхиму.
В предыдущем исследовании, проведенном с использованием взрослых крыс и свиней, была разработана новая методика доставки субпиальных векторов 8 . Используя этот подход, сильная и многосегментная экспрессия трансгена была продемонстрирована после однобалочной субпиальной доставки AAV9. Интенсивное выражение GFP постоянно наблюдалосьВ нейронах, глиальных клетках и нисходящих / восходящих аксонах через вводимые спинномозговые сегменты. Это исследование впервые продемонстрировало, что pia mater представляет собой первичный барьер, ограничивающий эффективную диффузию AAV9 в спинальную паренхиму из интратекального пространства. Хотя этот ранее разработанный метод и субпиальное инъекционное устройство относительно просты в использовании у крупных грызунов (например, крыс) или взрослых свиней, система не подходит для использования у мелких животных, таких как взрослые мыши. Из-за большого числа доступных моделей трансгенных мышей различных нейродегенеративных нарушений существует явная потребность в разработке эффективной техники доставки вектора-паренхиматозного вектора у мышей. Доступность такого метода позволила бы изучить влияние специфического подавления генов ( например, с использованием shRNA) или усиление с использованием неспецифических клеток ( например, цитомегаловирус-ЦМВ или Ubiquitin) или клеточно-специфических ( например, синапсина или глиальных Фибриллярная кислаяБелка (GFAP)) в раннем послеродовом развитии или в больных условиях.
Соответственно, в настоящем исследовании мы разработали и подтвердили систему миниатюрной субпиальной векторной доставки, которая может эффективно использоваться у взрослых мышей. Аналогично, как и в предыдущих исследованиях крыс и свиней, эта работа демонстрирует мощную трансгенную экспрессию во всей спинномозговой паренхиме после однобалочной субпиальной доставки AAV9 у мышей. Простота этого подхода, очень хорошая переносимость вводимых мышей к субпиальной доставке AAV9 и высокая эффективность экспрессии трансгена в спинномозговой паренхиме позволяют предположить, что этот метод можно эффективно реализовать в любой лабораторной обстановке и использовать в экспериментах, нацеленных на экспрессию спинного гена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эти исследования проводились в соответствии с протоколом, одобренным Институтом по уходу за животными и его использованием в Калифорнийском университете в Сан-Диего, и отвечали рекомендациям Ассоциации по оценке лабораторных рекомендаций по уходу за животными для животных. Все исследования проводились таким образом, чтобы минимизировать размер группы и страдания животных.
1. Общая подготовка животных и хирургии
- Перед началом хирургической процедуры оттереть вирус (AAV9-UBI-GFP, 5 мкл аликвот) 8 . Подготовьте 5% раствор декстрана (10 000 МВт) путем смешивания порошка декстрана в дистиллированной воде. Смешать раствор вируса с 5% раствором декстрана 1: 1 до конечной концентрации декстрана 2,5%.
- Храните раствор вируса на льду (4 ° C).
- Используйте взрослые мыши C57BL / 6J (мужчины и женщины, 20-30 г). Анестезируйте мышей с использованием 5% изофлурана (в O 2 , 1 л / мин) и поддерживайте их при 2-3% вдыхаемого изофлурана (в O 2 , 1 л / мин) носовым конусом во время операции, в зависимости от частоты дыхания и ответа на щепотку лапы.
- Бритья спины животных с помощью стрижки для стрижки и очистить кожу 2% хлоргексидина.
- При хронических исследованиях восстановления придерживаются строгой стерильной техники.
- Если необходимо провести поясничные субпиальные инъекции, разрежьте кожу, наложив на позвонки Th8-L1 скальпелем и отсоедините паравертебральную мышцу от позвонков позвонков Th10-12, используя ножницы.
- Установите животное в стандартную стереотаксическую рамку с помощью мышечных зажимов.
- Потяните обе стороны пластинки позвонков Th10-12, используя зубную дрель (сверло: 0,9 мм, скорость: 20000 об / мин) до появления трещин.
- Удалите растрескивающиеся фрагменты кости с помощью щипцов и выставить дорсальную поверхность поясничного спинного мозга.
- Отрежьте твердую поверхность около 1 см, используя иглу из нержавеющей стали 30 г и щипцы.
- Удалите атланто-затылочную мембрану цистерны магна, используя иглу из нержавеющей стали 23G и щипцы.
- Очистите участок разреза любого тряпочного и костного обломков с помощью ватных тампонов.
- Отрежьте трубу около 2-3 мм, используя иглу из нержавеющей стали 30 г и щипцы.
2. Открытие мембранной мембраны и установка подпиальной иглы для доставки AAV9
- Вставьте пробивную иглу 34 G в Z-образную рукоятку манипулятора XYZ, используя стеклянный капиллярный держатель ( рис. 1A и B ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы изготовить иглу для пианинга, исходный скошенный наконечник иглы 34G затачивается с помощью стеклянного капиллярного сковорода с алмазной абразивной пластиной - грубых (размеры наконечника от 5,0 до 50 мкм) и угла измельчения15 - 20 °. Кончик иглы (длина 1 мм, измеренный от наконечника) затем осторожно согнут примерно до 90 ° ( рис. 1В , левая вставка). - Используя область хирургического рассечения, установите 8-10-кратное увеличение, пронизывайте пиа с помощью пион-проникающей иглы примерно на 1 мм ( рис. 1C ) с помощью X-arm.
- Держите угол проникающей иглы на поверхности ткани при 5-10 °.
- После открытия пии выньте иглу для пианинга горизонтально из подпиального пространства ( рисунок 1 D), используя X-образную рукоятку.
ПРИМЕЧАНИЕ. Помните пронзительный сайт с помощью ориентира, такого как кровеносный сосуд. - Загрузите тупую иглу 36G для инъекций с вирусом AAV9-UBI-GFP, используя микролизер, содержащий 50 мкл, подключенный к инъекционной игле с помощью трубки PE-10 или PE-20.
- Установите иглу в Z-плечо второго манипулятора XYZ ( рисунок 1A B ) с использованием стеклянного капиллярного держателя ( рисунок 1B , правая вставка).
ПРИМЕЧАНИЕ. Для изготовления субпиальной инъекционной иглы AAV9 тупой наконечник иглы 36 G полируется с использованием стеклянного капиллярного сковорода с алмазно-абразивной пластиной - крупнозернистой (от 5,0 до 50 мкм) для удаления острых кромок. Кончик иглы (длина 2-3 мм, измеренный от наконечника) затем мягко согнут до 90 °. Пиля-проникающие и подпиальные иглы для инъекций вставляются в трубку из нержавеющей стали длиной 20 см длиной 20 см (10 мм от конца иглы) и склеены эпоксидной смолой. Для надежного крепления к стеклянному капиллярному держателю требуется использование трубки диаметром 20 G (0,91 мм). - Управляя стрелками X, Y и Z второго манипулятора, поместите кончик инъекционной иглы AAV9 в участок, покрытый пиаром, а затем продвиньте его примерно на 2-3 мм в пространство подпила через предыдущее отверстие для пузырьковой мембраны, используя X-рука( Рис. 1Е и F ).
ПРИМЕЧАНИЕ. 1) AAV9-UBI-GFP готовят в соответствии с ранее сообщенными протоколами 9 , 10 , а конечные титры регулируют до 1,2 × 10 13 копий генома на мл (г / мл). 2) Нет необходимости отмечать сайт открытия сообщения, поскольку он легко идентифицируется ( рисунок 1D ). - Внесите AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 или 5 мкл) в субпиальное пространство с помощью микролизера 50 мкл (см. Таблицу 1 для экспериментальных групп).
- Удалите инъекционную иглу из субпиального пространства после завершения инъекции AAV9-UBI-GFP.
- Закройте мышцы и кожу, используя 4,1 монофиламентный шов и хирургические зажимы.
ПРИМЕЧАНИЕ. Нет необходимости закрывать открытый позвонок. - Разрешить животным восстанавливаться на нагревательной подушке.
- Для контроля боли вводят бупренорфин 0,05 мг / кг / ш каждые 12 ч дляЧерез 2-3 дня после операции.
3. Перфузионная фиксация, тканевая криозащита и иммунофлуоресцентное окрашивание
- В заданный момент времени после подпиальных инъекций AAV9 глубоко обезболивают мышей раствором эвтаназии (см. Таблицу материалов , 0,3 мл) и транскрипционно перфузируют их 20 мл гепаринизированного физиологического раствора, а затем 20 мл 4% параформальдегида в PBS.
- Рассеивайте спинномозговые шнуры и мозги с помощью костного рога и фиксируйте их в 4% формальдегиде в PBS в течение ночи при 4 ° C.
- Криозащита спинного мозга и мозгов с 30% сахарозы в PBS в течение минимум 5-7 дней.
- Вырезать корональные, поперечные или продольные / горизонтальные замороженные секции (толщиной 30 мкм) на криостате и хранить их в PBS при 4 ° C.
4. Иммунофлуоресцентное окрашивание спинного мозга и разделов мозга (см. Таблицу материалов)
- Инкубировать свободно плавающие участки в примареY антител в течение ночи.
- После инкубации с первичными антителами промыть секции три раза в PBS и инкубировать с люминесцентными конъюгированными ослиными анти-кроличьими, ослиными анти-куриными и осликовыми антителами против козиса.
- Смонтируйте секции на горках микроскопа, высушите их при комнатной температуре и накройте их анти-затухающей средой.
- Захват изображений с использованием эпифлуоресцентного флуоресцентного микроскопа (цели: 10X, NA-0,3; 20X, NA-0,8 и 63X, NA-1,4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сильное трансгенное выражение в субпиально AAV9-инъекциях Сегменты:
Анализ экспрессии трансгена (GFP) в отделах спинного мозга через 14 дней после доставки AAV9 показал экспрессию GFP, зависимую от AAV9, по всей спинномозговой паренхиме. Во-первых, две двусторонние 3 мкл инъекции AAV9-UBI-GFP, введенные в верхнее поясничное субпиальное пространство, были связаны с почти полной инфекцией белого и серого вещества во всем поясничном спинном мозге, простирающемся до верхних грудных сегментов ( рисунок 2A И 2B , левый и средний столбцы). Две двусторонние инъекции 1,5 мкл AAV9-UBI-GFP в верхнее поясничное субпиальное пространство были связаны с аналогичной почти полной инфекцией белого и серого вещества во всем поясничном спинном мозге (как видно после инъекций 3 мкл); Однако в срединно-грудных сегментах наблюдались только эпизодически инфицированные нейроны (Ass = "xfig"> Рисунок 2B, правый столбец). Окрашивание α-мотонейрон-специфическими (ChAT) и нейрон-специфическими (NeuN) антителами показало последовательную экспрессию GFP во всей популяции поясничных α-мотонейронов ( рис. 2C ) и интернейроны, локализованные в дорзальном роге ( рисунок 2D ), промежуточная зона ( Рисунок 2E ) и вентральный рог ( рис. 2F ). Во-вторых, две двусторонние инъекции шейки матки AAV9 (5 мкл для каждой инъекции) приводили к аналогичной экспрессии GFP в белом и сером веществе во всем шейном спинном мозге (серое и белое вещество) и в верхних грудных сегментах ( фиг. 3A и 3B ) , Анализ участков поясничного отдела спинного мозга у тех же животных показал высокую плотность GFP + нисходящих аксонов, заканчивающихся вблизи поясничных GFP-отрицательных α-мотонейронов и интернейронов ( рис. 3CИ 3D ). Доставка двух двусторонних шейных и двух двусторонних верхних поясничных инъекций AAV9 (5 мкл для каждой инъекции) была связана с экспрессией GFP во всем спинном мозге, от верхних шейных до крестцовых сегментов и была гомогенно присутствовала в белом и сером веществе ( Фиг. 3Е- 3H ).
Ретроградная и антероградная трансгенная экспрессия в супраспинальном моторном и сенсорном центрах:
Широко распространенная экспрессия GFP в поясничном или шейном спинном мозге после субпиальной доставки AAV9 была связана с надежной ретроградной и антероградной инфекцией, опосредованной GFP позитивностью в супраспинальных нисходящих аксонах и их проекционных нейронах, а также в аксонах и терминалах восходящих участков ( рис. 4 ). Таким образом, интенсивная положительная активность GFP наблюдалась в нейронах, локализованных в ретикулярной формации (RF), Ядерный ребер (NR) и моторную кору (MC) ( рисунок 4B- 4D ). Аналогично, явная иммунореактивность GFP наблюдалась в терминалах спиноцеребеллярного (SCT), спиноретикулярного и спиноталамического трактов (STT) ( рис. 4B- 4D ).
Рисунок 1 : Экспериментальная установка для проведения инъекций спинальной подпирации у взрослых мышей. ( A ) Для выполнения инъекций спинномозговой субпиальности у взрослых мышей используются два отдельных манипулятора XYZ (I и II). ( B ) Z-плечо каждого манипулятора удерживает стеклянный капиллярный держатель. Один капиллярный держатель удерживает пиа-проникающую иглу 34 G, а второй удерживает тупую иглу для инъекции 36 G. ( C , D , E и F) Изображения , изображающие положение иглы Пиа-проникновения сразу после мягкой мозговой пункции (С; Dura вопрос уже удален), после удаления мягкого мозговой -проникающей иглы (D), после вставки наконечника subpial инъекционной иглы ( E ), и после продвижения субпиальную инъекционную иглу 3 мм в субпиальное пространство ( F ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Экспрессия GFP мощного спинного паренхима после поясничной субпиальной доставки AAV9-UBI-GFP у взрослых мышей. ( A ) Два двусторонних инъекции AAV9-UBI-GFP (1,5 или 3 мкл инъекций каждый) были доставлены в верхнюю поясницуUbpial space и животных перфузионно фиксировались через 14 дней после доставки AAV9. ( B ) Интенсивная экспрессия GFP в сером (внутри пунктирной области) и белом веществе, простирающемся от поясничного отдела до верхних грудных сегментов, видна у животных, которым вводили 3 + 3 мкл AAV9 (левая и средняя колонки). ( C, D, E и F ). Соокрашивание секций поперечного спинного мозга, взятых из поясничного расширения у животных, инъецированных 3 + 3 мкл AAV9, демонстрирует экспрессию GFP практически во всех марках ChAT (α-мотонейрона) -положительных α- Мотонейроны ( C и F ) и NeuN-позитивные интернейроны в дорзальном роге ( D ) и промежуточной зоне ( E ). Шкала шкалы = 1000 мкм (B); 30 мкм (С); 100 мкм (DF). DH: дорзальный рог; LV: lamina V; VH: вентральный рог. Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображениеЭта цифра.
Рисунок 3: Сравнение экспрессии GFP Spinal после спинальной Subpial шейного отдела позвоночника в сравнении с Subpial шейки матки плюс Subpial поясничной AAV9-Ubi-GFP доставки у взрослых мышей. ( A, B, C и D ). Горизонтальное сечение разрезалось по всей длине спинного мозга у животного, которое ранее получало инъекции верхней части шейки матки AAV9-UBI-GFP (5 + 5 мкл). Интенсивное выражение GFP в белом и сером веществе в области шейки матки можно увидеть ( B ). В поясничном спинном мозге можно идентифицировать высокую плотность GFP + нисходящих аксонов в боковом funiculus (LF) и серое вещество между NeuN-положительными, но GFP-отрицательными нейронами ( C и D ). ( E, F, G и H Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4
| Экспериментальные группы | Сайт / уровень доставки AAV9 (*) | Объем AAV9-инъекции, скорость инфузии | Время выживания | Анализ тканей |
| Группа А (n = 7) | C2 (двусторонний) | 5 мкл / 5 мин | 14 дней | Мозг + спинной мозг |
| Группа B (n = 12) | L1-L2 (двусторонний) | 1,5 мкл или 3 мкл, 60 с / мкл | 14 дней | Мозг + спинной мозг |
| Группа C (n = 6) | C2 + L1-L2 (двусторонний на каждом уровне) | 5 мкл / 5 мин | 14 дней | Спинной мозг |
| * - двусторонние= Две субпиальные инъекции, одна из которых передается вправо, а одна в левое субпиальное пространство инжектированного сегмента (сегментов) выполняется. | ||||
Таблица 1: Экспериментальные группы. Все эксперименты проводили у взрослых мышей C57BL / 6J.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем исследовании описывается методика доставки субпиальных векторов (AAV9) у взрослых мышей. Как показано в сопроводительном видео, этот подход и техника могут быть эффективно использованы при условии, что необходимые инструменты и пиа-проникающая игла и субпиальная инъекционная игла правильно изготовлены в соответствии с установленными и проверенными спецификациями.
Критические технические переменные при выполнении последовательной и безопасной субпиальной инъекции у мышей:
Как показано, субпиальную инъекцию можно легко выполнить у взрослых анестезированных мышей после дорсальной шейки матки или поясничной ламинэктомии. Существует несколько важных технических переменных, которые определяют успех метода субпиальной инъекции. Во-первых, кончик иглы 34 G, проникающей в пию, должен быть постоянно заточен с помощью скобы, чтобы обеспечить гладкую пункцию пиа. Любые несоответствия в технике о том, как заостренная игла может привести к затруднениюВо время проникновения пии и / или может вызвать повреждение позвоночника, используя слишком сильное усилие для прокола пиа. При нормальных обстоятельствах (как показано на видео и на рисунках 1C и D ), сайт открытия pia не показывает признаков травмы спинного мозга или субпиального кровотечения. В некоторых случаях можно видеть некоторые субпиальные кровотечения, но это не было связано с неврологической дисфункцией или измененной экспрессией генов после доставки AAV9. Во-вторых, важно, чтобы хирургический сайт не содержал крови после удаления влаги с помощью электрокаутера. Любой пятнистый остаток крови может скрывать надежную идентификацию поверхности пиа, даже если используется хирургический микроскоп. Как показано на рис. 1C-F , сайт без латекса, не содержащий крови, можно эффективно поддерживать с использованием небольших частей из гелевой пены для покрытия ламинэктомированного позвонка и окружающих мягких тканей. В-третьих, особое внимание должно быть уделено надлежащему размещению анестезированных животных вПозвоночника и иммобилизации позвоночника с использованием спинальных зажимов. Использование чрезмерного давления во время размещения спинальных зажимов может привести к разрыву позвонков; При недостаточном давлении может привести к постепенному ослаблению иммобилизованного позвонка, что обычно происходит, когда зубная дрель используется для выполнения ламинэктомии.
Объем субпиально-инъецируемого AAV9 коррелирует с величиной ростро-каудальной трансгенной экспрессии. Таким образом, использование двух поясничных двусторонних субпиальных инъекций AAV9 (3 + 3 мкл или 5 + 5 мкл) было связано с последовательной экспрессией GFP во всей области поясничного серо-белого вещества, простирающейся вплоть до верхних грудных сегментов. Существовала минимальная изменчивость у животных. Объем инъекций AAV9 1,5 + 1,5 мкл привел к аналогичной экспрессии GFP в сегментах, локализованных вблизи инъекций; Однако распространение вируса и результирующая экспрессия GFP были ограничены в грудных сегментах ( Ограничение метода доставки субдиальной гены: Будущие приложения SubpiAl Gene Техника доставки: Например, с использованием векторов-шумоглушителей ожидается, что высокоэффективное снижение экспрессии мутированных генов ( например, SOD в случае унаследованной формы ALS) будет достигнуто во всем спинном мозге, а также в спинальном -проектирование ядер мозга мозга. Во-вторых,Из-за высокоэффективной инфекции аксонов спинного белого вещества терапевтические гены ( например, кодирующие факторы роста) могут быть усилены, чтобы стимулировать прорастание аксонов у животных с травмой позвоночника. В-третьих, манипулируя объемом или титром субпиализованного вируса, а также местом субпиальной инъекции, экспрессия трансгена может быть нацелена на дискретную область спинного мозга ( например, односторонний дорзальный рог). Локализованная экспрессия трансгена потенциально может быть использована при лечении боли или мышечной спастимости путем активирования ингибирующих нейротрансмиттерных систем ( например, ГАМК) или ингибирования возбуждающих систем ( например, рецепторной системы, связанной с глутаматом). В-четвертых, в дополнение к доставке AAV другие молекулы или векторы с плохой проницаемостью для гематоэнцефалического барьера ( например, микро РНК), скорее всего, будут более эффективно передаваться в спинномозговую паренхиму после субпиальной доставки. Они могут быть эффективно протестированы usinG техника, описанная в этой рукописи. Наконец, как показано в текущем исследовании, субпиальную технику можно успешно использовать у взрослых мышей со средним весом тела (BW) от 20 до 30 г. Таким образом, вполне вероятно, что тот же метод и экспериментальная установка могут быть использованы у других видов животных с аналогичными BW ( например, щенки крысы Sprague-Dawley (SD)). BW крыс P6 и P21 SD составляет около 17 и 62 г соответственно. Использование крысиных щенков на ранней стадии послеродового развития может быть полезным инструментом для изучения роли специфического роста гена или уменьшения его в развитии спинальных нейронных цепей и сенсорной и двигательной обработки.
Одним из относительных ограничений метода субпиальной инъекции (по сравнению с интратекальной доставкой) является более инвазивный характер этого подхода, когда необходимо провести дорсальную ламинэктомию, чтобы обеспечить доступ к дорзальной поверхности спинного мозга. Однако сильная трансгенная экспрессия, наблюдаемая во всем спинном мозге и в супраспинальных центрах головного мозга, по-видимому, демонстрирует явное преимущество перед интратекальной доставкой AAV, которая характеризуется селективной экспрессией трансгена в субпопуляции α-мотонейронов и первичных афферентов (но нет в нейронах спинного мозга глубже пластинками) 8.
Аналогично, как показано в предыдущих исследованиях у взрослых крыс и свиней, высокоэффективная трансгенная экспрессия может быть достигнута в спинном белом и сером веществе у взрослых мышей с использованием субпиальной доставки AAV9. Кроме того, из-за относительно меньших размеров (в частности, длины) спинного мозга мыши доставка AAV9 только на двух уровнях спинного мозга (верхняя шейка матки и верхняя поясница) достаточна, чтобы привести к почти полной инфекции спинного мозга. Эта характеристика может иметь важное значение для разработки конкретных методов лечения, модифицирующих болезнь, путем либо целевого гениального молчания, либо усиления активности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Мартин Марсала является соучредителем Neurgain Technologies, Inc. (Сан-Диего, США).
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом SANPORC и ALSA Foundation (Martin Marsala); Национальная программа устойчивого развития, номер проекта LO1609 (Чешское министерство образования, молодежи и спорта); И РВО: 67985904 (Стефан Юхас и Яна Юхасова).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50 μL Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1,000 U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory |
References
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gray, S. J., et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).
- Passini, M. A., et al. Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy. Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).
- Bell, P., et al. Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).
- Miyanohara, A., et al. Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046 (2016).
- Xu, Q., et al. In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery. PLoS One. 7 (3), 32581 (2012).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).
