Summary
Intercellulära korsningar är nödvändiga för bröstkörtelns specifika funktioner och utveckling. Detta manuskript ger ett detaljerat protokoll för studier av protein-protein-interaktioner (PPI) och samlokalisering med användning av murina bröstkörtlar. Dessa tekniker möjliggör undersökning av dynamiken i den fysiska kopplingen mellan intercellulära korsningar vid olika utvecklingsstadier.
Abstract
Cellcellsinteraktioner spelar en central roll för att bevara vävnadsintegriteten och barriären mellan de olika avdelningarna i bröstkörteln. Dessa interaktioner tillhandahålls av föreningsproteiner som bildar nexuser mellan intilliggande celler. Junctional protein mislokalisering och reducerade fysiska föreningar med sina bindande partner kan resultera i förlust av funktion och följaktligen organ dysfunktion. Identifiering av proteinlokalisering och protein-protein-interaktioner (PPI) i normala och sjukdomsrelaterade vävnader är således väsentlig för att hitta nya bevis och mekanismer som leder till utvecklingen av sjukdomar eller förändringar i utvecklingsstatus. Detta manuskript presenterar en tvåstegsmetod för att utvärdera PPI i murina bröstkörtlar. I protokollsektion 1 beskrivs en metod för att utföra co-immunofluorescens (co-IF) med användning av antikroppar upptagna mot proteiner av intresse följt av sekundära antikroppar märkta med fluorokrom. Även om co-IF allaOws för demonstration av närheten av proteinerna, gör det möjligt att studera deras fysiska interaktioner. Därför tillhandahålls ett detaljerat protokoll för samimmunutfällning (co-IP) i protokollavsnitt 2. Denna metod används för att bestämma de fysiska interaktionerna mellan proteiner, utan att bekräfta om dessa interaktioner är direkta eller indirekta. Under de senaste åren har co-IF och co-IP-tekniker visat att vissa komponenter i intercellulära korsningar samlokaliserar och interagerar tillsammans, vilket skapar stegberoende förbindelser som varierar under utveckling av bröstkörteln.
Introduction
Mammakörtelns tillväxt och utveckling sker huvudsakligen efter födseln. Detta organ ombygger sig hela tiden under det reproduktiva livet hos ett däggdjur 1 . Det vuxna bröstkörtelepitelet består av ett inre lager av luminala epitelceller och ett yttre lager av basalceller, huvudsakligen sammansatta av myopiteliala celler omgivna av ett källarmembran 2 . För en bra översyn av bröstkörtelstrukturen och utvecklingen kan läsaren hänvisa till Sternlicht 1 . Cellcellsinteraktioner via gap (GJ), tight (TJ) och adherens (AJ) -förbindelser är nödvändiga för normal utveckling och funktion hos körtelen 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Huvudkomponenterna hos dessa korsningar i den murina bröstkörteln är Cx26, Cx30, Cx32 och Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 och -7 ochZO-1 (TJ); Och E-kadherin, P-kadherin och P-katenin (AJ) 7 , 8 . Expressionsnivåerna för dessa olika föreningsproteiner varierar på ett stadiumberoende sätt under utveckling av bröstkörteln, vilket föreslår differentialcellcell-interaktionskrav 9 . GJ, TJ och AJ är kopplade strukturellt och funktionellt och binda andra strukturella eller regulatoriska proteiner till de intilliggande sidorna av intilliggande celler, vilket därigenom skapar en samverkande nexus 10 . Sammansättningen av föreningsnekroppen kan påverka överbryggning med den underliggande cytoskeleten, såväl som nexuspermeabilitet och stabilitet, och kan följaktligen påverka funktionen hos körteln 8 , 9 , 10 , 11 . Komponenterna i intercellulära klyftor som är bosatta i förbindelserna eller interagerar med varandra vid difFerenta utvecklingsstadier av bröstkörtelutveckling analyserades nyligen med användning av co-immunofluorescens (co-IF) och samimmunutfällning (co-IP) 9 . Medan andra tekniker tillåter utvärdering av den funktionella associationen mellan proteiner, presenteras dessa metoder inte i detta manuskript.
Eftersom proteiner bara fungerar ensamma för att fungera är det viktigt att studera protein-protein-interaktioner (PPI), såsom signaltransduktioner och biokemiska kaskader, för många forskare och kan ge betydande information om proteins funktion. Co-IF och mikroskopisk analys hjälper till att utvärdera några proteiner som delar samma subcellulära utrymme. Antalet mål är emellertid begränsat av antikropparna, vilket måste höjas i olika djur och genom tillträdet till ett konfokalt mikroskop utrustad med olika våglängdslaser och en spektral detektor för multiplexering. Co-IP bekräftar eller avslöjar fysiska interaktioner med hög affinitet betwEn två eller flera proteiner som ligger inom ett proteinkomplex. Trots utvecklingen av nya tekniker, såsom fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) 12 och närhetsligationsanalys (PLA) 13 , som samtidigt kan detektera lokalisering och interaktioner av proteiner, är co-IP en lämplig och överkomlig teknik för att studera interaktioner mellan Endogena proteiner.
Den steg-för-steg-metod som beskrivs i detta manuskript kommer att underlätta studiet av proteinlokalisering och PPI och peka ut fallgropar för att undvika när man studerar endogena PPI i bröstkörtlarna. Metoden börjar med presentation av de olika bevarandeförfarandena för de vävnader som krävs för varje teknik. I del 1 presenteras hur man studerar proteinsamlokalisering i tre steg: i) delning av bröstkörtlar, ii) dubbel- eller trippelmärkning av olika proteiner med hjälp av co-IF-tekniken, och iii) avbildning avProtein lokalisering. Del 2 visar hur man utfäller ett endogent protein och identifierar dess interaktiva proteiner i tre steg: i) lysatpreparation, ii) indirekt proteinimmunutfällning, och iii) bindningspartneridentifikation genom SDS-PAGE och Western blot. Varje steg i detta protokoll är optimerat för bröstmjölkvävnadsvävnader och genererar högkvalitativa, specifika och reproducerbara resultat. Detta protokoll kan också användas som utgångspunkt för PPI-studier i andra vävnader eller cellinjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprotokoll som användes i denna studie godkändes av University Animal Care Committee (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Kanada).
1. Identifiering av Protein Co-lokalisering
- Från vävnad till mikroskopiska diabilder
OBS! Vävnader och sektioner ska hanteras på torris.- Accisera bröstkörtlarna från ett djur (för en fullständig beskrivning av denna procedur, se Plante et al. ) 14 .
- Bädda in excised vävnad i frys / monteringsmedium på torris. Lägg till tillräckligt med medium för att täcka körteln. När mediet är stelnat, överför vävnaderna till en frys vid -80 ° C för senare användning 9 .
- Använd en kryomikrotom som sätts vid ≤ -35 ° C, skär vävnaderna i 7-10 μm tjocka sektioner och placera dem på mikroskopglas.
OBS! Placera om möjligt två avsnitt på varje bild. Den vänstra sektionen kommer att användas som enEgativ kontroll för att verifiera antikroppens specificitet och vävnadens autofluorescens, medan höger sida kommer att märkas med antikropparna. - Håll avdelningarna vid -80 ° C för senare användning.
- Co-IF-färgning
- Hämta lämpliga mikroskopiska diabilder från frysen och omedelbart fixa sektionerna genom att nedsänka dem i formaldehyd 4% i 15 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Därefter sänk gliderna i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid RT. Lämna bilderna i PBS vid RT tills du går vidare till nästa steg.
- Cirkla varje sektion av bilden med en kommersiellt tillgänglig hydrofob barriär eller en vattenavvisande labpenna (se Materialetabell ). Var försiktig så att du inte rör på vävnaden. Lägg omedelbart droppar av PBS till vävnaden och placera gliden i en fuktig histologi kammare för återstoden av proceduren.
OBS! Vävnadssektionerna måste förbli fuktiga. AlternativAnvänd en låda med lock och placera våta pappershanddukar på botten. - Blockera varje vävnadssektion med 100-200 μl 3% bovint serumalbumin (BSA) -Trisbuffrad saltlösning (TBS) -0,1% polysorbat 20 (se Materialetabell ) under 30 minuter vid RT. Medan proverna blockerar, förbereder de primära och sekundära antikroppslösningarna genom att späda antikropparna i TBS-0,1% polysorbat 20.
OBS: Den erforderliga koncentrationen för antikroppen tillhandahålls av tillverkaren. Se materialet och figurerna 1 och 2 för exempel, liksom Dianati et al. 9 . Även om det inte är nödvändigt att arbeta i mörkret när man använder de flesta fluoroforkonjugerade antikropparna, undviker att utsätta antikroppslösningarna eller färgade vävnader för intensivt, starkt ljus. - Ta bort blockeringslösningen genom aspiration och inkubera sektionerna i 100-200 μl av den utspädda primära antikroppen under 60 minuter vid RT. AlternativelY inkubera med den primära antikroppen över natten vid 4 ° C.
- Ta bort den primära antikroppslösningen genom aspiration och tvätta sektionerna med 250-500 μl TBS-0,1% polysorbat 20 i 5 min. Avlägsna tvättlösningen genom aspiration och upprepa tvätten två gånger.
- Avlägsna tvättlösningen genom aspiration och inkubera sektionerna med 100-200 | il av den lämpliga fluorofor-konjugerade sekundära antikroppen under 60 minuter vid RT.
- Ta bort den sekundära antikroppslösningen genom aspiration och tvätta sektionerna med 250-500 μl TBS-0,1% polysorbat 20 i 5 min. Ta bort tvättlösningen och upprepa två gånger.
- Upprepa steg 2.5-2.8 med användning av lämplig kombination av primära och sekundära antikroppar för det efterföljande proteinet / proteinerna av intresse.
- Ta bort tvättlösningen genom aspiration och utföra kärnfärgen genom att inkubera sektionen med 100-200 | il av 1 mg / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i TBS-0,1% polysorbat 20 under 5 min vidRT.
- Ta bort DAPI-lösningen genom att suga upp och montera glidorna med ett vattenlösligt, icke-fluorescerande monteringsmedium (se materialet ) och täckglas. Fortsätt en bild i taget.
OBS! Inkubation av kärnfärgen i mer än 5 min kommer inte att ändra färgens intensitet. Alternativt, ta bort DAPI-lösningen på alla diabilder och inkubera vävnaderna i PBS när du monterar diabilden. - Placera objektglasen i ett 4 ° C-kylskåp i minst 8 timmar. Fortsätt till fluorescensmikroskopisk avbildning (se figurerna 1 och 2 ).
- Mikroskopisk bildbehandling
- Visualisera de fluoroforkonjugerade sekundära antikropparna med hjälp av ett konfokalt mikroskop utrustad med de olika lasrarna som krävs för att excitera fluoroforerna vid deras specifika våglängder.
Obs! För att kunna visualisera kanaler och alveoler föreslås ett 40X-objekt med en numerisk öppning på 0,95. En provplE för de specifika inställningarna finns i figur 1 . - Verifiera lokaliseringen av varje protein individuellt genom att skanna bilden en våglängd vid den tiden.
Obs! I detta skede är det viktigt att kritiskt analysera lokaliseringen av samlingsproteinerna. För att kunna bilda knutpunktsintervall måste dessa proteiner lokaliseras vid plasmamembranet. - Bestäm samlokalisering av proteiner genom att slå samman bilderna som är skannade med lasrarna vid olika våglängder.
Obs! Proteinsamlokalisering kan visualiseras genom färgförändring som härrör från utsläpp av två eller flera fluoroforer på samma plats och kan mätas med hjälp av lämplig programvara (figurerna 1 och 2 , se även referens 9).
- Visualisera de fluoroforkonjugerade sekundära antikropparna med hjälp av ett konfokalt mikroskop utrustad med de olika lasrarna som krävs för att excitera fluoroforerna vid deras specifika våglängder.
2. Studera PPI
OBS: Magekörtlar i buken bör användas för att studera PPI, eftersom bröstkörtlarna är i nära anslutning till pectoralmuskler. Uppskatta bröstkörtlarna (för en fullständig beskrivning av detta förfarande, se Plante et al .) 14 och förvara dem vid -80 ° C för senare användning.
- Lysatberedning
- Placera vägningspapper och 2 ml mikrocentrifugrör på torris för att förkyla dem innan du fortsätter med nästa steg.
- Ta bröstkörtelvävnaden från -80 ° C och håll dem på torris.
- Väg vävnaderna på de förkylda vikningsdokumenten och överför sedan vävnaden till 2 ml mikrocentrifugrör (hantera på torris). Använd mellan 50 och 100 mg vävnad per prov. Håll vävnaden på torris tills steg 2.1.5.
- Förbered den önskade mängden triple detergent lysisbuffert kompletterad med NaF, NaVO 3 och proteas / fosfatashämmare, såsom anges i Materialet , med användning av följande formler. Möss: krävs buffert (μL) = musvävnadsvikt (mg) x 3; Råtta: krävsBuffert (μL) = råttvävnadsvikt (mg) x 5.
- Tillsätt den önskade mängden iskall lysbuffert (beräknad i steg 2.1.4) till 2 ml röret som innehåller vävnaden.
OBS! I steg 2.1.5-2.1.6 fortsätt med ett enda rör i taget. - Homogenisera vävnaden i 30-40 s med användning av kontinuerlig homogenisering på en vävnadsslipmaskin; Håll alltid röret på is. Justera vävnadshomogenisatorn till medellång hastighet och rör försiktigt kvar kvar och ner i röret.
- Upprepa steg 1.6 och 1.7 med de andra rören.
- Inkubera lysaten på is i 10-30 minuter.
- Centrifugera rören vid 170 xg i 10 minuter vid 4 ° C.
- Under tiden identifiera 6-10 mikrocentrifugrör (0,6 ml) för varje prov och håll dem på is.
- När centrifugeringen är klar, kontrollera rören. Se till att de innehåller ett översta lager av fett, klara, gul-till-rosa lysater (beroende på utvecklingsstadiet) och en pellets.
- Skapa ett hål i lipidskiktetMed en 200-liters pipettspets för att komma åt vätskefasen. Byt spetsen och samla lysatet utan att störa pelleten eller aspirera lipidskiktet. Aliquot lysatet i förmärkta rör på is (steg 2.1.11) och förvara dem vid -80 ° C.
- Använd en alikvot för att kvantifiera proteinkoncentrationen med användning av ett lämpligt kommersiellt tillgängligt kit (se Materialetabell ).
- Indirekt immunutfällning
- På is tinas två alikvoter av de totala bröstkörtellysaten som framställts tidigare.
OBS: En alikvot kommer att användas för målproteinets IP, medan den andra kommer att fungera som den negativa kontrollen. - Samla 500-1000 μg av lysatet och späd det i PBS för att nå en slutlig volym av 200 μl i varje 1,5 ml rör.
OBS: Mängden lysat som ska användas beror på proteinets överflöd av intresse och effektiviteten hos antikroppen (se figur 3 för enN exempel, samt materialet ). För att optimera för varje mål bör olika mängder lysat ( dvs 500, 750 och 1000 μg) och antikropp ( dvs 5, 10 och 20 μg) användas. Fortsätt med följande steg (2.2.3-2.3.7.4). - Lägg antikroppen mot antigenet av intresse för det första lysatröret och håll det på is.
OBS! Den nödvändiga mängden föreslås vanligtvis på instruktionsbladet som tillhandahålls av varje företag (se materialet ). - I det andra röret, förbereda en negativ kontroll genom tillsats av samma koncentration av isotyp IgG-kontroll som antikroppen använd i steg 2.2.3.
- Inkubera rören över natten vid 4 ° C på en rörrulleblandare med låg hastighet.
- Följande dag, tillsätt 50 μL magnetiska pärlor till nya 1,5 ml rör för förtvätt.
- Välj antingen magnetiska pärlor av protein A eller protein G baserat på den relativa affiniteten till antikroppen. Det är viktigt att undvika att använda aggregerade pärlor; Blanda pärlsuspensionen försiktigt tills den är jämt uppslagen innan den läggs till rören.
- Placera rören som innehåller pärlorna på magnetstativet och låt pärlorna migrera till magneten. Ta bort lagringsbufferten från pärlorna med en 200 μl pipett.
- Tvätta pärlorna genom att tillsätta 500 pi PBS-0,1% polysorbat 20 och virvela rören kraftigt under 10 s.
- Sätt rören på magnetstativet och låt pärlorna migrera till magneten.
- Avlägsna överskottstvättbufferten genom pipettering med en 200 pl pipett.
- Tillsätt reaktionskomplexet (lysat-antikropp) från steg 2.2.5 till pärlorna och inkubera i 90 minuter vid RT på valsblandaren.
- Placera rören på magnetstativet och låt pärlorna migrera till magneten. Använd en 200 μL pipett, aspirera och kassera lysatet och placera rören på is.
- Tvätta pärlanS genom att tillsätta 500 | j, l PBS, placera rören på magnetstativet och avlägsna vätskan med en 200 pl pipett. Upprepa detta tvättsteg. Under tvättstegen, undvik vortexing och behåll proverna på is.
- Tvätta pärlorna en gång med PBS-0,1% polysorbat 20 utan vortexering och kassera den sista tvättbufferten med en 200 μl pipettspets.
- För eluering tillsätt 20 μL 0,2 M sur glycin (pH = 2,5) till rören och skaka dem i 7 minuter på rullblandaren.
- Centrifugera med hög hastighet i några sekunder (snabbvridning) och samla supernatanten i ett nytt iskallt rör.
- Upprepa steg 2.2.14 och 2.2.15 för varje rör.
OBS: Slutvolymen blir 40 μL. - Tillsätt 10 μl 4 x Laemmli-buffert till det 40 μl eluerade provet från steg 2.2.16.
OBS! Färgen blir gul på grund av det sura pH-värdet. - Lägg omedelbart 1 M Tris (pH = 8), en droppe i taget, till det eluerade provet från steg 2.2.18 tills dess färgBlir blå. Fortsätt till nästa rör.
- Koka provet från steg 2.2.18 vid 70-90 ° C i 10 min. Fortsätt genast till gelelektrofores. Alternativt överför proven till en frys vid -80 ° C tills den laddas.
- På is tinas två alikvoter av de totala bröstkörtellysaten som framställts tidigare.
- Nedströmsapplikation: gelelektrofores följt av Western blot
- Förbered separering och stapling av SDS-PAGE akrylamidgeler (1,5 mm tjocklek) enligt standardprocedurer 15 .
OBS: Valet av gel (8-15% akrylamid, gradient: se materialet ) bör bestämmas baserat på molekylstorleken hos proteinet som skall utfällas och av de potentiella bindande partner som ska analyseras. Dessa proteiner måste lösas från varandra för att möjliggöra korrekt immunodetektion. - Tina immunoprecipitation (IP) -eluerade prov (steg 2.2.20) på is.
- Beredda proteinlysater från samma prov (används för IP-proceduren ovan). Använd 50Μg total lysat och tillsätt 4X Laemmli provbuffert. Koka provet vid 70-90 ° C i 5 minuter och lägg på is tills det laddas.
OBS: Dessa prover laddas bredvid det eluerade IP-provet för att visa närvaron av utfällda proteiner i det totala lysatet. - Ladda de beredda lysaten från steg 2.3.3 och de utfällda proven från steg 2.2.20 sida vid sida i en akrylamidgel och kör dem i löpande buffert (10x löpande buffert: 30,3 g Tris, 144,1 g glycin och 10 G SDS i 1 liter destillerat vatten) vid 100 V under approximativt 95 min eller tills kanten av de migrerande proteinerna når gelens botten.
- Överför gelerna till ett nitrocellulosa eller PVDF-membran med hjälp av ett standardprotokoll 9 , 15 .
- Blockera membranet i 1 h på en vippare med låg hastighet i 5% torr mjölk-TTBS (20 mM Tris, 500 mM NaCl och 0,05% polysorbat 20).
- Identifiera huruvida nederbörden var succégångsrika.
- Probe membranet med den första antikroppen mot det utfällda proteinet, utspätt i 5% torrmjölk-TTBS vid den koncentration som rekommenderas av tillverkaren, över natten vid 4 ° C på en vågplattform med långsam omröring.
OBS: Se materialet för rekommendationer. - Följande dag, tvätta membranet 3 gånger i 5 min vardera med TTBS på en vågplattform med hög omrörning.
- Inkubera membranet i den lämpliga sekundära antikroppen konjugerad med pepparrotperoxidas (HRP), utspädd i TTBS, i 1 timme vid RT på en vågplattform med långsam omröring.
OBS: Alternativt kan en sekundär antikropp konjugerad med en fluorokrom användas om en lämplig apparat för att detektera signalen är tillgänglig. - Utför 3 till 6 tvättar, var 5: e minut, med TTBS på en vågplattform med hög omrörning. Analysera signalen hos den sekundära antikroppen genom att inkubera membranet med en kommersiellt aTillgänglig luminollösning (se materialet ) och följ tillverkarens anvisningar. Upptäck signalen med hjälp av ett kemiluminescensavbildningssystem (se materialet ).
OBS! För ett detaljerat protokoll om Western blot-analys, se Referens 16.
- Probe membranet med den första antikroppen mot det utfällda proteinet, utspätt i 5% torrmjölk-TTBS vid den koncentration som rekommenderas av tillverkaren, över natten vid 4 ° C på en vågplattform med långsam omröring.
- För att identifiera interaktiva proteiner, utför steg 2.3.7.1-2.3.7.4 med hjälp av lämpliga antikroppar på samma blöt.
OBS! Om proteiner interagerar kommer bindningspartnerna att vara samimmunutfällda med målproteinet och kommer därmed att detekteras genom Western blotting. Steg 2.3.8 kan upprepas med fler antikroppar för att bestämma om andra proteiner bor i samma proteinkomplex, så länge som molekylvikterna hos proteinerna skiljer sig tillräckligt för att vara väl separerade på gelén och membranet. - För att bekräfta att de identifierade bindande parterna inte är artefakter bör ömsesidig IP utföras.
OBS: Detta utförs genom att upprepaSteg 2.2.1-2.2.20 med samma lysat men utfällning av en av bindningspartnersna identifierade i steg 3.8. Därefter upprepas steg 3.1-3.8 med användning av den primära antikroppen mot det första proteinet av intresse.
- Förbered separering och stapling av SDS-PAGE akrylamidgeler (1,5 mm tjocklek) enligt standardprocedurer 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bestämma huruvida GJ, AJ och TJ-komponenter kan interagera ihop i bröstkörteln genomfördes co-IF-analyser först. Cx26, ett GJ-protein och β-Catenin, ett AJ-protein, undersöktes med specifika antikroppar och avslöjades med användning av fluorofore-konjugerade mus-647 (grön, pseudokolor) respektive get-568 (röda) antikroppar ( Figur IB och C ) . Data visade att de co-lokaliseras vid cellmembranet i epitelceller i muskörtelkörteln på laktationsdag 7 (L7), vilket återspeglas av den gula färgen ( Figur 1D ). För det andra, Claudin-7, ett TJ-protein; E-cadherin, ett AJ-protein; Och Connexin26 (Cx26), ett GJ-protein, undersöktes med sina specifika antikroppar och avslöjades med fluorofore-konjugerade kanin-488 (gröna), mus-555 (röda) respektive mus-647 (koralblåa, pseudocolor) antikroppar ( Figur 2B-D ). E-cadherin och Claudin-7 co-lokalisering ärVisas som en gul-till-ljus-orange färg, medan Cx26-co-lokalisering med E-cadherin och Claudin-7 resulterade i vit punkterad färgning hos muse-bröstkörtlar på graviditetsdagen 18 (P18) ( Figur 2E ).
För att ta reda på vilka föreningsproteiner som blandar sig och fysiskt sammanbindas vid cellmembranet utfördes samimmunutfällning med användning av bröstkörtelvävnader från lakterande möss (L14). Resultaten visade att Cx43, en komponent i GJ, interagerar med E-Cadherin och Claudin-7, men inte med Claudin-3 ( Figur 3A och B ). Dessa resultat bekräftades av den ömsesidiga IP; När E-Cadherin immunoprecipiterade, interagerades det med Cx43 och Claudin-7 ( Figur 3C ).
Figur 1: P-Catenin och Cx26 co-lokaliseras vid cellmembranetRane i möss bröstkörtlar. Kryosektioner från bröstkörtlar hos möss vid lakteringsdag 7 (L7) skars (7 μm) och behandlades för immunofluorescerande färgning. ( A ) Nuclei färgades med DAPI (blå). ( B ) Cx26 (grön, pseudokolor) och ( C ) P-Catenin (röd) visas kombinerade med lämpliga fluoroformärkta antikroppar. ( D ) En sammanslagd bild. Bilder erhölls med ett konfokalt mikroskop utrustad med en spektral detektor. DAPI visualiserades med hjälp av följande inställningar: utsläppsvåglängd, 450,0 nm; Excitationsvåglängd, 402,9 nm; Laserkraft, 1,2; Detektorförstärkning, PMT HV 100; PMT-offset, 0. Cx26 (647) visualiserades med användning av följande inställningar: utsläppsvåglängd, 700,0 nm; Excitationsvåglängd, 637,8 nm; Laserkraft, 2,1; Detektorförstärkning, PMT HV 110; PMT-förskjutning, 0-Catenin (568) visualiserades med användning av följande inställningar: utsläppsvåglängd, 595,0 nm; Excitationsvåglängd, 561,6 nm; laserKraft, 2,1; Detektorförstärkning, PMT HV 110; PMT-offset, 0. Skalstänger = 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Connexin26 (Cx26), E-cadherin och Claudin-7 co-lokaliseras vid cellmembranet i mössbröstkörtlar. Kryosektioner från bröstkörtlar på graviditetsdag 18 (P18) skars (7 μm) och behandlades för immunofluorescerande färgning med användning av ( B ) Claudin-7 (grön), ( C ) E-Cadherin (röd) och ( D ) Cx26 Blå, pseudokolor), i kombination med lämpliga fluoroforemärkta antikroppar. ( A ) Nuclei färgades med DAPI (blå). Bilder erhölls med ett konfokalt mikroskop utrustad med en spektral detektor. DAPI visualiserades med hjälp av fOllowing inställningar: emissionsvåglängd, 450,0 nm; Excitationsvåglängd, 402,9 nm; Laserkraft, 5,4; Detektorförstärkning, PMT HV 65; PMT-offset 0. Claudin-7 (488) visualiserades med användning av följande inställningar: emissionsvåglängd, 525,0 nm; Excitationsvåglängd, 489,1 nm; Laserkraft, 5,0; Detektorförstärkning, PMT HV 12; PMT-offset, 0. E-Cadherin (568) visualiserades med användning av följande inställningar: emissionsvåglängd, 595,0 nm; Excitationsvåglängd, 561,6 nm; Laserkraft, 13,5; Detektorförstärkning, PMT HV 45; PMT-offset 0. Cx26 (647) visualiserades med användning av följande inställningar: emissionsvåglängd, 700,0; Excitationsvåglängd, 637,8; Laserkraft, 5,0; Detektorförstärkning, PMT HV 55; PMT-offset, 0. Skalstänger = 50 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Cx43, E-Cadherin och Claudin-7, men inte Claudin-3, är involverade i ett proteinkomplex. Cx43 ( A och B ) och E-Cadherin ( C ) immunoprecipiterade med användning av 500 mg totalt lysat från muggkörtlar hos möss vid laktation. IPs och lysater laddades i geler och överfördes på PVDF-membran. Eftersom Claudin-7 och Claudin-3 har samma molekylvikt, kunde de inte analyseras på samma membran. Således utfördes två parallella IPs med samma lysat för Cx43, laddades på två geler och överfördes (membran A och B). Membran A undersöktes först med Cx43 för att bekräfta effektiviteten hos IP (topppanel). Sedan undersöktes membranet sekventiellt med E-Cadherin och Claudin-7. Western blot-analys visade att de två proteinerna interagerar med Cx43. Membran B testades först med Cx43 för att bekräfta effektiviteten hos IP (toppanelen) och sedan probed med Claudin-3. Western blot-analys visade att Claudin-3 dId inte IP med Cx43, vilket visar att de två proteinerna inte interagerar. Membran C testades först med E-kadherin för att bekräfta effektiviteten hos IP (toppanel). Sedan undersöktes membranet sekventiellt med Cx43 och Claudin-7. Western blot-analys bekräftade interaktionerna mellan proteinerna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellcellsinteraktioner via korsningar krävs för korrekt funktion och utveckling av många organ, såsom bröstkörteln. Studier har visat att föreningsproteiner kan reglera funktionen och stabiliteten hos varandra och aktivera signaltransduktion genom att binda varandra i cellmembranet 10 . De protokoll som presenteras i det nuvarande manuskriptet har gett intressanta funderingar om kopplingsproteinskillnadsuttryck, lokalisering och interaktion under normal utveckling av murkörteln 9 . Med tanke på att kopplingsproteinlokalisering är kritisk för proteins funktion, och eftersom de är kända för att interagera med ställningsproteiner och många kinaser 3 , är co-IF och co-IP effektiva tekniker inom cellcellsinteraktioner. Dessa metoder är inte bara nödvändiga för att upplysa nödvändigheten av sammandragande nexus i utvecklingen av magsjukdomar och deras dyserReglering i bröstcancer, men de kan också användas i andra vävnader och i experiment som använder cellinjer.
Bröstkörteln består av två huvudfack: stroma och epitel 4 . Vuxenepitelet är tillverkat av två lager av celler. I detta tillvägagångssätt bestämdes närheten hos de potentiella bindande partnerna med användning av co-IF-tekniken, och deras fysiska interaktioner bekräftades med användning av co-IP. Co-IF har framgångsrikt använts av andra för att visa samlokalisering av proteiner inom samma vävnad, struktur, cell eller intracellulärt fack 17 , 18 . Den huvudsakliga fördelen med denna teknik är den visuella informationen som det medför cell- eller subcellulär lokalisering av varje protein inom de olika celltyperna som komponerar vävnaden. Även om denna teknik är ganska enkel, måste vissa rekommendationer följas. Till exempel för att undvika vävnadsskador,Lägg alltid lösningarna en droppe åt gången med en 200 μL pipett eller en överföringspipett. Detta kommer att tillåta nedsänkning av vävnadsytan utan att skada vävnaderna. På samma sätt avlägsna lösningarna med en Pasteur pipette placerad bredvid vävnaderna genom att luta glidningen försiktigt. För antikroppar, vars lagringslösning innehåller glycerol, krävs dessutom noggrann sugning av tvättbuffertarna för att minska bakgrunden. Vidare kan närvaron av mjölkproteiner, såsom kaseiner, under laktation interferera med antikropparna genom att fånga dem, vilket resulterar i falska positiva effekter. En kritisk analys av den resulterande bilden krävs således, speciellt i detta skede.
Denna co-IF-teknik har också vissa begränsningar eller fallgropar. För det första kräver det specifika antikroppar. Som tidigare nämnts (steg 1.1) rekommenderas att man använder en sektion ( dvs. den på höger sida) på varje bildruta för färgning enligt de ovan beskrivna stegen, och lägger tillPrimära och sekundära antikroppar i följd. För den återstående delen ( dvs. den på vänster sida), följ samma procedur, med TBS-polysorbat 20 0,1% i stället för de primära antikroppslösningarna. Även om det också är möjligt, och ännu bättre, att verifiera antikroppens specifika bindning med hjälp av peptidkonkurrens, är inte peptider som används för att generera kommersiella antikroppar alltid tillgängliga. Det är således viktigt att verifiera bindningens specificitet med hjälp av positiva och negativa kontroller ( dvs vävnader eller celler som är kända att uttrycka, eller inte, proteinet av intresse). Vidare kan antigenfixeringsställen vara otillgängliga, speciellt för formalin-fixerade vävnader, vilket resulterar i frånvaro av en specifik signal. Ett antigenhämtningsförfarande kan sålunda krävas för vissa vävnader. En kort inkubation med detergent kan också utföras före antigenhämtning för att permeabilisera cellmembranet. För det andra, för multiplexering måste antikroppar höjas i olika djur.Om till exempel anti-kanin användes i steg 1.2.6 kan anti-mus väljas i steg 1.2.10, men inte en annan antikropp upphöjd i kanin. Eftersom de flesta kommersiella antikroppar uppkommer på kaniner, möss eller getter, är det ibland svårt, eller till och med omöjligt, att rikta två proteiner samtidigt på grund av bristen på lämpliga antikroppar. För att övervinna dessa begränsningar kan man antingen köpa kommersiellt tillgängliga, för-märkta antikroppar eller märka primära antikroppar med fluoroforer med användning av kommersiellt tillgängliga kit. För det tredje är en annan brist kopplad till excitering och utsläpp av de olika fluoroforerna. För att undvika överlappning av signalerna från två olika antikroppar måste excitations-emissionsspektret för varje fluorofor separeras. Således kan antalet mål som kan analyseras på en gång variera beroende på konfigurationen av det tillgängliga mikroskopet. Slutligen är kvaliteten på analysen starkt beroende av det använda mikroskopet. Mer detaljerad och exakt data kanErhållas med användning av ett konfokalt mikroskop jämfört med ett epifluorescerande mikroskop. Användningen av superresolutionmikroskopi kan avslöja proteinsamlokalisering i ännu mer detalj 19 .
Även om co-IF ger viktiga insikter om närheten av potentiella bindande partners bör den kompletteras med andra metoder för att identifiera fysiska interaktioner mellan proteiner. Bland de tillgängliga metoderna är co-IP antagligen en av de mest prisvärda att utföra, eftersom utrustningen och materialet är lättillgängliga. Med användning av en antikropp bunden till magnetiska pärlor kan man isolera proteinkomplex och identifiera komponenterna närvarande i det komplexet med användning av typisk Western blot-analys. På samma sätt som med IF bör vissa rekommendationer följas för bästa praxis. Det rekommenderas till exempel att minimera proverna vid homogenisering av vävnaderna för att minska tiden mellan steg 2.1.5 och 2.1.9. Medan en erfaren person kan bearbeta upp till 10 prov vidIme, en nybörjare ska inte hantera mer än 4-6 prov. På samma sätt bör antalet rör vara begränsade när IP-protokollet utförs för första gången. Det rekommenderas att man börjar med en negativ kontroll ( dvs. IgG) och en positiv kontroll ( dvs. en vävnad som är känd att innehålla proteinet som ska immunoprecipiteras). Den andra försöket ska vara tillägnad optimering (se steg 2.2.2). Så snart dessa steg ger tillfredsställande resultat kan prover som analyseras bearbetas. Observera att en negativ kontroll alltid ska ingå i proceduren.
Denna co-IP-teknik har också potentiella fallgropar. För det första kräver det att vävnader homogeniseras under betingelser som möjliggör bevarande av kopplingarna mellan proteiner. För membranproteiner, såsom kopplingsproteiner, är det också avgörande att använda en buffert som bevarar bindningarna mellan proteinerna samtidigt som de tillåter deras löslighet. För det andra, liknande co-IF, krävs det högaffinitetsantikropparFör både målproteinet och bindningspartnerna. Dessutom, eftersom proteiner förblir i deras tertiära konformation och inte dissocieras proteinkomplex genom homogenisering, om antikroppen igenkänner en del av målproteinet som ligger i närheten av bindningsdomänen hos en partner eller som är gömd inuti proteinets ursprungliga struktur , IP kan äventyras. Det är således viktigt att alltid verifiera effektiviteten hos IP med Western Blotting innan man avslutar frånvaron av en bindande partner. För det tredje kan sam-IP generera falskt positiva resultat på grund av att proteinet antingen binder direkt till pärlorna eller utfälls under proceduren utan att vara en del av komplexet. För att identifiera dessa artefakter krävs en IgG-kontroll, såväl som en ömsesidig IP, såsom beskrivits i de presenterade metoderna. Det är också möjligt att lägga till ett "för rengöring" -förfarande mellan steg 2.2.2 och 2.2.3 för att undvika ospecifik bindning av proteiner till pärlorna. För att göra det, inkubera thE lyserar med 50 | jg pärlor i 1 timme vid 4 ° C på en rullblandare. Ta bort pärlorna med magnetstativet och fortsätt till steg 2.2.3. För det fjärde kan de tunga och lätta kedjorna av IgG vara lika stora som proteinerna av intresse eller bindningspartnern, varigenom signalen maskeras. En lösning är att dissociera IgG-kedjorna med glycin, såsom beskrivs i detta manuskript. Det är också möjligt att köpa sekundära antikroppar som endast känner igen nativa antikroppar och därför inte binder till det denaturerade ljuset och tunga kedjor som laddas i membranet (se Materialetabellen ). De två metoderna måste ibland kombineras. För det femte tillåter co-IP identifieringen av ett begränsat antal bindande partners, delvis på grund av antalet antikroppar som kan probes på membranet. Det kräver också föridentifiering av dessa bindande partners, antingen genom co-IF eller genom en litteraturgranskning. Slutligen tillåter co-IP identifieringen av proteintrycketEnt i ett komplex, och inte för den direkta interaktionen mellan två proteiner.
Resultat från sam-IP kan analyseras på olika sätt. Det är möjligt att enbart identifiera interaktiva partners genom att ompröva samma membran med olika antikroppar, såsom beskrivs i detta manuskript. Det är också möjligt att kvantifiera denna interaktion. För att göra så kvantifieras mängden av proteinet som immunoprecipiteras först genom att proba membranet med en antikropp mot detta protein. Signalintensiteten analyseras med hjälp av en bildhanteringsprogramvara, som beskrivs i detta manuskript. Därefter omproveras membranet med en antikropp mot bindningspartnern, och signalintensiteten kvantifieras också. Samverkan mellan de två proteinerna kan sedan uttryckas som ett förhållande av bindemedelsmängden till mängden av det immunprecipiterade proteinet. För att kunna jämföras måste de olika proven behandlas samtidigt och laddas på samma membran. biologIcal replikat kan fortsättas och analyseras på liknande sätt, och statistisk analys kan utföras.
Under de senaste åren har andra tekniker utvecklats för att analysera PPI. FRET tillåter exempelvis identifiering av interaktiva proteiner genom energiöverföring från en märkning till en annan, endast när proteinerna är tillräckligt nära varandra för att interagera 20 . Men eftersom det krävs proteiner, kan denna teknik inte användas i vävnader. På samma sätt är det möjligt att identifiera PPI med användning av ett protein fuserat med en bakteriell biotinligas, BirA 21 . Denna ligas kommer att tillsätta biotin till proteiner som kommer i närheten ( dvs interagerar) med det chimära proteinet. Medan denna metod är innovativ och opartisk, kan den inte utföras i vävnader. Alternativt kan PLA användas i vävnader. På samma sätt som med IF, baseras denna analys på antikroppsaffinitet. För denna analys märks sekundära antikroppar med DNA-sekvenser thaT kan interagera när de är i närheten ( dvs på PPI) och bildar en cirkulär DNA-molekyl 22 . Denna cirkulära DNA-molekyl amplifieras sedan och detekteras med användning av fluorescensmärkta komplementära oligonukleotider. Fastän denna analys är elegant krävs det många valideringssteg och beror fortfarande på primär antikroppsaffinitet och viss kunskap om potentiella interaktiva partners. Slutligen har ett opartiskt alternativ till den traditionella IP-analysen också utvecklats för att identifiera PPI. Vid snabb immunprecipitation-masspektrometri av endogena proteinet (RIME) analyser analyseras IP-prover genom masspektrometri (IP / MS) 23 i stället för Western blot-analys. Den främsta fördelen med denna hög genomströmningsmetod är att den ger massiv information om alla endogena interaktiva proteiner med hjälp av få material. Det kräver emellertid åtkomst till ett peptidsekvenseringsinstrument 23 .
Det ärViktigt att nämna att, efter flera preliminära tester, har varje steg i detta protokoll optimerats för bröstkörteln. Metoden kan dock säkert användas för andra organ efter några ändringar. För sam-IF var den optimala temperaturen för bröstkörtsektion, lämplig blockering och tvättning och lösningar och de korrekta antikroppskoncentrationerna alla testade. För sam-IP testades också olika lys- och elueringsbuffertar och extraktionsmetoder och hade stor inverkan på IP-framgång. Sammanfattningsvis är varje steg i detta protokoll viktigt för att uppnå högkvalitativa och reproducerbara resultat med minst möjlig bakgrund och mest specificitet. Medan andra metoder finns tillgängliga, är co-IF följt av co-IP fortfarande giltiga och enkla metoder för att utvärdera PPI. Dessa två tekniker kan användas både i vävnader och i cellinjer och kräver bara några valideringssteg och kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att deklarera.
Acknowledgments
IP finansieras av ett stipendium för naturvetenskap och teknik vid Kanada (NSERC # 418233-2012); Ett Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), en karriärpris för Quebec Breast Cancer Foundation, och ett Leader Founds-bidrag från Canadian Foundation for Innovation grant. ED fick ett stipendium från Fondation Universitaire Armand-Frappier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10x (stock) | 1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water; 2) Adjust the PH to 7.4; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
||
| TBS 10x (stock) | 1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water; 2) Adjust the pH to 7.5; 3) Add water to reach to the 1 L final volume. |
||
| Part 1: Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | See Comments | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Part 2: Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0 | 1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O. 2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL). 3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | See Comments | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10 mL) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | See Comments | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207 (2006).
- El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
- Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
- Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
- Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
- Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
- Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
- Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
- Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
- Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
- Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
- Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
- Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
- Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
- Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
- Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074 (2015).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).
