Summary
Bu çalışmanın amacı yetişkin farelerde yeni bir subpial gen dağıtım tekniği kullanarak spinal adeno-ilişkili virüs 9 (AAV9) aracılı gen dağıtımının potensi ve güvenliğini geliştirmek ve doğrulamaktı.
Abstract
Yetişkin sıçanlarda ve domuzlarda subpeal bir adeno-ilişkili virüs 9 (AAV9) vektör nakli tekniğinin başarıyla geliştirilmesi daha önce bildirilmiştir. AAV9 sunumu için sub-polial polietilen kateteri (PE-10 veya PE-5) kullanarak subpial enjekte edilmiş spinal segmentlerdeki spinal parankima boyunca (beyaz ve gri madde) güçlü transgen ekspresyonu gösterilmiştir. Nörodejeneratif hastalıkların geniş çaplı transgenik fare modelleri nedeniyle, yetişkin farelerde güçlü bir merkezi sinir sistemi (CNS) hedefli vektör nakli tekniğinin geliştirilmesi için güçlü bir istek vardır. Buna göre, bu çalışmada yetişkin C57BL / 6J farelerinde güvenli ve etkili spinal AAV9 verilmesine izin veren bir spinal subpial vektör nakil cihazının ve teknik geliştirilmesi açıklanmaktadır. Spinal olarak immobilize ve anestezi uygulanmış farelerde, pia mater (servikal 1 ve lumbar 1-2 spinal segmental düzey), bir XYZ manipülatörü kullanılarak keskin bir 34G iğne ile kesilmiştir. İkinci bir XYZ maNipulator daha sonra lomber ve / veya servikal subpial alana künt bir 36G iğne ilerletmek için kullanıldı. Daha sonra, yeşil flüoresan proteini (GFP) kodlayan AAV9 vektörü (3-5 uL, 1.2 x 10 13 genom kopyaları (gc)) subpial olarak enjekte edildi. Enjeksiyondan sonra nörolojik fonksiyon (motor ve duyu) periyodik olarak değerlendirildi ve hayvanlar% 4 paraformaldehitle AAV9 verildikten 14 gün sonra perfüzyonla sabitlendi. Yatay veya transvers omurilik kesitlerinin analizi, gri ve beyaz maddelerin tümünde omurilik boyunca transgen ekspresyonu gösterdi. Buna ek olarak, motor kortekste, çekirdek ruberinde ve formatio retikularda inen motor aksonlarda ve nöronlarda, retrograd olarak aracılık edilen yoğun GFP ekspresyonu görüldü. Herhangi bir hayvanda hiçbir nörolojik bozukluk kaydedilmedi. Bu veriler, subpial vektör sunum tekniğinin prosedürle ilişkili omurilik hasarına neden olmaksızın erişkin farelerde başarıyla kullanılabileceğini ve son derece güçlü transgen ekspresyonlarıyla ilişkili olduğunu göstermektedirOmurilik nöraksileri boyunca.
Introduction
Çeşitli omurilik ve SSS nörodejeneratif bozukluklarını tedavi etmek için AAV vektörlerinin kullanılması ilgi gen (ler) in ekspresyonunu etkili bir şekilde arttırmak veya susturmak için iyi kabul görmüş bir platform haline gelmektedir. CNS / omurilik bozukluklarını tedavi etmek için bu teknolojinin daha etkin kullanılması için en önemli sınırlamalardan biri, yetişkin memelilerde AAV vektör (ler) ini derin beyne veya omurilik parankimine sunma yeteneğinin sınırlı olmasıdır.
Örneğin AAV9'un yetişkin kemirgenlerde, kedilerde veya insan dışı primatlarda sistemik olarak verilmesinin, beyinde ve omurilikte bulunan nöronlarda 1 , 2 , 3 nolu transgen ekspresyonunu indüklemede sadece orta derecede etkili olduğu gösterildi. AAV9 vektörlerinin daha etkin intratekal sunumunun, anatomik olarak tanımlanmış nöron havuzlarında sadece sınırlı transgenin ekspresyona yol açtığı gösterilmiştir. Daha özel olarak, iblisler olduInsan dışı primatlarda, domuzlarda veya kemiricilerde sisternal veya lumbo-sakral intratekal AAV9 verilmesinin spinal α motonöronlarında ve segmental dorsal kök ganglion nöronlarında yüksek düzeyde transgene eksprese edildiğini belirtti. Bununla birlikte, beyaz cevherde spinal internöronlarda veya artan veya azalan aksonlarda minimal veya hiç ifade görülmemektedir 4 , 5 , 6 , 7 . Toplu halde, bu veriler, intratekal olarak verilen AAV'nin daha derin spinal parankime yayılmasını önleyen, oldukça etkili bir biyolojik anatomik bariyer bulunduğunu göstermektedir.
Yetişkin sıçan ve fareleri kullanılarak Önceki bir çalışmada, yeni bir subpial vektör dağıtım tekniği 8 geliştirilmiştir. Bu yaklaşımı kullanarak, tekli bolus subpial AAV9 sunumundan sonra çok kuvvetli ve çok segmentli transgen ekspresyonu gösterildi. Yoğun GFP ifadesi sürekli olarak görüldüEnjekte edilmiş spinal segmentler vasıtasıyla nöronlarda, glial hücrelerde ve inen / yükselen aksonlarda. Bu çalışma, pia mater'in intratekal alanın spinal parankim içine etkili AAV9 difüzyonunu sınırlayan birincil bariyeri temsil ettiğini ilk kez gösterdi. Bu önceden geliştirilmiş teknik ve subpial enjeksiyon cihazı büyük kemirgenlerde (sıçanlar gibi) veya yetişkin domuzlarda nispeten kolaydır; ancak sistem yetişkin fareler gibi küçük hayvanlarda kullanım için uygun değildir. Çeşitli nörodejeneratif bozukluklara sahip mevcut transjenik fare modellerinin sayısının yüksek olması nedeniyle farelerde etkili bir spinal-parankimal vektör nakli tekniğinin geliştirilmesine açık bir ihtiyaç vardır. Böyle bir tekniğin varlığı spesifik gen sessizleşmesinin etkisini ( örneğin shRNA kullanarak) veya hücreye özgü olmayan ( örneğin sitomegalovirüs-CMV veya Ubiquitin) veya hücreye spesifik ( örn., Sinapsin veya glial Fibriler asidikProtein (GFAP) promotörlerinin erken postnatal gelişimi sırasında veya hastalıklı koşullar altında.
Buna göre, bu çalışmada, yetişkin farelerde etkili bir şekilde kullanılabilen minyatür bir subpial vektör iletim sistemini geliştirdik ve doğruladık. Benzer şekilde, önceki sıçan ve domuz çalışmalarında olduğu gibi, bu çalışma farelerde tekli bolus subpial AAV9 verilmesinden sonra omurilik parankim boyunca güçlü bir transgen ekspresyonunu göstermektedir. Bu yaklaşımın basitliği, enjekte edilen farelerin subpial AAV9 sunumu için çok iyi tolere edilebilirliği ve spinal parankimdeki transgen ekspresyonunun yüksek gücü, bu tekniğin herhangi bir laboratuar ortamında etkili bir şekilde uygulanabileceğini ve spinal gen ekspresyonunu hedefleyen deneylerde kullanılabileceğini düşündürmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmalar, San Diego Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan ve hayvan kullanımı için Laboratuar Hayvan Bakımı yönergelerinin Değerlendirilmesi Derneği ile uyumlu bir protokol çerçevesinde yürütülmüştür. Tüm çalışmalar, grup büyüklüğünü ve hayvan acısını en aza indirecek şekilde yapıldı.
1. Genel Hayvan ve Cerrahi Hazırlık
- Cerrahi prosedürü başlatmadan önce virüsü çözdürün (AAV9-UBI-GFP, 5 μL alikotlar) 8 . Damıtılmış suda dekstran tozunu karıştırarak% 5 dekstran (10,000 MW) solüsyonu hazırlayın. Virüs çözeltisini,% 2.5'lik bir son dekstran konsantrasyonuna kadar% 5 dekstran çözeltisi 1: 1 ile karıştırın.
- Virüs çözeltisini buzda (4 ° C) saklayın.
- Yetişkin C57BL / 6J fareler kullanın (erkek ve dişi, 20-30 g). Farelerde% 5 izofluran (O 2 , 1 L / dakika) ile anestezi uygulayın ve 2Solunum hızına ve pençe tutam tepkisine bağlı olarak cerrahi sırasında burun konisi ile% 3 inhale izofluran (O 2 , 1 L / dakika).
- Hayvanların tıraş tıraş makası ile tıraş edin ve cildi% 2 klorheksidin ile temizleyin.
- Kronik iyileşme çalışmalarında sıkı bir steril teknik izleyin.
- Lomber subpial enjeksiyonlar yapılacaksa, Th8-L1 vertebra üzerine örtülü bir deri kestiği bir bisturi ile kesin ve makas kullanarak paravertebral kası Th10-12 spinal vertebradan ayırın.
- Fareyi omurga kelepçeleri kullanarak standart bir stereotaksik çerçeveye yerleştirin.
- Çatlaklar görününene kadar Th10-12 omurganın katının her iki tarafını bir diş matkabı (matkap ucu: 0.9 mm, hız: 20.000 dev / dak) ile tıraş edin.
- Kırık kemik parçalarını forsepsle çıkarın ve bel omurgasının dorsal yüzeyini ortaya çıkarın.
- 30 g paslanmaz çelik bir iğne ve forseps kullanarak durayı 1 cm kadar açık bırakın.
- 23G paslanmaz çelik bir iğne ve forseps kullanarak cisterna magnanın atlanto-oksipital zarını çıkarın.
- Pamuklu çubuk kullanarak herhangi bir doku ve kemik enkazının kesi bölgesini temizleyin.
- Durayı, 30 G paslanmaz çelik bir iğne ve forseps kullanarak 2-3 mm kadar kesip kesin.
2. Piyel Membranının Açılması ve AAV9 Tesliminde Alt İğne Takılması
- 34 G pia delici iğneyi, bir cam kılcal tutucu kullanarak bir XYZ manipülatörünün Z-koluna takın ( Şekil 1A ve B ).
NOT: Pia delici iğneyi üretmek için, 34G iğnenin orijinal eğimli ucu, elmas aşındırıcı plakalı (kaba (5.0 μm ila 50 μm uç boyutları) cam kılcal bir beveller ve bileme açısı15 - 20 °. İğnenin ucu (1 mm uzunluk, ucundan ölçülür) yaklaşık 90 ° derece hafifçe bükülür ( Şekil 1B , sol uç). - Cerrahi bir diseksiyon kapsamı kullanarak, 8-10 X büyütme noktasına ayarlayın, pia'yı pia nüfuz eden iğne ile X-kolunu kullanarak yaklaşık 1 mm ( Şekil 1C ) geçirin.
- 5-10 ° C'de doku yüzeyine nüfuz eden iğnenin açısını koruyun.
- Pia açıldıktan sonra, X-kolunu kullanarak pia penetrasyon iğnesini alt yüzey alanından yatay olarak çıkarın ( Şekil 1 D).
NOT: Girilen bölgeyi bir kan damarı gibi bir yer işareti ile hatırla. - PE-10 veya PE-20 hortumu ile enjeksiyon iğnesine bağlı 50 μL'lik bir mikrosirajı kullanarak AAV9-UBI-GFP virüsü ile künt bir 36G enjeksiyon iğnesi yerleştirin.
- İğneyi ikinci bir XYZ manipülatörünün Z-koluna monte edin ( Şekil 1A B ) bir cam kılcal tutucu ( Şekil 1B , sağ ekleme) kullanarak.
NOT: Alt AAV9 enjeksiyon iğnesi üretmek için, 36 G'lik bir iğnenin künt ucu, keskin kenarları kaldırmak için elmas aşındırıcı plakalı kaba (5.0 μm ila 50 μm uç boyutları) bir cam kılcal eğimli bez kullanarak cilalanır. İğnenin ucu (2-3 mm uzunluğunda, ucundan ölçülür) yaklaşık 90 ° derece hafifçe bükülür. Pia nüfuz eden ve subpial enjeksiyon iğneleri, 1-2 cm uzunluğundaki 20G köle paslanmaz çelik boruya (iğnenin ucundan 10 mm uzaklıkta) sokulur ve epoksi ile yapıştırılır. Cam kılcal tutucuya güvenli bir şekilde tutturmak için 20 G (0,91 mm çaplı) boru kullanılması gereklidir. - İkinci manipülatörün X, Y ve Z kollarını manipüle ederek, AAV9 enjeksiyon iğnesinin ucunu pia nüfuz etmiş bölgeye yerleştirin ve daha sonra bir önceki piyel membran açılımı boyunca alt yüzey alanına 2-3 mm ilerletin. X-kolu( Şekil 1E ve F ).
NOT: 1) AAV9-UBI-GFP, daha önce bildirilen protokoller 9 , 10'a göre hazırlanır ve nihai titreler mL başına (gc / mL) 1.2 x 10 13 genom kopyasına ayarlanır. 2) Kolaylıkla tanımlanabileceği için çukur açma bölgesinin işaretlenmesine gerek yoktur ( Şekil 1D ). - AAV9-UBI-GFP'yi (1.5, 3 veya 5 μL) 50 μL'lik bir mikro-şırınga kullanarak subspektif alana enjekte edin (deneysel gruplar için Tablo 1'e bakın).
- AAV9-UBI-GFP enjeksiyonu tamamlandıktan sonra enjeksiyon iğnesini alt yüzey alanından çıkarın.
- 4.0 monofilament sütür ve cerrahi klipsleri kullanarak kas ve cildi kapatın.
NOT: Açık omurgayı sızdırmaya gerek yoktur. - Hayvanların bir ısıtma masasında iyileşmesine izin verin.
- Ağrı kontrolü için her 12 saatte 0.05 mg / kg / sn Buprenorfin enjekte edilirAmeliyattan 2-3 gün sonra.
3. Perfüzyon-fiksasyon, Doku KriyroKoruma ve İmmünofloresan Boyama
- Alt AAV9 enjeksiyonlarından sonra önceden belirlenmiş bir zaman noktasında, ötenazi solüsyonu ( Madde Tablosu , 0.3 mL) ile fareleri derinden anestezi altına alınız ve bunları 20 mL heparinize salin ile transkardiyolden perfüze ettikten sonra 20 mL% 4 paraformaldehid PBS içinde perfüze edin.
- Omurga kordlarını ve beyinlerini bir kemik rongeur kullanarak parçalara ayırın ve gece boyunca 4 ° C'de PBS'de% 4 formaldehitle post-fix edin.
- Omurga kordlarını ve beyinlerini 5-7 gün minimum süreyle PBS içinde% 30 sükroz ile kriyoprotekte edin.
- Bir kriyostat üzerinde koronal, transvers veya uzunlamasına / yatay dondurulmuş kesitleri (30 μm kalınlıkta) kesin ve 4 ° C'de PBS'de saklayın.
4. Omurilik ve Beyin Bölümlerinin İmmünofloresan Boyaması (Bkz. Malzeme Tablosu)
- Serbest yüzen bölümleri ilk aşamada kuluçkalayınY antikorlarını gece boyunca.
- Birincil antikorlar ile inkübasyondan sonra, bölümleri PBS içinde üç kez yıkayın ve flüoresan eşlenik eşek anti-tavşan, eşek anti-tavuk ve eşek anti-keçi ikincil antikorlarla inkübe edin.
- Mikroskopik slaytlar bölümleri monte edin, oda sıcaklığında kurutun ve bir anti-solmaya ortamı ile örtün.
- Epifloresan floresan mikroskopu (hedefler: 10X, NA-0.3; 20X, NA-0.8 ve 63X, NA-1.4) kullanarak görüntü yakalama.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Subpial AAV9 Enjeksiyonlu Kesitlerdeki Potansiyel Transgen Ekspresyonu:
AAV9 verilmesinden 14 gün sonra omurilik bölümlerindeki transgene (GFP) ekspresyon analizi, spinal parankim boyunca AAV9 dozuna bağımlı GFP ekspresyonu gösterdi. Önce, üst bel subpial alanına enjekte edilen iki bilateral 3 μL AAV9-UBI-GFP enjeksiyonu, tüm lomber omurilikte üst torakal segmentlere uzanan beyaz ve gri maddenin yakın komşuluğu ile ilişkilendirildi ( Şekil 2A Ve 2B , sol ve orta sütunlar). AAV9-UBI-GFP'nin üst bel alt alanı alanına iki bilateral 1.5 mcL enjeksiyonu, tüm lomber omurilikte beyaz ve gri maddenin (yaklaşık 3 μL enjeksiyon sonrasında görüldüğü gibi) yakın benzer bir enfeksiyon ile ilişkilendirildi; Bununla birlikte, orta torasik kesimler bazen enfekte nöronlar göstermiştir (Ass = "xfig"> Şekil 2B, sağ sütun). Α-motoneuron spesifik (ChAT) ve nöron spesifik (NeuN) antikorlar ile boyama, sırt boynuzu ( Şekil 2D ), orta bölge ( Şekil 2C ) ve lümenli α motonöronlarının ( Şekil 2C ) ve internöronların lokalize olduğu tüm popülasyonda tutarlı GFP ekspresyonu gösterdi Şekil 2E ) ve ventral boynuz ( Şekil 2F ). İkinci olarak, AAV9'un iki bilateral servikal enjeksiyonu (her enjeksiyon için 5 μL) servikal omurilikte (gri ve beyaz madde) ve üst torakal segmentlerde beyaz ve gri materyalde benzer GFP ekspresyonuna yol açtı ( Şekil 3A ve 3B ) . Aynı hayvanlardaki lomber omurilik bölümlerinin analizi, lomber GFP negatif α motonöronları ve internöronların yakınında sona eren yüksek yoğunluklu GFP + inen aksonları gösterdi ( Şekil 3CVe 3D ). AAV9'un iki bilateral servikal ve iki bilateral üst lumbar enjeksiyonunun (her enjeksiyon için 5 μL) verilmesi, tüm omurilikte üst servikalden sakral bölmelere GFP ekspresyonu ile ilişkiliydi ve homojen olarak beyaz ve gri cevherde mevcuttu ( Şekil 3E-3H ).
Supraspinal Motor ve Duyusal Merkezlerde Retrograd ve Anterograde Taşınım Yoluyla Transgen Ekspresyonu:
Subpay AAV9 verilmesinden sonra lumbar veya servikal omurilikte yaygın GFP ifadesi, supraspinal inen aksonlarda ve öngörülen nöronlarda, artan yolların aksonlarında ve terminallerinde güçlü retrograd ve anterograde enfeksiyonu aracılı GFP pozitifliği ile ilişkiliydi ( Şekil 4 ). Böylece, yoğun GFP pozitifliği, retiküler oluşumda (RF) lokalize nöronlarda görüldü, Çekirdek rüber (NR) ve motor korteks (MC) ( Şekil 4B- 4D ). Benzer şekilde, spinoserebellar (SCT), spinoretiküler ve spinotalamik yolların (STT) terminallerinde berrak GFP immünreaktivitesi görüldü ( Şekil 4B- 4D ).
Şekil 1 : Yetişkin Bir Farede Spinal Subpial Enjeksiyon Yapan Deneysel Kurulum. ( A ) Yetişkin farelerde omurilik subpial enjeksiyonu yapmak için, iki ayrı XYZ manipülatörü kullanılır (I ve II). ( B ) Her bir manipülatörün Z-kolu bir cam kılcal tutucu tutar. Bir kılcal tutucu, pia nüfuz eden 34 G iğneyi tutar ve ikincisi, künt 36 G subpial iğneyi tutar. ( C , D , E ve F) Pia delinmesinin hemen ardından pia penetrasyon iğnesinin pozisyonunu gösteren resimler ( C ; dura madde zaten çıkarıldı), pia nüfuz eden iğnenin ( D ) çıkarılmasından sonra, subpial enjeksiyon iğnesinin ucunun yerleştirilmesinden sonra ( E ) ve subpial enjeksiyon iğnesi subpial boşluğa ( F ) 3 mm ilerlettikten sonra. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Yetişkin Farelerde Lomber Subpial AAV9-UBI-GFP Dağıtımından Sonra Potansiyel Spinal Parenkimal GFP Ekspresyonu. ( A ) AAV9-UBI-GFP'nin iki bilateral enjeksiyonu (her biri 1.5 veya 3 μL enjeksiyon) üst bel başına yüklendiUbpial boşluk ve hayvanlar, AAV9 doğumundan 14 gün sonra perfüzyonla sabitlendi. ( B ) 3 + 3 μL AAV9 (sol ve orta sütunlar) enjekte edilen hayvanlarda, lumbardan üst torasik segmentlere kadar uzanan gri (noktalı alanın içindeki) ve beyaz maddede yoğun GFP ifadesi görülebilir. ( C, D, E ve F ) 3 + 3 μL AAV9 enjekte edilen hayvanlarda lomber genişlemeden alınan transvers omurilik kesitlerinin birlikte boyaması neredeyse tüm ChAT'de (α-motoneuron işaretleyici) -pozitif α- Dorsal boynuz ( D ) ve orta bölge ( E ) 'de motoneuronlar ( C ve F ) ve NeuN-pozitif internöronlar. Ölçek çubukları = 1000 μm (B); 30 um (C); 100 μm (DF). DH: sırt boynuzu; LV: ince tabaka V; VH: ventral boynuz. Daha büyük ve daha büyük görüntülemek için lütfen tıklayınız.Bu rakamın rsionu.
Şekil 3: Yetişkin Farelerde Spinal Subpial Servikal Artı Subpial Lomber AAV9-UBI-GFP Teslimine Karşı Spinal Subpektif Servikal Sonra Spinal GFP Anlatımının Karşılaştırılması. ( A, B, C ve D ) Daha önce üst servikal subpial AAV9-UBI-GFP (5 + 5 μL) enjeksiyonlarını alan bir hayvanda omuriliğin tüm uzunluğunu kesen yatay kesit. Servikal bölgedeki beyaz ve gri maddede yoğun GFP ifadesi görülebilir ( B ). Lomber omurilikte, lateral funikülde (LF) yüksek yoğunlukta GFP + inen aksonlar ve NeuN-pozitif ancak GFP-negatif nöronlar arasındaki gri madde belirlenebilir ( C ve D ). ( E, F, G ve H Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4
| Deney Grupları | AAV9 dağıtım tesisi / seviyesi (*) | AAV9 inj hacmi, infüzyon hızı | Hayatta kalma süresi | Doku analizi |
| Grup A (n = 7) | C2 (bilateral) | 5 uL / 5 dak | 14 gün | Beyin + omurilik |
| Grup B (n = 12) | L1-L2 (bilateral) | 1,5 uL veya 3μL, 60 sn / μL | 14 gün | Beyin + omurilik |
| Grup C (n = 6) | C2 + L1-L2 (her seviyede çift taraflı) | 5 uL / 5 dak | 14 gün | Omurilik |
| * - ikili= Enjekte edilen segment (ler) in sağ ve birinde sol subpay boşluğuna gönderilen iki subpial enjeksiyon yapılır. | ||||
Tablo 1: Deneysel Gruplar. Tüm deneyler yetişkin C57BL / 6J farelerde gerçekleştirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut çalışma yetişkin farelerde subpial vektör (AAV9) verilmesinin bir teknikini açıklamaktadır. Ekli videoda gösterildiği gibi, bu yaklaşım ve teknik, gerekli araçların ve pia-delici iğne ve subpial enjeksiyon iğnesinin kurulmuş ve test edilmiş spesifikasyonlara uygun olarak üretilmesi şartıyla etkin bir şekilde kullanılabilir.
Farelerde Tutarlı ve Güvenli Subpial Enjeksiyon Yapmada Kritik Teknik Değişkenler:
Gösterildiği gibi, dorsal bir servikal veya lomber laminektomi sonrası yetişkin anestezi uygulanmış farelerde bir subpial enjeksiyon kolayca yapılabilir. Subpial enjeksiyon tekniğinin başarısını tanımlayan kritik teknik değişkenler vardır. İlk olarak, 34 G pia delici iğnenin ucu, pia'nın pürüzsüz delinmesini sağlamak için bir beveller kullanarak keskin şekilde bilenmiş olmalıdır. Tekniğin, iğnenin nasıl keskinleştirildiğine ilişkin tutarsızlıkları difficu'ya neden olabilirPia penetrasyonu sırasında ltys ve / veya pia delinmek için çok fazla kuvvet kullanarak spinal yaralanmaya neden olabilir. Normal koşullar altında (videoda gösterildiği gibi Şekil 1C ve D ), pia açılmasının alanı omurilik hasarı veya subpektif kanama belirtisi göstermez. Bazı vakalarda, bazı subpektif kanamalar görülebilir, ancak AAV9 doğumundan sonra bu, nörolojik disfonksiyon veya değişmiş gen ekspresyonuyla ilişkili bulunmamıştır. İkincisi, elektrokoter kullanarak dura çıkarıldıktan sonra cerrahi bölgenin kanından uzak tutulması önemlidir. Herhangi bir lekeli kan artıkları, cerrahi bir mikroskop kullanılsa bile pia yüzeyinin güvenilir tanımlanmasını engelleyebilir. Şekil 1C-F'de gösterildiği gibi, kan-özgür laminektomi bölgesi, laminektomize vertebra ve çevreleyen yumuşak dokuyu örten küçük jel-köpük parçaları kullanılarak etkili bir şekilde muhafaza edilebilir. Üçüncü olarak, anestezi altındaki hayvanlara anestezi uygulanmış hayvanların uygun yerleştirilmesine özellikle dikkat edilmelidir.Omurga çerçevesi ve spinal klempleri kullanarak spinal kolonun immobilizasyonu. Omurilik kelepçeleri yerleştirilirken aşırı basınç uygulanması vertebra rüptürüne neden olabilir; Yetersiz basınç uygulanması, hareketsizleştirilmiş omurganın giderek gevşetilmesine ve tipik olarak bir laminatektomi gerçekleştirmek için bir diş hekimi kullanıldığında ortaya çıkmasına neden olabilir.
Sub-pial enjekte edilen AAV9 hacmi, rostro-kaudal transgen ekspresyonunun büyüklüğü ile ilişkilidir. Böylece, iki belde alt eklem AAV9 enjeksiyonunun (3 + 3 μL veya 5 + 5 μL) kullanımı, bütün lomber gri ve beyaz cevherde tutarlı GFP ekspresyonu ile birlikte üst torasik segmentlere kadar uzanıyordu. Kullanılan hayvanlar arasında minimal değişkenlik mevcuttu. 1.5 + 1.5 uL'lik AAV9 enjeksiyon hacimleri, enjeksiyon bölgelerinde lokalize olan segmentlerde benzer GFP ekspresyonuna yol açtı; Bununla birlikte, virüs yayılımı ve ortaya çıkan GFP ifadesi torasik segmentlerde sınırlıydı ( Subpial Gen Teslimat Tekniğinin Sınırlandırılması: Subpi'nin Gelecekteki UygulamalarıAl Gene Teslimat Tekniği: Örneğin, shRNA sessizleştirme vektörleri kullanarak mutasyona uğramış genlerin ekspresyonunda ( örn . Kalıtsal ALS durumunda SOD) son derece etkili bir azalmanın spinal kord boyunca ve ayrıca omurilikte gerçekleşmesi beklenir - Beyin motor çekirdeğini projelendirmek. İkinci,Omurga beyaz maddesi aksonlarının oldukça etkili enfeksiyonu nedeniyle terapötik genler ( örn., Büyüme faktörlerini kodlayan) spinal travma yaralı hayvanlarda aksonal filizlenmeyi teşvik etmek için yukarı doğru düzenlenebilir. Üçüncüsü, subpial enjeksiyonun yanı sıra, alttan beslenen virüsün hacmini veya titresini manipüle ederek, transgenin ekspresyonu, omuriliğin ayrı bir bölgesine ( örneğin, tek taraflı dorsal boynuz) hedef alınabilir. Lokalize edilmiş transgen ekspresyonu, inhibe edici nörotransmitter sistemleri ( örn., GABA) yukarı regüle ederek veya eksitatör sistemleri ( örn . Glutamat ile birleşmiş reseptör sistemi) inhibe ederek ağrı veya kas spastisitesini değiştirici tedavide potansiyel olarak kullanılabilir. Dördüncü olarak, AAV'nin verilmesine ilaveten, zayıf kan-beyin bariyeri geçirgenliğine ( örneğin, mikro RNA) sahip diğer moleküller veya vektörler, subpial doğumdan sonra omurilik parankim içine daha etkili bir şekilde verilir. Bunlar etkili kullanılarak test edilebilir.Bu yazıda anlatılan teknik. Son olarak, bu çalışmada gösterildiği gibi, subpial teknik, ortalama vücut ağırlığı (BW) 20 ila 30 g arasında olan yetişkin farelerde başarılı bir şekilde kullanılabilir. Bu nedenle, benzer BW'ye sahip diğer hayvan türlerinde ( örneğin, Sprague-Dawley (SD) sıçan yavruları) aynı tekniğin ve deney düzeneğinin kullanılabileceği muhtemeldir. P6 ve P21 SD sıçanlarının BW'leri sırasıyla yaklaşık 17 ve 62 g'dır. Sıçan yavrularını, doğum sonrası gelişmenin erken safhasında kullanmak, spinal sinir devrelerinin gelişiminde ve duyu ve motor işlemedeki spesifik gen up-downregülasyonunun rolünü incelemek için yararlı bir araç olabilir.
Subpial enjeksiyon tekniğinin göreceli sınırlamalardan biri (intratekal doğumla karşılaştırıldığında), spinal kordun dorsal yüzeyine erişime izin vermek için dorsal laminektomi yapılması gerektiğinde bu yaklaşımın daha invaziv olmasıdır. Bununla birlikte, omurilik ve supraspinal beyin merkezlerinde görülen güçlü transgen ifadesi, α-motonöronların ve birincil afferentlerin bir alt popülasyonunda seçici transgen ekspresyonu ile vasıflandırılmış (ancak mevcut değildir) intratekal AAV'nin verilmesine karşı açık bir avantaj sergilediği görülmektedir Daha derin spinal kord tabakalarında nöronlarda) 8 .
Benzer şekilde, yetişkin sıçanlarda ve domuzlarda önceki çalışmalarla gösterildiği gibi, subpial AAV9 sunumu kullanılarak erişkin farelerde spinal beyaz ve gri maddede son derece etkili transgen ekspresyonu sağlanabilir. Buna ek olarak, fare omuriliğinin nispeten daha küçük boyutları (özellikle uzunluğu) nedeniyle, AAV9'un yalnızca iki omurilik seviyesinde (üst servikal ve üst lumbar) verilmesi yakın komple omurilik enfeksiyonuna yol açmaya yeterlidir. Bu özellik, hedeflenen gen sessizleştirmesi veya yukarı doğru düzenlenmesiyle spesifik hastalık iyileştirme yaklaşımlarını tasarlarken önemli bir etkiye sahip olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Martin Marsala, Neurgain Technologies, Inc'in (San Diego, ABD) kurucu ortaklarından biridir.
Acknowledgments
Bu çalışma SANPORC ve ALSA Vakfı (Martin Marsala) tarafından desteklenmiştir; Ulusal Sürdürülebilirlik Programı, proje numarası LO1609 (Çek Milli Eğitim Bakanlığı, Gençlik ve Spor Bakanlığı); Ve RVO: 67985904 (Stefan Juhas ve Jana Juhasova).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | 664 | |
| Lab Standard Stereotaxic for Mice | Harvard Apparatus | 72-9568 | |
| Mouse Spinal Adaptor | Harvard Apparatus | 72-4811 | |
| XYZ Manipulator | Stoelting | 51604 | |
| Manual Infusion Pump | Stoelting | 51218 | |
| 34G Beveled Nanofill Needle | World Precision Instruments | NF34BV-2 | |
| 36G Blunt Nanofill needle | World Precision Instruments | NF-36BL-2 | |
| Fluriso, Isoflurane | MWI Veterinary Supply | 502017 | |
| Chlorhexidine Solution | MWI Veterinary Supply | 501027 | |
| 20G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305175 | |
| 23G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305145 | |
| 30G Stainless Steel Needle | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Cotton Tipped Applicator | MWI Veterinary Supply | 27426 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige International | SM-25B | |
| Slide Microscope Superfrost | Leica Microsystems | M80 | |
| 50 μL Microsyringe | Hamilton | 81242 | |
| BD Intramedic PE-20 Tubing | Becton, Dickinson | 427406 | |
| BD Intramedic PE-10 Tubing | Becton, Dickinson | 427401 | |
| 4-0 monofilament suture | VetOne | V1D397 | |
| Glass Capillary Beveller | Narishige | Pipet Micro Grinder EG-40 | |
| 5 min Epoxy (Epoxy Clear) | Devcon | 14310 | |
| Euthanasia Solution | MWI Veterinary Supply | 11168 | |
| Heparin Inj 1,000 U/mL | MWI Veterinary Supply | 54254 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Anti NeuN Antibody | EMD-Millipore | ABN78 | Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody | EMD-Millipore | AB144P | Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100 |
| Anti GFP Antibody | Aves Labs | GFP-1020 | Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A21207 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680 | ThermoFisher Scientific | A10043 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Jackson Immunoresearch Labs | 703-545-155 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150131 | Secondary Antibody, 1:1000 |
| Slide Microscope Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher Scientific | P36930 | |
| Epifluorescence Microscope | Zeiss | Zeiss AxioImager M2 | |
| Fluorescence Confocal Microscope | Olympus | Olympus FV1000 | |
| Dextran | Polysciences, Inc | 19411 | |
| AAV9-UBC-GFP | UCSD Viral Vector Core Laboratory |
References
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gray, S. J., et al. Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates. Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).
- Meyer, K., et al. Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates. Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).
- Foust, K. D., et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).
- Passini, M. A., et al. Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy. Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).
- Bell, P., et al. Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).
- Miyanohara, A., et al. Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046 (2016).
- Xu, Q., et al. In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery. PLoS One. 7 (3), 32581 (2012).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).
