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Developmental Biology

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और सह-स्थानीकरण का विश्लेषण, गैप, चुस्त और मुर्इन स्तन ग्रंथों के अनुयायकों के जंक्शनों के बीच

Published: May 30, 2017 doi: 10.3791/55772
Automatic Translation
1,2, 1
1INRS, Institut Armand-Frappier, 2Biomed, UQAM

Summary

अंतर्वस्तु जंक्शन, स्तन ग्रंथि के चरण-विशिष्ट कार्यों और विकास के लिए आवश्यक वस्तुएं हैं। यह पांडुलिपि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) के अध्ययन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल और मुरिन स्तन ग्रंथियों का उपयोग करके सह-स्थानीयकरण प्रदान करता है। इन तकनीकों के विभिन्न विकास चरणों में अंतर जंक्शन जंक्शन के बीच शारीरिक संबंध की गतिशीलता की जांच के लिए अनुमति है।

Abstract

सेल-सेल इंटरैक्शन ऊतक की अखंडता को बनाए रखने और स्तन ग्रंथि के विभिन्न डिब्बों के बीच की बाधा के बीच एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इन इंटरैक्शन को संभागीय प्रोटीनों द्वारा प्रदान किया जाता है जो आसन्न कोशिकाओं के बीच nexuses बनाते हैं। जंक्शन बाध्यकारी साझीदारों के साथ श्वसन संबंधी प्रोटीन मिस्लोकेलाइज़ेशन और कम भौतिक संघों के परिणामस्वरूप फल की हानि हो सकती है और इसके परिणामस्वरूप, अंग रोग के लिए हो सकता है। इस प्रकार, सामान्य और बीमारी संबंधी ऊतकों में प्रोटीन स्थानीयकरण और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) की पहचान करना, नए प्रमाणों और तंत्रों को खोजने के लिए आवश्यक है जो विकास की स्थिति में बीमारियों की फेरबदल या परिवर्तन की ओर अग्रसर होते हैं। यह पांडुलिपि murine स्तन ग्रंथियों में पीपीआई का मूल्यांकन करने के लिए एक दो-चरण विधि प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल खंड 1 में, ब्याज की प्रोटीन के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी का उपयोग करके सह-इम्यूनोफ्लोरेसेंस (सह-आईएफ़) का प्रदर्शन करने के लिए एक विधि, जिसमें फ्लोरोरेक्रोम्स के साथ लेबल की गई माध्यमिक एंटीबॉडीज़ का वर्णन किया गया है। हालांकि सह सभी अगरप्रोटीन की निकटता के प्रदर्शन के लिए, यह अपनी शारीरिक बातचीत का अध्ययन करना संभव बनाता है। इसलिए, प्रोटोकॉल अनुभाग 2 में सह-इम्युनोपेरेग्रेशन (सह-आईपी) के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। इस पद्धति का उपयोग प्रोटीन के बीच शारीरिक संबंधों को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, यह पुष्टि किए बिना कि ये इंटरैक्टिव प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष हैं। पिछले कुछ सालों में, सह-अगर और सह-आईपी तकनीकों ने यह दर्शाया है कि अंतर जंक्शन जंक्शन के कुछ घटक सह-स्थानीयकरण और साथ-साथ बातचीत करते हैं, स्टेज-पररंपक्व जेंशनल नेक्सस बनाते हैं जो कि स्तन ग्रंथि विकास के दौरान भिन्न होते हैं।

Introduction

स्तन ग्रंथि की वृद्धि और विकास मुख्य रूप से जन्म के बाद होता है। यह अंग लगातार एक स्तनपायी 1 के प्रजनन जीवन में खुद को फिर से तैयार करता है वयस्क स्तन ग्रंथि एपिथेलियम ल्यूमनल एपिथेलियल कोशिकाओं की एक आंतरिक परत और मूल कोशिकाओं की एक बाहरी परत से बना है, मुख्यतः माय्योपेटिलियल कोशिकाओं से बना होता है, जो तहखाने झिल्ली 2 से घिरा होता है। स्तन ग्रंथि संरचना और विकास पर अच्छी समीक्षा के लिए, पाठक Sternlicht 1 को संदर्भित कर सकता है। ग्रंथि 1 , 3 , 4 , 5 , 6 के सामान्य विकास और कार्य के लिए अंतर (जीजे), तंग (टीजे) और अनुयायियों (एजे) जंक्शनों के माध्यम से सेल-सेल इंटरैक्शन आवश्यक हैं। Murine स्तन ग्रंथि में इन जंक्शनों के मुख्य घटक Cx26, Cx30, Cx32, और Cx43 (जीजे) हैं; क्लाउडिन -1, -3, -4, और -7 औरZO-1 (टीजे); और ई-कैडरिन, पी-कैडरिन, और बीए-कैटेनिन (ए जे) 7 , 8 इन विभिन्न जंक्शन प्रोटीनों की अभिव्यक्ति के स्तर स्तन ग्रंथि विकास के दौरान एक चरण-आश्रित तरीके से अलग-अलग होते हैं, जो अंतर सेल सेल बातचीत की आवश्यकताओं 9 बताते हैं। जीजे, टीजे और एजे संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से जुड़े हुए हैं और आसन्न कोशिकाओं की पड़ोसी साइटों के लिए अन्य संरचनात्मक या विनियामक प्रोटीन से जुड़े हैं, इस प्रकार इस प्रकार एक जंक्शन जंक्शन का निर्माण किया जाता है। संभागीय गठजोड़ की संरचना अंतर्निहित साइटोस्केलेटन के साथ-साथ नेक्सस पारगम्यता और स्थिरता के साथ ब्रिजिंग को प्रभावित कर सकती है, और फलस्वरूप ग्रंथ 8 , 9 , 10 , 11 के कार्य को प्रभावित कर सकती है। जंक्शन जंक्शन के अवयवों के जंक्शनों के संयोजन या अलग-अलग पर एक दूसरे के साथ बातचीत करनाहाल ही में सह-इम्युनोफ्लोरेसेंस (सह-आईएफ़) और सह-इम्युनोप्रेग्रेशन (सह-आईपी) 9 का उपयोग करते हुए स्तन ग्रंथि विकास के प्रवण विकास के चरणों का विश्लेषण किया गया। जबकि अन्य तकनीकों प्रोटीन के बीच कार्यात्मक सहयोग के मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं, इन तरीकों इस पांडुलिपि में प्रस्तुत नहीं हैं।

प्रोटीन केवल कार्य करने के लिए अकेले काम करता है, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) का अध्ययन करता है, जैसे कि सिग्नल ट्रांसडक्शन और बायोकेमिकल कैसकेड, कई शोधकर्ताओं के लिए आवश्यक है और प्रोटीन के कार्य के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं। सह-अगर और सूक्ष्म विश्लेषण कुछ प्रोटीनों का मूल्यांकन करने में सहायता करते हैं जो एक ही उपशीर्षक स्थान को साझा करते हैं। हालांकि, लक्ष्य की संख्या एंटीबॉडीज़ द्वारा सीमित होती है, जिसे विभिन्न जानवरों में उठाया जाना चाहिए और विभिन्न तरंग दैर्ध्य लेसरों के साथ सुसज्जित एक confocal सूक्ष्मदर्शी तक पहुंच और बहुसंकेतन के लिए एक वर्णक्रमीय डिटेक्टर। सह-आईपी पुष्टि करती है या उच्च-संबंध भौतिक बातचीत बीटीड से पता चलता हैएक प्रोटीन जटिल के भीतर रहने वाले दो या अधिक प्रोटीन प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) 12 और नजदीकी लघरी परख (पीएलए) 13 के रूप में उपन्यास तकनीकों के विकास के बावजूद, जो एक साथ प्रोटीन के स्थानीयकरण और इंटरैक्शन का पता लगा सकता है, सह-आईपी के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उचित और सस्ती तकनीक बनी हुई है। अंतर्जात प्रोटीन

इस पांडुलिपि में वर्णित चरण-दर-चरण विधि प्रोटीन स्थानीयकरण और पीपीआई के अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगी और स्तन ग्रंथियों में अंतर्जात पीपीआई का अध्ययन करते समय से बचने के लिए नुकसान का पता लगाएगा। प्रत्येक तकनीक के लिए आवश्यक ऊतकों के लिए विभिन्न संरक्षण प्रक्रियाओं की प्रस्तुति के साथ कार्यप्रणाली शुरू होती है। भाग 1 तीन चरणों में प्रोटीन सह-स्थानीयकरण का अध्ययन कैसे करता है: i) स्तन ग्रंथियों का सेक्शनिंग, ii) सह-तकनीक का इस्तेमाल करते हुए अलग-अलग प्रोटीनों की डबल या ट्रिपल-लेबलिंग, और iii) इमेजिंगप्रोटीन स्थानीयकरण भाग 2 बताता है कि एक अंतर्जात प्रोटीन को कैसे निकालना है और तीन चरणों में इसकी बातचीत करने वाले प्रोटीन की पहचान कैसे करें: i) लिज़ेट की तैयारी, ii) अप्रत्यक्ष प्रोटीन इम्युनोपेरेग्रेशन, और iii) एसडीएस पेज और पश्चिमी ब्लॉट द्वारा बाध्यकारी भागीदार की पहचान। इस प्रोटोकॉल का प्रत्येक चरण कृंतक स्तन ग्रंथि के ऊतकों के लिए अनुकूलित है और उच्च-गुणवत्ता, विशिष्ट, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य ऊतकों या सेल लाइनों में पीपीआई अध्ययन के लिए प्रारंभिक बिंदु के रूप में भी किया जा सकता है।

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Protocol

इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए सभी जानवरों के प्रोटोकॉल को यूनिवर्सिटी एनिमल केयर कमेटी (आईएनआरएस-इंस्टीट्यूट आर्मंड-फ्रेपीयर, लावाल, कनाडा) ने मंजूरी दे दी थी।

1. प्रोटीन सह-स्थानीयकरण की पहचान करना

  1. ऊतक से सूक्ष्म स्लाइड तक
    नोट: ऊतकों और वर्गों को सूखा बर्फ पर संभाला जाना चाहिए।
    1. जानवरों से स्तन ग्रंथियां उत्पादित करें (इस प्रक्रिया के संपूर्ण विवरण के लिए, प्लान्ट एट अल देखें) 14 ।
    2. ठंडे बर्फ पर फ्रीजिंग / माउंटेड माध्यम में excised ऊतक को एम्बेड करें ग्रंथि को कवर करने के लिए पर्याप्त माध्यम जोड़ें। जब माध्यम मजबूत हो जाता है, तो ऊतक को फ्रीजर में -80 डिग्री सेल्सियस पर बाद में 9 उपयोग के लिए स्थानांतरित करें।
    3. ≤ -35 ​​डिग्री सेल्सियस पर क्रोनिकोटोटोम सेट का उपयोग करके, ऊतकों को 7-10 माइक्रोन-मोटी वर्गों में काटकर उन्हें माइक्रोस्कोप स्लाइड्स पर रखें।
      नोट: जब संभव हो, प्रत्येक स्लाइड पर दो अनुभाग रखें; बाएं अनुभाग को एक के रूप में उपयोग किया जाएगाएंटीबॉडी की विशिष्टता और ऊतक के आटोफ्लोरेसेंस की पुष्टि करने के लिए एग्टेक्टिव कंट्रोल, जबकि सही पक्ष एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाएगा।
    4. बाद के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर वर्गों को रखें।
  2. सह-अगर धुंधला हो जाना
    1. फ्रीजर से उचित सूक्ष्म स्लाइड्स को पुनः प्राप्त करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए फार्मलाडहाइड 4% में उन्हें डुबोकर तुरंत उनको ठीक करें।
    2. फिर आरटी पर फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) में स्लाइड्स को विसर्जित करें। अगले चरण में आगे बढ़ने तक, आरबी पर पीबीएस में स्लाइड छोड़ें।
    3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हाइड्रोफोबिक बाधा या जल-विकर्षक प्रयोगशाला पेन (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके स्लाइड के प्रत्येक अनुभाग को मंडल करें । ऊतक को छूने के लिए सावधान रहें प्रक्रिया के बाकी हिस्सों के लिए तुरंत पीबीएस के टिपों को ऊतक में जोड़ने के लिए और स्लाइड को नम आर्द्रता कक्ष में रखें।
      नोट: ऊतक वर्गों को मॉइस्चराइज किया जाना चाहिए। विकल्पली, एक ढक्कन के साथ एक बॉक्स का उपयोग करें और तल पर गीला कागज तौलिये रखें
    4. आरटी के 30 मिनट के लिए प्रत्येक ऊतक अनुभाग को 100% से 200 μL 3% गोजाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) -ट्रिस-बफर्ड खारा (टीबीएस) -0.1% पॉलिस्ोरबेट 20 (सामग्री की तालिका देखें) के साथ ब्लॉक करें । जबकि नमूने अवरुद्ध कर रहे हैं, टीबीएस-एंटीबॉडी को 0.1% पॉलिस्ोरबेट 20 में गिराकर प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
      नोट: एंटीबॉडी के लिए आवश्यक एकाग्रता निर्माता द्वारा प्रदान की जाती है; उदाहरण के लिए सामग्री की सारणी और आंकड़े 1 और 2 देखें , साथ ही साथ डायनाटि एट अल 9 हालांकि अधिकांश फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करते समय अंधेरे में काम करना जरूरी नहीं है, एंटीबॉडी समाधान या दाग वाले ऊतकों को तेज, उज्ज्वल प्रकाश से उजागर न करें।
    5. आकांक्षा द्वारा ब्लॉकिंग समाधान निकालें और आरटी पर 60 मिनट के लिए पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 100-200 μL में वर्गों को सेते। Alternativelवाई, 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात प्राथमिक एंटीबॉडी से सेते हैं
    6. आकांक्षा के द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और 5-5 मिनट के लिए 250-500 μL टीबीएस-0.1% पॉलीयोर्बेट 20 के साथ वर्गों को धो लें। आकांक्षा द्वारा धोने के समाधान को निकालें और दो बार धो लें।
    7. आकांक्षा के द्वारा धोने के समाधान को निकालें और आरटी पर 60 मिनट के लिए उचित फ्लोरोफोरे-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के 100-200 μL वाले वर्गों को निकालें।
    8. आकांक्षा के माध्यम से माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान को निकालें और 5-5 मिनट के लिए 250-500 μL टीबीएस-0.1% पॉलीज़ोरबेट 20 के साथ वर्गों को धो लें। धोने का समाधान निकालें और दो बार दोहराएं।
    9. ब्याज के बाद के प्रोटीन (एस) के लिए प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के उपयुक्त संयोजन का उपयोग करके चरण 2.5-2.8 दोहराएं।
    10. आकांक्षा के द्वारा धोने के समाधान को निकालें और टीबीएस-0.1% पॉलीसेर्बेट 20 में 5 मिनट के लिए 100-200 μL 1 मिलीग्राम / एमएल 4 ', 6-डायरीडिनो-2-फेनिलंडोल (डीएपीआई) के साथ अनुभाग को शामिल करके नाभिक धुंधला को हटा दें।आर टी।
    11. आकांक्षा के द्वारा डीएपीआई समाधान को निकालें और एक जल-घुलनशील, गैर-फ्लोरोसिंग बढ़ते माध्यम ( सामग्रियों की सारणी देखें) और कवरलेट्स का उपयोग करके स्लाइड्स को माउंट करें। एक समय में एक स्लाइड आगे बढ़ें
      नोट: 5 मिनट से अधिक के लिए नाभिक दाग को उकसाना, धुंधला होने की तीव्रता में परिवर्तन नहीं करेगा। वैकल्पिक रूप से, सभी स्लाइड्स पर डीएपीआई समाधान को हटा दें और स्लाइड्स बढ़ते समय पीबीएस में ऊतकों को सेते हैं।
    12. कम से कम 8 घंटे के लिए एक 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में स्लाइड्स सपाट रखें। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग ( आंकड़े 1 और 2 देखें) के लिए आगे बढ़ें।
  3. सूक्ष्म इमेजिंग
    1. फ्लोरोफोरे-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का प्रयोग करें, जो कि उनके विशिष्ट तरंगलांबिक पर फ्लोरोफोर्स को उत्तेजित करने के लिए आवश्यक विभिन्न लेसरों के साथ सुसज्जित एक confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करते हैं।
      नोट: 0.95 के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 40 एक्स उद्देश्य, नलिकाएं और एल्विओली कल्पना करने में सक्षम होने के लिए सुझाव दिया गया है। एक परीक्षाविशिष्ट सेटिंग्स की ई चित्रा 1 में प्रदान की गई है।
    2. समय पर छवि को तरंग दैर्ध्य स्कैन करके व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक प्रोटीन के स्थानीयकरण को सत्यापित करें।
      नोट: इस स्तर पर, जांघल प्रोटीन के स्थानीयकरण का गंभीर विश्लेषण करना महत्वपूर्ण है। जंजात्मक nexuses बनाने में सक्षम होने के लिए, इन प्रोटीन को प्लाज्मा झिल्ली पर स्थानांतरित किया जाना चाहिए।
    3. विभिन्न तरंगदैर्यों पर लेसरों के साथ स्कैन की गई छवियों को विलय करके प्रोटीनों के सह-स्थानीयकरण का निर्धारण करें।
      नोट: प्रोटीन सह-स्थानीयकरण को उसी स्थान पर दो या अधिक फ्लोरोफोर्स के उत्सर्जन के परिणामस्वरूप रंग के परिवर्तन से देखा जा सकता है और उपयुक्त सॉफ़्टवेयर ( आंकड़े 1 और 2 , संदर्भ 9 को भी देखें) का उपयोग करके मापा जा सकता है।

2. पीपीआई का अध्ययन

नोट: पेटी स्तन ग्रंथियों का उपयोग पीपीआई के अध्ययन के लिए किया जाना चाहिए, क्योंकि छातीग्रस्त ग्रंथियां छात्रावास के साथ घनिष्ठ संबंध में हैंमांसपेशियों। स्तन ग्रंथियों को एक्साइज करें (इस प्रक्रिया के संपूर्ण विवरण के लिए, प्लान्ट एट अल देखें ।) 14 और बाद में उपयोग के लिए उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

  1. Lysate तैयारी
    1. सूखे बर्फ पर कागज और 2 एमएल माइक्रोसॉसिटिव ट्यूबों का वजन रखें और उन्हें अगले चरण के साथ आगे बढ़ने से पहले ठंडा करने दें।
    2. स्तन-ग्रंथि के ऊतक को -80 डिग्री सेल्सियस से लें और उन्हें सूखा बर्फ पर रखें।
    3. पूर्व ठंडा वजन वाले पेपर पर ऊतकों का वजन और फिर ऊतक को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों (सूखी बर्फ पर संभाल) में स्थानांतरित करें। नमूना प्रति ऊतक 50 और 100 मिलीग्राम के बीच का प्रयोग करें। चरण 2.1.5 तक ऊतक को शुष्क बर्फ पर रखें।
    4. निम्नलिखित फ़ार्मुलों का उपयोग करके, सामग्री की तालिका में बताए अनुसार , एनएफ़, नावो 3 , और प्रोटीज / फॉस्फेटस अवरोधक के साथ पूरक ट्रिपल डिटर्जेंट लसीस बफर की आवश्यक मात्रा तैयार करें। चूहे: आवश्यक बफर (μL) = माउस ऊतक वजन (एमजी) x 3; चूहा: आवश्यकबफर (μL) = चूहे ऊतक वजन (एमजी) x 5
    5. टिशू युक्त 2 मिलीलीटर ट्यूब के लिए जरूरी मात्रा में बर्फ-ठंड लसीस बफर (चरण 2.1.4 में गणना) को जोड़ें।
      नोट: चरण 2.1.5-2.1.6 में, एक समय में एक ही ट्यूब के साथ आगे बढ़ें।
    6. एक ऊतक की चक्की पर सतत होमोजिनायझेशन का उपयोग करके ऊतक को 30-40 एस के लिए होमोजेनिक बनाना; हमेशा बर्फ पर ट्यूब रखें मध्यम गति के लिए ऊतक homogenizer समायोजित करें और धीरे से ट्यूब के अंदर और नीचे चक्की ऊपर ले जाएँ।
    7. अन्य ट्यूबों के साथ चरण 1.6 और 1.7 दोहराएं।
    8. बर्फ पर lysates 10-30 मिनट के लिए सेते हैं
    9. ट्यूबों को 1 9 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र
    10. इस बीच, प्रत्येक नमूने के लिए 6-10 माइक्रोसॉसिटर्यूज ट्यूबों (0.6 एमएल) की पहचान करें और उन्हें बर्फ पर रखें।
    11. एक बार सेंटीफ्यूगेशन किया जाता है, ट्यूबों की जांच करें यह सुनिश्चित करें कि उनके पास वसा, स्पष्ट, पीले-से-गुलाबी lysates (विकास के स्तर पर निर्भर करता है) और एक गोली का शीर्ष स्तर होता है।
    12. लिपिड परत में एक छेद बनाएंतरल चरण का उपयोग करने के लिए 200-μL विंदुक टिप का उपयोग करना। टिप को बदलें और गोली को परेशान किए बिना लाइसीट को इकट्ठा करें या लिपिड लेयर की तरक्की करें। बर्फ पर पूर्व-लेबल ट्यूबों में लिज़ेट को विभाजित करना (चरण 2.1.11) और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करना
    13. उचित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता का परिमाण करने के लिए एक विभाजक का उपयोग करें।
  2. अप्रत्यक्ष immunoprecipitation
    1. बर्फ पर, कुल स्तन ग्रंथि lysates के दो aliquots पहले से तैयार तैयार।
      नोट: एक विभाज्य का उपयोग लक्ष्य प्रोटीन के आईपी के लिए किया जाएगा, जबकि अन्य नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करेगा।
    2. लीज़ेट का 500-1000 ग्राम लीजिए और पीबीएस में इसे पतला करें, प्रत्येक 1.5 एमएल ट्यूब में 200 μL के अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए।
      नोट: उपयोग की जाने वाली lysate की मात्रा ब्याज की प्रोटीन और एंटीबॉडी की दक्षता की बहुतायत पर निर्भर करती है (देखें चित्रा 3N उदाहरण, साथ ही सामग्री की सारणी ) प्रत्येक लक्ष्य के लिए अनुकूलित करने के लिए, अलग-अलग lysate ( यानी, 500, 750, और 1,000 μg) और एंटीबॉडी ( यानी, 5, 10, और 20 माइक्रोग्राम) का उपयोग किया जाना चाहिए निम्न चरणों का पालन करें (2.2.3-2.3.7.4)।
    3. लिटनेट की पहली ट्यूब को ब्याज के प्रतिजन के प्रति एंटीबॉडी जोड़ें और इसे बर्फ पर रखें।
      नोट: प्रत्येक कंपनी द्वारा उपलब्ध कराई गई अनुदेश शीट पर आमतौर पर आवश्यक राशि का सुझाव दिया जाता है (सामग्री की तालिका देखें)।
    4. द्वितीय ट्यूब में, चरण 2.2.3 में एंटीबॉडी के रूप में आइसीटीपी आईजीजी नियंत्रण के समान एकाग्रता को जोड़कर एक नकारात्मक नियंत्रण तैयार करें।
    5. कम गति पर ट्यूब रोलर-मिक्सर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ट्यूबों सेते हैं।
    6. अगले दिन, प्री-वाशिंग के लिए नए 1.5 एमएल ट्यूबों के लिए 50 μL चुंबकीय मोतियों को जोड़ें।
      1. एंटीबॉडी के रिश्तेदार आत्मीयता के आधार पर प्रोटीन ए या प्रोटीन जी चुंबकीय मोतियों का चयन करें। एकत्रित मोतियों का उपयोग करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है; धीरे से मनका निलंबन मिश्रण जब तक यह ट्यूबों को जोड़ने से पहले इसे एकसाथ पुनः निलंबित कर दिया है।
    7. चुंबकीय स्टैंड पर मोती युक्त ट्यूब रखें और मोती को चुंबक के लिए स्थानांतरित करने की अनुमति दें। 200 μL पिपेट का उपयोग करके मोती से भंडारण बफर निकालें।
    8. 500 μL पीबीएस-0.1% पॉलीसेर्बेट 20 जोड़कर मोतियों को धो लें और 10 एस के लिए सख्ती से ट्यूबें भंवर करें
    9. ट्यूबों को चुंबकीय स्टैंड पर वापस रखें और मोती को चुंबक में स्थानांतरित करने की अनुमति दें।
    10. एक 200 μL विंदुक के साथ pipetting द्वारा अतिरिक्त धो बफर निकालें।
    11. मोती को 2.2.5 कदम से प्रतिक्रिया जटिल (lysate-antibody) जोड़ें और रोलर मिश्रक पर आरटी पर 90 मिनट के लिए सेते।
    12. चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूबें रखें और मोती को चुंबक में स्थानांतरित करने की अनुमति दें। 200 μL विंदुक का प्रयोग करना, महाप्राणियों को लपेटने के लिए और बर्फ पर ट्यूबों को स्थानांतरित करना।
    13. मोती धो लेंएसपीबीएस के 500 μL जोड़कर, चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूबों को रखकर, और 200 μL विंदुक का उपयोग करके तरल को निकालने के लिए। इस धोने के कदम को दोहराएं। धोने के चरणों के दौरान, भंवर से बचें और नमूनों को बर्फ पर रखें।
    14. एक बार मोती को पीबीएस-0.1% पॉलिज़ोरबेट 20 को बिना भंवर के धो लें और 200 μL विंदुक टिप का उपयोग करके अंतिम धो बफर को त्याग दें।
    15. लुप्त होने के लिए, ट्यूबों में 20 μL 0.2 एम अम्लीय ग्लाइसीन (पीएच = 2.5) जोड़ें और उन्हें रोलर मिक्सर पर 7 मिनट के लिए मिलाएं।
    16. कुछ सेकंड (त्वरित स्पिन) के लिए उच्च गति पर अपकेंद्रित्र और एक ताज़ा बर्फ-ठंडा ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
    17. प्रत्येक ट्यूब के लिए चरणों 2.2.14 और 2.2.15 दोहराएं।
      नोट: अंतिम मात्रा में 40 μL होगा।
    18. चरण 2.2.16 से 40 μL eluted नमूने के लिए 10 μL 4x Laemmli बफर जोड़ें।
      नोट: रंग अम्लीय पीएच के कारण पीले हो जाएगा।
    19. तुरंत 1 एम ट्रिस (पीएच = 8), एक समय में एक बूंद, चरण 2.2.18 से रंगों में रंग के जब तक उसका नमूनों में जोड़ेंनीले रंग बदल जाता है अगली ट्यूबों के लिए आगे बढ़ें
    20. नमूनों को चरण 2.2.18 से 10 मिनट तक 70-90 डिग्री सेल्सियस पर उबाल लें। तुरंत जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए आगे बढ़ें। वैकल्पिक रूप से, नमूनों को लोड किए जाने तक -80 डिग्री सेल्सियस तक फ्रीज़र में स्थानांतरित करें।
  3. डाउनस्ट्रीम एप्लीकेशन: जेल वैद्युतकणसंचलन पश्चिमी ब्लॉट द्वारा पीछा किया
    1. मानक प्रक्रिया 15 के बाद एसडीएस पेज एक्रयलामाइड जैल (1.5 मिमी मोटाई) को अलग और स्टैकिंग तैयार करें।
      नोट: जेल का विकल्प (8-15% एरिकलाइड, ढाल: सामग्री की तालिका देखें) प्रोटीन के आणविक आकार के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए और संभाव्य बंधन साझेदारों का विश्लेषण किया जाना चाहिए। इन प्रोटीनों को उचित प्रतिरक्षा के लिए अनुमति देने के लिए एक दूसरे से हल किया जाना चाहिए।
    2. बर्फ पर immunoprecipitation (आईपी) -छाया नमूने (चरण 2.2.20) पिघलना
    3. उसी नमूने (उपरोक्त आईपी प्रक्रिया के लिए प्रयुक्त) से प्रोटीन lysates तैयार करें। 50 का उपयोग करेंकुल lysate के μg और 4x Laemmli नमूना बफर जोड़ें। 5 मिनट के लिए 70-90 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को उबाल लें और लोड होने तक बर्फ पर रखें।
      नोट: कुल नमूनों में प्रशीतित प्रोटीनों की उपस्थिति को प्रदर्शित करने के लिए ये नमूनों को विशिष्ट आईपी नमूने के बगल में लोड किया जाएगा।
    4. चरण 2.3.3 से तैयार lysates और एसीललाइड जेल में चरण 2.2.20 की ओर से उपजी नमूने लोड करें और उन्हें बफर चलाने (10x चलने वाला बफर: 30.3 ग्राम ट्रिस, 144.1 ग्राम ग्लाइसीन और 10 1 एल के आसुत जल में एसडीएस का जी) लगभग 100 मिनट के लिए 100 वी पर या जब तक माइग्रेट करने वाले प्रोटीन के किनारे जेल के नीचे पहुंचते हैं।
    5. एक मानक प्रोटोकॉल 9 , 15 का उपयोग करते हुए जैल को एक नाइट्रो सेलुलोज़ या पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित करें।
    6. 5% सूखी दूध-टीटीबीएस (20 मिमी त्रि, 500 मिमी NaCl, और 0.05% पॉलिसीर्बेट 20) में कम गति पर घुमाव पर 1 घंटे के लिए झिल्ली को अवरुद्ध करें।
    7. पहचानें कि क्या वर्षा सफल थी या नहींcessful।
      1. धीमी गति से आंदोलन के साथ एक कमाल की प्लेटफार्म पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर निर्माता द्वारा सिफारिश की गई एकाग्रता पर 5% सूखी-दूध- टीटीबीएस में पतला प्रोटीटेटेड प्रोटीन के खिलाफ पहला एंटीबॉडी का प्रयोग करके झिल्ली की जांच करें।
        नोट: सिफारिशों के लिए सामग्री की तालिका देखें
      2. अगले दिन, उच्च आंदोलन के साथ एक कमाल की प्लेटफार्म पर टीटीबीएस के साथ प्रत्येक 5 मिनट के लिए झिल्ली 3 बार धोएं।
      3. धीमी गति से आंदोलन के साथ रॉकिंग प्लेटफार्म पर आरटी के 1 घंटे के लिए टीटीबीएस में पतला सहिरोडाशिश पेरोक्साइड (एचआरपी) के साथ संयुग्मित उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी में झिल्ली को सेते हैं।
        नोट: वैकल्पिक रूप से, एक फ्लोरोक्रोम के साथ संयुग्मित एक माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है, यदि सिग्नल का पता लगाने के लिए उपयुक्त उपकरण उपलब्ध है।
      4. उच्च आंदोलन के साथ एक कमाल की प्लेटफार्म पर टीटीबीएस के साथ 3 से 6 वाश, प्रत्येक 5 मिनट के लिए प्रदर्शन करें। वाणिज्यिक रूप से एक झिल्ली incubating द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी के संकेत का विश्लेषण करेंVailable luminol समाधान (सामग्री की तालिका देखें) और निर्माता निर्देशों का पालन करें। कैममिलाइन्सेंस इमेजिंग सिस्टम (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके संकेत का पता लगाएं।
        नोट: पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण पर विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए संदर्भ 16 देखें।
    8. इंटरैक्टिंग प्रोटीन की पहचान करने के लिए, समान दाग पर उपयुक्त एंटीबॉडी का इस्तेमाल करते हुए 2.3.7.1-2.3.7.4 चरणों का पालन करें।
      नोट: यदि प्रोटीन बातचीत कर रहे हैं, तो बाध्यकारी भागीदारों को लक्ष्य प्रोटीन के साथ सह-प्रतिरक्षित किया जाएगा और इस प्रकार पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा पता लगाया जा सकता है। चरण 2.3.8 को अधिक एंटीबॉडीज़ के साथ दोहराया जा सकता है, यह निर्धारित करने के लिए कि प्रोटीन जटिल में अन्य प्रोटीन रहते हैं या नहीं, जब तक कि प्रोटीन के आणविक वजन काफी जेल और झिल्ली पर अच्छी तरह से अलग होने के लिए अलग होते हैं।
    9. यह पुष्टि करने के लिए कि बाध्यकारी साझीदार कलात्मक नहीं हैं, पारस्परिक आईपी होना चाहिए।
      नोट: यह दोहरा द्वारा किया जाता हैकदम 2.2.1-2.2.20 वही lysate के साथ, लेकिन कदम 3.8 में पहचाने गए बाध्यकारी भागीदारों में से एक का उपवास करना। फिर, चरण 3.1-3.8 को ब्याज की पहली प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर दोहराया जाता है।

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Representative Results

यह निर्धारित करने के लिए कि जीजे, ए जे, और टीजे घटकों स्तन ग्रंथि में एक साथ बातचीत कर सकते हैं, सह-अगर एहसास पहली बार प्रदर्शन किया गया था। Cx26, एक जीजे प्रोटीन, और एए प्रोटीन, ए.जे. प्रोटीन, विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ जांच की गई और क्रमशः फ्लोरोफोरे-संयुग्मित माउस -647 (ग्रीन, स्यूडोकोलोर) और बकरी -568 (लाल) एंटीबॉडी का उपयोग करके दिखाया गया ( चित्रा 1 बी और सी ) । डेटा से पता चला है कि वे पीले रंग ( चित्रा 1 डी ) द्वारा दर्शाए गए अनुसार स्तनपान के दिन 7 (एल 7) पर चूहों स्तन ग्रंथि में उपकला कोशिकाओं के सेल झिल्ली पर सह-स्थानीयकरण करते हैं। दूसरे, क्लॉइडिन -7, एक टीजे प्रोटीन; ई-कैडरिन, ए जे प्रोटीन; और जीएन प्रोटीन के कॉनक्सिन 26 (सीएक्स 26), उनके विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ जांच किए गए थे और क्रमशः फ्लोरोफोरे-संयुग्मित खरगोश -488 (हरा), माउस -555 (लाल), और माउस -647 (कोरल नीला, पीयूडोकोलोर) एंटीबॉडी से पता चला था ( चित्रा 2 बी-डी )। ई-कैडरिन और क्लाउडिन -7 सह-स्थानीयकरण हैपी-टू-लाइट-ऑरेंज रंग के रूप में प्रदर्शित किया गया, जबकि ई-कैदरिन और क्लाउडिन -7 के साथ सीएक्स 26 सह-स्थानीयकरण गर्भावस्था दिवस 18 (पी 18) ( चित्रा 2 ई ) पर चूहों स्तन ग्रंथियों में सफेद विरामित धुंधला हो गया।

कोशिका झिल्ली पर किन किनारेदार प्रोटीनों का मिश्रण और शारीरिक रूप से टेदर मिलते हैं यह पता लगाने के लिए, लैक्टेटिंग चूहों (एल 14) से स्तन ग्रंथि के ऊतकों का उपयोग करके सह-इम्युनोपेरेजिशन किया गया था। परिणाम दिखाते हैं कि जीजे के एक घटक सीएक्स 43 ई-कैदरिन और क्लाउडिन -7 के साथ बातचीत करते हैं, लेकिन क्लाउडिन -3 ( चित्रा 3 ए और बी ) के साथ नहीं। ये परिणाम पारस्परिक आईपी द्वारा पुष्टि किए गए थे; जब ई-कैडरिन immunoprecipitated था, यह Cx43 और Claudin-7 ( चित्रा -3 सी ) के साथ बातचीत की।

आकृति 1
चित्रा 1: सेल मेम्ब में β-catenin और Cx26 सह-स्थानीयकरणचूहों स्तन ग्रंथियों में राणे स्तनपान के दिन 7 (एल 7) में चूहों के स्तन ग्रंथियों से क्युओजेक्शन (7 माइक्रोन) काट दिया गया था और इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला के लिए प्रोसेस किया गया था। ( ए ) नाभिक डीएपीआई (नीला) के साथ दाग रहे थे। ( बी ) सीएक्स 26 (ग्रीन, स्यूडोकोलोर) और ( सी ) बी-कैटेिनिन (लाल) को उपयुक्त फ्लोरोफोरे-लेबल एंटीबॉडीज के साथ मिलाया जाता है। ( डी ) एक विलय की छवि चित्र एक स्पेक्टल डिटेक्टर के साथ सुसज्जित एक confocal सूक्ष्मदर्शी के साथ प्राप्त किया गया। डीएपीआई को निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके देखा गया: उत्सर्जन तरंगलांबी, 450.0 एनएम; उत्तेजना तरंगलांबी, 402.9 एनएम; लेजर पावर, 1.2; डिटेक्टर लाभ, पीएमटी एचवी 100; पीएमटी ऑफसेट, 0. सीएक्स 26 (647) को निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके देखा गया: उत्सर्जन तरंगलांबी, 700.0 एनएम; उत्तेजना तरंगलांबी, 637.8 एनएम; लेजर पावर, 2.1; डिटेक्टर लाभ, पीएमटी एचवी 110; पीएमटी ऑफसेट, 0. बीए-कैटाइनिन (568) निम्न सेटिंग्स का उपयोग करके देखा गया: उत्सर्जन तरंगलांबी, 595.0 एनएम; उत्तेजना तरंगलांबी, 561.6 एनएम; लेज़रशक्ति, 2.1; डिटेक्टर लाभ, पीएमटी एचवी 110; पीएमटी ऑफसेट, 0. स्केल बार = 50 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: कॉन्सेक्सिन 26 (सीएक्स 26), ई-कैदरिन, और क्लाउडिन -7 चूहों स्तन ग्रंथियों में कोशिका झिल्ली पर सह-स्थानीयकरण करें। गर्भावस्था के दिन 18 (पी 18) पर स्तन ग्रंथियों से कूचेज़ (7 माइक्रोन) काट दिया गया था और ( बी ) क्लाउडिन -7 (ग्रीन), ( सी ) ई-कैदरिन (लाल) और ( डी ) सीएक्स 26 (कोरल) का उपयोग करके immunofluorescent धुंधला के लिए संसाधित किया गया था। नीला; pseudocolor), उपयुक्त फ्लोरोफोरे-लेबल एंटीबॉडी के साथ मिलकर। ( ए ) नाभिक डीएपीआई (नीला) के साथ दाग रहे थे। चित्र एक स्पेक्टल डिटेक्टर के साथ सुसज्जित एक confocal सूक्ष्मदर्शी के साथ प्राप्त किया गया। डीएपीआई को एफ का इस्तेमाल करके देखा गया थाओलॉउटिंग सेटिंग्स: उत्सर्जन तरंगलांबी, 450.0 एनएम; उत्तेजना तरंगलांबी, 402.9 एनएम; लेजर पावर, 5.4; डिटेक्टर लाभ, पीएमटी एचवी 65; पीएमटी ऑफसेट, 0. क्लॉइडिन -7 (488) निम्न सेटिंग्स का उपयोग करके देखा गया: उत्सर्जन तरंगलांबी, 525.0 एनएम; उत्तेजना तरंगलांबी, 48 9 .1 एनएम; लेजर पावर, 5.0; डिटेक्टर लाभ, पीएमटी एचवी 12; पीएमटी ऑफसेट, 0. ई-कैडरिन (568) को निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके देखा गया: उत्सर्जन तरंगलांबी, 595.0 एनएम; उत्तेजना तरंगलांबी, 561.6 एनएम; लेजर पावर, 13.5; डिटेक्टर लाभ, पीएमटी एचवी 45; पीएमटी ऑफ़सेट, 0. सीएक्स 26 (647) को निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करके देखा गया: उत्सर्जन तरंगलांबी, 700.0; उत्तेजना तरंगलांबी, 637.8; लेजर पावर, 5.0; डिटेक्टर लाभ, पीएमटी एचवी 55; पीएमटी ऑफसेट, 0. स्केल बार = 50 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: सीएक्स 43, ई-कैदरिन, और क्लाउडीन -7, लेकिन क्लॉइडिन -3 नहीं, प्रोटीन परिसर में शामिल हैं। सीएक्स 43 ( ए और बी ) और ई-कैदरिन ( सी ) स्तनपान पर चूहों के स्तन ग्रंथियों से कुल lysates के 500 मिलीग्राम का उपयोग कर immunoprecipitated थे। आईपीएस और लाइसेट्स जैल में लोड किए गए थे और पीवीडीएफ झिल्ली पर स्थानांतरित किए गए थे। क्योंकि क्लाउडिन -7 और क्लाउडिन -3 के समान आणविक वजन हैं, वे उसी झिल्ली पर विश्लेषण नहीं किए जा सकते हैं। इस प्रकार, दो समानांतर आईपीएस को सीएक्स 43 के लिए एक समान lysate के साथ पेश किया गया, दो जैल पर लोड किया गया, और (झिल्ली ए और बी) स्थानांतरित किया गया। झिल्ली ए को पहली बार सीएक्स 43 के साथ जांच आईपी (शीर्ष पैनल) की कार्यक्षमता की पुष्टि करने के लिए किया गया था। इसके बाद, झिल्ली को ई-कैदरिन और क्लाउडीन -7 के साथ क्रमशः जांच किया गया। पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण से पता चला है कि दो प्रोटीन Cx43 के साथ बातचीत करते हैं। झिल्ली बी को पहली बार सीएक्स 43 के साथ जांच आईपी (शीर्ष पैनल) की कार्यक्षमता की पुष्टि करने के लिए किया गया और फिर क्लाउडिन -3 के साथ जांच की गई। पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण से पता चला है कि क्लाउडिन -3 डीआईडी नहीं है Cx43, दिखा रहा है कि दो प्रोटीन बातचीत नहीं करते। झिल्ली सी की जांच आईपी (शीर्ष पैनल) की कार्यक्षमता की पुष्टि करने के लिए ई-कैडरिन के साथ पहले जांच की गई थी। उसके बाद, झिल्ली, क्रमिक रूप से सीएक्स 43 और क्लाउडिन -7 के साथ जांच की गई। पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण ने प्रोटीन के बीच बातचीत की पुष्टि की। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

जंक्शन ग्रंथों के माध्यम से सेल-सेल बातचीत आवश्यक अंग और कई अंगों के विकास के लिए आवश्यक होती है, जैसे कि स्तन ग्रंथि अध्ययनों से पता चला है कि जंक्शन प्रोटीन कोशिका झिल्ली 10 पर एक-दूसरे को टेदरिंग करके एक दूसरे के फ़ंक्शन और स्थिरता को विनियमित कर सकते हैं और संकेत पारगमन सक्रिय कर सकते हैं। वर्तमान पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल ने सामान्य मुरिन ग्रंथि विकास 9 के दौरान जंगल प्रोटीन विभेदक अभिव्यक्ति, स्थानीयकरण और संपर्क के बारे में दिलचस्प निष्कर्ष प्रदान किए हैं। यह देखते हुए कि जनल-प्रोटेन्ट स्थानीयकरण प्रोटीन के कार्य के लिए महत्वपूर्ण है, और क्योंकि वे मचान प्रोटीन और कई किनसेस 3 , सह-अगर और सह-आईपी के साथ बातचीत करने के लिए जाने जाते हैं सेल-सेल इंटरैक्शन के क्षेत्र में प्रभावी तकनीक हैं। स्तन ग्रंथि विकास और उनके रोगियों में जंगल संबंधी nexuses की आवश्यकता को उजागर करने के लिए इन विधियों को आवश्यक नहीं हैंस्तन कैंसर में विनियमन, लेकिन उनका उपयोग अन्य ऊतकों में भी किया जा सकता है और सेल लाइनों के उपयोग के प्रयोग में किया जा सकता है।

स्तन ग्रंथि दो मुख्य डिब्बों से बना है: स्ट्रोमा और एपिथेलियम 4 । वयस्क उपकला कोशिकाओं के दो परतों से बना है। इस दृष्टिकोण में, संभावित बाध्यकारी साझीदारों की निकटता को सह-तकनीक का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, और सह-आईपी के प्रयोग से उनकी शारीरिक बातचीत की पुष्टि की गई थी। एक ही ऊतक, संरचना, सेल या इंट्रासेल्युलर कम्पार्टमेंट 17 , 18 में प्रोटीन के सह-स्थानीयकरण को प्रदर्शित करने के लिए सह-आइएफ़ सफलतापूर्वक दूसरों द्वारा उपयोग किया गया है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि विज़ुअलाइज्ड सूचना यह ऊतक की रचना के विभिन्न सेल प्रकारों के भीतर प्रत्येक प्रोटीन के सेलुलर या सबसेलुलर स्थानीयकरण के बारे में लाती है। हालांकि यह तकनीक काफी सरल है, कुछ सुझावों का पालन किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए,हमेशा एक 200 μL विंदुक या एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करके समाधान एक बूंद जोड़ते हैं। यह ऊतकों को क्षतिग्रस्त बिना ऊतक सतह के विसर्जन के लिए अनुमति देगा। इसी तरह, स्लाइड को धीरे-धीरे झुकाकर ऊतकों के बगल में रखे पाश्चर पिपेट का उपयोग करके समाधान निकालें। इसके अलावा, एंटीबॉडी के लिए जिनके भंडारण समाधान में ग्लिसरॉल होते हैं, धोने बफ़र्स की सावधानीपूर्वक चूषण पृष्ठभूमि को कम करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, दूध प्रोटीन की उपस्थिति, जैसे कैसिइन, स्तनपान कराने के दौरान एंटीबॉडी के साथ उन्हें फँसाने में दिक्कत कर सकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप झूठी सकारात्मक हो सकती है। परिणामस्वरूप छवि का एक महत्वपूर्ण विश्लेषण इस प्रकार आवश्यक है, विशेष रूप से इस स्तर पर।

यह सह-अगर तकनीक में कुछ निश्चित सीमाएं या नुकसान भी होते हैं। सबसे पहले, इसमें विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है (चरण 1.1), यह ऊपर वर्णित चरणों के बाद धुंधला हो जाने के लिए प्रत्येक स्लाइड पर एक खंड ( यानी, एक दाएं तरफ) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती हैप्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी क्रमिक रूप से शेष भाग के लिए ( यानी, बाईं तरफ वाला एक), प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के बजाय टीबीएस-पॉलिस्ोरबेट 20 0.1% का उपयोग करते हुए, उसी प्रक्रिया का पालन करें। हालांकि यह भी संभव है, और इससे भी बेहतर, पेप्टाइड प्रतियोगिता का उपयोग करके एंटीबॉडी के विशिष्ट बंधन को सत्यापित करने के लिए, वाणिज्यिक एंटीबॉडी उत्पन्न करने वाले पेप्टाइड्स हमेशा उपलब्ध नहीं होते हैं यह सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण ( यानी, ऊतक या कोशिकाओं को व्यक्त करने के लिए जाना जाता है, या नहीं, ब्याज की प्रोटीन) का उपयोग करके बाध्यकारी की विशिष्टता को सत्यापित करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, एंटीजन निर्धारण साइटों अप्राप्य हो सकते हैं, विशेष रूप से फफर्नल-फिक्स्ड ऊतकों के लिए, जिससे एक विशिष्ट सिग्नल की अनुपस्थिति होती है। इस प्रकार कुछ ऊतकों के लिए एक एंटीजन-पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया की आवश्यकता हो सकती है। डिटर्जेंट के साथ एक छोटा ऊष्मायन भी कोशिका झिल्ली को प्रचलित करने के लिए एंटीजन-पुनर्प्राप्ति से पहले किया जा सकता है। दूसरा, बहुसंकेतन के लिए, विभिन्न जानवरों में एंटीबॉडी उठाए जाने चाहिए।उदाहरण के लिए, यदि एंटी-खरगोश का चरण 1.2.6 में उपयोग किया गया था, विरोधी माउस को चरण 1.2.10 में चुना जा सकता है, लेकिन खरगोश में एक और एंटीबॉडी उठाया नहीं जा सकता। चूंकि अधिकांश वाणिज्यिक एंटीबॉडी खरगोशों, चूहों या बकरियों में उठाए जाते हैं, इसलिए कभी-कभी मुश्किल या असंभव हो सकता है, क्योंकि उचित एंटीबॉडी की कमी के कारण एक ही समय में दो प्रोटीनों को लक्षित किया जाता है। इन सीमाओं पर काबू पाने के लिए, एक या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, पूर्व-लेबल वाले एंटीबॉडी या फ्लोरोफोर्स के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी लेबल कर सकता है। तीसरा, एक और कमी को विभिन्न फ्लोरोफोर्स के उत्तेजना और उत्सर्जन से जुड़ा हुआ है। दो अलग एंटीबॉडी से संकेतों के ओवरलैप से बचने के लिए, प्रत्येक फ्लोराफोरे के उत्तेजना-उत्सर्जन स्पेक्ट्रम को अलग करना चाहिए। इस प्रकार, एक बार में विश्लेषण किए जा सकने वाले लक्ष्यों की संख्या उपलब्ध माइक्रोस्कोप के कॉन्फ़िगरेशन के अनुसार अलग-अलग होगी। अंत में, विश्लेषण की गुणवत्ता में इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप पर अत्यधिक निर्भर है। अधिक विस्तृत और सटीक डेटा कर सकते हैंएपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप की तुलना में एक confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके प्राप्त किया जाना चाहिए। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रोटीन सह-लोकिकीकरण को और भी अधिक विस्तार से प्रकट कर सकता है।

हालांकि, सह-अगर संभावित बाध्यकारी भागीदारों की निकटता के बारे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि लाती है, तो प्रोटीन के बीच शारीरिक संबंधों की पहचान करने के लिए अन्य तरीकों से पूरक होना चाहिए। उपलब्ध तरीकों में सह-आईपी संभवत: प्रदर्शन करने के लिए सबसे सस्ती है, क्योंकि उपकरण और सामग्री आसानी से सुलभ हो सकते हैं। चुंबकीय मोतियों से जुड़ी एक एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, एक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को अलग कर सकता है और ठेठ पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण का उपयोग कर उस परिसर में मौजूद घटकों की पहचान कर सकता है। सह-जैसे, श्रेष्ठ अभ्यासों के लिए कुछ सुझावों का पालन किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, ऊतकों को दोबारा 2.1.5 और 2.1.9 के बीच के समय को कम करने के लिए नमूने को कम करने की सलाह दी जाती है। जबकि एक अनुभवी व्यक्ति 10 नमूनों तक प्रक्रिया कर सकता हैIime, एक शुरुआत से अधिक 4-6 नमूनों को संभालना नहीं चाहिए इसी तरह, पहली बार आईपी प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते समय ट्यूबों की संख्या सीमित होनी चाहिए। यह नकारात्मक नियंत्रण ( यानी, आईजीजी) और एक सकारात्मक नियंत्रण ( यानी एक ऊतक जिसे प्रोटीन को अनियंत्रित करने के लिए जाना जाता है) के साथ शुरू करने की सिफारिश की जाती है। दूसरा परीक्षण अनुकूलन के लिए समर्पित होना चाहिए (चरण 2.2.2 देखें) एक बार ये कदम संतोषजनक परिणाम देते हैं, विश्लेषण किए जाने वाले नमूने संसाधित किए जा सकते हैं। ध्यान दें कि एक नकारात्मक नियंत्रण हमेशा प्रक्रिया में शामिल किया जाना चाहिए।

इस सह-आईपी तकनीक में भी संभावित नुकसान हो सकते हैं सबसे पहले, यह आवश्यक है कि ऊतकों को प्रोटीन के बीच के संबंधों के संरक्षण की अनुमति में परिस्थितियों में समरूप होना चाहिए। झिल्ली प्रोटीन जैसे कि जंजायलिक प्रोटीन के लिए, एक बफर का उपयोग करने के लिए भी महत्वपूर्ण है जो प्रोटीन के बीच बांड को संरक्षित करेगा जबकि इसके घुलनशीलता की अनुमति भी देगी। दूसरा, सह-आईएफ के समान, इसमें उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी की आवश्यकता होती हैदोनों लक्ष्य प्रोटीन और बाध्यकारी भागीदारों के लिए इसके अलावा, क्योंकि प्रोटीन अपने तृतीयक रचना में रहते हैं और प्रोटीन परिसरों को होमोजीनाइजेशन से अलग नहीं किया जाता है, यदि एंटीबॉडी लक्ष्य प्रोटीन का हिस्सा पहचानता है जो किसी साथी के बाइंडिंग डोमेन के करीब है या प्रोटीन के मूल संरचना में छिपा हुआ है , आईपी समझौता किया जा सकता है। इस प्रकार, बाध्यकारी भागीदार की अनुपस्थिति समाप्त होने से पहले पश्चिमी ब्लोटिंग का उपयोग करके आईपी की दक्षता को हमेशा सत्यापित करना आवश्यक है। तीसरा, सह-आईपी प्रोटीन की वजह से झूठी सकारात्मक परिणाम उत्पन्न कर सकता है, जो सीधे मोती के लिए बाध्य होती है या जटिल के भाग के बिना प्रक्रिया के दौरान उपजी हो सकता है। इन कलाकृतियों की पहचान करने के लिए, एक आईजीजी नियंत्रण की आवश्यकता है, साथ ही पारस्परिक आईपी भी, जैसा कि प्रस्तुत तरीकों में वर्णित है। मोतियों को प्रोटीन की अनिर्धारित बाइंडिंग से बचने के लिए 2.2.2 और 2.2.3 चरण के बीच "पूर्व-सफाई" प्रक्रिया जोड़ना संभव है। ऐसा करने के लिए, वें सेतेई रोलर्स मिक्सर पर 1 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 50 माइक्रोग्राम मोतियों के साथ lysates। चुंबकीय स्टैंड के साथ मोतियों को निकालें और 2.2.3 कदम आगे बढ़ें। चौथा, आईजीजी की भारी और हल्की श्रृंखलाएं, ब्याज या बाध्यकारी साथी के प्रोटीन के समान ही हो सकती हैं, जिससे सिग्नल को मुखौटा कर दिया जा सकता है। एक पांडुलिपि में बताया गया है कि एक समाधान ग्लासीन के साथ आईजीजी चेन को अलग करना है। द्वितीयक एंटीबॉडी खरीदना भी संभव है जो केवल देशी एंटीबॉडी को पहचानते हैं और इसलिए झिल्ली में लोड किए गए विकृत प्रकाश और भारी चेन को बाँध नहीं करते (सामग्री की तालिका देखें)। दो तरीकों को कभी-कभी जोड़ना पड़ सकता है फिफ्थ, सह-आईपी सीमित बाध्यकारी भागीदारों की पहचान के लिए अनुमति देता है, क्योंकि भाग में एंटीबॉडी की जांच की जा सकती है जो झिल्ली पर जांच की जा सकती है। इसके लिए इन बाध्यकारी भागीदारों की पूर्व-पहचान की आवश्यकता होती है, या तो सह-अगर या साहित्य समीक्षा के माध्यम से। अंत में, सह-आईपी प्रोटीन प्रेस्ट की पहचान के लिए अनुमति देता हैएक जटिल के भीतर ent, और दो प्रोटीन के बीच प्रत्यक्ष बातचीत के लिए नहीं।

सह-आईपी से परिणाम अलग-अलग तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है। इस पांडुलिपि में वर्णित अनुसार अलग-अलग एंटीबॉडी के साथ एक ही झिल्ली को फिर से जांचकर बातचीत करने वाले भागीदारों की पहचान करना संभव है। यह इस बातचीत का विस्तार करना भी संभव है। ऐसा करने के लिए, इस प्रोटीन के प्रति एंटीबॉडी के साथ झिल्ली की जांच करके प्रोटीन प्रतिरक्षी की मात्रा पहली मात्रा में मापा जाता है। इस पांडुलिपि में बताए अनुसार, इमेजिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग करके संकेत तीव्रता का विश्लेषण किया गया है। इसके बाद, झिल्ली को बंधन साथी के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ पुन: जांच किया जाता है, और संकेत तीव्रता भी मात्रा निर्धारित होती है। दो प्रोटीन के बीच परस्पर क्रियाओं को बाध्यकारी भागीदार की मात्रा के प्रति immunoprecipitated प्रोटीन की मात्रा के अनुपात के रूप में व्यक्त किया जा सकता है। हालांकि, तुलना की अनुमति देने के लिए, विभिन्न नमूनों को एक ही समय में संसाधित किया जाना चाहिए और उसी झिल्ली पर लोड किया जाना चाहिए। Biologिकल प्रतिकृतियां आगे की जा सकती हैं और उनका विश्लेषण भी किया जा सकता है, और सांख्यिकीय विश्लेषण किया जा सकता है।

पिछले कुछ वर्षों में, पीपीआई के विश्लेषण के लिए अन्य तकनीकों का विकास किया गया था। उदाहरण के लिए, एफईआरटी एक टैग से दूसरे स्थान पर ऊर्जा हस्तांतरण के माध्यम से इंटरएक्टिंग प्रोटीन की पहचान के लिए अनुमति देता है, केवल जब प्रोटीन 20 के साथ बातचीत करने के लिए पर्याप्त होते हैं हालांकि, क्योंकि इसे प्रोटीन को टैग करने की आवश्यकता है, इस तकनीक का उपयोग ऊतकों में नहीं किया जा सकता है। इसी तरह, एक जीवाणु बायोटिन ligase, बीरा 21 के साथ जुड़े प्रोटीन का उपयोग करके पीपीआई की पहचान करना संभव है। यह ligase बायोटीन को प्रोटीन से जोड़ देगा जो कि चिमरिक प्रोटीन के साथ निकटता ( यानी, बातचीत) में आते हैं। हालांकि यह विधि नवीन और निष्पक्ष है, यह ऊतकों में नहीं किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, पीएलए का उपयोग ऊतकों में किया जा सकता है। सह के समान, यह परख एंटीबॉडी आत्मीयता पर आधारित है। इस परख के लिए, द्वितीयक एंटीबॉडीज को डीएनए दृश्यों के साथ टैग किया जाता हैजब वे करीब निकटता ( यानी, पीपीआई पर) में बातचीत कर सकते हैं और एक परिपत्र डीएनए अणु 22 बना सकते हैं । इस परिपत्र डीएनए अणु को प्रत्यारोपित किया जाता है और फ्लोरोसेंटली लेबल वाले पूरक ऑलिगोनक्लियोटिड का उपयोग करके पता लगाया जाता है। यद्यपि यह परख सुरुचिपूर्ण है, इसके लिए कई सत्यापन कदमों की आवश्यकता होती है और फिर भी प्राथमिक एंटीबॉडी संबंध और संभावित बातचीत करने वाले भागीदारों के कुछ ज्ञान पर निर्भर होता है। अंत में, पारंपरिक आईपी परख के लिए एक निष्पक्ष विकल्प भी पीपीआई की पहचान के लिए विकसित किया गया है। अंतर्जात प्रोटीन (आरआईएमई) के assays की तेजी से immunoprecipitation-mass spectrometry में, आईपी नमूने पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण के बजाय जन स्पेक्ट्रोमेट्री (आईपी / एमएस) 23 द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं। इस उच्च-थ्रिपुट विधि का मुख्य लाभ यह है कि यह कुछ सामग्री का उपयोग करने वाले सभी अंतर्जात इंटरैक्टिंग प्रोटीनों के बारे में व्यापक जानकारी प्रदान करता है। हालांकि, इसमें पेप्टाइड-अनुक्रमण यंत्र 23 तक पहुंच की आवश्यकता है

यह हैउल्लेख करना महत्वपूर्ण है, कई प्रारंभिक परीक्षणों के बाद, इस प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण को स्तन ग्रंथि के लिए अनुकूलित किया गया है। हालांकि, कुछ संशोधनों के बाद विधि का निश्चित रूप से अन्य अंगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सह के लिए, स्तन ग्रंथि सेक्शनिंग, उपयुक्त अवरुद्ध और धोने और समाधान के लिए इष्टतम तापमान, और उचित एंटीबॉडी सांद्रता सभी का परीक्षण किया गया। सह-आईपी के लिए, विभिन्न विश्लेषण और अलगाव बफ़र्स और निष्कर्षों के तरीकों का भी परीक्षण किया गया और आईपी सफलता पर एक बड़ा प्रभाव पड़ा। संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण को कम-से-कम संभावित पृष्ठभूमि और सबसे विशिष्टता के साथ उच्च गुणवत्ता वाले और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। जबकि अन्य तरीके उपलब्ध हैं, सह-आईपी के बाद पीपीआई का मूल्यांकन करने के लिए सह-आईपी वैध और सरल तरीके हैं। इन दोनों तकनीकों का इस्तेमाल ऊतकों और सेल लाइनों में किया जा सकता है और केवल कुछ सत्यापन कदम और नियंत्रण की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

लेखकों को घोषित करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

आईपी ​​एक प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा अनुदान (एनएसईआरसी # 418233-2012) इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद द्वारा वित्त पोषित है; क्यूबेक स्तन कैंसर फाउंडेशन कैरियर पुरस्कार, और कनाडा के फाउंडेशन फॉर इनोवेशन ग्रांट से एक लीडर फाउंड्स ग्रांट के रूप में एक फ्रॉन्स डे रीशेचे डु क्यूबेक-सैंट (एफआरक्यूएस) ईडी ने फॉन्डेशन यूनिवर्सिटी आर्मंड-फ्रेपीयर से छात्रवृत्ति प्राप्त की।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice strain and stage St. Constant, Quebec, Canada C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10x (stock) 1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water;
2) Adjust the PH to 7.4;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
TBS 10x (stock) 1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water;
2) Adjust the pH to 7.5;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
Part 1: Immunofluorescence
Freezing media VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada 95067-840 VMR frozen sections compound 
Microtome Mississauga, ON, Canada 956640 Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
Blades C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada BLM1001C High profile gold coated blades
Pap pen Cedarlane, Burlington, ON, Canada 8899 Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slides Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada 12-550-15 Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
Formaldehyde BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada FOR201.1 Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution 3% BSA in TBS
Wash solution TBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20 Oakville, ON, Canada P 9416 Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting media Cedarlane, Burlington, ON 17984-25(EM) Fluoromount-G
First & secondary antibodies Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies  Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada  See Comments β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies  Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stain Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada D1306 DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS
Fluorescent microscope Nikon Canada, Mississauga, On, Canada Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysis Nikon Canada, Mississauga, On, Canada NIS-elements software (version 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0 1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O.
2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL).
3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge.
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitor Fisher Scientific, Burlington, ON 78441 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)
Protein dosage Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA 23225 Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinder Fisher Scientific, Burlington, ON FTH-115 Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and stand Millipore, Etobicoke, ON, Canada PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IP PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada See Comments Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation Cell Signaling, Beverly, MA, USA See Comments E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL
Laemmli buffer  BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada 1610747 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine  Fisher Scientific, Burlington, ON PB381-5 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris  Fisher Scientific, Burlington, ON BP152-1 1 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1610180 -5 TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x  BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water
Membranes BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704272 PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer method BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1704155 Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry Milk Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blots TBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada See Comments Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1705061 Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada 1708280 ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blots BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada ImageLab 5.2 software 

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References

  1. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
  2. Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
  3. Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
  4. El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
  5. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
  6. Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
  7. Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
  8. Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
  9. Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
  10. Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
  11. Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
  12. Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
  13. Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
  14. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
  15. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  16. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  17. Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
  18. Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
  19. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).
  22. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  23. Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).

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विकास जीवविज्ञान अंक 123 स्तन ग्रंथि विकास मूरीन प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन सह-लोकिकीकरण सेल-सेल इंटरैक्शन जनलैक्शनल नेक्सस कन्जिनस कैडरिन क्लाउडिंस कैटेनिन
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Dianati, E., Plante, I. Analysis of… More

Dianati, E., Plante, I. Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands. J. Vis. Exp. (123), e55772, doi:10.3791/55772 (2017).

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