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Neuroscience

Adenovirus Subagonal Asociado 9 (AAV9) Vector Entrega en Ratones Adultos

doi: 10.3791/55770 Published: July 13, 2017

Summary

El objetivo del presente estudio fue desarrollar y validar la potencia y la seguridad de la entrega del gen mediado por el virus adeno-asociado al virus espinal 9 (AAV9) mediante el uso de una nueva técnica de administración génica subpial en ratones adultos.

Abstract

Se ha informado previamente sobre el desarrollo exitoso de una técnica de administración vectorial de virus adenoasociado subpial 9 (AAV9) en ratas y cerdos adultos. Mediante el uso de catéteres de polietileno colocados subpialmente (PE-10 o PE-5) para el suministro de AAV9, se ha demostrado una potente expresión del transgén a través del parénquima espinal (materia blanca y gris) en los segmentos espinales inyectados subpialmente. Debido a la amplia gama de modelos de ratones transgénicos de enfermedades neurodegenerativas, existe un fuerte deseo de desarrollar una potente técnica de administración de vector dirigida al sistema nervioso central (CNS) en ratones adultos. Por consiguiente, el presente estudio describe el desarrollo de un dispositivo y una técnica de administración de un vector subpial espinal para permitir el suministro seguro y eficaz de AAV9 espinal en ratones adultos C57BL / 6J. En ratones inmovilizados y anestesiados de forma espi- nada, se inciso la pia-máter (cervical 1 y lumbar 1-2) con una aguja afilada de 34 G usando un manipulador XYZ. Un segundo XYZ maSe usó entonces el nipulador para hacer avanzar una aguja romo de 36G en el espacio subpial lumbar y / o cervical. El vector AAV9 (3-5 μl, 1,2 x 10 13 genoma copias (gc)) que codifica la proteína fluorescente verde (GFP) se inyectó posteriormente subpialmente. Después de las inyecciones, se evaluó periódicamente la función neurológica (motora y sensorial), y los animales se fijaron por perfusión 14 días después del parto con AAV9 con paraformaldehído al 4%. El análisis de secciones horizontales o transversales de la médula espinal mostró expresión transgénica en toda la médula espinal, tanto en la sustancia gris como en la blanca. Además, se observó una intensa expresión de GFP mediada retrogradadamente en los axones motores y neuronas descendentes en la corteza motora, núcleo ruber y formatio reticularis. No se observó disfunción neurológica en ningún animal. Estos datos muestran que la técnica de suministro de vectores subpiales puede usarse con éxito en ratones adultos, sin causar lesión medular relacionada con procedimiento, y se asocia con expresión transgénica muy potenteA través de la neuraxis espinal.

Introduction

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El uso de vectores de AAV para tratar una variedad de trastornos neurodegenerativos de la médula espinal y del SNC se está convirtiendo en una plataforma bien aceptada para aumentar efectivamente la regulación o silenciar la expresión de los genes de interés. Una de las limitaciones clave para la utilización más eficaz de esta tecnología para tratar trastornos del SNC / médula espinal es la limitada capacidad de suministrar el vector AAV al parénquima profundo del cerebro o de la médula espinal en mamíferos adultos.

Se demostró, por ejemplo, que la administración sistémica de AAV9 en roedores adultos, gatos o primates no humanos es sólo moderadamente eficaz para inducir la expresión del transgén en las neuronas del cerebro y la médula espinal 1 , 2 , 3 . También se ha demostrado que la administración intratecal más efectiva de vectores AAV9 conduce a una expresión limitada de transgenes en agrupaciones de neuronas anatómicamente definidas. Más específicamente, han sido demoniosQue el suministro intravenoso intrathecal cisternal o lumbo-sacro en primates, cerdos o roedores no humanos conduce a un alto nivel de expresión de transgenes en las neuronas de ganglio de la raíz dorsal segmentaria. Sin embargo, se observa una mínima o nula expresión en interneuronas espinales o axones ascendentes o descendentes en la sustancia blanca 4 , 5 , 6 , 7 . Colectivamente, estos datos demuestran que existe una barrera biológico-anatómica altamente efectiva, que impide la difusión de AAV intrathecally entregado en el parénquima espinal más profundo.

En un estudio previo con ratas y cerdos adultos, se desarrolló una nueva técnica de administración de vectores subpiales 8 . Utilizando este enfoque, se demostró una expresión transgénica altamente potente y multi-segmental después de un suministro de AAV9 subpial de un solo bolo. La expresión intensa de las buenas prácticas agrariasEn neuronas, células gliales y axones descendentes / ascendentes a través de los segmentos espinales inyectados. Este estudio demostró por primera vez que la pia-máter representa la barrera primaria que limita la difusión efectiva de AAV9 en el parénquima espinal desde el espacio intratecal. Aunque esta técnica previamente desarrollada y el dispositivo de inyección subpial son relativamente fáciles de usar en roedores grandes (como ratas) o cerdos adultos, el sistema no es adecuado para su uso en animales pequeños, tales como ratones adultos. Debido al elevado número de modelos de ratón transgénicos disponibles de una variedad de trastornos neurodegenerativos, existe una clara necesidad de desarrollar una técnica eficaz de administración de parásitos parenquimatosos en ratones. La disponibilidad de tal técnica permitiría el estudio del efecto del silenciamiento génico específico ( por ejemplo, utilizando shRNA) o la sobre-regulación utilizando células no específicas ( por ejemplo, citomegalovirus-CMV o ubiquitina) o células específicas ( por ejemplo, sinapsina o glial Ácido fibrilarProteína (GFAP)) promotores durante el desarrollo postnatal temprano o en condiciones enfermas.

Por consiguiente, en el presente estudio, hemos desarrollado y validado un sistema de suministro de vectores subpiales miniatura que se puede utilizar eficazmente en ratones adultos. De manera similar, como en estudios anteriores de rata y cerdo, este trabajo demuestra una expresión potente del transgén en todo el parénquima espinal después de un suministro de AAV9 subpial de un solo bolo en ratones. La simplicidad de este enfoque, la muy buena tolerabilidad de los ratones inyectados a la administración de AAV9 subpial y la alta potencia de la expresión del transgén en el parénquima espinal sugieren que esta técnica puede aplicarse eficazmente en cualquier laboratorio y utilizada en experimentos dirigidos a la expresión génica espinal.

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Protocol

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Estos estudios se llevaron a cabo bajo un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en San Diego y cumplieron con las directrices de la Asociación de Evaluación de Cuidados de Animales de Laboratorio para uso animal. Todos los estudios se realizaron de tal manera que minimizar el tamaño del grupo y el sufrimiento de los animales.

1. Preparación general de animales y quirúrgicos

  1. Antes de iniciar el procedimiento quirúrgico, descongelar el virus (AAV9-UBI-GFP, 5 μ l alícuotas) [ 8] . Preparar una solución al 5% de dextrano (10.000 MW) mezclando polvo de dextrano en agua destilada. Mezclar la solución de virus con solución de dextrano al 5% 1: 1 hasta una concentración final de dextrano del 2,5%.
    1. Guarde la solución del virus en hielo (4 ° C).
  2. Utilizar ratones adultos C57BL / 6J (macho y hembra, 20-30 g). Anestesiar los ratones utilizando isoflurano al 5% (en O 2 , 1 L / min) y mantenerlos a 2-3% de isoflurano inhalado (en O 2 , 1 L / min) por el cono de la nariz durante la cirugía, dependiendo de la frecuencia respiratoria y la respuesta de pellizco de la pata.
  3. Afeitar la parte posterior de los animales con afeitadoras y limpiar la piel con clorhexidina al 2%.
  4. En los estudios de recuperación crónica seguir una estricta técnica estéril.
  5. Si se realizan inyecciones subpiales lumbares, corte la piel superponiendo las vértebras Th8-L1 con un bisturí y separe el músculo paravertebral de las vértebras espinales Th10-12 usando unas tijeras.
    1. Montar el animal en un marco estereotáxico estándar utilizando pinzas de la columna vertebral del ratón.
    2. Afeitar los dos lados de la lámina de las vértebras Th10-12 usando un taladro dental (broca: 0.9 mm, velocidad: 20.000 rpm) hasta que aparezcan grietas.
    3. Quitar fragmentos de hueso agrietados con fórceps y exponer la superficie dorsal de la médula espinal lumbar.
    4. Cortar la dura alrededor de 1 cm usando una aguja de acero inoxidable 30 G y pinzas.
  6. Quitar la membrana atlanto-occipital de la cisterna magna utilizando una aguja de acero inoxidable 23G y fórceps.
  7. Limpie el sitio de la incisión de cualquier tejido y desechos óseos usando hisopos de algodón.
  8. Cortar la dura alrededor de 2-3 mm con una aguja de acero inoxidable 30 G y una pinza.

2. Apertura de la Membrana Pial e Inserción de la Aguja Subpial para la Entrega del AAV9

  1. Montar la aguja de penetración de 34G en el brazo Z de un manipulador XYZ utilizando un soporte capilar de vidrio ( Figura 1A y B ).
    NOTA: Para fabricar la aguja pia-penetrante, la punta biselada original de la aguja 34G se afila usando un biselador capilar de vidrio con placa abrasiva de diamante - grueso (tamaños de punta de 5,0 μm a 50 μm) y ángulo de molienda de15 - 20º. La punta de la aguja (1 mm de longitud, medida desde la punta) se dobla suavemente hasta aproximadamente 90º ( Figura 1B , inserto izquierdo).
  2. Usando un alcance de disección quirúrgica, ajustado a una ampliación de 8-10 X, penetre el pia con la aguja pia-penetrante en aproximadamente 1 mm ( Figura 1C ) usando el brazo X.
    1. Mantenga el ángulo de la aguja penetrante en la superficie del tejido a 5-10 °.
  3. Después de la abertura del pia, retire la aguja pia-penetrante horizontalmente del espacio subpial ( Figura 1 D) usando el brazo X.
    NOTA: Recuerde el sitio penetrado por un hito, tal como un vaso sanguíneo.
  4. Cargue una aguja de inyección romo de 36G con virus AAV9-UBI-GFP usando una microjeringe de 50 μL conectada a la aguja de inyección con tubo PE-10 o PE-20.
  5. Montar la aguja en el brazo Z de un segundo manipulador XYZ ( Figura 1A B ) usando un soporte capilar de vidrio ( Figura 1B , inserto derecho).
    NOTA: Para fabricar la aguja de inyección subpial AAV9, la punta roma de una aguja de 36 G se pulida usando un biselador capilar de vidrio con placa abrasiva de diamante - grueso (tamaños de punta de 5,0 μm a 50 μm) para eliminar los bordes afilados. La punta de la aguja (2-3 mm de longitud, medida desde la punta) se dobla entonces suavemente hasta aproximadamente 90 °. Las agujas de inyección pia-penetrante y subpial se insertan en una tubería de acero inoxidable esclavo 20G de 1 a 2 cm de longitud (10 mm desde el extremo de la aguja) y se pegan con epoxi. Se requiere el uso de tubos de 20 G (0,91 mm de diámetro) para una fijación segura al soporte capilar de vidrio.
  6. Mediante la manipulación de los brazos X, Y y Z del segundo manipulador, colocar la punta de la aguja de inyección de AAV9 en el sitio pia-penetrado y luego avanzar alrededor de 2-3 mm en el espacio subespacial a través de la abertura anterior de la membrana pial utilizando la Brazo X( Figura 1E y F ).
    NOTA: 1) El AAV9-UBI-GFP se prepara de acuerdo con los protocolos 9 , 10 y los títulos finales se ajustan a 1,2 x 10 13 copias del genoma por ml (gc / mL). 2) No hay necesidad de marcar el sitio de la apertura pial porque es fácilmente identificable ( Figura 1D ).
  7. Inyectar el AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 o 5 μL) en el espacio subespacial utilizando una microjeringe de 50 μL (véase la Tabla 1 para los grupos experimentales).
  8. Retire la aguja de inyección del espacio subespacial después de que la inyección de AAV9-UBI-GFP esté completa.
  9. Cierre el músculo y la piel con sutura monofilamento 4.0 y clips quirúrgicos.
    NOTA: No hay necesidad de sellar la vértebra abierta.
  10. Permita que los animales se recuperen en una almohadilla de calefacción.
  11. Para el control del dolor inyectar Buprenorfina 0,05 mg / kg / sc cada 12 h para2-3 días después de la cirugía.

3. Fijación por perfusión, crioprotección tisular y tinción con inmunofluorescencia

  1. En un punto de tiempo predeterminado después de las inyecciones de AAV9 subpial, anestesiar profundamente a los ratones con solución de eutanasia (véase la Tabla de Materiales , 0,3 ml) y perfundirlos transcardialmente con 20 ml de solución salina heparinizada seguida de 20 ml de paraformaldehído al 4% en PBS.
  2. Se disecan las médulas espinales y los cerebros usando un rongeur óseo y se fijan en 4% de formaldehído en PBS durante la noche a 4 ° C.
  3. Cryoprotect las médulas espinales y cerebros con 30% de sacarosa en PBS durante un mínimo de 5-7 días.
  4. Cortar cortes coronales, transversales o longitudinales / horizontales congelados (30 μm de grosor) en un criostato y almacenarlos en PBS a 4 ° C.

4. Tinción de inmunofluorescencia de la médula espinal y secciones del cerebro (Ver la tabla de materiales)

  1. Incubar secciones flotantes en primarioY durante la noche.
  2. Después de la incubación con anticuerpos primarios, lavar las secciones tres veces en PBS e incubar con anticuerpos anti-conejo, burro anti-pollo y burro anti-cabra conjugados con fluorescencia.
  3. Montar las secciones en portaobjetos microscópicos, secarlos a temperatura ambiente y cubrirlos con un medio anti-fade.
  4. Capture imágenes usando microscopio de fluorescencia de epifluorescencia (objetivos: 10X, NA-0.3, 20X, NA-0.8 y 63X, NA-1.4).

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Representative Results

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Potente Transgene Expresión en Subpially AAV9 inyectado Segmentos:
El análisis de la expresión del transgén (GFP) en las secciones de la médula espinal a los 14 días después de la administración de AAV9 mostró una expresión de la GFP dependiente de la dosis de AAV9 en todo el parénquima espinal. En primer lugar, dos inyecciones bilaterales de 3 μl de AAV9-UBI-GFP inyectadas en el espacio subpial lumbar superior se asociaron con la infección casi completa de la sustancia blanca y gris en toda la médula espinal lumbar, extendiéndose a los segmentos torácicos superiores ( Figura 2A Y 2B , columnas izquierda y media). Dos inyecciones bilaterales de 1,5 μl de AAV9-UBI-GFP en el espacio subpial lumbar superior se asociaron con una infección similar casi completa de la sustancia blanca y gris en toda la médula espinal lumbar (como se observó después de inyecciones de 3 μL); Sin embargo, los segmentos medio-torácicos mostraron solamente neuronas ocasionalmente infectadas (Ass = "xfig"> Figura 2B, columna derecha). La tinción con α-motoneurón específicos (ChAT) y neuronas específicas (NeuN) anticuerpos mostraron expresión GFP consistente en toda la población de lumbar α-motoneuronas ( Figura 2C ) y interneuronas localizadas en el cuerno dorsal ( Figura 2D ), zona intermedia Figura 2E ), y el cuerno ventral ( Figura 2F ]. En segundo lugar, dos inyecciones cervicales bilaterales de AAV9 (5 μL para cada inyección) produjeron una expresión similar de GFP en la sustancia blanca y gris en toda la médula espinal cervical (materia gris y blanca) y en los segmentos torácicos superiores ( Figura 3A y 3B ) . El análisis de las secciones de la médula espinal lumbar en los mismos animales mostró una alta densidad de GFP + axones descendentes que terminan en la vecindad de la lumbar GFP negativo α-motoneuronas y interneuronas ( Figura 3CY 3D ). La administración de dos inyecciones cervicales bilaterales y dos inyecciones lumbares bilaterales de AAV9 (5 μl para cada inyección) se asoció con la expresión de GFP en toda la médula espinal, desde el segmento cervical superior hasta el sacro, y se encontraba homogéneamente presente en la sustancia blanca y gris ( Figura 3E - 3H ).

Retrógrada y Anterógrada Transgénica Mediada por Transporte Expresión en Centros Sensores y Motor Supraspinal:
La expresión generalizada GFP en la médula espinal lumbar o cervical después del parto subcutáneo AAV9 se asoció con robusta retrógrada y anterógrada infección mediada por la positividad GFP en el supraspinal descendente axones y sus neuronas en proyección y en los axones y terminales de los tractos ascendentes ( Figura 4 ]. Así, la positividad GFP intensa se observó en las neuronas localizadas en la formación reticular (RF), Núcleo ruber (NR) y corteza motora (MC) ( Figura 4B- 4D ). Del mismo modo, clara inmunoreactividad GFP se observó en las terminales de la espinocerebelosa (SCT), spinoreticular, y spinothalamic tracts (STT) ( Figura 4B- 4D ).

Figura 1
Figura 1 : Configuración experimental para realizar inyecciones subpiales espinales en un ratón adulto. ( A ) Para realizar inyecciones subpiales espinales en ratones adultos, se usan dos manipuladores XYZ separados (I y II). ( B ) El brazo Z de cada manipulador sostiene un soporte capilar de vidrio. Un sujetador capilar sostiene la aguja pia-penetrante de 34 G, y el segundo sostiene la aguja de inyección subpial romo de 36 G. ( C , D , E , y F) Imágenes que representan la posición de la aguja pia-penetración justo después de la punción pia (C; duramadre ya se elimina), después de la eliminación de la pia de penetración de la aguja (D), después de la inserción de la punta de la aguja de inyección subpial ( E ), y después de avanzar la aguja de inyección subpial 3 mm en el espacio subespacial ( F ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2 : Expresión potente de la GFP parenquimatosa espinal después de la administración de AAV9-UBI-GFP subpial lumbar en ratones adultos. ( A ) Se administraron dos inyecciones bilaterales de AAV9-UBI-GFP (inyecciones de 1,5 o 3 μl cada una) en la parte lumbar superiorEl espacio ubpial y los animales se fijaron por perfusión 14 días después del parto con AAV9. ( B ) En animales inyectados con 3 + 3 μl de AAV9 (columnas izquierda y media) se observa una expresión intensa de GFP en el gris (dentro del área punteada) y en la sustancia blanca, que se extiende desde el segmento lumbar hasta el segmento torácico superior. ( C, D, E y F ) La co-tinción de secciones transversales de la médula espinal tomadas de la ampliación lumbar en animales inyectados con 3 + 3 μl de AAV9 muestran la expresión de GFP en virtualmente todos los α- Motoneuronas ( C y F ) y interneuronas positivas a NeuN en el cuerno dorsal ( D ) y la zona intermedia ( E ). Barras de escala = 1.000 μm (B); 30 mu m (C); 100 mu m (DF). DH: cuerno dorsal; LV: lámina V; VH: cuerno ventral. Haga clic aquí para ver un mapa más grandeRsión de esta cifra.

figura 3
Figura 3: Comparación de la expresión de GFP espinal Después espinal subpial cervical frente espinal subpial Cervical más subpial Lumbar AAV9-UBI-GFP Entrega en ratones adultos. ( A, B, C y D ) Sección horizontal corte a través de toda la longitud de la médula espinal en un animal que previamente recibió inyecciones subpiales cervicales superiores de AAV9-UBI-GFP (5 + 5 μL). Se puede observar una expresión intensa de GFP en la sustancia blanca y gris en la región cervical ( B ). En la médula espinal lumbar, se puede identificar una alta densidad de GFP + axones descendentes en el funículo lateral (LF) y la materia gris entre neuronas positivas a NeuN pero GFP negativas ( C y D ). ( E, F, G y H Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4 Rong>: potente retrógrado y anterógrado AAV9-UBI-GFP mediada GFP expresión en el cerebro del motor y los centros sensoriales. ( A ) Una imagen de baja potencia que muestra la presencia de intensa positividad GFP en la médula espinal cervical, medula oblonga, cerebelo y corteza motora (MC). ( B ) Una imagen de mayor potencia tomada de una sección sagital del cerebro y que muestra la presencia de fluorescencia GFP en neuronas en la formación reticular (RF), el núcleo ruber (NR) y los axones del tracto espino-cerebeloso (SCT). ( C ) Una imagen de menor potencia tomada de secciones cerebrales coronales que muestra la presencia de fluorescencia GFP en neuronas piramidales en la corteza motora (MC) y en las terminales del tracto espinotalámico en áreas de los núcleos talámicos reticulares (STT). ( D ) Una imagen de alta potencia que demuestra una intensa expresión de GFP en neuronas piramidales en la corteza motora. Barras de escala = 2.000 mu m (A); 1.000 $ μ $ m (B y C); 60 mu m (D).Csource.jove.com/files/ftp_upload/55770/55770fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Grupos Experimentales Sitio / nivel de entrega de AAV9 (*) Volumen de AAV9 inj, velocidad de infusión Tiempo de supervivencia Análisis de tejidos
Grupo A (n = 7) C2 (bilateral) 5 μL / 5 min 14 dias Cerebro + médula espinal
Grupo B (n = 12) L1-L2 (bilateral) 1,5 μl o 3 μl, 60 seg / μl 14 dias Cerebro + médula espinal
Grupo C (n = 6) C2 + L1-L2 (bilateral en cada nivel) 5 μL / 5 min 14 dias Médula espinal
Bilateral= Dos inyecciones subpiales una entregada en el derecho y una en el espacio subpial izquierdo del segmento (s) inyectado (s).

Tabla 1: Grupos Experimentales. Todos los experimentos se realizaron en adultos C57BL / 6J ratones.

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Discussion

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El presente estudio describe una técnica de suministro de vectores subpiales (AAV9) en ratones adultos. Como se demuestra en el video adjunto, este enfoque y técnica pueden utilizarse eficazmente, siempre que los instrumentos requeridos y la aguja pia-penetrante y la aguja de inyección subpial sean fabricados apropiadamente, de acuerdo con las especificaciones establecidas y probadas.

Variables técnicas críticas en la realización de una inyección subpial consistente y segura en ratones:
Como se ha demostrado, una inyección subpial se puede realizar fácilmente en ratones anestesiados adultos después de una laminectomía dorsal cervical o lumbar. Existen varias variables técnicas críticas que definen el éxito de la técnica de inyección subpial. En primer lugar, la punta de la aguja de penetración de 34 G debe ser afilada constantemente usando un biselador para asegurar la punción lisa del pia. Cualquier inconsistencia en la técnica sobre cómo afilar la aguja puedeDurante la penetración de pia y / o puede causar lesión de la columna vertebral usando demasiada fuerza para pinchar la pia. Bajo circunstancias normales (como se muestra en el video y en la Figura 1C y D ), el sitio de la abertura pia no muestra ningún signo de lesión de la médula espinal o hemorragia subpial. En algunos casos, puede observarse alguna hemorragia subpial, pero no se asoció con disfunción neurológica o alteración de la expresión génica después del parto con AAV9. En segundo lugar, es importante mantener el sitio quirúrgico libre de sangre después de que la duramadre se elimina mediante electrocauterización. Cualquier residuo de sangre puede obscurecer la identificación fiable de la superficie pia, incluso si se utiliza un microscopio quirúrgico. Como se muestra en la Figura 1C-F , un sitio de laminectomía libre de sangre puede mantenerse eficazmente usando piezas pequeñas de gel-espuma para cubrir la vértebra laminectomizada y el tejido blando circundante. En tercer lugar, debe prestarse especial atención a la colocación adecuada de animales anestesiadosEspinal y la inmovilización de la columna vertebral mediante pinzas espinales. El uso de demasiada presión durante la colocación de las pinzas espinales puede causar ruptura vertebral; El uso de presión insuficiente puede conducir a un aflojamiento progresivo de la vértebra inmovilizada, lo que suele ocurrir una vez que se utiliza un taladro dental para realizar la laminectomía.

El volumen de AAV9 inyectado subpialmente se correlaciona con la magnitud de la expresión del transgén rostro-caudal. Por lo tanto, el uso de dos inyecciones de AAV9 subpial lumbar bilateral (3 + 3 μl o 5 + 5 μL) se asoció con una expresión consistente de GFP en toda la sustancia lumbar gris y blanca, extendiéndose hasta los segmentos torácicos superiores. Hubo una variabilidad mínima entre los animales utilizados. Los volúmenes de inyección de AAV9 de 1,5 + 1,5 mu l condujeron a una expresión de GFP similar en los segmentos localizados en la vecindad de las inyecciones; Sin embargo, la propagación del virus y la expresión resultante de GFP se limitó en los segmentos torácicos (

Limitación de la técnica de entrega del gen subpial:
Una de las limitaciones relativas de la técnica de inyección subpial (en comparación con el parto intratecal) es la naturaleza más invasiva de este enfoque cuando se debe realizar una laminectomía dorsal para permitir el acceso a la superficie dorsal de la médula espinal. Sin embargo, la potente expresión de transgenes observada a lo largo de la médula espinal y en los centros cerebrales supraspinales parece demostrar la clara ventaja sobre el suministro intrathecal de AAV, que se caracteriza por la expresión selectiva del transgén en una subpoblación de α-motoneuronas y aferentes primarios (pero no está presente En neuronas en las capas más profundas de la médula espinal) 8 .

Aplicaciones futuras del SubpiAl Gene Técnica de entrega:
De manera similar, como se demostró en estudios previos en ratas y cerdos adultos, se puede conseguir una expresión transgénica altamente efectiva en la sustancia blanca y gris espinal en ratones adultos usando el suministro subagudo de AAV9. Además, debido a las dimensiones relativamente más pequeñas (particularmente la longitud) de la médula espinal del ratón, el suministro de AAV9 sólo a dos niveles de la médula espinal (cervical superior y lumbar superior) es suficiente para conducir a una infección casi completa de la médula espinal. Esta característica puede tener una implicación importante en el diseño de tratamientos modificadores de la enfermedad específicos, ya sea mediante el silenciamiento génico dirigido o la regulación positiva.

Por ejemplo, utilizando vectores de silenciamiento de shRNA, se espera que una disminución altamente efectiva en la expresión de genes mutados ( por ejemplo, SOD en el caso de la forma hereditaria de ALS) se logre en toda la médula espinal, así como en espinales -proyecto de núcleos motor del cerebro. Segundo,Debido a la infección altamente efectiva de los axones de la sustancia blanca espinal, los genes terapéuticos ( p. Ej., Que codifican factores de crecimiento) pueden ser regulados para promover el brote axonal en animales traumatizados traumáticos. Tercero, manipulando el volumen o el título de virus suministrado subpialmente, así como el sitio de inyección subpial, la expresión del transgén puede dirigirse a una región discreta de la médula espinal ( por ejemplo, el cuerno dorsal unilateral). La expresión transgénica localizada puede utilizarse potencialmente en el tratamiento del dolor o de la modificación de la espasticidad muscular mediante la regulación positiva de sistemas neurotransmisores inhibidores ( por ejemplo, GABA) o sistemas excitadores inhibidores ( por ejemplo, el sistema de receptores acoplados al glutamato). En cuarto lugar, además de la liberación de AAV, otras moléculas o vectores con mala permeabilidad de la barrera hematoencefálica ( por ejemplo, micro ARN) serán más eficazmente administrados al parénquima espinal después de la administración subpial. Estos pueden ser probados efectivamente por usinG la técnica descrita en este manuscrito. Finalmente, como se demostró en el presente estudio, la técnica subpial se puede utilizar con éxito en ratones adultos con pesos corporales medios (BW) entre 20 y 30 g. Por lo tanto, es probable que la misma técnica y configuración experimental se pueda emplear en otras especies animales con BW similar ( por ejemplo, cachorros de rata Sprague-Dawley (SD)). El BW de P6 y P21 SD ratas es de alrededor de 17 y 62 g, respectivamente. El uso de los cachorros de rata durante la etapa temprana del desarrollo postnatal puede ser una herramienta útil para estudiar el papel de la regulación de genes específicos o downregulation en el desarrollo de circuitos neuronales espinales y procesamiento sensorial y motor.

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Disclosures

Martin Marsala es cofundador de Neurgain Technologies, Inc. (San Diego, EE.UU.).

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por la concesión de la Fundación SANPORC y ALSA (Martin Marsala); El Programa Nacional de Sostenibilidad, número de proyecto LO1609 (Ministerio Checo de Educación, Juventud y Deportes); Y RVO: 67985904 (Stefan Juhas y Jana Juhasova).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J Mice Jackson Labs 664
Lab Standard Stereotaxic for Mice Harvard Apparatus 72-9568
Mouse Spinal Adaptor Harvard Apparatus 72-4811
XYZ Manipulator Stoelting 51604
Manual Infusion Pump Stoelting 51218
34G Beveled Nanofill Needle World Precision Instruments NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle World Precision Instruments NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane MWI Veterinary Supply 502017
Chlorhexidine Solution MWI Veterinary Supply 501027
20G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305175
23G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305145
30G Stainless Steel Needle Becton-Dickinson 305128
Cotton Tipped Applicator MWI Veterinary Supply 27426
Glass Capillary Beveller  Narishige International SM-25B
Slide Microscope Superfrost Leica Microsystems M80
50 μL Microsyringe  Hamilton 81242
BD Intramedic PE-20 Tubing Becton, Dickinson 427406
BD Intramedic PE-10 Tubing Becton, Dickinson 427401
4-0 monofilament suture VetOne V1D397
Glass Capillary Beveller  Narishige Pipet Micro Grinder EG-40 
5 min Epoxy (Epoxy Clear) Devcon 14310
Euthanasia Solution MWI Veterinary Supply 11168
Heparin Inj 1,000 U/mL MWI Veterinary Supply 54254
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Anti NeuN Antibody EMD-Millipore ABN78 Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody EMD-Millipore AB144P Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody Aves Labs GFP-1020 Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A21207 Secondary Antibody, 1:1000
 Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 ThermoFisher Scientific A10043 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Jackson Immunoresearch Labs 703-545-155 Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 Abcam ab150131 Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost Fisher Scientific 12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant Fisher Scientific P36930
Epifluorescence Microscope Zeiss Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope Olympus Olympus FV1000
Dextran Polysciences, Inc 19411
AAV9-UBC-GFP UCSD Viral Vector Core Laboratory

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References

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Adenovirus Subagonal Asociado 9 (AAV9) Vector Entrega en Ratones Adultos
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Tadokoro, T., Miyanohara, A., Navarro, M., Kamizato, K., Juhas, S., Juhasova, J., Marsala, S., Platoshyn, O., Curtis, E., Gabel, B., Ciacci, J., Lukacova, N., Bimbova, K., Marsala, M. Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice. J. Vis. Exp. (125), e55770, doi:10.3791/55770 (2017).More

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