Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

ניתוח אינטראקציות חלבון חלבון שיתוף לוקליזציה בין רכיבי פערים, צמודים, ו adherens צמתים Murine בלוטות החלב

Published: May 30, 2017 doi: 10.3791/55772
Automatic Translation
1,2, 1
1INRS, Institut Armand-Frappier, 2Biomed, UQAM

Summary

צמתים בין-תאיים הם דרישות עבור פונקציות ספציפיות של בלוטת החלב והתפתחותן. כתב היד מספק פרוטוקול מפורט לחקר האינטראקציות בין חלבונים לחלבון (PPI) לבין שיתוף לוקליזציה באמצעות בלוטות החלב Murine. טכניקות אלה מאפשרות לחקור את הדינמיקה של הקשר הפיזי בין צמתים בין-תאיים בשלבי התפתחות שונים.

Abstract

אינטראקציות תא סלולרי תפקיד מרכזי בשמירה על שלמות הרקמה ואת המכשול בין תאים שונים של בלוטת החלב. אינטראקציות אלה מסופקות על ידי חלבונים גנטיים המרכיבים נקסוס בין תאים סמוכים. מיצוקלציה של חלבון פונקציונאלי וירידה באסוציאציות פיזיות עם השותפים המחייבים שלהם עלולה לגרום לאובדן תפקוד, וכתוצאה מכך לתפקוד איברים. לכן, זיהוי לוקליזציה של חלבונים וחלבוני חלבונים (PPI) ברקמות הרגילות והמחלות, חיוניים למציאת עדויות ומנגנונים חדשים המביאים להתפתחות מחלות או שינויים במעמד ההתפתחותי. כתב היד מציג שיטה דו-שלבית להערכת PPIs בבלוטות החלב של Murine. בפרוטוקול סעיף 1, שיטה לבצע co- אימונופלורסנציה (שיתוף IF) באמצעות נוגדנים שהועלו נגד חלבונים של עניין, ואחריו נוגדנים משניים שכותרתו עם fluorochromes, מתואר. למרות שיתוף שיתוף IFבגלל ההוכחה של קרבת החלבונים, היא מאפשרת ללמוד את האינטראקציות הגופניות שלהם. לכן, פרוטוקול מפורט עבור שיתוף immunoprecipitation (שיתוף IP) מסופק בסעיף פרוטוקול 2. שיטה זו משמשת כדי לקבוע את האינטראקציות הגופניות בין חלבונים, מבלי לאשר אם אינטראקציות אלה הן ישירות או עקיפות. בשנים האחרונות, Co-IF ו- co-IP טכניקות הוכיחו כי רכיבים מסוימים של צמתים בין תאגידים שיתוף וליצור אינטראקציה יחד, יצירת תלויי שלב nexuses הגדילה המשתנים במהלך התפתחות בלוטת החלב.

Introduction

התפתחות בלוטת החלב ופיתוח מתרחשת בעיקר לאחר הלידה. איבר זה מתחדד ללא הרף לאורך כל חיי הפוריות של יונק 1 . האפיתל בבלוטת החלב הבוגרת מורכבת משכבה פנימית של תאי אפיתל לומינליים ושכבה חיצונית של תאים ביזליים, המורכבים בעיקר מתאי מיופתיטליים, מוקפים בקרום מרתף 2 . לבדיקה טובה על מבנה בלוטת החלב ופיתוח, הקורא יכול להתייחס Sternlicht 1 . תאים תא אינטראקציות דרך הפער (GJ), הדוק (TJ), והצמדות (AJ) צמתים הדרושים להתפתחות תקינה ותפקוד של בלוטה 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . המרכיבים העיקריים של צמתים אלה בלוטת החלב Murine הם Cx26, Cx30, Cx32, ו Cx43 (GJ); קלודין -1, -3, -4, -7 וZO-1 (TJ); ו E-cadherin, P-cadherin, ו β-catenin (AJ) 7 , 8 . רמות הביטוי של אלה חלבונים ג 'וניקט שונים להשתנות באופן תלוי שלב במהלך התפתחות בלוטת החלב, מה שמציע אינטראקציה תא תא אינטראקציה הדרישות 9 . GJ, TJ ו- AJ קשורים באופן מבניים ופונקציונליים ומקיפים חלבונים מבניים או רגולטוריים אחרים לאתרים הסמוכים של תאים סמוכים, ובכך יוצרים קשר גנטי. ההרכב של הקשר הג'ונקטי יכול להשפיע על גישור עם cytoskeleton הבסיסית, כמו גם חדירות ויציבות nexus, ולכן יכול להשפיע על הפונקציה של בלוטת 8 , 9 , 10 , 11 . המרכיבים של צמתים בין תאים המתגוררים nexuses פונקציונלי או אינטראקציה אחד עם השני ב difבשלבים התפתחותיים של התפתחות בלוטת החלב נותחו לאחרונה באמצעות שיתוף immunofluorescence (שיתוף IF) ושיתוף אימונופרסיפיטיון (שיתוף IP) 9 . בעוד טכניקות אחרות מאפשרות להעריך את הקשר הפונקציונלי בין חלבונים, שיטות אלו אינן מוצגות בכתב היד הזה.

כאשר חלבונים פועלים רק לבדם לתפקוד, לימוד אינטראקציות בין חלבונים לחלבון (PPI), כגון טרנספורמציות אותות ומפליות ביוכימיות, הוא חיוני לחוקרים רבים ויכול לספק מידע משמעותי על תפקוד החלבונים. Co-IF וניתוח מיקרוסקופי לעזור להעריך כמה חלבונים החולקים את אותו חלל תת-תאי. עם זאת, מספר מטרות מוגבל על ידי נוגדנים, אשר חייב להיות הרים בעלי חיים שונים, ועל ידי גישה מיקרוסקופ confocal מצויד לייזרים שונים אורך גלאי ספקטרלי עבור ריבוב. Co-IP מאשרת או מגלה זיקה גבוהה פיזית אינטראקציות betwEen שני חלבונים או יותר המתגוררים בתוך קומפלקס חלבון. למרות הפיתוח של טכניקות חדשניות, כגון העברת אנרגיה תהודה הקרינה (סריג) 12 ו assay קשירת הקרבה (PLA) 13 , אשר יכול לזהות בו זמנית את לוקליזציה ואינטראקציות של חלבונים, שיתוף IP נשאר טכניקה נאותה ובמחיר סביר ללמוד אינטראקציות בין חלבונים אנדוגניים.

שיטת צעד אחר צעד המתוארת בכתב יד זה יקל על המחקר של לוקליזציה חלבון PPIs להצביע על מלכודות להימנע בעת חקר PPIs אנדוגני בבלוטות החלב. המתודולוגיה מתחילה בהצגת הליכי השימור השונים לרקמות הנדרשות לכל טכניקה. חלק 1 מציג כיצד ללמוד חלבון שיתוף לוקליזציה בשלושה שלבים: 1) חתך של בלוטות החלב, ii) פעמיים או משולשת תיוג של חלבונים שונים באמצעות טכניקה שיתוף IF, ו- iii) הדמיה שללוקליזציה של חלבונים. חלק 2 מראה כיצד להאיץ חלבון אנדוגני ולזהות חלבונים אינטראקציה שלה בשלושה שלבים: i) הכנה lysate, ii) immunoprecipitation חלבון עקיף, ו- iii) זיהוי שותף מחייב על ידי SDS-PAGE כתם המערבי. כל צעד של פרוטוקול זה הוא מותאם עבור מכרסמים בלוטות הבלוטות החלב ומייצר באיכות גבוהה, ספציפי, תוצאות לשחזור. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כנקודת מוצא ללימודי PPI ברקמות אחרות או שורות תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים ששימשו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של האוניברסיטה (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada).

1. זיהוי חלבון שיתוף לוקליזציה

  1. מ רקמות לשקופיות מיקרוסקופיות
    הערה: יש לטפל רקמות וסעיפים על קרח יבש.
    1. בלו את בלוטות החלב מבעל חיים (עבור תיאור מלא של הליך זה, עיין Plante et al. ) 14 .
    2. הטמע את הרקמה הוסרה במדיום מקפיא / הרכבה על קרח יבש. הוסף בינוני מספיק כדי לכסות את הבלוטה. כאשר המדיום הוא solidified, להעביר את הרקמות למקפיא ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר 9 .
    3. באמצעות cryomicrotome מוגדר על 35 ° C, לחתוך את הרקמות לתוך 7-10 חלקים מיקרומטר עבה ומניחים אותם על שקופיות מיקרוסקופ.
      הערה: במידת האפשר, הנח שני קטעים בכל שקף. החלק השמאלי ישמש כשליטה אקטיבית כדי לאמת את הספציפיות של הנוגדנים ואת autofluorescence של הרקמה, בעוד הצד הימני יהיה שכותרתו עם הנוגדנים.
    4. שמור את הסעיפים ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
  2. Co-IF מכתים
    1. לאחזר את השקופיות מיקרוסקופיים המתאים מן המקפיא מיד לתקן את הסעיפים על ידי שקוע אותם פורמלדהיד 4% למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    2. לאחר מכן לטבול את השקופיות ב מלוחים זרחן מלוחים (PBS) ב RT. השאירו את השקופיות PBS ב RT עד לשלב הבא.
    3. מעגל כל קטע של השקופית באמצעות מחסום הידרופובי זמין מסחרית או עט מעבדה דוחה מים (ראה טבלה של חומרים ). היזהר לא לגעת ברקמה. מיד להוסיף טיפות של PBS לרקמה ומניחים את השקופית בתא histology לח למשך שארית ההליך.
      הערה: קטעי הרקמה חייבים להישאר לחים. חֲלוּפָהLy, להשתמש בקופסה עם מכסה ומניחים מגבות נייר רטובות בתחתית.
    4. בלוק כל סעיף רקמות עם μL 100-200 של 3% אלבומין בסרום שור (BSA) - טריס שנאגרו מלוחים (TBS) -0.1% polysorbate 20 (ראה טבלה של חומרים ) במשך 30 דקות ב RT. בעוד הדגימות חוסמות, להכין את הפתרונות נוגדנים ראשוניים ומשניים על ידי דילול הנוגדנים ב polysorbate TBS-0.1% 20.
      הערה: הריכוז הנדרש עבור הנוגדנים מסופק על ידי היצרן; ראה טבלה של חומרים ותמונות 1 ו -2 עבור דוגמאות, כמו גם Dianati et al. 9 . אמנם אין צורך לעבוד בחושך בעת שימוש רוב נוגדנים fluorophore מצומדות, למנוע חשיפת פתרונות נוגדן או רקמות מוכתמות לאור חזק, בהיר.
    5. הסר את הפתרון חסימה על ידי שאיפה דגירה הקטעים μL 100-200 של נוגדן ראשוני מדולל למשך 60 דקות ב RT. אלטרנטיבY, דגירה עם הנוגדן העיקרי לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    6. הסר את הפתרון נוגדנים ראשוניים על ידי שאיפה לשטוף את הסעיפים עם 250-500 μL של TBS-0.1% polysorbate 20 במשך 5 דקות. הסר את הפתרון לשטוף על ידי שאיפה לחזור על לשטוף פעמיים.
    7. הסר את הפתרון לשטוף על ידי שאיפה דגירה הקטעים עם μL 100-200 של הנוגדן המתאים fluorophore מצומדות משני עבור 60 דקות ב RT.
    8. הסר את הפתרון נוגדנים משני על ידי שאיפה לשטוף את הסעיפים עם 250-500 μL של TBS-0.1% polysorbate 20 במשך 5 דקות. הסר את הפתרון לשטוף וחזור פעמיים.
    9. חזור על שלב 2.5-2.8 באמצעות השילוב המתאים של נוגדנים ראשוניים ומשניים עבור חלבון (ים) הבאים של עניין.
    10. הסר את הפתרון לשטוף על ידי שאיפה ולבצע את מכתים גרעיני ידי דוגרים את החלק עם μL 100-200 של 1 מ"ג / מ"ל ​​4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ב TBS-0.1% polysorbate 20 דקות 5 בRT
    11. הסר את הפתרון DAPI על ידי שאיפה הר שקופיות באמצעות מסיס במים, שאינו זורם בינוני גובר (ראה טבלה של חומרים ) ו coverslips. המשך שקופית אחת בכל פעם.
      הערה: דגירה את הכתם בגרעין במשך יותר מ 5 דקות לא ישנה את עוצמת מכתים. לחלופין, להסיר את הפתרון DAPI על כל שקופיות דגירה הרקמות PBS בעת הרכבה שקופיות.
    12. מניחים את השקופיות שטוח במקרר 4 מעלות צלזיוס לפחות 8 שעות. המשך אל הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטי (ראה איורים 1 ו -2 ).
  3. הדמיה מיקרוסקופית
    1. דמיינו את הנוגדנים משני fluorophore מצומדות משני באמצעות מיקרוסקופ confocal מצויד לייזרים שונים הדרושים כדי לעורר את fluorophores באורכי גל ספציפיים שלהם.
      הערה: כדי להיות מסוגלים לדמיין צינורות ואלוולי, המטרה 40X עם צמצם המספרי של 0.95 הוא הציע. בחינהE של הגדרות ספציפיות מסופק באיור 1 .
    2. בדוק את לוקליזציה של כל חלבון בנפרד על ידי סריקת התמונה גל אחד באותו זמן.
      הערה: בשלב זה, חשוב לנתח בצורה ביקורתית את לוקליזציה של חלבונים ג 'וניקטיביים. כדי להיות מסוגל ליצור nexuses junctional, חלבונים אלה חייב להיות מקומי על קרום הפלזמה.
    3. קביעת שיתוף לוקליזציה של חלבונים על ידי מיזוג התמונות סרקו עם לייזרים באורכי גל שונים.
      הערה: ניתן לראות את הלוקליזציה המשותפת לחלבון על ידי שינוי הצבע הנובע מפליטת שני פלואורופורים או יותר באותו מיקום וניתן למדוד אותם באמצעות התוכנה המתאימה ( תרשימים 1 ו -2 , ראה גם סימוכין 9).

2. לימוד PPIs

הערה: בלוטות החלב הבטן יש להשתמש כדי ללמוד PPIs, כמו בלוטות החזה נמצאים בקשר הדוק עם החזהשרירים. בלו את בלוטות החלב (עבור תיאור מלא של הליך זה, עיין Plante et al .) 14 ולשמור אותם ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.

  1. הכנת Lysate
    1. מניחים נייר במשקל 2 צינורות microcentrifuge מ"ל על קרח יבש מראש מגניב אותם לפני שתמשיך עם השלבים הבאים.
    2. קח את הרקמה בלוטת החלב מ -80 מעלות צלזיוס ולשמור אותם על קרח יבש.
    3. לשקול את הרקמות על ניירות שקילה מראש צונן ולאחר מכן להעביר את הרקמה ל 2 צינורות microcentrifuge מ"ל (לטפל על קרח יבש). השתמש בין 50 ל 100 מ"ג של רקמה לדגימה. שמור את הרקמה על קרח יבש עד שלב 2.1.5.
    4. הכן את הכמות הנדרשת של חיץ משולש תמוגה חיץ בתוספת NaF, NaVO 3 , ו פרוטאז / phosphatase inhibitor, כפי שצוין בטבלה של חומרים , תוך שימוש בנוסחאות הבאות. עכברים: חיץ נדרש (μL) = משקל רקמת העכבר (מ"ג) x 3; Rat: נדרשחיץ (μL) = משקל רקמת חולדה (מ"ג) x 5.
    5. מוסיפים את הכמות הנדרשת של חיץ תמוגה קר כקרח (מחושב בשלב 2.1.4) לצינור 2 מ"ל המכיל את הרקמה.
      הערה: בצעדים 2.1.5-2.1.6, המשך עם צינור אחד בכל פעם.
    6. Homogenize הרקמה של 30-40 s באמצעות homogenization מתמשך על מטחנת רקמות; תמיד לשמור את הצינור על הקרח. התאם את homogenizer רקמות במהירות בינונית בעדינות להזיז את המטחנה למעלה ולמטה בתוך הצינור.
    7. חזור על שלבים 1.6 ו -1.7 עם צינורות אחרים.
    8. דגירה lysates על הקרח 10-30 דקות.
    9. צנטריפוגה צינורות ב XG 170 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    10. בינתיים, לזהות 6-10 צינורות microcentrifuge (0.6 מ"ל) עבור כל מדגם ולשמור אותם על הקרח.
    11. לאחר צנטריפוגה נעשה, לבדוק את צינורות. ודא כי הם מכילים שכבת העליון של שומן, ברור, צהוב lysates lysates (בהתאם לשלב של פיתוח) ו גלולה.
    12. צור חור בשכבת השומניםבאמצעות טיפ פיפטה 200 μL לגשת לשלב נוזלי. לשנות את קצה ולאסוף את lysate מבלי להפריע גלולה או aspirating את השכבה. Aliquot lysate ב מראש שכותרתו צינורות על הקרח (שלב 2.1.11) ולאחסן אותם -80 ° C.
    13. השתמש aliquot לכמת את ריכוז החלבון באמצעות ערכת זמין מסחרית מתאימה (ראה טבלה של חומרים ).
  2. אימונופרסיפיקציה עקיפה
    1. על הקרח, להפשיר שני aliquots של סך lysates בלוטת החלב שהוכן בעבר.
      הערה: אחד aliquot ישמש את ה- IP של חלבון היעד, ואילו השני ישמש שליטה שלילית.
    2. איסוף 500-1,000 מיקרוגרם של lysate ו לדלל אותו PBS להגיע נפח סופי של 200 μL בצינור 1.5 מ"ל כל.
      הערה: כמות lysate לשמש תלוי בשפע של חלבון של עניין ואת היעילות של הנוגדן (ראה איור 3 עבורN למשל, כמו גם את לוח החומרים ). כדי לייעל עבור כל יעד, כמויות שונות של lysate ( כלומר, 500, 750, ו 1000 מיקרוגרם) ו נוגדן ( כלומר, 5, 10, ו 20 מיקרוגרם) יש להשתמש. המשך בשלבים הבאים (2.2.3-2.3.7.4).
    3. מוסיפים את הנוגדן נגד האנטיגן של עניין הצינור הראשון של lysate ולשמור אותו על הקרח.
      הערה: הסכום הנדרש מוצע בדרך כלל על פי גיליון ההוראות שסופק על ידי כל חברה (ראה טבלת החומרים ).
    4. בצינור השני, להכין שליטה שלילית על ידי הוספת ריכוז זהה של איגוטפ IgG שליטה כמו הנוגדן בשימוש בשלב 2.2.3.
    5. דגירה צינורות לילה ב 4 מעלות צלזיוס על צינורית רולר מיקסר במהירות נמוכה.
    6. למחרת, להוסיף 50 μL של חרוזים מגנטיים צינורות חדשים 1.5 מ"ל עבור טרום כביסה.
      1. בחר חלבון או חלבון G חרוזים מגנטיים המבוססים על זיקה יחסית הנוגדן.
        2. חשוב להימנע משימוש בחרוזים מצטברים; בעדינות לערבב את השעיה חרוז עד שהוא אחיד מושעה מחדש לפני הוספת אותו צינורות.
    7. מניחים את צינורות המכילים את החרוזים על המעמד המגנטי ולאפשר חרוזים להגר אל המגנט. הסר את המאגר אחסון מן החרוזים באמצעות פיפטה 200 μL.
    8. שטפו את החרוזים על ידי הוספת 500 μL של polysorbate PBS-0.1% 20 ו מערבולת צינורות במרץ עבור 10 s.
    9. שים את הצינורות בחזרה על המעמד המגנטי ולאפשר חרוזים להגר אל המגנט.
    10. הסר את החיץ לשטוף עודף ידי pipetting עם פיפטה 200 μL.
    11. הוסף את התגובה מורכבת (lysate נוגדן) משלב 2.2.5 חרוזים ו דגירה של 90 דקות ב RT על מערבל הרים.
    12. מניחים את הצינורות על המעמד המגנטי ולאפשר חרוזים להגר אל המגנט. באמצעות פיפטה 200 μL, לשאוב ולזרוק lysate ומניחים את הצינורות על הקרח.
    13. שטפו את החרוזS על ידי הוספת 500 μL של PBS, הצבת צינורות על המעמד המגנטי, והסרת הנוזל באמצעות פיפטה 200 μL. חזור על צעד זה לשטוף. במהלך השלבים לשטוף, להימנע vortexing ולשמור על דגימות על הקרח.
    14. לשטוף את החרוזים פעם אחת עם PBS-0.1% polysorbate 20 ללא vortexing וזורקים למאגר לשטוף האחרון באמצעות טיפ 200 פיפטה μL.
    15. כדי elute, להוסיף 20 μL של 0.2 M חומצה גליצין (pH = 2.5) כדי צינורות ולנער אותם במשך 7 דקות על מיקסר רולר.
    16. צנטריפוגה במהירות גבוהה למשך כמה שניות (ספין מהיר) ולאסוף את supernatant בצינור קרח קר חדש.
    17. חזור על שלבים 2.2.14 ו 2.2.15 עבור כל צינור.
      הערה: נפח הסופי יהיה 40 μL.
    18. הוסף 10 μL של חיץ Laemmli 4x למדגם eluted 40 μL משלב 2.2.16.
      הערה: הצבע יהפוך צהוב בשל חומציות pH.
    19. מיד להוסיף 1 M Tris (pH = 8), טיפה אחת בכל פעם, כדי מדגם eluted משלב 2.2.18 עד צבע שלההופך כחול. המשך אל הצינורות הבאים.
    20. מרתיחים את הדגימות משלב 2.2.18 ב 70-90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להמשיך מיד ג'ל אלקטרופורזה. לחלופין, להעביר את דגימות למקפיא ב -80 מעלות צלזיוס עד הטעינה.
  3. יישום downstream: ג'ל אלקטרופורזה ואחריו כתם המערבי
    1. הכנת הפרדה וערימה SDS-PAGE ג'ל acrylamide (1.5 מ"מ עובי) בעקבות הליכים סטנדרטיים 15 .
      הערה: הבחירה של ג'ל (8-15% acrylamide, שיפוע: לראות את טבלת החומרים ) צריך להיקבע על בסיס גודל מולקולרי של החלבון להיות זירז של שותפים מחייב פוטנציאל להיות מנותח. חלבונים אלה חייבים להיפתר אחד מהשני כדי לאפשר immunodetection תקין.
    2. להפשיר את immunoprecipitation (IP) דגימות מרחוק (שלב 2.2.20) על הקרח.
    3. הכן lysates חלבון מן דגימות אותו (המשמש את ההליך IP לעיל). השתמש ב- 50מיקרוגרם של סך lysate ולהוסיף חיץ מדגם 4X Laemmli. מרתיחים את הדגימות ב 70-90 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומניחים על הקרח עד הטעינה.
      הערה: דגימות אלה יטענו ליד מדגם IP eluted כדי להדגים את נוכחותם של חלבונים זירז סך lysate.
    4. טען את lysates מוכן משלב 2.3.3 ואת דגימות זירז משלב 2.2.20 זה לצד זה בג'ל acrylamide ולהפעיל אותם במאגר פועל (10x חיץ פועל: 30.3 גרם של Tris, 144.1 גרם של גליצין, ו 10 G של SDS ב 1 L של מים מזוקקים) ב 100 V עבור 95 דקות בקירוב, או עד קצה החלבונים נודדים מגיע לתחתית של ג'ל.
    5. מעבירים את הג'לים ל nitrocellulose או קרום PVDF באמצעות פרוטוקול סטנדרטי 9 , 15 .
    6. לחסום את הממברנה במשך 1 שעות על נדנדה על מהירות נמוכה ב 5% חלב יבש-TTBS (20 מ"מ טריס, 500 מ"מ NaCl, ו 0.05% polysorbate 20).
    7. זהה אם המשקעים היו סוכברכות.
      1. בדוק את הממברנה באמצעות הנוגדן הראשון נגד חלבון זירז, בדילול של 5% חלב יבש- TTBS בריכוז המומלץ על ידי היצרן, לילה ב 4 ° C על פלטפורמת נדנדה עם תסיסה איטית.
        הערה: ראה טבלת חומרים להמלצות.
      2. למחרת, לשטוף את הממברנה 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם TTBS על פלטפורמת נדנדה עם תסיסה גבוהה.
      3. דגירה של קרום נוגדנים משני המתאים מצומדות עם חזרת peroxidase (HRP), מדולל TTBS, במשך שעה 1 ב RT על פלטפורמת נדנדה עם תסיסה איטית.
        הערה: לחלופין, נוגדנים משניים מצומדות עם fluorochrome ניתן להשתמש אם המנגנון המתאים כדי לזהות את האות זמין.
      4. בצע 3 עד 6 שוטף, כל 5 דקות, עם TTBS על פלטפורמת נדנדה עם תסיסה גבוהה. לנתח את האות של הנוגדן משני על ידי דוגרים את הממברנה עם מסחרית אVailable luminol פתרון (ראה טבלה של חומרים ) ופעל לפי הוראות היצרן. זיהוי האות באמצעות מערכת הדמיה chemiluminescence (ראה טבלה של חומרים ).
        הערה: לקבלת פרוטוקול מפורט על ניתוח כתם המערבי, ראה התייחסות 16.
    8. כדי לזהות חלבונים אינטראקטיביים, בצע את השלבים 2.3.7.1-2.3.7.4 באמצעות הנוגדנים המתאימים על אותו כתם.
      הערה: אם חלבונים הם אינטראקציה, השותפים מחייב יהיה שיתוף immunoprecipitated עם חלבון היעד ולכן יהיה לזיהוי על ידי סופג המערבי. שלב 2.3.8 ניתן לחזור עם נוגדנים יותר כדי לקבוע אם חלבונים אחרים מתגוררים באותו חלבונים מורכבים, כל עוד משקולות מולקולריות של חלבונים שונים מספיק כדי להיות מופרדים היטב על ג 'ל וקרום.
    9. כדי לאשר כי שותפים מחייב זיהו אינם חפצים, IP הדדי צריך להתבצע.
      הערה: פעולה זו מבוצעת על ידי חזרהצעדים 2.2.1-2.2.20 עם lysate אותו אבל מזרז אחד השותפים המחייבים המזוהים בשלב 3.8. לאחר מכן, צעדים 3.1-3.8 חוזרים על עצמם באמצעות הנוגדן העיקרי נגד החלבון הראשון של עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לקבוע אם GJ, AJ, ו TJ רכיבים יכולים לתקשר יחד בלוטת החלב, co-IF מבחני בוצעו לראשונה. Cx26, חלבון GJ, ו- β-Catenin, חלבון AJ, נבדקו באמצעות נוגדנים ספציפיים וגילו באמצעות נוגדנים של עכבר פלואורופורי-מצומדות (647, ירוק, pseudocolor) ועז-568 (אדום), בהתאמה ( איור 1B ו- C ) . הנתונים הראו כי הם שיתוף לוקליזציה בקרום התא של תאים אפיתל בבלוטת החלב עכברים ביום ההנקה 7 (L7), כפי שמשתקף על ידי צבע צהוב ( איור 1D ). שנית, Claudin-7, חלבון TJ; E-cadherin, AJ חלבון; ו - Connexin26 (Cx26), חלבון GJ, נבדקו עם הנוגדנים הספציפיים שלהם ונתגלו עם נוגדנים פלואורופיים מצומדות ארנב 488 (ירוק), עכבר 555 (אדום), עכבר 647 (כחול אלמוגים, pseudocolor), בהתאמה ( איור 2B-D ). E-cadherin ו Claudin -7 שיתוף לוקליזציה היאכפי שמוצג בצבע צהוב אל כתום בהיר, בעוד Cx26 שיתוף לוקליזציה עם E-cadherin ו Claudin -7 הביא מכתים מנוקב לבן בבלוטות החלב עכברים ביום ההריון 18 (P18) ( איור 2E ).

כדי לגלות אילו חלבונים junctional intermingle ו פיזית לקשור יחד בקרום התא, co-immunoprecipitation בוצע באמצעות רקמות בלוטת החלב מעכברים מניקות (L14). התוצאות הראו כי Cx43, רכיב של GJ, אינטראקציה עם E-Cadherin ו Claudin-7, אבל לא עם Claudin-3 ( איור 3A ו- B ). תוצאות אלו אושרו על ידי ה- IP ההדדי; כאשר E-Cadherin היה immunoprecipitated, זה אינטראקציה עם Cx43 ו-קלודין -7 ( איור 3 ג ).

איור 1
איור 1: β-Catenin ו Cx26 שיתוף למקם את התא התאRane ב עכברים בלוטות החלב. Cryosections מ בלוטות החלב של עכברים ביום הנקה 7 (L7) נחתכו (7 מיקרומטר) ומעובדים מכתים אימונופלורסנט. ( א ) גרעינים היו מוכתמים DAPI (כחול). ( B ) Cx26 (ירוק, pseudocolor) ו ( C ) β-Catenin (אדום) מוצגים יחד עם המתאים fluorophore שכותרתו נוגדנים. ( ד ) תמונה ממוזגת. תמונות התקבלו עם מיקרוסקופ confocal מצויד גלאי ספקטרלי. DAPI היה דמיינו באמצעות ההגדרות הבאות: אורך גל פליטה, 450.0 ננומטר; אורך גל עירור, 402.9 ננומטר; כוח לייזר, 1.2; גלאי רווח, PMT HV 100; PMT לקזז, 0. Cx26 (647) היה דמיינו את ההגדרות הבאות: אורך פליטה, 700.0 ננומטר; אורך גל עירור, 637.8 ננומטר; כוח לייזר, 2.1; גלאי רווח, PMT HV 110; PMT לקזז, 0. β-Catenin (568) היה דמיינו באמצעות ההגדרות הבאות: אורך גל פליטה, 595.0 ננומטר; אורך גל עירור, 561.6 ננומטר; לייזרעוצמה, 2.1; גלאי רווח, PMT HV 110; PMT לקזז, 0. סולם ברים = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: Connexin26 (Cx26), E-cadherin, ו- Claudin-7 שיתוף לוקליזציה בקרום התא בבלוטות החלב. Cryosections מ בלוטות החלב ביום ההריון 18 (P18) נחתכו (7 מיקרומטר) ומעובד מכתים אימונופלורסנט באמצעות ( ב ) Claudin-7 (ירוק), ( C ) E-Cadherin (אדום), ( D ) Cx26 (אלמוגים כחול, pseudocolor), בשילוב עם המתאים fluorophore שכותרתו נוגדנים. ( א ) גרעינים היו מוכתמים DAPI (כחול). תמונות התקבלו עם מיקרוסקופ confocal מצויד גלאי ספקטרלי. DAPI היה דמיינו באמצעות fOllowing הגדרות: גל פליטה, 450.0 ננומטר; אורך גל עירור, 402.9 ננומטר; כוח לייזר, 5.4; גלאי רווח, PMT HV 65; PMT לקזז, 0. Claudin-7 (488) היה דמיינו באמצעות ההגדרות הבאות: אורך גל פליטה, 525.0 ננומטר; אורך גל עירור, 489.1 ננומטר; כוח לייזר, 5.0; גלאי רווח, PMT HV 12; PMT לקזז, 0. E-Cadherin (568) היה דמיינו באמצעות ההגדרות הבאות: אורך גל פליטה, 595.0 ננומטר; אורך גל עירור, 561.6 ננומטר; כוח לייזר, 13.5; גלאי רווח, PMT HV 45; PMT לקזז, 0. Cx26 (647) היה דמיינו באמצעות ההגדרות הבאות: אורך פליטה, 700.0; אורך גל עירור, 637.8; כוח לייזר, 5.0; גלאי רווח, PMT HV 55; PMT לקזז, 0. סולם ברים = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: Cx43, E-Cadherin, ו- Claudin-7, אבל לא Claudin-3, מעורבים במכלול חלבון. Cx43 ( A ו- B ) ו- E-Cadherin ( C ) היו immunoprecipitated באמצעות 500 מ"ג של lysates סך מן בלוטות החלב של עכברים בהנקה. IPs ו lysates היו טעון ג 'ל הועבר על ממברנות PVDF. מכיוון שלקלודין 7 ולקלודין 3 יש משקל מולקולרי זהה, לא ניתן לנתח אותם על אותו קרום. כך, שתי כתובות IP מקבילות בוצעו עם אותו Lysate עבור Cx43, נטען על שני ג'לים, והעביר (ממברנות A ו- B). ממברנה A נבדק לראשונה עם Cx43 כדי לאשר את היעילות של ה- IP (הלוח העליון). לאחר מכן, הממברנה נבדקה ברצף עם E-Cadherin ו- Claudin-7. ניתוח כתם המערבי הראה כי שני חלבונים אינטראקציה עם Cx43. Membrane B נבדק לראשונה עם Cx43 כדי לאשר את היעילות של ה- IP (הלוח העליון) ולאחר מכן לחקור עם Claudin-3. ניתוח כתם המערבי הראה כי קלודין -3 דלא מזהה IP עם Cx43, הוכיח כי שני חלבונים לא אינטראקציה. ממברנה C נבדקה לראשונה עם E-cadherin כדי לאשר את היעילות של ה- IP (הלוח העליון). לאחר מכן, הממברנה, נבדקה ברצף עם Cx43 וקלודין -7. ניתוח כתם המערבי אישר את האינטראקציות בין החלבונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תאים תאים אינטראקציות באמצעות צמתים נדרשים לתפקוד תקין ופיתוח של איברים רבים, כגון בלוטת החלב. מחקרים הראו כי חלבונים פונקציונליים יכולים לווסת את הפונקציה ואת היציבות של אחד אחר ולהפעיל transduction האות על ידי קשירה זה לזה בקרום התא 10 . הפרוטוקולים שהוצגו בכתב היד הנוכחי סיפקו ממצאים מעניינים על ביטוי פונקציונלי של חלבון פונקציונלי, לוקליזציה ואינטראקציה במהלך התפתחות בלוטת המוריין הרגילה. בהתחשב בכך לוקליזציה חלבון junctional הוא קריטי לתפקוד של חלבונים, ובגלל שהם ידועים אינטראקציה עם חלבונים פיגומים רבים קינאזות 3 , שיתוף IF ו- co-IP הם טכניקות יעילות בתחום של תא תאים אינטראקציות. לא זו בלבד ששיטות אלה חיוניות להבהרת הצורך של חיבורי גדילה בהתפתחות בלוטת החלב,רגולציה בסרטן השד, אבל הם יכולים לשמש גם ברקמות אחרות בניסויים באמצעות שורות תאים.

בלוטת החלב מורכבת משני תאים עיקריים: סטרומה ואפיתל 4 . האפיתל הבוגר מורכב משתי שכבות של תאים. בגישה זו, הקרבה של השותפים הפוטנציאליים המחייבים נקבעה באמצעות הטכניקה co-IF, והאינטראקציות הגופניות שלהם אושרו באמצעות שיתוף IP. Co-IF שימש בהצלחה על ידי אחרים כדי להדגים את שיתוף לוקליזציה של חלבונים בתוך רקמות אותו, מבנה, תא, או תא תאיים 17 , 18 . היתרון העיקרי של טכניקה זו היא מידע חזותי שהיא מביאה על לוקליזציה הסלולר או תת תאי של כל חלבון בתוך סוגי תאים שונים להלחין את הרקמה. למרות טכניקה זו היא פשוטה למדי, כמה המלצות יש לעקוב. לדוגמה, כדי למנוע נזק לרקמות,תמיד להוסיף את הפתרונות ירידה אחת בכל פעם באמצעות פיפטה 200 μL או פיפטה ההעברה. זה יאפשר טבילה של משטח רקמה מבלי לפגוע ברקמות. באופן דומה, להסיר את הפתרונות באמצעות פיפטה פסטר להציב ליד הרקמות על ידי הטיה בעדינות את השקופית. יתר על כן, עבור נוגדנים אשר פתרון אחסון מכיל גליצרול, שאיבה זהירה של המאגרים לשטוף נדרש כדי להפחית את הרקע. יתר על כן, נוכחות של חלבונים חלב, כגון caseins, במהלך הנקה יכול להפריע נוגדנים על ידי השמנה אותם, וכתוצאה מכך תוצאות חיוביות שגויות. במיוחד נדרש ניתוח קריטי של התמונה המתקבלת, במיוחד בשלב זה.

טכניקה זו שיתוף IF יש גם מגבלות מסוימות או מלכודות. ראשית, זה דורש נוגדנים ספציפיים. כפי שצוין לעיל (שלב 1.1), מומלץ להשתמש בסעיף אחד ( כלומר, אחד בצד ימין) על כל שקופית עבור מכתים בעקבות הצעדים המתוארים לעיל, והוסיףנוגדנים ראשוניים ומשניים ברצף. עבור החלק הנותר ( כלומר, אחד בצד שמאל), בצע את אותו הליך, באמצעות TBS-polysorbate 20 0.1% במקום פתרונות נוגדן העיקרי. אמנם זה אפשרי, ואפילו טוב יותר, כדי לאמת את מחייב ספציפי של נוגדנים באמצעות תחרות פפטיד, פפטידים המשמשים לייצור נוגדנים מסחריים אינם זמינים תמיד. לכן חשוב לאמת את הספציפיות של הכריכה באמצעות בקרות חיוביות ושליליות ( כלומר רקמות או תאים הידועים כמבטאים, או לא, את חלבון העניין). יתר על כן, אתרי קיבוע אנטיגן יכול להיות נגיש, במיוחד עבור רקמות קבוע פורמלין, ובכך וכתוצאה מכך העדר אות מסוים. פרוצדורה של אחזור אנטיגן עשויה להיות נדרשת עבור כמה רקמות. הדגירה קצר עם חומר ניקוי יכול גם להתבצע לפני אנטיגן אחזור כדי permeabilize את קרום התא. שנית, עבור ריבוב, נוגדנים חייב להיות הרים בעלי חיים שונים.לדוגמה, אם אנטי ארנב שימש בשלב 1.2.6, אנטי עכבר יכול להיות נבחר בשלב 1.2.10, אבל לא נוגדנים אחרים שהועלו ארנב. מאחר שרוב הנוגדנים המסחריים גדלים בארנבות, בעכברים או בעזים, לפעמים קשה, או אפילו בלתי אפשרי, למקד שני חלבונים בו-זמנית בשל היעדר נוגדנים מתאימים. כדי להתגבר על המגבלות האלה, ניתן לקנות נוגדנים זמינים מראש, שכותרתם מראש או תווית נוגדנים ראשוניים עם fluorophores באמצעות ערכות זמין מסחרית. שלישית, חסרון נוסף קשור לעירור ולפליטה של ​​הפלואורופורים השונים. כדי למנוע חפיפה של אותות משני נוגדנים שונים, ספקטרום פליטת עירור של כל fluorophore יש להפריד. לכן, מספר מטרות שניתן לנתח בבת אחת ישתנה בהתאם לתצורה של המיקרוסקופ הזמין. לבסוף, איכות הניתוח תלויה מאוד במיקרוסקופ המשמש. נתונים מפורטים ומדויקים יותרלהיות מושגת באמצעות מיקרוסקופ confocal לעומת מיקרוסקופ epifluorescent. השימוש במיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה יכול לחשוף שיתוף חלבון שיתוף בפירוט עוד יותר 19 .

למרות שיתוף IF מביא תובנות חשובות על הקרבה של שותפים מחייב פוטנציאליים, זה צריך להיות משלים על ידי שיטות אחרות כדי לזהות אינטראקציות פיזיות בין חלבונים. בין השיטות הזמינות, שיתוף IP הוא כנראה אחד הזולה ביותר לבצע, כמו הציוד והחומר הם נגישים בקלות. באמצעות נוגדנים קשורה חרוזים מגנטיים, אפשר לבודד קומפלקסים חלבונים לזהות את הרכיבים הקיימים במתחם זה באמצעות ניתוח כתם המערבי המערבי. בדומה co-IF, כמה המלצות יש לעקוב אחר שיטות עבודה מומלצות. לדוגמה, מומלץ למזער את הדגימות כאשר homogenizing הרקמות כדי לצמצם את הזמן בין צעדים 2.1.5 ו 2.1.9. בעוד אדם מנוסה יכול לעבד עד 10 דגימות בביתIme, מתחיל לא צריך להתמודד עם יותר מ 4-6 דגימות. באופן דומה, מספר צינורות צריך להיות מוגבל בעת ביצוע פרוטוקול IP בפעם הראשונה. מומלץ להתחיל עם שליטה שלילית ( כלומר, IgG) ו שליטה חיובית ( כלומר, רקמה הידועה להכיל את החלבון להיות immunoprecipitated) בלבד. המשפט השני צריך להיות מוקדש אופטימיזציה (ראה שלב 2.2.2). לאחר צעדים אלה לתת תוצאות מספקות, דגימות ניתח יכול להיות מעובד. שים לב כי שליטה שלילית תמיד צריך להיכלל בהליך.

זו טכניקה שיתוף IP יש גם מלכודות פוטנציאליים. ראשית, הוא דורש רקמות להיות homogenized בתנאים המאפשרים שימור הקשרים בין חלבונים. עבור חלבונים ממברנה, כגון חלבונים ג 'וניקטיביים, הוא חיוני גם כדי להשתמש חיץ שישמור את הקשרים בין החלבונים תוך גם מאפשר מסיסות שלהם. שנית, בדומה שיתוף IF, זה דורש נוגדנים זיקה גבוהההן עבור חלבון המטרה והן של השותפים המחייבים. יתר על כן, מכיוון שחלבונים נשארים בקונפורמציה שלישוניים, ומורכבות חלבונים אינן מנותקות על ידי הומוגניזציה, אם הנוגדן מזהה חלק מחלבון המטרה שנמצא בקרבת מקום לתחום המחייב של בן זוג או שהוא מוסתר בתוך המבנה הטבעי של החלבון , ה- IP יכול להיות בסכנה. זה חיוני ולכן תמיד לוודא את היעילות של ה- IP באמצעות סופג המערבי לפני סיום העדר שותף מחייב. שלישית, Co-IP יכול לייצר תוצאות חיוביות שגויות בגלל החלבון או מחייב ישירות חרוזים או משקעים במהלך ההליך מבלי להיות חלק של המתחם. כדי לזהות את הממצאים האלה, נדרשת שליטה ב- IgG, כמו גם כתובת IP הדדית, כמתואר בשיטות המוצגות. ניתן גם להוסיף נוהל "טרום ניקוי" בין שלבים 2.2.2 ו 2.2.3 כדי למנוע את מחייב unpetific של חלבונים חרוזים. כדי לעשות זאת, דגירה הE lysates עם 50 מיקרוגרם של חרוזים במשך שעה 1 ב 4 ° C על מערבל הרים. הסר את החרוזים עם המעמד המגנטי והמשך לשלב 2.2.3. רביעית, שרשראות כבדות וקלות של IgG יכול להיות בגודל זהה לחלבונים של עניין או שותף מחייב, ובכך מסווה את האות. פתרון אחד הוא לנתק את שרשרות IgG עם גליצין, כמתואר בכתב יד זה. כמו כן ניתן לרכוש נוגדנים משניים כי רק לזהות נוגדנים מקומיים ולכן לא להיקשר האור מפוגל ורשתות כבדות נטען בקרום (ראה טבלה של חומרים ). שתי השיטות עשויות לעיתים להיות משולבות. חמישית, שיתוף IP מאפשר זיהוי של מספר מצומצם של שותפים מחייב, בין השאר בגלל מספר נוגדנים שניתן לחקור על הממברנה. זה גם דורש מראש זיהוי של שותפים מחייבים אלה, או על ידי שיתוף IF או באמצעות סקירת ספרות. לבסוף, שיתוף IP מאפשר זיהוי של חלבונים presEnt בתוך קומפלקס, ולא עבור אינטראקציה ישירה בין שני חלבונים.

התוצאות של שיתוף IP ניתן לנתח בדרכים שונות. זה אפשרי רק לזהות שותפים אינטראקציה על ידי בדיקה מחדש של אותו קרום עם נוגדנים שונים, כמתואר בכתב היד הזה. ניתן גם לכמת אינטראקציה זו. לשם כך, כמות החלבון immunoprecipitated הוא לכמת הראשון על ידי חיטוט הממברנה עם נוגדן כנגד חלבון זה. עוצמת האות מנותחת באמצעות תוכנת הדמיה, כמתואר בכתב יד זה. לאחר מכן, הממברנה נבדקת מחדש עם נוגדנים נגד השותף מחייב, ואת עוצמת האות גם לכמת. יחסי הגומלין בין שני החלבונים יכולים לבוא לידי ביטוי כשיעור של כמות השותף המחייב לכמות החלבון החיסוני. עם זאת, כדי לאפשר השוואה, דגימות שונות חייב להיות מעובד באותו זמן וטעון על קרום אותו. ביולוגמשכפל ical ניתן להמשיך ונותחו באופן דומה, וניתן לבצע ניתוח סטטיסטי.

בשנים האחרונות, פותחו טכניקות אחרות כדי לנתח PPIs. לדוגמה, סריג מאפשר זיהוי של חלבונים אינטראקציה באמצעות העברת אנרגיה מתג אחד למשנהו, רק כאשר החלבונים קרובים מספיק כדי לקיים אינטראקציה 20 . עם זאת, מכיוון שהוא דורש חלבונים להיות מתויג, טכניקה זו לא ניתן להשתמש ברקמות. באופן דומה, ניתן לזהות PPIs באמצעות חלבון התמזגו עם ליגז ביוטין חיידקי, בירא 21 . ליגז זה יוסיף ביוטין לחלבונים שמגיעים בסמיכות ( כלומר, אינטראקציה) עם חלבון chimeric. בעוד שיטה זו היא חדשנית ולא משוחדת, זה לא יכול להתבצע ברקמות. לחלופין, PLA ניתן להשתמש ברקמות. בדומה שיתוף IF, assay זה מבוסס על זיקה נוגדן. עבור assay זה, נוגדנים משני מתויגות עם רצפי DNA thaלא יכולים לתקשר כאשר הם נמצאים בקרבת מקום ( כלומר, על PPIs) ויוצרים מולקולה דנ"א עגולה 22 . זה מולקולה דנ"א עגולה היא הגברה ואז זוהה באמצעות oligonucleotides משויך fluorescently שכותרתו. למרות assay זה אלגנטי, זה דורש צעדים אימות רבים ועדיין מסתמך על זיקה נוגדן העיקרי וכמה ידע של שותפים פוטנציאליים אינטראקציה. לבסוף, חלופה משוחדת assay IP המסורתית פותחה גם כדי לזהות PPIs. ב מהיר ספקטרומטריית מסה immunoprecipitation של מבחני חלבון אנדוגני (RIME), דגימות IP מנותחות על ידי ספקטרומטריית מסה (IP / MS) 23 במקום ניתוח כתם המערבי. היתרון העיקרי של שיטה זו תפוקה גבוהה היא כי הוא מספק מידע מסיבי על כל חלבונים אינטראקציה אנדוגני באמצעות כמה חומרים. עם זאת, זה דורש גישה מכשיר פפטיד רצף 23 .

זהחשוב לציין כי, לאחר מספר בדיקות ראשוניות, כל צעד של פרוטוקול זה כבר מותאם במיוחד עבור בלוטת החלב. עם זאת, השיטה יכולה בהחלט לשמש לאיברים אחרים לאחר כמה שינויים. עבור שיתוף IF, הטמפרטורה האופטימלית עבור חתך בלוטת החלב, חסימה מתאימה כביסה ופתרונות, ואת ריכוזי נוגדנים תקין נבדקו כולם. עבור שיתוף IP, שונות תמוגה ו buffers elution ושיטות של extractions נבדקו גם יש השפעה גדולה על ההצלחה IP. לסיכום, כל צעד בפרוטוקול זה חשוב להשגת תוצאות באיכות גבוהה לשחזור עם הרקע האפשרי לפחות הספציפיות ביותר. בעוד שיטות אחרות זמינות, שיתוף- IF ואחריו שיתוף IP נותרו תקפות ושיטות פשוטות כדי להעריך PPIs. שתי טכניקות אלה ניתן להשתמש הן ברקמות שורות תאים ורק דורשים כמה צעדים אימות ובקרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה להכריז.

Acknowledgments

IP ממומן על ידי מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של מענק קנדה (NSERC # 418233-2012); פונדס דה Recherche du Québec-Santé (FRQS), פרס קריירה לסרטן השד של קוובק, ומענק למנהיגים מייסד הקרן הקנדית לחדשנות. א.ד. קיבל מלגה מארגון ארנדנד-פריייר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice strain and stage St. Constant, Quebec, Canada C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10x (stock) 1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water;
2) Adjust the PH to 7.4;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
TBS 10x (stock) 1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water;
2) Adjust the pH to 7.5;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
Part 1: Immunofluorescence
Freezing media VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada 95067-840 VMR frozen sections compound 
Microtome Mississauga, ON, Canada 956640 Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
Blades C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada BLM1001C High profile gold coated blades
Pap pen Cedarlane, Burlington, ON, Canada 8899 Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slides Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada 12-550-15 Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
Formaldehyde BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada FOR201.1 Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution 3% BSA in TBS
Wash solution TBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20 Oakville, ON, Canada P 9416 Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting media Cedarlane, Burlington, ON 17984-25(EM) Fluoromount-G
First & secondary antibodies Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies  Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada  See Comments β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stain Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada D1306 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS
Fluorescent microscope Nikon Canada, Mississauga, On, Canada Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysis Nikon Canada, Mississauga, On, Canada NIS-elements software (version 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0 1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O.
2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL).
3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge.
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitor Fisher Scientific, Burlington, ON 78441 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)
Protein dosage Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA 23225 Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinder Fisher Scientific, Burlington, ON FTH-115 Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and stand Millipore, Etobicoke, ON, Canada PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IP PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada See Comments Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL
Laemmli buffer  BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada 1610747 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine  Fisher Scientific, Burlington, ON PB381-5 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris  Fisher Scientific, Burlington, ON BP152-1 1 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1610180 -5 TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water
Membranes BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer method BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704155 Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry Milk Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blots TBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1705061 Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1708280 ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada ImageLab 5.2 software 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
  2. Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
  3. Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
  4. El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
  5. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
  6. Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
  7. Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
  8. Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
  9. Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
  10. Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
  11. Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
  12. Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
  13. Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
  14. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
  15. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  16. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  17. Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
  18. Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
  19. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).
  22. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  23. Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גליון 123 התפתחות בלוטת החלב אינטראקציה בין חלבונים לחלבון שיתוף לוקליזציה אינטראקציות תאיות קשרים נקשרים קונקינס קדרינים קלודינים קטנינים
ניתוח אינטראקציות חלבון חלבון שיתוף לוקליזציה בין רכיבי פערים, צמודים, ו adherens צמתים Murine בלוטות החלב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dianati, E., Plante, I. Analysis of… More

Dianati, E., Plante, I. Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands. J. Vis. Exp. (123), e55772, doi:10.3791/55772 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter