Summary
Intercellulaire kruispunten zijn benodigdheden voor stadiumspecifieke functies en ontwikkeling van de borstklier. Dit manuscript biedt een gedetailleerd protocol voor de studie van eiwit-eiwit interacties (PPI's) en co-lokalisatie met behulp van muizenklinieken. Deze technieken maken het mogelijk om de dynamiek van de fysieke associatie tussen intercellulaire kruispunten in verschillende ontwikkelingsstadia te onderzoeken.
Abstract
Cell-cel interacties spelen een cruciale rol bij het behoud van de weefselintegriteit en de barrière tussen de verschillende compartimenten van de borstklier. Deze interacties worden geleverd door junctionele eiwitten die nexussen vormen tussen aangrenzende cellen. Junctionele eiwit mislokalisatie en verminderde fysieke associaties met hun bindende partners kunnen resulteren in verlies van functie en bijgevolg tot orgaansdisfunctie. Zo is het identificeren van eiwit lokalisatie en eiwit-eiwit interacties (PPI's) in normale en ziekteverwante weefsels essentieel om nieuwe bewijzen en mechanismen te vinden die leiden tot de voortgang van ziekten of veranderingen in ontwikkelingsstatus. Dit manuscript presenteert een tweetraps methode om PPI's in muizenkliere te beoordelen. In protocol sectie 1 wordt een werkwijze beschreven voor het uitvoeren van co-immunofluorescentie (co-IF) onder gebruikmaking van antilichamen die worden opgewekt tegen de eiwitten van belang, gevolgd door secundaire antilichamen die met fluorochromen gemerkt zijn. Hoewel co-IF allemaalOws voor de demonstratie van de nabijheid van de eiwitten, het maakt het mogelijk om hun fysieke interacties te bestuderen. Daarom wordt een gedetailleerd protocol voor co-immunoprecipitatie (co-IP) gegeven in protocol sectie 2. Deze methode wordt gebruikt om de fysieke interacties tussen eiwitten te bepalen, zonder te bevestigen of deze interacties direct of indirect zijn. In de laatste jaren hebben co-IF en co-IP technieken aangetoond dat bepaalde componenten van intercellulaire kruispunten co-lokaliseren en samenwerken, waardoor stadiumafhankelijke kruispunten ontstaan die variëren tijdens de ontwikkeling van de borstkanker.
Introduction
De groei en ontwikkeling van de mammierklier komt voornamelijk na de geboorte voor. Dit orgaan remodelleert zich voortdurend door het voortplantingsleven van een zoogdier 1 . Het volwassen embryonale epitheel bestaat uit een binnenlaag van luminale epitheelcellen en een buitenste laag basale cellen, voornamelijk samengesteld uit myoepitheliale cellen, omringd door een keldermembraan 2 . Voor een goede beoordeling over de structuur en ontwikkeling van de borstklier kan de lezer naar Sternlicht 1 verwijzen. Cell-cel interacties via gap (GJ), strak (TJ) en adheren (AJ) kruispunten zijn nodig voor de normale ontwikkeling en functie van de klier 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . De belangrijkste componenten van deze kruispunten in de muizenkliniek zijn Cx26, Cx30, Cx32 en Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 en -7 enZO-1 (TJ); En E-cadherine, P-cadherine, en β-catenin (AJ) 7 , 8 . De expressieniveaus van deze verschillende junctionele eiwitten variëren op een stadiumafhankelijke wijze tijdens de ontwikkeling van de borstkanker, wat de differentiële cel-celinteractievereisten voorstelt 9 . GJ, TJ en AJ zijn structureel en functioneel gekoppeld aan andere structurele of regulerende eiwitten aan de naburige plaatsen van aangrenzende cellen, waardoor een knooppunt 10 wordt gecreëerd. De samenstelling van de verbindingsneus kan invloed hebben op de overbruggen van het onderliggende cytoskelet, evenals de doorlaatbaarheid en de stabiliteit van de nexus, en kan derhalve de functie van de klier 8 , 9 , 10 , 11 beïnvloeden. De componenten van intercellulaire knooppunten die zich in knooppunten bevinden, of met elkaar in wisselwerking met elkaarGeurende ontwikkelingsfasen van de ontwikkeling van de borstklier werden onlangs geanalyseerd met behulp van co-immunofluorescentie (co-IF) en co-immunoprecipitatie (co-IP) 9 . Terwijl andere technieken de evaluatie van de functionele associatie tussen eiwitten mogelijk maken, worden deze methoden niet in dit manuscript gepresenteerd.
Aangezien eiwitten alleen maar alleen functioneren om te functioneren, is het belangrijk om veel onderzoekers te onderzoeken eiwit-eiwit interacties (PPI's), zoals signaaltransducties en biochemische cascades, en kunnen belangrijke informatie over de functie van eiwitten leveren. Co-IF en microscopische analyse helpen bij het evalueren van een paar eiwitten die dezelfde subcellulaire ruimte delen. Het aantal doelen is echter beperkt door de antilichamen die in verschillende dieren moeten worden opgewekt en door de toegang tot een confocale microscoop uitgerust met verschillende golflengtelaser en een spectrale detector voor multiplexing. Co-IP bevestigt of onthult fysische interacties met hoge affiniteit betwEen twee of meer eiwitten die binnen een eiwitcomplex verblijven. Ondanks de ontwikkeling van nieuwe technieken, zoals fluorescentie resonantie energie-overdracht (FRET) 12 en proximity ligation assay (PLA) 13 , die gelijktijdig de lokalisatie en interacties van eiwitten kan detecteren, blijft co-IP een geschikte en betaalbare techniek om interacties tussen Endogene eiwitten.
De stap-voor-stap methode die in dit manuscript wordt beschreven, zal de studie van eiwitlokalisatie en PPI's vergemakkelijken en valkuilen verklaren om te vermijden bij het bestuderen van endogene PPI's in de borstklippen. De methodologie begint met de presentatie van de verschillende bewaringsprocedures voor de weefsels die nodig zijn voor elke techniek. In deel 1 wordt gepresenteerd hoe u co-lokalisatie van eiwitten in drie stappen kunt bestuderen: i) het segmenteren van mammekirtels, ii) de dubbele of drievoudige etikettering van verschillende eiwitten met behulp van de co-IF-techniek, en iii) het imago vanEiwit lokalisatie. Deel 2 laat zien hoe een endogeen eiwit neerslag wordt en zijn interactieproteïnen in drie stappen identificeren: i) lysatepreparatie, ii) indirecte eiwitimmunoprecipitatie, en iii) bindingspartneridentificatie door SDS-PAGE en Western blot. Elke stap van dit protocol is geoptimaliseerd voor knaagdierkankerweefsels en produceert hoogwaardige, specifieke en reproduceerbare resultaten. Dit protocol kan ook gebruikt worden als uitgangspunt voor PPI studies in andere weefsels of cellijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierprotocollen die in deze studie werden gebruikt, werden goedgekeurd door het College Animal Care Committee (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada).
1. Identificatie van proteïne co-lokalisatie
- Van weefsel tot microscopische dia's
OPMERKING: Weefsels en afdelingen moeten op droogijs worden behandeld.- Accijns de borstkieren van een dier (voor een volledige beschrijving van deze procedure, verwijzen naar Plante et al. ) 14 .
- Bevestig het uitgesneden weefsel in het bevriezen / montage medium op droogijs. Voeg voldoende medium toe om de klier te bedekken. Wanneer het medium is verstevigd, doe de weefsels over op een vriezer bij -80 ° C voor later gebruik 9 .
- Gebruik een cryomicrotoom ingesteld op ≤ -35 ° C, snijd de weefsels in 7-10 μm dikke delen en plaats ze op microscoopschuiven.
OPMERKING: plaats indien mogelijk twee secties op elke dia; Het linker gedeelte wordt gebruikt als eenEgatieve controle om de specificiteit van de antilichamen en de autofluorescentie van het weefsel te verifiëren, terwijl de rechterkant wordt gemerkt met de antilichamen. - Houd de secties bij -80 ° C voor later gebruik.
- Co-IF kleuring
- Haal de juiste microscopische glijbanen uit de vriezer en stel de secties onmiddellijk vast door ze gedurende 15 minuten bij formaldehyde 4% te dompelen bij kamertemperatuur (RT).
- Dompel vervolgens de glijbanen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij RT. Verlaat de glijbanen in PBS bij RT totdat u verder gaat naar de volgende stap.
- Omcirkel elke sectie van de dia met behulp van een in de handel verkrijgbare hydrofobe barrière of een waterafstotende lab pen (zie de tabel van materialen ). Wees voorzichtig om het weefsel niet aan te raken. Voeg druppels PBS onmiddellijk aan het weefsel toe en plaats de glijbaan in een vochtige histologiekamer voor de rest van de procedure.
OPMERKING: De weefselsecties moeten vochtig blijven. AlternatiefGebruik een doos met een deksel en plaats natte papieren handdoeken op de bodem. - Blok elk weefsectie met 100-200 μL 3% runderserumalbumine (BSA) -Trisgebufferde zoutoplossing (TBS) -0,1% polysorbaat 20 (zie de Tabel van Materialen ) gedurende 30 minuten bij RT. Terwijl de monsters blokkeren, bereidt u de primaire en secundaire antilichaamoplossingen voor door de antilichamen te verdunnen in TBS-0,1% polysorbaat 20.
OPMERKING: De vereiste concentratie voor het antilichaam wordt door de fabrikant verstrekt; Zie de tabel van materialen en figuren 1 en 2 voor voorbeelden, evenals Dianati et al. 9 . Hoewel het niet nodig is om in het donker te werken bij het gebruik van meeste fluorofore-geconjugeerde antilichamen, vermijd het blootstellen van de antilichaamoplossingen of gekleurde weefsels tot intens, helder licht. - Verwijder de blokkerende oplossing door aspiratie en incubeer de secties in 100-200 μL van het verdunde primaire antilichaam gedurende 60 minuten bij RT. AlternativelY, incuberen met het primaire antilichaam 's nachts bij 4 ° C.
- Verwijder de primaire antilichaamoplossing door aspiratie en wass de afdelingen met 250-500 μL TBS-0,1% polysorbaat 20 gedurende 5 minuten. Verwijder de wasoplossing door aspirasie en herhaal de was twee keer.
- Verwijder de wasoplossing door aspiratie en incubeer de secties met 100-200 μl van het geschikte fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichaam gedurende 60 minuten bij RT.
- Verwijder de secundaire antilichaamoplossing door aspiratie en was de secties gedurende 5 minuten met 250-500 μl TBS-0,1% polysorbaat 20 gewassen. Verwijder de wasoplossing en herhaal tweemaal.
- Herhaal stap 2.5-2.8 met behulp van de juiste combinatie van primaire en secundaire antilichamen voor de daaropvolgende eiwitten die van belang zijn.
- Verwijder de wasoplossing door aspiratie en voer de nucleuskleuring uit door het gedeelte 5 tot 5 minuten bij 100 tot 100 μl 1 mg / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) in TBS-0,1% polysorbaat 20 te incuberenRT.
- Verwijder de DAPI-oplossing door aspirasie en plaats de dia's met behulp van een in water oplosbaar, niet-fluorescerend montagemedium (zie de Tafel van Materialen ) en deksels. Ga één dia tegelijk door.
OPMERKING: Incuberen van de kernvlek gedurende meer dan 5 minuten verandert de intensiteit van de kleuring niet. Als alternatief, verwijder de DAPI oplossing op alle glijbanen en incubeer de weefsels in PBS tijdens het monteren van de glijbanen. - Plaats de dia's plat in een koelkast van 4 ° C gedurende minstens 8 uur. Ga verder naar de fluorescentiemicroscopische beeldvorming (zie figuren 1 en 2 ).
- Microscopische beeldvorming
- Visualiseer de fluorofore-geconjugeerde secundaire antilichamen met behulp van een confocale microscoop uitgerust met de verschillende lasers die nodig zijn om de fluoroforen op hun specifieke golflengten op te wekken.
Opmerking: Om kanalen en alveolen te visualiseren, wordt een 40X objectief met een numerieke diafragma van 0,95 voorgesteld. Een examplE van de specifieke instellingen wordt weergegeven in figuur 1 . - Verifieer de lokalisatie van elk eiwit individueel door de afbeelding een golflengte op het moment te scannen.
Opmerking: in dit stadium is het belangrijk om de lokalisatie van de junctionele eiwitten kritisch te analyseren. Om junctionele nexussen te kunnen vormen, moeten deze eiwitten gelokaliseerd worden bij het plasmamembraan. - Bepaal de co-lokalisatie van eiwitten door het samenvoegen van de beelden die met de lasers zijn gescand bij de verschillende golflengten.
Opmerking: Proteïne co-lokalisatie kan worden geconfronteerd door de kleurwijziging die voortvloeit uit de uitstoot van twee of meer fluoroforen op dezelfde locatie en kan worden gemeten met behulp van de passende software ( figuren 1 en 2 , zie ook referentie 9).
- Visualiseer de fluorofore-geconjugeerde secundaire antilichamen met behulp van een confocale microscoop uitgerust met de verschillende lasers die nodig zijn om de fluoroforen op hun specifieke golflengten op te wekken.
2. Het bestuderen van PPI's
OPMERKING: Abdominale borstklippen dienen te worden gebruikt om PPI's te bestuderen, aangezien borstklippen in nauwe band met de borsspieren. Accijns de borstklippen (voor een volledige beschrijving van deze procedure, zie Plante et al .) 14 en houd ze bij -80 ° C voor later gebruik.
- Lysaatbereiding
- Plaats weegpapier en 2 ml microcentrifugebuizen op droogijs om ze vooraf te koelen voordat u verder gaat met de volgende stappen.
- Neem het weefselweefsel van -80 ° C en houd ze op droogijs.
- Weeg de weefsels op de voorgekoelde weegpapieren en laat het weefsel vervolgens overbrengen naar 2 ml microcentrifugebuizen (handvat op droogijs). Gebruik tussen 50 en 100 mg weefsel per monster. Bewaar het weefsel op droogijs tot stap 2.1.5.
- Bereid de benodigde hoeveelheid triple detergent lysisbuffer aangevuld met NaF, NaVO 3 en protease / fosfataseremmers, zoals aangegeven in de Tabel van Materialen , met behulp van de volgende formules. Muizen: vereiste buffer (μL) = muisweefselgewicht (mg) x 3; Rat: vereistBuffer (μL) = weefselgewicht (mg) x 5
- Voeg de benodigde hoeveelheid ijskoude lysisbuffer (berekend in stap 2.1.4) toe aan de 2 ml buis die het weefsel bevat.
OPMERKING: Ga in stap 2.1.5-2.1.6 door met één enkele buis tegelijk. - Homogeniseer het weefsel gedurende 30-40 s met behulp van continue homogenisatie op een weefselmolen; Houd de buis altijd op ijs. Zet het weefselhomogenisator aan op middelmatige snelheid en beweeg de grinder voorzichtig naar boven en onder in de buis.
- Herhaal stappen 1.6 en 1.7 met de andere buizen.
- Incubeer de lysaten op ijs gedurende 10-30 minuten.
- Centrifugeer de buizen bij 170 xg gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Identificeer ondertussen 6-10 microcentrifugebuizen (0,6 ml) voor elk monster en houd ze op ijs.
- Zodra de centrifugering is gedaan, controleer de buizen. Zorg ervoor dat ze een bovenste laag vet, heldere, geel-naar-roze lysaten bevatten (afhankelijk van het ontwikkelingsstadium) en een pellet.
- Maak een gat in de lipidlaagMet behulp van een 200-liter pipetpunt om toegang te krijgen tot de vloeibare fase. Verander de tip en verzamel het lysaat zonder de pellet te storen of de lipidlaag te aspireren. Aliquot het lysaat in voorgemarkeerde buizen op ijs (stap 2.1.11) en houd ze op -80 ° C.
- Gebruik een aliquot om de eiwitconcentratie te kwantificeren met behulp van een geschikte, commercieel verkrijgbare kit (zie de Tabel van Materialen ).
- Indirecte immunoprecipitatie
- Op ijs ontdooien twee aliquots van de al eerder bereide mammary gland lysaten.
OPMERKING: Er wordt één aliquot gebruikt voor het IP van het doel eiwit, terwijl de andere als negatieve controle zal dienen. - Verzamel 500-1000 μg van het lysaat en verdun het in PBS om een eindvolume van 200 μL in elke 1,5 ml buis te bereiken.
OPMERKING: De hoeveelheid te gebruiken lysaat hangt af van de overvloed van het eiwit van belang en de efficiëntie van het antilichaam (zie Figuur 3 voor eenN voorbeeld , evenals de tabel van materialen ). Om te optimaliseren voor elk doel, dienen verschillende hoeveelheden lysaat ( dat wil zeggen 500, 750 en 1000 μg) en antilichaam ( dwz 5, 10 en 20 μg) te worden gebruikt. Ga verder met de volgende stappen (2.2.3-2.3.7.4). - Voeg het antilichaam tegen het antigeen van belang toe aan de eerste buis lysaat en hou het op ijs.
OPMERKING: De benodigde hoeveelheid wordt meestal voorgesteld op het instructieblad dat door elk bedrijf wordt verstrekt (zie de Tabel van Materialen ). - Bereid in de tweede buis een negatieve controle op door dezelfde concentratie van isotype-IgG-controle toe te voegen als het antilichaam dat in stap 2.2.3 wordt gebruikt.
- Incubeer de buizen overnacht bij 4 ° C op een buisrolmenger bij lage snelheid.
- De volgende dag voeg 50 μL magnetische kralen toe aan nieuwe 1,5 ml buizen voor voorwas.
- Selecteer ofwel magnetische korrels van eiwit A of eiwit G, gebaseerd op de relatieve affiniteit voor het antilichaam. Het is belangrijk om te voorkomen dat geaggregeerde kralen worden gebruikt; Meng de kogelophanging voorzichtig totdat het gelijkmatig opnieuw wordt opgehangen voordat u deze aan de buizen toevoegt.
- Plaats de buizen die de kralen op de magnetische stand bevinden en laat de kralen migreren naar de magneet. Verwijder de opslagbuffer uit de kralen met een 200 μL pipet.
- Was de kralen door 500 μl PBS-0,1% polysorbaat 20 toe te voegen en de buizen krachtig te vortexen gedurende 10 s.
- Zet de buizen weer op de magnetische stand en laat de kralen migreren naar de magneet.
- Verwijder de overtollige wasbuffer door pipettering met een 200 μL pipet te verwijderen.
- Voeg het reactiecomplex (lysaat-antilichaam) van stap 2.2.5 toe aan de kralen en incubeer gedurende 90 minuten bij RT op de roller mixer.
- Plaats de buizen op de magnetische stand en laat de kralen migreren naar de magneet. Gebruik een 200 μL pipet, aspireer en doei het lysaat en gooi de buizen op ijs.
- Was de kraalS door 500 μL PBS toe te voegen, de buizen op de magnetische stand te plaatsen en de vloeistof te verwijderen met behulp van een 200 μL pipet. Herhaal deze wasstap. Vermijd vortexing tijdens de wasstappen en houd de monsters op ijs.
- Was de kralen eenmaal met PBS-0,1% polysorbaat 20 zonder vortexing en wis de laatste wasbuffer met behulp van een 200 μL pipettip.
- Om te elueren voeg 20 μL 0,2 M zuurglycine (pH = 2,5) toe aan de buizen en schud ze gedurende 7 minuten op de roller mixer.
- Centrifugeer gedurende een paar seconden bij hoge snelheid en snijd de supernatant in een frisse ijskoude buis.
- Herhaal de stappen 2.2.14 en 2.2.15 voor elke buis.
OPMERKING: Het uiteindelijke volume bedraagt 40 μL. - Voeg 10 μl 4x Laemmli buffer toe aan het 40 μl geëlueerde monster uit stap 2.2.16.
OPMERKING: De kleur wordt geel door de zure pH. - Voeg onmiddellijk 1 M Tris (pH = 8), 1 druppel per keer, toe aan het geëlueerde monster van stap 2.2.18 tot de kleur ervanWordt blauw. Ga door naar de volgende buizen.
- Kook de monsters van stap 2.2.18 bij 70-90 ° C gedurende 10 minuten. Ga onmiddellijk door naar gelelektroforese. Als alternatief, steek de monsters over op een vriezer bij -80 ° C tot het laden.
- Op ijs ontdooien twee aliquots van de al eerder bereide mammary gland lysaten.
- Aanwaartse toepassing: gelelektroforese gevolgd door Western blot
- Bereid het scheiden en stapelen van SDS-PAGE acrylamide gels (1,5 mm dikte) volgens standaardprocedures 15 .
OPMERKING: De keuze van gel (8-15% acrylamide, gradiënt: zie de Tabel van Materialen ) moet worden bepaald op basis van de moleculaire grootte van het te precipiteren eiwit en van de mogelijke bindende partners die geanalyseerd moeten worden. Deze eiwitten moeten van elkaar worden opgelost om de juiste immunodetectie mogelijk te maken. - Doe de immunoprecipitatie (IP) -geluide monsters (stap 2.2.20) op ijs.
- Bereid eiwitlysaten uit dezelfde monsters (gebruikt voor de bovenstaande IP-procedure). Gebruik 50Μg totaal lysaat en voeg 4X Laemmli monsterbuffer toe. Kook de monsters bij 70-90 ° C gedurende 5 minuten en plaats op ijs tot het laden.
OPMERKING: Deze monsters worden naast het geëlueerde IP-monster geladen om de aanwezigheid van geprecipiteerde eiwitten in het totale lysaat aan te tonen. - Laad de bereide lysaten van stap 2.3.3 en de geprecipiteerde monsters van stap 2.2.20 naast elkaar in een acrylamidegel en laat ze in lopende buffer lopen (10x loopbuffer: 30,3 g Tris, 144,1 g glycine en 10 G SDS in 1 liter gedestilleerd water) bij 100 V gedurende ongeveer 95 minuten, of tot de rand van de migrerende eiwitten de bodem van de gel bereikt.
- Breng de gels over naar een nitrocellulose- of PVDF-membraan met behulp van een standaardprotocol 9 , 15 .
- Blokkeer het membraan gedurende 1 uur op een rocker bij lage snelheid in 5% droge melk-TTBS (20 mM Tris, 500 mM NaCl en 0,05% polysorbaat 20).
- Identificeer of het neerslag succesvol wascesvol.
- Probeer het membraan met behulp van het eerste antilichaam tegen het geprecipiteerde eiwit, verdund in 5% droogmelk-TTBS bij de door de fabrikant aanbevolen concentratie, overnacht bij 4 ° C op een schommelplatform met langzame roering.
OPMERKING: Raadpleeg de Tabel van Materialen voor aanbevelingen. - De volgende dag was de membraan 3 keer gedurende 5 minuten elk met TTBS op een schommelplatform met hoge agitatie.
- Incubeer het membraan in het geschikte secundaire antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP), verdund in TTBS, gedurende 1 uur bij RT op een schommelplatform met langzame roering.
OPMERKING: Alternatief kan een secundair antilichaam geconjugeerd met een fluorochroom gebruikt worden indien een geschikt apparaat voor het detecteren van het signaal beschikbaar is. - Voer 3 tot 6 wassen, elk 5 minuten, met TTBS op een schommelplatform met hoge agitatie. Analyseer het signaal van het secundaire antilichaam door het membraan te incuberen met een commercieel aBeschikbare luminoloplossing (zie de Tabel van Materialen ) en volg de instructies van de fabrikant. Ontdek het signaal met behulp van een chemiluminescentie beeldvormingssysteem (zie de Tabel van Materialen ).
OPMERKING: Voor een gedetailleerd protocol over Western blot analyse, zie Referentie 16.
- Probeer het membraan met behulp van het eerste antilichaam tegen het geprecipiteerde eiwit, verdund in 5% droogmelk-TTBS bij de door de fabrikant aanbevolen concentratie, overnacht bij 4 ° C op een schommelplatform met langzame roering.
- Om interactieproteïnen te identificeren, voer stappen 2.3.7.1-2.3.7.4 uit met behulp van de juiste antilichamen op dezelfde blote.
OPMERKING: Als eiwitten elkaar interpreteren, zullen de bindingspartners co-immunoprecipiteerd worden met het doel eiwit en zullen derhalve door Western blotting detecteerbaar zijn. Stap 2.3.8 kan worden herhaald met meer antilichamen om te bepalen of andere eiwitten zich in hetzelfde eiwitcomplex bevinden, zolang de molecuulgewichten van de eiwitten voldoende verschillen om goed gescheiden te zijn op de gel en het membraan. - Om te bevestigen dat de geïdentificeerde bindende partners geen artefacten zijn, moet wederkerig IP worden uitgevoerd.
OPMERKING: dit wordt uitgevoerd door te herhalenStappen 2.2.1-2.2.20 met hetzelfde lysaat maar precipiteren van een van de bindingspartners geïdentificeerd in stap 3.8. Vervolgens worden stappen 3.1-3.8 herhaald met behulp van het primaire antilichaam tegen het eerste eiwit van belang.
- Bereid het scheiden en stapelen van SDS-PAGE acrylamide gels (1,5 mm dikte) volgens standaardprocedures 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te bepalen of GJ, AJ en TJ componenten samen kunnen werken in de borstklier, werden co-IF assays eerst uitgevoerd. Cx26, een GJ-eiwit, en β-Catenin, een AJ-eiwit, werden met specifieke antilichamen getest en geopenbaard met behulp van respectievelijk fluorofore-geconjugeerde respectievelijke (respectievelijk Figuur 1B en C ) geverfde muis 647 (groen, pseudocolor) en geiten-568 (rood) . De gegevens toonden aan dat zij co-lokaliseren bij het celmembraan van epitheelcellen in de muizenmierklier op lactatie dag 7 (L7), zoals weerspiegeld door de gele kleur ( Figuur 1D ). Ten tweede, Claudin-7, een TJ-eiwit; E-cadherine, een AJ-eiwit; En Connexin26 (Cx26), een GJ-eiwit, werden onderzocht met hun specifieke antilichamen en werden geopenbaard met respectievelijk fluorofore-geconjugeerde konijnen 488 (groen), muis 555 (rood) en respectievelijk muis 647 (koraalblauw, pseudocolor) antilichamen ( Figuur 2B-D ). E-cadherine en Claudin-7 co-lokalisatie isWeergegeven als een geel-naar-licht-oranje kleur, terwijl Cx26 co-lokalisatie met E-cadherine en Claudin-7 resulteerde in witte gesplitste kleuring in muizenziekteklieren op zwangerschapsdag 18 (P18) ( Figuur 2E ).
Om uit te vinden welke kruisingsproteïnen elkaar binden en fysiek binden aan het celmembraan, werd co-immunoprecipitatie uitgevoerd met behulp van borstkankerweefsels van lakterende muizen (L14). Resultaten toonden aan dat Cx43, een component van GJ, interactie heeft met E-Cadherin en Claudin-7, maar niet met Claudin-3 ( Figuur 3A en B ). Deze resultaten werden bevestigd door het wederkerige IP; Toen E-Cadherine immunoprecipitueerde, interactieerde het met Cx43 en Claudin-7 ( Figuur 3C ).
Figuur 1: ß-Catenin en Cx26 co-lokaliseren bij de celmembRane in muizen mamma's. Kryosecties van muizenklieren van muizen op lactatie dag 7 (L7) werden gesneden (7 μm) en verwerkt voor immunofluorescente kleuring. ( A ) Nuclei werden gekleurd met DAPI (blauw). ( B ) Cx26 (groen, pseudocolor) en ( C ) P-Catenin (rood) worden gecombineerd met geschikte fluorofoor-gemerkte antilichamen. ( D ) Een samengevoegde afbeelding. Beelden werden verkregen met een confocale microscoop uitgerust met een spectrale detector. DAPI werd gevisualiseerd met behulp van de volgende instellingen: emissie golflengte, 450,0 nm; Excitatie golflengte, 402,9 nm; Laser kracht, 1,2; Detector gain, PMT HV 100; PMT-compensatie, 0. Cx26 (647) werd gevisualiseerd onder gebruikmaking van de volgende instellingen: emissiegolflengte, 700,0 nm; Excitatie golflengte, 637,8 nm; Laser kracht, 2,1; Detector gain, PMT HV 110; PMT-compensatie, werd 0 β-Catenin (568) geconfigureerd onder gebruikmaking van de volgende instellingen: emissiegolflengte, 595,0 nm; Excitatie golflengte, 561,6 nm; laserKracht, 2,1; Detector gain, PMT HV 110; PMT-compensatie, 0. Schaalstaven = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Connexin26 (Cx26), E-cadherine en Claudin-7 co-lokaliseren bij het celmembraan bij muizenkwartieren. Cryosecties van mammeklieren op zwangerschapsdag 18 (P18) werden gesneden (7 μm) en verwerkt voor immunofluorescerende kleuring onder toepassing van ( B ) Claudin-7 (groen), ( C ) E-Cadherine (rood) en ( D ) Cx26 Blauw; pseudocolor), gecombineerd met de geschikte fluorofoor-gemerkte antilichamen. ( A ) Nuclei werden gekleurd met DAPI (blauw). Beelden werden verkregen met een confocale microscoop uitgerust met een spectrale detector. DAPI werd gevisualiseerd met behulp van de fOllowing instellingen: emissie golflengte, 450,0 nm; Excitatie golflengte, 402,9 nm; Laser kracht, 5,4; Detector gain, PMT HV 65; PMT-compensatie, 0. Claudin-7 (488) werd gevisualiseerd onder gebruikmaking van de volgende instellingen: emissiegolflengte, 525,0 nm; Excitatie golflengte, 489,1 nm; Laser kracht, 5,0; Detector gain, PMT HV 12; PMT-compensatie, 0. E-Cadherine (568) werd gevisualiseerd onder gebruikmaking van de volgende instellingen: emissiegolflengte, 595,0 nm; Excitatie golflengte, 561,6 nm; Laser kracht, 13,5; Detector gain, PMT HV 45; PMT-compensatie, 0. Cx26 (647) werd gevisualiseerd onder gebruikmaking van de volgende instellingen: emissiegolflengte, 700,0; Excitatie golflengte, 637,8; Laser kracht, 5,0; Detector gain, PMT HV 55; PMT-compensatie, 0. Schaalstaven = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Cx43, E-Cadherine en Claudin-7, maar niet Claudin-3, zijn betrokken bij een eiwitcomplex. Cx43 ( A en B ) en E-Cadherine ( C ) werden immunoprecipitueerd onder gebruikmaking van 500 mg totaal lysaten uit muizenklieren van muizen bij lactatie. IPs en lysaten werden geladen in gels en overgebracht op PVDF membranen. Omdat Claudin-7 en Claudin-3 hetzelfde molecuulgewicht hebben, kunnen ze niet op hetzelfde membraan geanalyseerd worden. Zo werden twee parallelle IP's uitgevoerd met hetzelfde lysaat voor Cx43, geladen op twee gels, en overgebracht (membranen A en B). Membraan A werd eerst met Cx43 getest om de efficiëntie van het IP (toppaneel) te bevestigen. Vervolgens werd het membraan sequentieel getest met E-Cadherin en Claudin-7. Western blot analyse toonde aan dat de twee eiwitten interactie hebben met Cx43. Membraan B werd eerst getest met Cx43 om de efficiëntie van het IP (bovenpaneel) te bevestigen en vervolgens met Claudin-3 te proberen. Western blot analyse toonde aan dat Claudin-3 dId niet IP met Cx43, aan te tonen dat de twee eiwitten niet interageren. Membraan C werd eerst getest met E-cadherine om de efficiëntie van het IP (toppaneel) te bevestigen. Vervolgens werd het membraan sequentieel getest met Cx43 en Claudin-7. Western blot analyse bevestigde de interacties tussen de eiwitten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cell-cel interacties via kruispunten zijn nodig voor de juiste functie en ontwikkeling van veel organen, zoals de borstklier. Studies hebben aangetoond dat junctionele eiwitten de functie en stabiliteit van elkaar kunnen regelen en signaaltransductie activeren door elkaar te binden aan het celmembraan 10 . De protocollen die in het huidige manuscript zijn gepresenteerd, hebben interessante bevindingen geleverd over de interactie tussen de eiwitverschillen, lokalisatie en interactie tijdens de normale ontwikkeling van de mierenklier 9 . Gezien het feit dat junctionele eiwit lokalisatie van cruciaal belang is voor de functie van de eiwitten, en omdat zij bekend zijn met interactie met steigerproteïnen en talrijke kinases 3 , zijn co-IF en co-IP effectieve technieken op het gebied van cel-cel interacties. Niet alleen zijn deze methoden van essentieel belang om de noodzaak van knelpunten in de ontwikkeling van de borstklier en hun dys te verlichtenRegulering in borstkanker, maar ze kunnen ook worden gebruikt in andere weefsels en in experimenten met behulp van cellijnen.
De borstkanker bestaat uit twee hoofdcompartimenten: de stroma en het epithelium 4 . Het volwassen epithelium is gemaakt van twee lagen cellen. In deze aanpak werd de nabijheid van de potentiële bindende partners bepaald met behulp van de co-IF techniek, en hun fysieke interacties werden bevestigd met behulp van co-IP. Co-IF is met succes gebruikt door anderen om de co-lokalisatie van eiwitten in hetzelfde weefsel, structuur, cel of intracellulaire compartiment 17 , 18 te demonstreren. Het voornaamste voordeel van deze techniek is de visuele informatie die de cellulaire of subcellulaire lokalisatie van elk eiwit in de verschillende celtypes vormt die het weefsel samenstellen. Hoewel deze techniek vrij simpel is, moeten enkele aanbevelingen worden gevolgd. Om bijvoorbeeld weefselschade te vermijden,Voeg de oplossingen altijd een druppel tegelijk toe met een 200 μL pipet of een transferpipette. Dit zorgt voor het onderdompelen van het weefseloppervlak zonder de weefsels te beschadigen. Verwijder ook de oplossingen met behulp van een Pasteur pipette die naast de weefsels wordt geplaatst, door de glijbaan voorzichtig te kantelen. Bovendien, voor antilichamen waarvan de opslagoplossing glycerol bevat, is een zorgvuldige zuiging van de wasbuffers nodig om de achtergrond te verminderen. Bovendien kan de aanwezigheid van melkproteïnen, zoals caseïne, tijdens de lactatie de antilichamen bemoeien door ze te vallen, waardoor valse positieven ontstaan. Een kritische analyse van het resulterende beeld is dus vereist, specifiek in dit stadium.
Deze co-IF techniek heeft ook bepaalde beperkingen of valkuilen. Ten eerste vereist het specifieke antilichamen. Zoals eerder vermeld (stap 1.1), is het aan te raden om op elke dia één sectie ( dwz de rechterkant) te gebruiken voor het vleken met de hierboven beschreven stappen, waarbij u dePrimaire en secundaire antilichamen opeenvolgend. Voor de overige sectie ( dwz de linkerzijde), volg dezelfde procedure, met behulp van TBS-polysorbaat 20 0,1% in plaats van de primaire antilichaamoplossingen. Hoewel het ook mogelijk is, en nog beter, de specifieke binding van het antilichaam met behulp van peptidecompetitie te verifiëren, zijn peptiden die gebruikt worden om commerciële antilichamen te genereren niet altijd beschikbaar. Het is dus belangrijk om de specificiteit van de binding te verifiëren met behulp van positieve en negatieve controles ( dat wil zeggen weefsels of cellen die bekend zijn om uit te drukken of niet het eiwit van belang). Bovendien kunnen antigeenfixatieplaatsen ontoegankelijk zijn, met name voor formaline-vaste weefsels, waardoor de afwezigheid van een specifiek signaal resulteert. Een antigeen-retrieval procedure kan dus nodig zijn voor sommige weefsels. Een korte incubatie met detergent kan ook worden uitgevoerd voor antigeen-retrieval om het celmembraan te permeabiliseren. Ten tweede, voor multiplexing, moeten antilichamen in verschillende dieren worden opgewekt.Bijvoorbeeld, als anti-konijn werd gebruikt in stap 1.2.6, kan anti-muis geselecteerd worden in stap 1.2.10, maar niet een ander antilichaam dat in konijn wordt opgewekt. Aangezien de meeste commerciële antilichamen worden opgeheven bij konijnen, muizen of geiten, is het soms moeilijk of zelfs onmogelijk om twee eiwitten tegelijkertijd te targeten door het gebrek aan passende antilichamen. Om deze beperkingen te overwinnen kan men commercieel verkrijgbare, voorafgemerkeerde antilichamen kopen of primaire antilichamen met fluorofooren mengen met commercieel verkrijgbare kits. Ten derde, een andere tekortkoming is gekoppeld aan de excitatie en emissie van de verschillende fluoroforen. Om overlapping van de signalen van twee verschillende antilichamen te voorkomen, moet het excitatie-emissiespectrum van elke fluorofoor gescheiden worden. Zo kan het aantal doelen die tegelijk geanalyseerd kunnen worden, variëren afhankelijk van de configuratie van de beschikbare microscoop. Ten slotte is de kwaliteit van de analyse sterk afhankelijk van de gebruikte microscoop. Meer gedetailleerde en nauwkeurige gegevens kunnenWorden verkregen met behulp van een confocale microscoop in vergelijking met een epifluorescente microscoop. Het gebruik van superresolutie microscopie kan nog meer gedetailleerde eiwit co-lokalisatie 19 weergeven.
Hoewel co-IF belangrijke inzichten geeft over de nabijheid van potentiële bindende partners, moet deze worden aangevuld met andere methoden om fysieke interacties tussen eiwitten te identificeren. Onder de beschikbare methoden is co-IP waarschijnlijk een van de meest betaalbare opties, omdat de apparatuur en het materiaal gemakkelijk toegankelijk zijn. Met behulp van een antilichaam gebonden aan magnetische kralen kan men eiwitcomplexen isoleren en de componenten die in dat complex aanwezig zijn, identificeren onder gebruikmaking van typische Western blot analyse. Net als bij IF, moeten enkele aanbevelingen worden gevolgd voor beste praktijken. Bijvoorbeeld, het wordt aanbevolen om de monsters te minimaliseren bij het homogeniseren van de weefsels om de tijd tussen stappen 2.1.5 en 2.1.9 te verminderen. Terwijl een ervaren persoon maximaal 10 monsters kan verwerken bij atIk moet een beginner niet meer dan 4-6 monsters hanteren. Evenzo moet het aantal buizen beperkt worden bij het uitvoeren van het IP-protocol voor de eerste keer. Het wordt aangeraden om te beginnen met een negatieve controle ( dwz IgG) en een positieve controle ( dat wil zeggen een weefsel dat bekend is om het eiwit te bevatten dat alleen immunoprecipitueert). De tweede proef moet worden toegespitst op optimalisatie (zie stap 2.2.2). Zodra deze stappen bevredigende resultaten geven, kunnen de te analyseren monsters worden verwerkt. Merk op dat een negatieve controle altijd in de procedure moet worden opgenomen.
Deze co-IP techniek heeft ook potentieel valkuilen. Ten eerste vereist het dat weefsels worden gehomogeniseerd in omstandigheden die het behoud van de verbindingen tussen eiwitten mogelijk maken. Voor membraanproteïnen, zoals kruisingsproteïnen, is het ook van cruciaal belang een buffer te gebruiken die de bindingen tussen de eiwitten zal behouden, terwijl ook hun oplosbaarheid mogelijk wordt. In de tweede plaats, vergelijkbaar met co-IF, vereist het een hoge affiniteit antilichamenVoor zowel het doelproteïne als de bindende partners. Bovendien, omdat eiwitten in hun tertiaire conformatie blijven en eiwitcomplexen niet door homogenisatie worden gedissocieerd, als het antilichaam een deel van het doelwitproteïne herkent dat in de nabijheid van het bindingsdomein van een partner is of die verborgen is in de native structuur van het eiwit , Het IP kan worden gecompromitteerd. Het is dus essentieel om altijd de efficiëntie van het IP te controleren met behulp van Western Blotting alvorens de afwezigheid van een bindende partner af te sluiten. Ten derde kan co-IP valse positieve resultaten genereren doordat het eiwit ofwel direct aan de kralen bindt of tijdens de procedure precipiteert zonder deel uit te maken van het complex. Om deze artefacten te identificeren is een IgG-controle nodig, evenals een wederkerig IP, zoals beschreven in de beschreven methodes. Het is ook mogelijk om een "pre-cleaning" procedure tussen stappen 2.2.2 en 2.2.3 toe te voegen om de onspecifieke binding van eiwitten aan de kralen te vermijden. Om dit te doen, incubate thE lyseren met 50 μg kralen gedurende 1 uur bij 4 ° C op een roller mixer. Verwijder de kralen met de magnetische stand en ga verder met stap 2.2.3. Ten vierde kunnen de zware en lichte ketens van IgG dezelfde grootte hebben als de eiwitten van interesse of de bindingspartner, waardoor het signaal wordt gemaskerd. Eén oplossing is het oplossen van de IgG-ketens met glycine, zoals beschreven in dit manuscript. Het is ook mogelijk om secundaire antilichamen te kopen die alleen inheemse antilichamen herkennen en daarom niet binden aan de gedenatureerde licht en zware ketens die in het membraan geladen zijn (zie de Tabel van Materialen ). De twee methoden kunnen soms gecombineerd moeten worden. Ten vijfde maakt co-IP de mogelijkheid om een beperkt aantal bindende partners te identificeren, onder meer door het aantal antilichamen dat op het membraan kan worden onderzocht. Het vereist ook de vooraf-identificatie van deze bindende partners, hetzij door co-IF of via een literatuuroverzicht. Tenslotte maakt co-IP de identificatie van de eiwitten mogelijkEnt in een complex, en niet voor de directe interactie tussen twee eiwitten.
Resultaten van co-IP kunnen op verschillende manieren worden geanalyseerd. Het is mogelijk om alleen interactieve partners te identificeren door hetzelfde membraan opnieuw te onderzoeken met verschillende antilichamen, zoals beschreven in dit manuscript. Het is ook mogelijk om deze interactie te kwantificeren. Om dit te doen wordt de hoeveelheid van het eiwit dat immunoprecipitueert wordt eerst gekwantificeerd door het membraan met een antilichaam tegen dit eiwit te onderzoeken. De signaalintensiteit wordt geanalyseerd met behulp van een beeldsoftware, zoals beschreven in dit manuscript. Daarna wordt het membraan opnieuw getest met een antilichaam tegen de bindingspartner, en de signaalintensiteit wordt ook gekwantificeerd. De interacties tussen de twee eiwitten kunnen dan uitgedrukt worden als een verhouding van de hoeveelheid bindingspartner tot de hoeveelheid immunoprecipitierd eiwit. Om echter te kunnen vergelijken, moeten de verschillende monsters tegelijkertijd worden verwerkt en geladen op hetzelfde membraan. BiologIcal replicaten kunnen op dezelfde manier worden uitgevoerd en geanalyseerd, en statistische analyse kan worden uitgevoerd.
In de afgelopen jaren zijn andere technieken ontwikkeld om PPI's te analyseren. FRET staat bijvoorbeeld toe voor het identificeren van interactieproteïnen door energieoverdracht van de ene tag naar de andere, alleen wanneer de eiwitten dicht genoeg zijn om te interageren 20 . Echter, omdat het vereist dat eiwitten worden getekend, kan deze techniek niet in weefsels worden gebruikt. Op dezelfde manier is het mogelijk om PPI's te identificeren met behulp van een eiwit gefuseerd met een bacteriële biotine ligase, BirA 21 . Deze ligase voegt biotine toe aan eiwitten die in de nabijheid komen ( dwz interacteren) met het chimere eiwit. Hoewel deze methode innovatief en onpartijdig is, kan het niet in weefsels worden uitgevoerd. Alternatief kan PLA in weefsels worden gebruikt. Vergelijkbaar met co-IF, is deze bepaling gebaseerd op antilichaamaffiniteit. Voor deze analyse worden secundaire antilichamen getagd met DNA sequenties thaT kunnen interageren wanneer ze in de nabijheid zijn ( dwz op PPI's) en vormen een cirkelvormig DNA-molecuul 22 . Dit circulaire DNA-molecuul wordt dan geamplificeerd en gedetecteerd met behulp van fluorescent gemerkte complementaire oligonucleotiden. Hoewel deze analyse elegant is, vereist het veel validatie stappen en staat nog steeds op primaire antilichaam affiniteit en enige kennis van potentiële interactieve partners. Tenslotte is ook een onontbeerlijk alternatief voor de traditionele IP-analyse ontwikkeld om PPI's te identificeren. Bij snelle immunoprecipitatie-massaspectrometrie van endogene eiwit (RIME) assays worden IP-monsters geanalyseerd door massaspectrometrie (IP / MS) 23 in plaats van Western blot analyse. Het belangrijkste voordeel van deze high-throughput methode is dat het massale informatie geeft over alle endogene interactieve eiwitten met weinig materialen. Het vereist echter toegang tot een peptide-sequencing instrument 23 .
Het isBelangrijk om te vermelden, is na elke voorlopige test elke stap van dit protocol geoptimaliseerd voor de borstklier. Echter, de methode kan zeker worden gebruikt voor andere organen na enkele wijzigingen. Voor co-IF werden de optimale temperatuur voor het segmenteren van de membraan, geschikt blokkeren en wassen en oplossingen, en de juiste antilichaamconcentraties werden allemaal getest. Voor co-IP werden diverse lysis- en elueringsbuffers en extractiewerkwijzen ook getest en hebben ze een grote invloed op het succes van IP. Samenvattend is elke stap van dit protocol belangrijk voor het verkrijgen van hoogwaardige en reproduceerbare resultaten met de minst mogelijke achtergrond en de meest specificiteit. Terwijl andere methoden beschikbaar zijn, blijven co-IF gevolgd door co-IP geldige en eenvoudige methoden om PPI's te evalueren. Deze twee technieken kunnen zowel in weefsels als in cellijnen worden gebruikt en vereist slechts een paar validatie stappen en controles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te verklaren.
Acknowledgments
IP wordt gefinancierd door een wetenschappelijke wetenschappelijke en technische onderzoeksraad van Canada (NSERC # 418233-2012); Een Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), een carriere-award voor Quebec Breast Cancer Foundation, en een Leader Founds-subsidie van de Canadian Foundation for Innovation grant. ED ontving een beurs van het Fondation universitaire Armand-Frappier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10x (stock) | 1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water; 2) Adjust the PH to 7.4; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
||
| TBS 10x (stock) | 1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water; 2) Adjust the pH to 7.5; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
||
| Part 1: Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | See Comments | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Part 2: Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0 | 1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O. 2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL). 3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
- Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
- Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
- Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
- Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
- Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
- Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
- Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
- Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
- Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
- Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
- Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
- Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).
