Analyse av protein-protein-interaksjoner og samlokalisering mellom komponenter av gap-, tett- og adherens-junks i murine mammarykjertler

Summary

Intercellulære veikryss er krav til brystkreftsspesifikke funksjoner og utvikling. Dette manuskriptet gir en detaljert protokoll for studiet av protein-protein-interaksjoner (PPIs) og co-lokalisering ved bruk av murine brystkjertler. Disse teknikkene tillater undersøkelse av dynamikken i den fysiske forbindelsen mellom intercellulære veikryss på forskjellige utviklingsstadier.

Abstract

Cell-celle-interaksjoner spiller en sentral rolle for bevaring av vevets integritet og barrieren mellom de forskjellige delene av brystkjertelen. Disse interaksjonene er tilveiebrakt ved kryssproteiner som danner sammenhenger mellom tilstøtende celler. Junctional protein mislokalisering og reduserte fysiske foreninger med deres bindende partnere kan resultere i tap av funksjon og følgelig til organ dysfunksjon. Derfor er det viktig å identifisere protein lokalisering og protein-protein-interaksjoner (PPI) i normale og sykdomsrelaterte vev for å finne nye bevis og mekanismer som fører til utviklingen av sykdommer eller endringer i utviklingsstatus. Dette manuskriptet presenterer en to-trinns metode for å evaluere PPI i murine brystkjertler. I protokollseksjon 1 beskrives en metode for å utføre co-immunofluorescens (co-IF) ved bruk av antistoffer opptatt mot proteiner av interesse, etterfulgt av sekundære antistoffer merket med fluorokromer. Selv om co-IF alleOws for demonstrasjon av nærhet av proteiner, gjør det mulig å studere sine fysiske interaksjoner. Derfor er det gitt en detaljert protokoll for samimmunutfelling (co-IP) i protokolleksjon 2. Denne metoden brukes til å bestemme de fysiske samspillet mellom proteiner, uten å bekrefte om disse interaksjonene er direkte eller indirekte. I de siste årene har co-IF og co-IP teknikker vist at visse komponenter i intercellulære veikryss co-lokaliserer og interagerer sammen, og skaper faseavhengige knutepunktene som varierer under utvikling av brystkirtler.

Introduction

Mammekirtlen vekst og utvikling skjer hovedsakelig etter fødselen. Dette organet forandrer seg hele tiden gjennom det reproduktive livet til et pattedyr ¹ . Det voksne brystkjertelepitelet består av et indre lag av luminale epitelceller og et ytre lag av basale celler, hovedsakelig sammensatt av myopiteliale celler, omgitt av en kjellermembran ² . For en god anmeldelse på brystkirtels struktur og utvikling, kan leseren henvise til Sternlicht ¹ . Cell-celle interaksjoner via gap (GJ), tett (TJ) og adherens (AJ) kryssinger er nødvendige for normal utvikling og funksjon av kjertelen ^{1 , 3 , 4 , 5 , 6} . Hovedkomponentene i disse kryssene i den murine brystkjertelen er Cx26, Cx30, Cx32 og Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 og -7 ogZO-1 (TJ); Og E-cadherin, P-cadherin og β-catenin (AJ) ^{7 , 8} . Ekspresjonsnivåene for disse forskjellige kryssproteiner varierer på en stadiumavhengig måte under utvikling av brystkirtler, noe som foreslår differensialcelle-celleinteraksjonskrav ⁹ . GJ, TJ og AJ er strukturelt og funksjonelt knyttet sammen og sammenkobler andre strukturelle eller regulatoriske proteiner til naboområdene av tilstøtende celler, og danner dermed en sammenføyningsnekke ¹⁰ . Sammensetningen av knutepunktet kan påvirke brodannelsen med det underliggende cytoskeletet, samt gjennomtrengelighetens permeabilitet og stabilitet, og kan derfor påvirke funksjonen til kjertelen ^{8 , 9 , 10 , 11} . Komponentene i intercellulære kryssninger som ligger i kryssende nexuser eller interagerer med hverandre ved difHelt utviklede stadier av brystkjertelutvikling ble analysert nylig ved bruk av co-immunofluorescens (co-IF) og co-immunutfelling (co-IP) ⁹ . Mens andre teknikker tillater evaluering av den funksjonelle forbindelsen mellom proteiner, presenteres disse metodene ikke i dette manuskriptet.

Da proteiner bare virker alene for å fungere, er det viktig for mange forskere å studere protein-protein-interaksjoner (PPI), slik som signaltransduksjoner og biokjemiske kaskader, og kan gi betydelig informasjon om proteinens funksjon. Co-IF og mikroskopisk analyse bidrar til å evaluere noen få proteiner som deler det samme subcellulære rommet. Imidlertid er antall mål begrenset av antistoffene, som må heves i forskjellige dyr, og ved tilgang til et konfokalt mikroskop utstyrt med forskjellige bølgelengdelasere og en spektral detektor for multipleksering. Co-IP bekrefter eller avslører høy-affinitet fysiske interaksjoner betwEn to eller flere proteiner som ligger innenfor et proteinkompleks. Til tross for utviklingen av nye teknikker, slik som fluorescensresonansenergioverføring (FRET) ¹² og nærhetsligasjonsanalysen (PLA) ¹³ , som samtidig kan oppdage lokalisering og interaksjoner av proteiner, forblir co-IP en hensiktsmessig og rimelig teknikk for å studere interaksjoner mellom Endogene proteiner.

Den trinnvise metoden beskrevet i dette manuskriptet vil lette studiet av proteinlokalisering og PPI og peke ut fallgruver for å unngå når man studerer endogene PPI i brystkjertlene. Metodikken starter med presentasjonen av de ulike bevaringsprosedyrene for vevene som kreves for hver teknikk. Del 1 presenterer hvordan man studerer protein-co-lokalisering i tre trinn: i) deling av brystkjertler, ii) dobbelt- eller trippelmerking av forskjellige proteiner ved hjelp av co-IF-teknikken, og iii) avbildning avProtein lokalisering. Del 2 viser hvordan man utfeller et endogent protein og identifiserer dets samvirkende proteiner i tre trinn: i) lysatpreparasjon, ii) indirekte proteinimmunutfelling, og iii) bindingspartneridentifikasjon ved SDS-PAGE og Western blot. Hvert trinn i denne protokollen er optimalisert for gnagekjertelvev fra gnagere og genererer høykvalitets, spesifikke og reproducerbare resultater. Denne protokollen kan også brukes som utgangspunkt for PPI-studier i andre vev eller cellelinjer.

Protocol

Alle dyreprotokoller som ble brukt i denne studien ble godkjent av Universitets dyrepleieutvalget (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada).

1. Identifisering av Protein Co-lokalisering

1. Fra vev til mikroskopiske lysbilder
   MERK: Vev og seksjoner skal håndteres på tørr is.
   1. Nedsatt brystkjertlene fra et dyr (for en fullstendig beskrivelse av denne prosedyren, se Plante et al. ) ¹⁴ .
   2. Embed det utskårne vevet i fryser / monteringsmedium på tørr is. Legg til nok medium til å dekke kjertelen. Når mediet er størknet, overfør vevet til en fryser ved -80 ° C til senere bruk ⁹ .
   3. Ved hjelp av et kryomikrotom satt til ≤ -35 ​​° C, kutte vevene i 7-10 μm tykke seksjoner og plasser dem på mikroskopdører.
      MERK: Når det er mulig, plasser to seksjoner på hvert lysbilde; Den venstre delen vil bli brukt som enEgativ kontroll for å verifisere antistoffets spesifisitet og autofluorescens av vevet, mens høyre side vil bli merket med antistoffene.
   4. Hold seksjonene ved -80 ° C for senere bruk.
2. Co-IF-farging
   1. Hent de riktige mikroskopiske lysbildene fra fryseren, og umiddelbart reparer seksjonene ved å senke dem i formaldehyd 4% i 15 minutter ved romtemperatur (RT).
   2. Damp deretter lysbildene i fosfatbuffert saltvann (PBS) ved RT. Legg lysbildene i PBS ved RT før du fortsetter til neste trinn.
   3. Sirkle hver del av lysbildet ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig hydrofob barriere eller en vannavvisende labpenn (se Materialetabellen ). Vær forsiktig så du ikke berører vevet. Legg øyeblikkelig dråper PBS til vevet og legg lysbildet i et fuktig histologi kammer for resten av prosedyren.
      MERK: Vevseksjonene må forbli fuktet. AlternativLy, bruk en boks med lokket og legg våte papirhåndklær på bunnen.
   4. Blokker hver vevsdel med 100-200 μL 3% bovint serumalbumin (BSA) -Trisbuffert saltvann (TBS) -0,1% polysorbat 20 (se Materialetabell ) i 30 minutter ved RT. Mens prøvene blokkerer, klargjør primære og sekundære antistoffløsninger ved å fortynne antistoffene i TBS-0,1% polysorbat 20.
      MERK: Den nødvendige konsentrasjonen for antistoffet er gitt av produsenten; Se Materialebordet og figurene 1 og 2 for eksempler, så vel som Dianati et al. ⁹ . Selv om det ikke er nødvendig å arbeide i mørket ved bruk av de fleste fluorofore-konjugerte antistoffer, unngå å utsette antistoffløsninger eller flekkete vev til intens, sterkt lys.
   5. Fjern blokkeringsløsningen ved aspirasjon og inkuber seksjonene i 100-200 μL av det fortynnede primære antistoff i 60 minutter ved RT. AlternativelY, inkuber med det primære antistoffet over natten ved 4 ° C.
   6. Fjern den primære antistoffoppløsningen ved aspirasjon og vask seksjonene med 250-500 μL TBS-0,1% polysorbat 20 i 5 minutter. Fjern vaskeløsningen ved suging og gjenta vasken to ganger.
   7. Fjern vaskeoppløsningen ved aspirasjon og inkuber seksjonene med 100-200 μL av det passende fluorofore-konjugerte sekundære antistoff i 60 minutter ved RT.
   8. Fjern sekundær antistoffløsning ved aspirasjon og vask seksjonene med 250-500 μL TBS-0,1% polysorbat 20 i 5 minutter. Fjern vaskeløsningen og gjenta to ganger.
   9. Gjenta trinn 2.5-2.8 ved å bruke den riktige kombinasjonen av primære og sekundære antistoffer for det etterfølgende protein (er) av interesse.
   10. Fjern vaskeoppløsningen ved å aspirere og utføre kjernefargingen ved å inkuberte delen med 100-200 μl 1 mg / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i TBS-0,1% polysorbat 20 i 5 minutter vedRT.
   11. Fjern DAPI-løsningen ved å aspirere og monter glidene ved hjelp av et vannløselig, ikke-fluorescerende monteringsmedium (se Materialebordet ) og dekselplater. Fortsett ett lysbilde om gangen.
       MERK: Inkubasjon av kjerneflekken i mer enn 5 minutter vil ikke endre intensiteten av fargingen. Alternativt kan du fjerne DAPI-løsningen på alle lysbilder og inkuber vevet i PBS mens du monterer lysbildene.
   12. Plasser lysbildene flatt i et 4 ° C kjøleskap i minst 8 timer. Fortsett til fluorescensmikroskopisk avbildning (se figurene 1 og 2 ).
3. Mikroskopisk avbildning
   1. Visualiser fluorofore-konjugerte sekundære antistoffer ved bruk av et konfokalt mikroskop utstyrt med de forskjellige laserene som kreves for å excitere fluoroforene ved deres spesifikke bølgelengder.
      Merk: For å kunne visualisere kanaler og alveoler, foreslås et 40X objektiv med en numerisk blenderåpning på 0,95. En undersøkelseE av de spesifikke innstillingene er gitt i figur 1 .
   2. Verifiser lokaliseringen av hvert protein enkeltvis ved å skanne bildet en bølgelengde på den tiden.
      Merk: På dette stadiet er det viktig å kritisk analysere lokaliseringen av kryssproteiner. For å være i stand til å danne tverrgående nexuser, må disse proteinene være lokalisert ved plasmamembranen.
   3. Bestem samlokalisering av proteiner ved å slå sammen bildene som er skannet med lasere ved forskjellige bølgelengder.
      Merk: Protein co-lokalisering kan visualiseres ved fargeendring som følge av utslipp av to eller flere fluoroforer på samme sted og kan måles ved hjelp av riktig programvare ( figur 1 og 2 , se også referanse 9).

2. studere PPIer

MERK: Abdominale brystkjertler bør brukes til å studere PPI, da thoraxkjertlene er i nær tilknytning til pectoralmuskler. Nedsatt brystkjertlene (for en fullstendig beskrivelse av denne prosedyren, se Plante et al .) ¹⁴ og hold dem ved -80 ° C til senere bruk.

1. Lysatpreparasjon
   1. Legg veierpapir og 2 ml mikrocentrifugerør på tør is for å kjøle dem før du fortsetter med de neste trinnene.
   2. Ta brystkjertelvevet fra -80 ° C og hold dem på tøris.
   3. Veie vevene på de forkjølte veidokumenter og overfør deretter vevet til 2 ml mikrocentrifugerør (håndtak på tørr is). Bruk mellom 50 og 100 mg vev pr. Prøve. Hold vævet på tøris til trinn 2.1.5.
   4. Forbered den nødvendige mengden triple detergent lysis buffer supplert med NaF, NaVO ₃ og protease / fosfatase inhibitor, som angitt i Materialetabellen , ved å bruke følgende formler. Mus: Krevd buffer (μL) = musvevevekt (mg) x 3; Rotte: krevesBuffer (μL) = rottevevvekt (mg) x 5.
   5. Tilsett den nødvendige mengden iskald lysisbuffer (beregnet i trinn 2.1.4) til 2 ml røret som inneholder vevet.
      MERK: I trinn 2.1.5-2.1.6, fortsett med ett enkelt rør om gangen.
   6. Homogeniser vevet i 30-40 s ved bruk av kontinuerlig homogenisering på en vevslipemaskin; Hold alltid røret på is. Juster vevshomogenisatoren til middels hastighet og flytt forsiktig grinder opp og ned i røret.
   7. Gjenta trinn 1.6 og 1.7 med de andre rørene.
   8. Inkuber lysatene på is i 10-30 minutter.
   9. Sentrifuger rørene ved 170 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
   10. I mellomtiden identifiserer 6-10 mikrocentrifugerør (0,6 ml) for hver prøve og oppbevar dem på is.
   11. Når sentrifugeringen er ferdig, kontroller rørene. Sørg for at de inneholder et topplag av fett, klare, gul-til-rosa lysater (avhengig av utviklingsstadiet) og en pellet.
   12. Lag et hull i lipidlagetVed hjelp av en 200-liters pipettespiss for å få tilgang til væskefasen. Bytt tuppet og saml lysatet uten å forstyrre pelleten eller aspirere lipidlaget. Aliquot lysatet i pre-merkede rør på is (trinn 2.1.11) og lagre dem ved -80 ° C.
   13. Bruk en alikvot til å kvantifisere proteinkonsentrasjonen ved å bruke et passende kommersielt tilgjengelig kit (se Materialetabellen ).
2. Indirekte immunutfelling
   1. På is, tine to alikvoter av de totale brystkjertellysater fremstilt tidligere.
      MERK: En alikvot vil bli brukt til målproteinets IP, mens den andre vil tjene som negativ kontroll.
   2. Samle 500-1 000 μg av lysatet og fortynn det i PBS for å nå et sluttvolum på 200 μl i hvert 1,5 ml rør.
      MERK: Mengden lysat som skal brukes, avhenger av overflaten av proteinet av interesse og effektiviteten av antistoffet (se figur 3 for enN eksempel, samt materialetabellen ). For å optimalisere for hvert mål, bør forskjellige mengder lysat ( dvs. 500, 750 og 1000 μg) og antistoff ( dvs. 5, 10 og 20 μg) brukes. Fortsett med følgende trinn (2.2.3-2.3.7.4).
   3. Legg antistoffet mot antigenet av interesse for det første lysisrøret og hold det på is.
      MERK: Den nødvendige mengden er vanligvis foreslått på instruksjonsarket som er gitt av hvert selskap (se Materialebordet ).
   4. I det andre røret lagrer du en negativ kontroll ved å tilsette den samme konsentrasjonen av isotype IgG-kontroll som antistoffet som ble brukt i trinn 2.2.3.
   5. Inkubér rørene over natten ved 4 ° C på en rørrulleblander med lav hastighet.
   6. Den følgende dag, tilsett 50 μL magnetiske perler til nye 1,5 ml rør for forhåndsvasking.
      1. Velg enten Protein A eller Protein G magnetiske perler basert på den relative affiniteten til antistoffet. Det er viktig å unngå å bruke aggregerte perler; Bland forsiktig opp perlens suspensjon til den er jevnt resuspendert før du legger den til rørene.
   7. Plasser rørene som inneholder perlene på magnetisk stativ og la perlene migrere til magneten. Fjern lagringsbufferen fra perlene med en 200 μL pipette.
   8. Vask perlene ved å tilsette 500 μl PBS-0,1% polysorbat 20 og vortex rørene kraftig i 10 s.
   9. Sett rørene igjen på magnetstativet og la perlene migrere til magneten.
   10. Fjern overflødig vaskebuffer ved pipettering med en 200 μl pipette.
   11. Tilsett reaksjonskomplekset (lysat-antistoff) fra trinn 2.2.5 til perlene og inkuber i 90 minutter ved RT på rulleblanderen.
   12. Plasser rørene på det magnetiske stativet og la perlene migrere til magneten. Bruk en 200 μL pipette, aspirer og kast lysatet og plasser rørene på is.
   13. Vask perlenS ved å tilsette 500 μl PBS, plassere rørene på magnetisk stativ og fjerne væsken ved hjelp av en 200 μl pipette. Gjenta dette vaske trinnet. Under vaske trinnene, unngå vortexing og hold prøver på is.
   14. Vask perlene en gang med PBS-0,1% polysorbat 20 uten vortexing og kast den siste vaskebufferen ved hjelp av en 200 μl pipettespiss.
   15. For å eluere, tilsett 20 μl 0,2 M sur glycin (pH = 2,5) til rørene og rist dem i 7 minutter på rulleblanderen.
   16. Sentrifuger med høy hastighet i noen sekunder (hurtig spinn) og samle supernatanten i et nytt iskaldt rør.
   17. Gjenta trinn 2.2.14 og 2.2.15 for hvert rør.
       MERK: Det endelige volumet vil være 40 μL.
   18. Tilsett 10 μl 4 x Laemmli buffer til 40 μl eluert prøve fra trinn 2.2.16.
       MERK: Fargen blir gul på grunn av den sure pH.
   19. Tilsett øyeblikkelig 1 M Tris (pH = 8), en dråpe om gangen, til den eluerte prøven fra trinn 2.2.18 til fargenBlir blå. Fortsett til de neste rørene.
   20. Kok prøvene fra trinn 2.2.18 ved 70-90 ° C i 10 minutter. Fortsett umiddelbart til gelelektroforese. Alternativt, overfør prøvene til en fryser ved -80 ° C til lasting.
3. Nedstrømsapplikasjon: gelelektroforese etterfulgt av Western blot
   1. Klargjør separering og stabling av SDS-PAGE akrylamidgeler (1,5 mm tykkelse) etter standardprosedyrer ¹⁵ .
      MERK: Valget av gel (8-15% akrylamid, gradient: se Materialetabell ) skal bestemmes ut fra molekylstørrelsen til proteinet som skal utfelles og av de potensielle bindingspartner som skal analyseres. Disse proteinene må løses fra hverandre for å muliggjøre riktig immunodeteksjon.
   2. Tine immunoprecipitasjon (IP) -eluerte prøver (trinn 2.2.20) på is.
   3. Forbered proteinlysater fra de samme prøvene (brukt til IP-prosedyren ovenfor). Bruk 50Μg total lysat og tilsett 4X Laemmli prøvebuffer. Kok prøvene ved 70-90 ° C i 5 minutter og sett på is til innlasting.
      MERK: Disse prøvene vil bli lastet ved siden av den eluerte IP-prøven for å demonstrere tilstedeværelsen av utfelt proteiner i det totale lysatet.
   4. Last inn de fremstilte lysater fra trinn 2.3.3 og de utfelte prøvene fra trinn 2.2.20 side ved side i en akrylamidgel og løp dem i løpebuffer (10x løpebuffer: 30,3 g Tris, 144,1 g glycin og 10 G SDS i 1 liter destillert vann) ved 100 V i omtrent 95 minutter, eller til kanten av de migrerende proteiner når bunnen av gelen.
   5. Overfør gelene til en nitrocellulose eller PVDF-membran ved hjelp av en standardprotokoll ^{9 , 15} .
   6. Blokker membranen i 1 time på en rocker med lav hastighet i 5% tørrmelk-TTBS (20 mM Tris, 500 mM NaCl og 0,05% polysorbat 20).
   7. Identifiser om nedbør var vellykketcessful.
      1. Probe membranen ved å bruke det første antistoffet mot det utfelte proteinet, fortynnet i 5% tørrmelk-TTBS ved konsentrasjonen anbefalt av produsenten, over natten ved 4 ° C på en gyngeplate med langsom omrøring.
         MERK: Se Materialebordet for anbefalinger.
      2. Den følgende dagen, vask membranen 3 ganger i 5 minutter hver med TTBS på en gyngeplattform med høy omrøring.
      3. Inkuber membranen i det passende sekundære antistoffet som er konjugert med pepperrotperoksidase (HRP), fortynnet i TTBS, i 1 time ved RT på en gyngeplattform med langsom omrøring.
         MERK: Alternativt kan et sekundært antistoff som er konjugert med et fluorokrom brukes dersom et passende apparat for å detektere signalet er tilgjengelig.
      4. Utfør 3 til 6 vasker, hver i 5 minutter, med TTBS på en gyngeplattform med høy omrøring. Analyser signalet fra det sekundære antistoffet ved å inkuberere membranen med et kommersielt aVailable luminoloppløsning (se Materialebordet ) og følg produsentens instruksjoner. Registrere signalet ved hjelp av et kjemiluminescensavbildningssystem (se Materialetabellen ).
         MERK: For en detaljert protokoll om Western blot-analyse, se Referanse 16.
   8. For å identifisere interagerende proteiner, utfør trinn 2.3.7.1-2.3.7.4 ved å bruke de riktige antistoffene på samme blott.
      MERK: Hvis proteiner interagerer, vil bindingspartnerne være coimmunutfället med målproteinet og vil dermed bli detekterbare ved Western blotting. Trinn 2.3.8 kan gjentas med flere antistoffer for å bestemme om andre proteiner ligger i samme proteinkompleks, så lenge molekylvektene til proteinene er forskjellige nok til å være godt separert på gel og membran.
   9. For å bekrefte at de identifiserte bindingspartner ikke er gjenstander, skal gjensidig IP utføres.
      MERK: Dette utføres ved å gjentaTrinn 2.2.1-2.2.20 med samme lysat, men utfelling av en av bindingspartnerne identifisert i trinn 3.8. Deretter gjentas trinnene 3.1-3.8 ved bruk av det primære antistoff mot det første protein av interesse.

Representative Results

For å bestemme om GJ, AJ og TJ-komponenter kan samhandle sammen i brystkirtlen, ble co-IF-analyser først utført. Cx26, et GJ-protein og β-Catenin, et AJ-protein, ble probet med spesifikke antistoffer og ble avslørt ved hjelp av henholdsvis fluorofore-konjugert henholdsvis muse 647 (grønn, pseudocolor) og geit-568 (rød) antistoffer ( figur 1B og C ) . Data viste at de co-lokaliserer ved cellemembranen til epitelceller i musklikkjertelen på laktasjonsdag 7 (L7), som reflektert av den gule fargen ( Figur 1D ). For det andre, Claudin-7, et TJ protein; E-kadherin, et AJ protein; Og Connexin26 (Cx26), et GJ protein, ble probet med sine spesifikke antistoffer og ble avslørt med henholdsvis fluorofore-konjugert kanin-488 (grønn), mus-555 (rød) og mus-647 (koralblå, pseudocolor) antistoffer ( Figur 2B-D ). E-cadherin og Claudin-7 co-lokalisering erVist som en gul-til-lys-oransje farge, mens Cx26-samlokalisering med E-cadherin og Claudin-7 resulterte i hvite tegnsettende farging i muskirtler på graviditetsdag 18 (P18) ( Figur 2E ).

For å finne ut hvilke kryssproteiner som blander seg og fysisk tetter sammen ved cellemembranen, ble co-immunutfelling utført ved bruk av brystkjertelvev fra lakterende mus (L14). Resultatene viste at Cx43, en komponent av GJ, interagerer med E-Cadherin og Claudin-7, men ikke med Claudin-3 ( Figur 3A og B ). Disse resultatene ble bekreftet av gjensidig IP; Da E-Cadherin ble immunoprecipitert, interagerte det med Cx43 og Claudin-7 ( figur 3C ).

Figur 1: P-Catenin og Cx26 co-lokaliseres ved cellemembranenRane i muse morkirtler. Kryoseksjoner fra morkirtler hos mus ved laktasjonsdag 7 (L7) ble kuttet (7 μm) og behandlet for immunfluorescerende farging. ( A ) Nuclei ble farget med DAPI (blå). ( B ) Cx26 (grønn, pseudokolor) og ( C ) P-Catenin (rød) er vist kombinert med passende fluorofore-merkede antistoffer. ( D ) Et fusjonert bilde. Bilder ble oppnådd med et konfokalt mikroskop utstyrt med en spektral detektor. DAPI ble visualisert ved hjelp av følgende innstillinger: utslippsbølgelengde, 450,0 nm; Eksitasjonsbølgelengde, 402,9 nm; Laser kraft, 1,2; Detektorøkning, PMT HV 100; PMT-offset, 0. Cx26 (647) ble visualisert ved å bruke følgende innstillinger: utslippsbølgelengde, 700,0 nm; Eksitasjonsbølgelengde, 637,8 nm; Laser kraft, 2,1; Detektorøkning, PMT HV 110; PMT offset, ble 0β-Catenin (568) visualisert ved å bruke følgende innstillinger: utslippsbølgelengde, 595,0 nm; Eksitasjonsbølgelengde, 561,6 nm; laserKraft, 2,1; Detektorøkning, PMT HV 110; PMT offset, 0. Skalestenger = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Connexin26 (Cx26), E-cadherin og Claudin-7 co-lokaliseres ved cellemembranen i mus-brystkjertler. Kryoseksjoner fra morkirtler på graviditetsdag 18 (P18) ble kuttet (7 μm) og behandlet for immunfluorescerende farging ved bruk av ( B ) Claudin-7 (grønn), ( C ) E-Cadherin (rød) og ( D ) Cx26 Blå; pseudocolor), kombinert med passende fluorofore-merkede antistoffer. ( A ) Nuclei ble farget med DAPI (blå). Bilder ble oppnådd med et konfokalt mikroskop utstyrt med en spektral detektor. DAPI ble visualisert ved hjelp av fOllowing innstillinger: utslipp bølgelengde, 450,0 nm; Eksitasjonsbølgelengde, 402,9 nm; Laserkraft, 5,4; Detektor forsterkning, PMT HV 65; PMT offset, 0. Claudin-7 (488) ble visualisert ved å bruke følgende innstillinger: utslippsbølgelengde, 525,0 nm; Eksitasjonsbølgelengde, 489,1 nm; Laserkraft, 5,0; Detektorøkning, PMT HV 12; PMT-forskyvning, 0. E-Cadherin (568) ble visualisert ved å bruke følgende innstillinger: utslippsbølgelengde, 595,0 nm; Eksitasjonsbølgelengde, 561,6 nm; Laserkraft, 13,5; Detektorøkning, PMT HV 45; PMT-offset, 0. Cx26 (647) ble visualisert ved å bruke følgende innstillinger: utslippsbølgelengde, 700,0; Eksitasjonsbølgelengde, 637,8; Laserkraft, 5,0; Detektorøkning, PMT HV 55; PMT offset, 0. Skalestenger = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Cx43, E-Cadherin og Claudin-7, men ikke Claudin-3, er involvert i et proteinkompleks. Cx43 ( A og B ) og E-Cadherin ( C ) ble immunpresipitert ved bruk av 500 mg totale lysater fra mammakirtler hos mus ved amming. IPer og lysater ble lastet i geler og overført på PVDF membraner. Fordi Claudin-7 og Claudin-3 har samme molekylvekt, kunne de ikke analyseres på samme membran. Således ble to parallelle IP'er utført med det samme lysatet for Cx43, lastet på to geler, og overført (membran A og B). Membran A ble først probet med Cx43 for å bekrefte effektiviteten til IP (topppanel). Deretter ble membranen sekventielt probet med E-Cadherin og Claudin-7. Western blot-analyse viste at de to proteinene interagerer med Cx43. Membran B ble først probet med Cx43 for å bekrefte effektiviteten til IP (toppanelet) og deretter probet med Claudin-3. Western blot-analyse viste at Claudin-3 dID ikke IP med Cx43, som viser at de to proteinene ikke samhandler. Membran C ble først probet med E-kadherin for å bekrefte effektiviteten til IP (toppanelet). Deretter ble membranen sekventielt probet med Cx43 og Claudin-7. Western blot-analyse bekreftet samspillet mellom proteinene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Cell-celle interaksjoner via krysser er nødvendig for riktig funksjon og utvikling av mange organer, som for eksempel brystkjertelen. Studier har vist at kryssproteiner kan regulere funksjonen og stabiliteten til hverandre og aktivere signaltransduksjon ved å knytte hverandre til cellemembranen ¹⁰ . Protokollene presentert i det nåværende manuskriptet har gitt interessante funn om kryssprotein differensial ekspresjon, lokalisering og interaksjon under normal utvikling av mursteinkjertelen ⁹ . Gitt at sammenkoblingsproteinlokalisering er kritisk for proteinens funksjon, og fordi de er kjent for å interagere med stillasproteiner og mange kinaser ³ , er co-IF og co-IP effektive teknikker innen celle-celle-interaksjoner. Ikke bare er disse metodene avgjørende for å opplyse nødvendigheten av knutepunktsutviklinger i utviklingen av brystkirtler og deres dyserRegulering i brystkreft, men de kan også brukes i andre vev og i eksperimenter ved bruk av cellelinjer.

Mammekirtlen består av to hovedrom: Stroma og epitel ⁴ . Det voksne epitelet er laget av to lag med celler. I denne tilnærmingen ble nærheten til de potensielle bindingspartner bestemt ved bruk av co-IF teknikken, og deres fysiske interaksjoner ble bekreftet ved bruk av co-IP. Co-IF har blitt brukt av andre til å demonstrere samlokalisering av proteiner innenfor samme vev, struktur, celle eller intracellulært rom ^{17 , 18} . Den største fordelen med denne teknikken er den visuelle informasjonen som fører til den cellulære eller subcellulære lokalisering av hvert protein i de forskjellige celletyper som komponerer vevet. Selv om denne teknikken er ganske enkel, må noen anbefalinger følges. For eksempel, for å unngå vevskader,Legg alltid løsningene en dråpe om gangen med en 200 μL pipette eller en overføringspipette. Dette vil tillate nedsenking av vevsoverflaten uten å skade vevet. På samme måte fjerner du løsningene ved hjelp av en Pasteur pipette plassert ved siden av vevet ved forsiktig å vippe lysbildet. Videre, for antistoffer hvis oppbevaringsoppløsning inneholder glyserol, er det nødvendig med forsiktig suging av vaskebufferne for å redusere bakgrunnen. Videre kan tilstedeværelsen av melkeproteiner, så som kaseiner, under amming forstyrre antistoffene ved å fange dem, noe som resulterer i falske positiver. En kritisk analyse av det resulterende bildet er således nødvendig, spesielt på dette stadiet.

Denne co-IF-teknikken har også visse begrensninger eller fallgruver. For det første krever det spesifikke antistoffer. Som nevnt tidligere (trinn 1.1), anbefales det å bruke en seksjon ( dvs. den på høyre side) på hvert lysbilde for farging ved å følge trinnene beskrevet ovenfor, legge tilPrimære og sekundære antistoffer sekvensielt. For den gjenværende delen ( dvs. den på venstre side), følg samme fremgangsmåte, ved bruk av TBS-polysorbat 20 0,1% i stedet for de primære antistoff-løsningene. Selv om det også er mulig, og enda bedre, å verifisere spesifikk binding av antistoffet ved hjelp av peptidkonkurranse, er peptider som brukes til å generere kommersielle antistoffer, ikke alltid tilgjengelige. Det er derfor viktig å verifisere bindingens spesifisitet ved å bruke positive og negative kontroller ( dvs. vev eller celler som er kjent for å uttrykke, eller ikke, proteinet av interesse). Videre kan antigenbindingssteder være utilgjengelige, spesielt for formalin-fikserte vev, og resulterer således i fravær av et spesifikt signal. En antigen-gjenfinningsprosedyre kan således være nødvendig for noen vev. En kort inkubasjon med vaskemiddel kan også utføres før antigen-gjenvinning for å permeabilisere cellemembranen. For det andre, for multipleksering, må antistoffer heves i forskjellige dyr.For eksempel, hvis anti-kanin ble brukt i trinn 1.2.6, kunne anti-mus velges i trinn 1.2.10, men ikke et annet antistoff hevet i kanin. Siden de fleste kommersielle antistoffer er oppvokst hos kaniner, mus eller geiter, er det noen ganger vanskelig eller umulig å målrette to proteiner samtidig på grunn av mangel på passende antistoffer. For å overvinne disse begrensningene kan man enten kjøpe kommersielt tilgjengelige, forhåndsmerkede antistoffer eller merke primære antistoffer med fluoroforer ved å bruke kommersielt tilgjengelige kits. For det tredje er en annen mangel knyttet til eksitering og utslipp av de forskjellige fluoroforene. For å unngå overlapping av signaler fra to forskjellige antistoffer, må excitasjons-utslippspektret for hver fluorofor skilles fra. Dermed kan antall mål som kan analyseres på en gang variere i henhold til konfigurasjonen av det tilgjengelige mikroskop. Til slutt er kvaliteten på analysen svært avhengig av det anvendte mikroskop. Mer detaljert og presis data kanOppnås ved bruk av et konfokalmikroskop sammenlignet med et epifluorescerende mikroskop. Bruken av superoppløsningsmikroskopi kan avsløre proteinsamlokalisering i enda mer detalj ¹⁹ .

Selv om co-IF bringer viktig innsikt om nærheten til potensielle bindende partnere, bør den suppleres med andre metoder for å identifisere fysiske interaksjoner mellom proteiner. Blant de tilgjengelige metodene er co-IP sannsynligvis en av de rimeligste å utføre, ettersom utstyret og materialet er lett tilgjengelig. Ved å bruke et antistoff bundet til magnetiske perler kan man isolere proteinkomplekser og identifisere komponentene som er til stede i det komplekset ved bruk av typisk Western blot-analyse. På samme måte som med IF, bør noen anbefalinger følges for beste praksis. For eksempel anbefales det å minimere prøvene ved homogenisering av vevet for å redusere tiden mellom trinnene 2.1.5 og 2.1.9. Mens en erfaren person kan behandle opptil 10 prøver på atIme, en nybegynner bør ikke håndtere mer enn 4-6 prøver. På samme måte bør antallet rør være begrenset når IP-protokollen utføres for første gang. Det anbefales å starte med en negativ kontroll ( dvs. IgG) og en positiv kontroll ( dvs. et vev kjent for å inneholde proteinet som skal immunoprecipiteres). Den andre rettssaken skal være dedikert til optimalisering (se trinn 2.2.2). Når disse trinnene gir tilfredsstillende resultater, kan prøver som skal analyseres behandles. Vær oppmerksom på at en negativ kontroll alltid skal inkluderes i prosedyren.

Denne IP-teknikken har også potensielle fallgruver. For det første krever det at vev blir homogenisert under forhold som tillater bevaring av forbindelsene mellom proteiner. For membranproteiner, så som kryssproteiner, er det også avgjørende å bruke en buffer som vil bevare bindingene mellom proteinene samtidig som de tillater oppløseligheten. For det andre, lik co-IF, krever det høy-affinitetsantistofferFor både målproteinet og bindingspartnerne. Dessuten, fordi proteiner forblir i deres tertiære konformasjon, og proteinkomplekser ikke dissosieres ved homogenisering, dersom antistoffet gjenkjenner en del av målproteinet som ligger i nærheten av bindingsdomene til en partner eller som er skjult inne i den native strukturen av proteinet , IP kan bli kompromittert. Det er således avgjørende å alltid verifisere effektiviteten til IP ved hjelp av Western blotting før man avslutter fraværet av en bindingspartner. For det tredje kan co-IP generere falske positive resultater på grunn av at proteinet enten binder direkte til perlene eller utfeller under prosessen uten å være en del av komplekset. For å identifisere disse artefakter, er det nødvendig med en IgG-kontroll, så vel som en gjensidig IP, som beskrevet i metodene som presenteres. Det er også mulig å legge til en "forrensing" -prosedyre mellom trinnene 2.2.2 og 2.2.3 for å unngå uspesifikk binding av proteiner til perlene. For å gjøre det, incubate thE lyserer med 50 μg perler i 1 time ved 4 ° C på en rulleblander. Fjern perlene med magnetisk stativ og fortsett til trinn 2.2.3. For det fjerde kan de tunge og lette kjedene av IgG være av samme størrelse som proteiner av interesse eller bindingspartner, og dermed maskere signalet. En løsning er å dissociere IgG-kjedene med glycin, som beskrevet i dette manuskriptet. Det er også mulig å kjøpe sekundære antistoffer som bare gjenkjenner native antistoffer og derfor ikke binder seg til den denaturerte lys og tunge kjeder som er lastet inn i membranen (se Materialetabellen ). De to metodene kan noen ganger kombineres. For det femte tillater co-IP identifisering av et begrenset antall bindingspartnere, delvis på grunn av antall antistoffer som kan probes på membranen. Det krever også forhåndsidentifikasjon av disse bindende partnere, enten ved co-IF eller gjennom en litteraturvurdering. Endelig tillater co-IP identifisering av proteinpresenetEnt i et kompleks, og ikke for den direkte interaksjon mellom to proteiner.

Resultatene fra co-IP kan analyseres på forskjellige måter. Det er mulig å bare identifisere samspillende partnere ved å prøve på samme membran med forskjellige antistoffer, som beskrevet i dette manuskriptet. Det er også mulig å kvantifisere denne interaksjonen. For å gjøre dette kvantifiseres mengden av proteinet som immunoprecipiteres først ved å probere membranen med et antistoff mot dette proteinet. Signalintensiteten analyseres ved hjelp av en bildebehandling programvare, som beskrevet i dette manuskriptet. Deretter re-probes membranen med et antistoff mot bindingspartneren, og signalintensiteten kvantifiseres også. Interaksjonene mellom de to proteinene kan da uttrykkes som et forhold av mengden av bindingspartneren til mengden av det immunpresipiterte protein. For å tillate sammenligning må de ulike prøvene behandles samtidig og lastes på samme membran. BiologIcal replikater kan videreføres og analyseres på samme måte, og statistisk analyse kan utføres.

I de siste årene har andre teknikker blitt utviklet for å analysere PPIer. FRET tillater for eksempel identifisering av interaksjonsproteiner gjennom energioverføring fra en merke til en annen, bare når proteinene er nær nok til å samhandle ²⁰ . Men fordi det krever at proteiner blir merket, kan denne teknikken ikke brukes i vev. På samme måte er det mulig å identifisere PPI med et protein fusjonert med en bakteriell biotinligase, BirA ²¹ . Denne ligasen vil legge biotin til proteiner som kommer i umiddelbar nærhet ( dvs. interaksjon) med det kimære proteinet. Mens denne metoden er innovativ og objektiv, kan den ikke utføres i vev. Alternativt kan PLA brukes i vev. På samme måte som co-IF, er denne analysen basert på antistoffaffinitet. For denne analysen er sekundære antistoffer merket med DNA-sekvenser thaT kan samhandle når de er i umiddelbar nærhet ( dvs. på PPIer) og danner et sirkulært DNA-molekyl ²² . Dette sirkulære DNA-molekylet blir så amplifisert og detektert ved bruk av fluorescensmerkede komplementære oligonukleotider. Selv om denne analysen er elegant, krever det mange valideringstrinn og er fortsatt avhengig av primær antistoffaffinitet og litt kunnskap om potensielle samspillende partnere. Endelig er et objektivt alternativ til den tradisjonelle IP-analysen også utviklet for å identifisere PPIer. I rask immunpresipitasjon-massespektrometri av endogene protein-analyser (RIME) analyseres IP-prøver ved massespektrometri (IP / MS) ²³ i stedet for Western blot-analyse. Hovedfordelen ved denne høye gjennomstrømmingsmetoden er at den gir massiv informasjon om alle endogene interaktive proteiner ved å bruke få materialer. Imidlertid krever det tilgang til et peptidsekvenseringsinstrument ²³ .

Det erDet er viktig å nevne at hvert trinn i denne protokollen etter flere foreløpige tester har blitt optimalisert for brystkjertelen. Metoden kan imidlertid sikkert brukes til andre organer etter noen få modifikasjoner. For co-IF ble den optimale temperaturen for brystkjertelseksjonering, egnet blokkering og vasking og oppløsning og de riktige antistoffkonsentrasjoner alle testet. For co-IP ble forskjellige lysis- og elueringsbuffere og ekstraksjonsmetoder også testet og har stor innvirkning på IP-suksess. Samlet sett er hvert trinn i denne protokollen viktig for å oppnå høy kvalitet og reproduserbare resultater med minst mulig bakgrunn og mest spesifisitet. Mens andre metoder er tilgjengelige, er co-IF etterfulgt av co-IP fortsatt gyldige og enkle metoder for å evaluere PPI. Disse to teknikkene kan brukes både i vev og i cellelinjer, og krever bare noen få valideringstrinn og kontroller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice strain and stage	St. Constant, Quebec, Canada		C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada
PBS 10x (stock)			1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water; 2) Adjust the PH to 7.4; 3) Add water to reach to the 1 L final volume.
TBS 10x (stock)			1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water; 2) Adjust the pH to 7.5; 3) Add water to reach to the 1 L final volume.
Part 1: Immunofluorescence
Freezing media	VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada	95067-840	VMR frozen sections compound
Microtome	Mississauga, ON, Canada	956640	Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
Blades	C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada	BLM1001C	High profile gold coated blades
Pap pen	Cedarlane, Burlington, ON, Canada	8899	Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slides	Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada	12-550-15	Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
Formaldehyde	BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada	FOR201.1	Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA)	Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution			3% BSA in TBS
Wash solution			TBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20	Oakville, ON, Canada	P 9416	Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting media	Cedarlane, Burlington, ON	17984-25(EM)	Fluoromount-G
First & secondary antibodies	Cell Signaling, Beverly, MA, USA	See Comments	E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling
First & secondary antibodies	Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA	See Comments	Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling)
First & secondary antibodies	Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada	See Comments	β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies	Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA	See Comments	Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s)
Nuclei stain	Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada	D1306	DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS
Fluorescent microscope	Nikon Canada, Mississauga, On, Canada		Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector
Software of IF images analysis	Nikon Canada, Mississauga, On, Canada		NIS-elements software (version 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0			1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O. 2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL). 3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitor	Fisher Scientific, Burlington, ON	78441	Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)
Protein dosage	Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA	23225	Pierce BCA protein assay kit
Tissue grinder	Fisher Scientific, Burlington, ON	FTH-115	Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and stand	Millipore, Etobicoke, ON, Canada		PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IP			PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitation	Cell Signaling, Beverly, MA, USA	See Comments	IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation	Cell Signaling, Beverly, MA, USA	See Comments	IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation	Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada	See Comments	Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation	Cell Signaling, Beverly, MA, USA	See Comments	E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL
Laemmli buffer	BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada	1610747	4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine	Fisher Scientific, Burlington, ON	PB381-5	0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl
Tris	Fisher Scientific, Burlington, ON	BP152-1	1 M (pH=8)
SDS-PAGE acrylamide gels	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1610180 -5	TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1704272	Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water
Membranes	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1704272	PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer method	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1704155	Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry Milk	Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada		Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots			5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blots			TBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)	Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada	See Comments	Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)	Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada	See Comments	E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)	Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada	See Comments	Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)	Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada	See Comments	Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blots	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1705061	Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blots	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1708280	ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blots	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada		ImageLab 5.2 software