Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Интеграция миниатюрной твердофазной экстракции и LC-MS / MS Обнаружение 3-нитротирозина в моче человека для клинических применений

Published: July 14, 2017 doi: 10.3791/55778
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,2
1Pharmasan Labs, Inc., 2NeuroScience, Inc.

Summary

Для измерения свободного 3-нитротирозина был разработан метод селективной и чувствительной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS / MS), связанный с эффективной твердофазной экстракцией на 96-луночном микропланшетном катионообменном (MCX) смешанном режиме (MCX) 3-NT) в моче человека с высокой пропускной способностью, которая подходит для клинических применений.

Abstract

Свободный 3-нитротирозин (3-NT) широко использовался в качестве возможного биомаркера для окислительного стресса. Сообщалось о повышении уровня 3-NT в самых разнообразных патологических состояниях. Однако существующие методы не обладают достаточной чувствительностью и / или специфичностью, необходимой для надежного измерения уровня эндогенного уровня 3-NT и слишком громоздки для клинических применений. Следовательно, срочно необходимо аналитическое улучшение для точного количественного определения уровней 3-NT и проверки роли 3-NT в патологических условиях. Этот протокол представляет собой разработку новой спектроскопии тандемной масс-спектрометрии (LC-MS / MS) в жидкой хроматографии в сочетании с миниатюризированной твердофазной экстракцией (SPE) для быстрого и точного измерения 3-NT в человеческой моче как неинвазивный биомаркер Для окислительного стресса. SPE с использованием 96-луночного планшета заметно упрощает процесс путем объединения очистки образца и обогащения аналита без утомительной дериватизации и стадии испарения, Снижение потребления растворителя, удаление отходов, риск загрязнения и общее время обработки. Применение 25 мМ ацетата аммония (NH 4 OAc) при рН 9 в качестве раствора элюирования SPE существенно повысило селективность. Реакция сигнала масс-спектрометрии была улучшена путем регулирования переходов с множественным контролем реакции (MRM). Использование 0,01% HCOOH в качестве добавки на колонке пентафторфенила (PFP) (150 мм x 2,1 мм, 3 мкм) улучшало реакцию сигнала еще в 2,5 раза и сокращало общее время работы до 7 мин. Был достигнут нижний предел количественного определения (LLOQ) 10 пг / мл (0,044 нМ), что представляет собой значительное улучшение чувствительности по сравнению с указанными анализами. Этот упрощенный, быстрый, выборочный и чувствительный метод позволяет обрабатывать две пластины мочи (n = 192) в течение 24-часового периода времени. Учитывая значительно улучшенные аналитические характеристики и неинвазивный и недорогой выборки мочи, предлагаемый анализ полезен для доклинических и клиническихисследования.

Introduction

В последние годы воздействие окислительного стресса на клиническое проявление было выдвинуто на первый план 1 . Один из исследованных биомаркеров представляет собой 3-нитротирозин (3-NT), конечный стабильный продукт, образующийся при взаимодействии реакционноспособных видов азота (RNS) с тирозином, предшественником нейротрансмиттера катехоламина. Хотя 3-NT может иметь клиническое значение в качестве биомаркера для RNS in vivo, существенные изменения свойств и функций тирозина могут неблагоприятно влиять на соответствующие белки и клеточные функции 1 , 2 . Новые исследования показали, что 3-NT может играть важную роль в воспалительных заболеваниях 3 , нейродегенеративных расстройствах 4 , 5 , сердечно-сосудистых заболеваниях 6 и диабете 7, а также в условиях, связанных с окислительным стрессом. Однако эти обманкиОснованные на результатах методологий, не обладающих чувствительностью и / или селективностью 8 , 9 , 10 , 11 . Огромные диапазоны концентраций 3-НТ для биологических образцов, о которых сообщалось ранее в литературе, показывают, что с этими анализами связаны серьезные аналитические проблемы, и требуется техническое усовершенствование для точного количественного определения уровней 3-НТ и проверки его роли в патологии этих условий ,

Количественное определение свободных 3-NT в биологических матрицах представляет особый вызов человеку и инструменту 8 , 9 , 10 , 11 . Во-первых, уровень следа эндогенного 3-NT требует ультрачувствительного обнаружения; Во-вторых, существование многочисленных структурно подобных аналогов, особенно тирозина, которое присутствует вОгромный избыток, требует высокой степени избирательности; В-третьих, артефактное образование 3-NT тирозиновым нитрованием с вездесущим нитратом и нитритом требует особого рассмотрения при подготовке образца, чтобы избежать ложной переоценки 3-NT.

Среди широкого спектра методологий, используемых для измерения 3-NT, MS / MS считается золотым стандартным методом из-за его превосходной чувствительности и селективности 11 , 12 , 13 , 14 . Газовая хроматография (ГХ), связанная с MS / MS, обеспечивает лучшую чувствительность, однако незаменимые этапы дериватизации образцов слишком утомительны и требуют много времени, чтобы быть эффективными для клинической полезности 15 , 16 . LC-MS / MS не требует сложной дериватизации образцов, что делает его более перспективным. Тем не менее, есть несколько препятствий для преодоления, таких какВ литературе необходимо повысить чувствительность методов LC-MS / MS, которые необходимо улучшить для измерения низких концентраций 3-NT 7 , 17 , 18, и относительно длительное время поворота должно быть сокращено для высокопроизводительных приложений 12 , 13 , 17 , 19 ,

Кроме того, при рассмотрении клинических применений важную роль играет используемая биологическая матрица. Это должно быть легко и недорого для получения и неинвазивного, если это возможно, 20 , 21 , 22 . Плазма, традиционно используемая в литературе, не является клинически желательной матрицей, поэтому была запрошена методология использования неинвазивной и рентабельной мочи.

Несколько попыток разработать relМетоды LC-MS / MS были разработаны с использованием мочи 9 , 10 , 11 . Тем не менее, они все еще не были избирательными, надежными или эффективными для клинического использования. Эффективность преобладающего SPE с использованием традиционного картриджа с обращенной фазой (тип C18) в качестве очистки образца для анализа 3-NT была поставлена ​​под сомнение и предложена последовательная SPE сильного катионного обмена (SCX) и обратная фаза C18-OH 6 , 7 , 19 . В недавно разработанном методе LC-MS / MS использовался многоступенчатый процесс очистки ручного C18 SPE, препаративной жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) и онлайн-SPE для анализа 3-NT 23 . Хотя этот метод был достаточно чувствительным для клинических целей, с LLOQ 0,041 нМ, процесс очистки был интенсивным и утомительным и требовалКрасный 3 мл мочи, что ограничивает его возможность высокой пропускной способности. В качестве сорбента SPE использовали молекулярно-импринтированный полимер для повышения эффективности процесса очистки 14 , но полученный LLOQ (0,7 мкг / мл) был недостаточно низким для клинических образцов. Другой метод требовал двумерной (2D) LC-MS / MS и иммуноаффинной хроматографии для очистки образца для достижения предела обнаружения (LOD) 0,022 нМ 24 . Хотя все эти методы сделали успехи в оценке 3-NT, ни один из них не достиг чувствительности, надежности и эффективности, необходимых для клинических применений.

Чтобы исследовать патологию свободного 3-NT и его роль биомаркера окислительного стресса в клинических условиях, мы разработали простую, эффективную, точную и точную методологию, позволяющую применять высокопроизводительные клинические применения 25 . Миниатюрный катион смешанного режима(MCX) была выполнена 96-луночная микропланшетная микропланшетная установка для обеспечения простой и эффективной очистки образца и обогащения 3-NT в одной экстракции, минуя недостатки, существующие в существующих методах, которые требуют дериватизации, испарения и 2D-LC. Жидкая хроматография с 0,01% HCOOH в качестве добавки в подвижной фазе обеспечивала повышенный сигнал с быстрым временем цикла. Селективность была дополнительно улучшена за счет применения мягкого раствора элюирования NH 4 OAc для селективного элюирования 3-NT и использования перехода MRM как для 3-NT, так и для внутреннего стандарта (IS). Матричный эффект был компенсирован за счет использования уменьшенного количества предпочтительной 13 С-меченой изотопной ИС для количественной оценки. С появлением этой методологии исследователи и клиницисты смогут проверить роль 3-НТ в клинических условиях и дополнительно изучить влияние окислительного стресса.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все исследования с использованием образцов мочи человека проводились в соответствии с процедурой, утвержденной Советом по институциональному обзору Pharmasan / Neuroscience (IRB).

1. Сбор образцов мочи и определение креатинина (Cr)

  1. Соберите 5 мл образцов мочи следующего дня после ок. 10 ч на ночь в транспортной трубке объемом 5 мл А, содержащей 250 мкл 3 н. HCl в качестве консерванта и хранить при -20 ° С до использования.
  2. Оттепель и вихрь 5 мл транспортной мочи. Пробирку и центрифугу в центрифуге ( например, Сорваль) (2297 × 10 мин).
  3. Аликвоту 1 мл мочи дважды из 5 мл транспортной трубки А.
  4. Определить Cr с помощью метода креатинина в моче 26 .

2. Подготовка образцов стандартного, ИС и контроля качества (КК)

  1. Подготовьте исходный раствор 3-NT при 100 мкг / мл в воде с 0,01% HCOOH подвижной фазой A (MA) и храните при -20 ° C.
  2. Делать3-NT рабочий стандартный раствор при концентрации 100 нг / мл путем разбавления исходного раствора 100 мкг / мл 3-NT с помощью МА.
  3. Генерировать стандарты в пределах от 5 до 2500 пг / мл путем разбавления рабочего раствора 100 нг / мл с 0,15 М HCl подкисленной чистой мочой без 3-NT вместе с пустыми и двойными пустыми образцами.
  4. Подготовьте исходный раствор IS 13 C 9 -3-NT при 100 мкг / мл в воде с МА и храните при -20 ° C.
  5. Сделайте рабочий раствор IS при 500 пг / мл путем разбавления исходного раствора 100 мкг / мл 13 C 9 -3-NT IS с помощью МА.
  6. Создайте пять уровней образцов КК, покрывающих LLOQ, низкий, средний и высокий уровни ( то есть 10, 25, 100, 500 и 1,250 пг / мл), путем разбавления рабочего стандарта 3 NT в подкисленной пустой моче.

3. Процедура твердофазной экстракции

  1. Образцы оттаивания и вихревой мочи, стандарты и образцы КК.
  2. Добавить образцы мочи, стандарты и QC samp(По 250 мкл каждый) до 32 лунок чистой 2 мл 96-луночного планшета.
  3. Ввести рабочий раствор 500 мкг / мл IS (50 мкл) в каждую лунку, за исключением двойной чистой пробы. Добавить 0,01% HCOOH (50 мкл) в лунку с двойной пустой пробкой.
  4. Добавляют воду LC-MS / MS с 0,1% HCOOH (250 мкл).
  5. Смешайте вышеуказанную смесь с 8-канальной пипеткой три раза.
  6. Накройте пластину до загрузки SPE.
  7. Поместите пластину для экстракции MCX 96 и коллекционный резервуар на процессоре с положительным давлением.
  8. Заполните экстракционную пластину проточным MeOH (200 мкл) через сорбент.
  9. Уравновешивают проточной водой 2% HCOOH (200 мкл) через сорбент.
  10. Загрузите весь объем каждого из предварительно смешанных образцов на предварительно подготовленную экстракционную пластину осторожно с помощью 8-канальной пипетки.
  11. Установите низкое положительное давление ( например , 3 фунта на квадратный дюйм) на процессор с положительным давлением, чтобы смесь могла течьМедленно, при необходимости отрегулируйте давление.
  12. Промыть лунки проточной водой 2% HCOOH (200 мкл) через сорбент.
  13. Промыть лунки проточным метанолом (200 мкл) через сорбент.
  14. Промыть лунки проточной водой (200 мкл) через сорбент.
  15. Полностью высушите колодцы с высокой установкой положительного давления ( например , 40 psi) на процессоре с положительным давлением.
  16. Замените резервуар чистой 2 мл 96-луночным планшетом.
  17. Применяют 25 мМ NH 4 OAc при рН 9 (50 мкл) для элюирования удерживаемого аналита и IS из экстракционной пластины.
  18. Пипетируют воду LC-MS с 5% HCOOH (50 мкл) для нейтрализации элюата.
  19. Три раза смешивайте с 8-канальной пипеткой и отправляйте на станцию ​​LC-MS / MS для анализа.

4. Анализ LC-MS / MS

  1. Точно измерьте 2000 мл воды LC-MS с градуированным цилиндром и перенесите его в 2-литровый флакон.
  2. пIpet 200 мкл чистого HCOOH в вышеуказанную бутылку, содержащую воду LC-MS.
  3. Тщательно перемешать и маркировать как подвижную фазу A (MA). Включите инициалы, дату подготовки и срок действия.
  4. Возьмите 2 л бутылки метанола LC-MS и наклейте в качестве подвижной фазы B (МБ) с датой начала и датой истечения срока годности.
  5. Установите температуру автосэмплера на 4 ° C.
  6. Поместите сборную пластину с подготовленными образцами в автосамплер.
  7. Поместите колонку PFP (150 мм x 2,1 мм id, 3 мкм) и защитную колонну в духовке.
  8. Установите температуру в духовке до 30 ° C.
  9. Равновелибить 10 минут, используя метод получения с элюированием градиента LC, как показано в таблице 1 .
Время (мин) модуль Мероприятия параметр
0 Насосы Насос B Conc. 5
0,5 Насосы Насос B Conc. 20
1 Насосы Насос B Conc. 50
3 Насосы Насос B Conc. 80
4 Насосы Насос B Conc. 90
4,01 Насосы Насос B Conc. 95
5,5 Насосы Насос B Conc. 95
5,6 Насосы Насос B Conc. 5
7 контроллер Стоп

Таблица 1: Условия элюирования градиентом жидкой хроматографии

  1. Создайте список партий, включаяСтандартов, образцов КК и мочи.
  2. Начните партию путем инъекции готовых образцов (12 мкл).

5. Идентификация пика, интеграция и процесс обработки данных

  1. Сбор и обработка данных управления с помощью программного обеспечения.
  2. Определите и интегрируйте 3-NT и IS пики для всех образцов.
  3. Установите стандартную кривую с диапазоном 10-2 500 пг / мл для количественного определения 3 NT с помощью линейной регрессии отношения площади пиков 3-NT и IS к номинальной концентрации 3 NT с весовым коэффициентом 1 / x.
  4. Количественное определение всех образцов с использованием стандартной кривой.
  5. Определите, попадают ли образцы контроля качества в установленный диапазон.
  6. Преобразовать обнаруженные концентрации образцов мочи в конечные результаты в единицах нМ или нмоль / ммоль Cr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 показано, что 3-NT полностью хроматографически отделена от других аналогично аналогичных аналогов тирозина при оптимизированном состоянии ЖК, что устраняет сопутствующие помехи из-за этих значительно избыточных соединений и, следовательно, повышает степень селективности анализа. Кроме того, градиентное элюирование 0,01% HCOOH в качестве добавки в МА и метаноле при скорости потока 0,45 мл / мин позволяет быстро элюировать 3-НТ ( т. Е. 3 мин с временем поворота 7 мин).

Рисунок 1
Рисунок 1: Исходное LC-хроматографическое разделение 3-NT от других тирозиновых аналогов в стандартном растворе. ( А ) р- тирозин; ( B ) m- тирозин; ( C ) o -тирозин; ( D ) Cl-тирозин; ( E ) 3-NT. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2 показывает, что в двойном пустом образце не наблюдается сигнала 3-NT, что указывает на отсутствие образования артефактного 3-NT во время всего процесса. Рисунок 3 иллюстрирует типичные хроматограммы MRM 3-NT и IS для здорового человека. Как можно видеть, не наблюдается мешающих сигналов во время удерживания 3-NT и IS. Кроме того, наблюдалось менее ± 6% разницы в 3-НТ между образцами нешипованной и шипованной пули с нитритом (50 мкМ), нитратом (50 мкМ) и тирозином (50 мг / л) 25 , что также оказывает поддержку К специфичности анализа.


Рисунок 2: МРМ-хроматограммы 3-NT и IS в типичном образце с двойной пробой. ( A ) квантор квантования 3-NT MR7 227,0> 90,0; ( B ) IS MRM-квантификатор 236,0> 189,0. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Хроматограммы MRM 3-NT и IS в типичном образце мочи здоровых людей. ( A ) квантор квантования 3-NT MR7 227,0> 90,0; ( B ) IS MRM-квантификатор 236,0> 189,0. Пожалуйста, нажмитеЧтобы просмотреть большую версию этого рисунка.

Стандартная кривая была установлена ​​путем экстракции подкисленной заготовки мочи, расшитой 3-NT в диапазоне 10-2,500 пг / мл, путем расчета отношения площади пика 3-NT и IS к номинальной концентрации 3-NT с линейным фитингом Взвешивания 1 / х. Репрезентативная стандартная кривая показана на рисунке 4 . Было определено, что LOD, определяемый как самая низкая концентрация с отношением сигнал-шум больше трех, составляет 2 пг / мл (0,0088 нМ). Было определено, что LLOQ составляет 10 пг / мл (0,044 нМ) по определению как самая низкая концентрация, которая должна быть измерена в пределах ± 20% от неточности и точности с отношением сигнал / шум больше десяти.

Рисунок 4
Рисунок 4: Типичная стандартная кривая 3-NT вДиапазон 10-2,500 пг / мл. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Существенные изменения концентраций, ранее описанные в литературе для эндогенного свободного 3-НТ в образцах мочи человека, выявили методологические проблемы, связанные с доступными анализами 8 , 9 , 10 , 11 . Точное определение низкого базального уровня 3-NT в моче человека остается сложной задачей, требующей специальных мер предосторожности для подготовки проб и анализа LC-MS / MS. Этот протокол описывает новую процедуру SPE в сочетании с выборочным обнаружением LC-MS / MS, которое позволяет специфическое и чувствительное определение мочевого 3-NT с высокой пропускной способностью.

Тщательный выбор параметров MRM улучшил селективность для обнаружения 3-NT. Переход MRM m / z 236.0> 96.0 IS для 3-NT в плазме 27 вызвал сильное загрязнение образцов мочи. Более чистое, 9-кратное увеличение сигналаРеакция была достигнута при переходе MRM m / z 236,0> 189,0. Переход MRM m / z 227,0> 90,0 был выбран для количественной оценки 3-NT из-за сильных помех с использованием наиболее интенсивного перехода m / z 227,0> 181,0. Подробные MRM-переходы и составные параметры приведены в таблице 2 .

Аналит Переход MRM (m / z) DP (V) EP (V) CE (эВ) CXP (V)
3-NT (квантификатор) 227,0> 90,0 50 10 38 13
3-NT (квалификатор) 227,0> 103,9 50 10 45 16
13 C 9 -NT (IS) 236,0> 189,0 50 10 21 14
напряжение ионного распыления: 2200 В; Температура: 600 ° C; Занавес газа: 35; CAD-газ: 9; Небулайзерный газ (GS1): 50; Газообразный газ (GS2): 55.

Таблица 2: Оптимизированные условия MRM.

Традиционная колонка типа C18, обычно используемая для жидкостного хроматографического разделения 3-NT в литературе 12 , 13 , 17 , 19, как правило, требовала длительного времени поворота для уменьшения помех, что делало его невосприимчивым к высокой пропускной способности. В этом протоколе использовалась колонка PFP для оптимизации хроматографического разделения LC 3-NT на основе его усиленного удержания полярных соединений 22 ,> 27 , 28 . Концентрация подвижных фазовых добавок оказывает важное влияние на интенсивность сигнала 25 , 28 . Было обнаружено, что HCOOH при 0,01% является оптимальной добавкой в ​​МА, так как это приводит к увеличению сигнала в 2,5 раза более чем на 0,1%, а также к уменьшению концентрации сигнала. Был разработан профиль градиентного элюирования с использованием 0,01% HCOOH в воде (MA) и метаноле (МБ) со скоростью потока 0,45 мл / мин, обеспечивая оптимальное разделение и быстрое элюирование 3-NT в течение 3 мин с общим временем работы Всего 7 мин, что позволяет значительно ускорить анализ 3-НТ в сложных биологических матрицах, чем описано в литературе 12 , 13 , 17 , 19 .

Чтобы устранить неэффективность традиционного картриджа с обращенной фазой (тип C18) pНедавно использовавшийся для SPE биологических образцов 6 , 7 , мы недавно разработали метод LC-MS / MS для определения 3-NT в плазме человека SPE на одной двухфункциональной 96-луночной пластине MCX 27 , что привело к улучшению SPE Эффективности и селективности. Тем не менее, особый недостаток всех подходов SPE в литературе - трудоемкие и связанные с риском шаги по испарению и восстановлению. Кроме того, для плазменного метода потребовалась дополнительная предварительная промывка экстракционной пластины для устранения загрязнения из сорбента. В этом протоколе эти недостатки были устранены с помощью специализированного SPE с использованием миниатюрной 96-луночной микропланшет. Было обнаружено, что выбор раствора для элюирования имеет решающее значение для эффективности извлечения. Существенные помехи наблюдались в образцах мочи, применяя общий раствор элюирования NH 4 OH с различным составом MeOH. Высказывалось предположение, что интерференцияВещества были элюированы с помощью аналита из-за сильной элюирующей способности метанольного раствора элюирования NH 4 OH, что в результате привело к низкой селективности. Чтобы улучшить селективность, необходимо было определить решение, которое было бы достаточно сильным, чтобы элюировать 3-NT и достаточно слабым, чтобы не вызывать элюирование мешающих соединений. После детального исследования менее основного NH 4 OAc при разных значениях рН и концентраций было установлено, что раствор 25 мМ NH 4 OAc с рН 9 является оптимальным в качестве раствора для элюирования. С оптимизированным элюирующим раствором проблема интерферирующих соединений была решена, и чувствительность достигала 40% по сравнению с обычным метанольным раствором элюирования NH 4 OH.

В таблице 3 представлено подробное резюме аналитических характеристик этого протокола 25 по сравнению с другими доступными методами определения свободного 3-NT в биологических матрицах. Этот протокол Дает несколько отличных преимуществ по сравнению с ранее описанными анализами. Во-первых, с использованием 96-луночного экстракционного микропланшета была достигнута одна стадия для очистки образца и обогащения аналита, избегая 1-5 циклов испарения и восстановления, как правило, требуемых в методах 3-NT с участием SPE. Во-вторых, использование растворителя на образец для SPE было резко уменьшено - от 5,5 до 118 мл до всего 1,1 мл, что в 5-10 раз уменьшило растворимость и удаление отходов. В-третьих, время обработки LC на образец уменьшалось в 2-7 раз по сравнению с другими анализами и было на 30% быстрее, чем наш предыдущий метод плазмы. В-четвертых, для компенсации матричного эффекта требовалось на 10-3000 раз меньшее количество предпочтительного 13 С-меченного ИС. Наконец, этот анализ представляет собой значительное улучшение чувствительности по сравнению с другими традиционными методами LC-MS / MS на основе SPE для количественного определения мочевого 3-NT.

пути "> Базовые приготовления аналитический
метод матрица LOD (нМ) LOQ (nM) Запуск LC (мин) Evap c Sol d (мл) IS (ng) Ссылка SPE (С18)
+ фильтрация ЖХ-МС / МС плазма 0,034 0,112 20 1 13 Аналоговый f 2 [6] SPE
(Пластина MCX) ЖХ-МС / МС плазма 0,0088 0,022 10 1 5,6 13 C 9 -NT 0,25 [27] РРТ + SPE (MCX) + ОегЛ ВЭЖХ-УФ сыворотка NA b 100 40 1 7,3 NA b NA b [12] ВЭЖХ + ОегЛ ГХ-МС / МС урина 0,004 0,125 NA b 5 NA b D 3 -NT 4,6 [16] РРТ + SPE (амин) + ОегЛ ЖХ-МС / МС Моча кошки NA b 14,5 40 3 23 D 3 -NT 75 [17] PPT + гидролиз + SPE (SCX-C18) ЖХ-МС / МС Моча (белок) 400 Не Доступно 50 2 118 D 3 -NT 2 [19] IA-2D LC e ЖХ-МС / МС урина 0,022 Не Доступно 14 NA b NA b 13 C 9 -NT 0,85 [24] SPE (C18) + гидролиз ВЭЖХ-ECD Моча (всего) NA b 4 40 2 5,5 NA b NA b [13] SPE (C18) + Prep LC g
+ Онлайн SPE ЖХ-МС / МС урина 0,0088 0,041 30 2 38 D 3 -NT 5 [23] SPE (MIP) ВЭЖХ-УФ Шипованная моча 700 Не Доступно 20 18 NA b NA b [14] SPE (MCX μElution) ЖХ-МС / МС урина 0,0088 0,044 7 НЕТ 1,1 13 C 9 -NT 0.03 Эта работа A der: дериватизация; B NA: недоступно; C Evap: испарение; D Sol: растворитель на образец; E IA-2D LC: иммуноаффинная хроматография и двумерный LC; F Аналог: o-метилтирозин; G Prep LC: препаративная ВЭЖХ-очистка.

Таблица 3: CompariСын аналитического исполнения этого протокола с существующими анализами для обнаружения 3-NT в биологических матрицах

Аналитическая и клиническая обоснованность предлагаемого анализа дополнительно оценивалась путем определения контрольного интервала для 3-NT для мочеиспускания, установленного на основе аутентичных образцов мочи у 82 здоровых людей 25 . Усовершенствованный метод простоты и пропускной способности позволяет обрабатывать и анализировать две пластины мочи (n = 192) в течение 24-часового периода времени. Ожидается, что разработанный метод с использованием неинвазивной выборки мочи, простой, быстрой, чувствительной и селективной, станет мощным инструментом для проверки роли 3-НТ в клинических условиях и дальнейшего изучения влияния окислительного стресса. Критические этапы протокола включают SPE на микропланшет MCX с использованием мягкого NH4OAc в качестве элюирующего буфера, отделение LC на колонке PFP с 0,01% HCOOH в качестве добавки и выбор MRM для количественной оценки 3-NTТион. Дальнейшее применение метода заключается в количественном определении концентраций 3-NT у пациентов с такими патологическими состояниями, как воспалительные и нейродегенеративные расстройства и т. Д. По-прежнему необходимо устранить потенциальные ловушки предлагаемого протокола для клинических применений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы признали Скотта Говарда и Абигайль Маринак за общую поддержку и координацию этой работы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Nitro-L-tyrosine Sigma N7389-5g
3-Nitro-L-tyrosine-13C9 Sigma 652296-5.0mg
Mass Spec Gold Urine Golden West Biologicals MSG 5000-1L
Oasis MCX 96-well µElution plate Waters 186001830BA
2 mL 96 well collection plate Phenomenex   AH0-7194
96 positive processor Waters  186005521
LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol   Sigma 14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV water Sigma 14263-2L
Formic acid for mass spectrometry Sigma 94318-50ML-F
Ammonium hydroxide solution Sigma 338818-1L
Ultra PFP propyl columns Restek 9179362
5500 Triple quad AB Sciex  / Contact manufacture for more detail
UFLC-XR Shimadzu  / Contact manufacture for more detail
Integra 400 Plus  Roche / Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method
LCMS certified 12 x 32 mm screw neck vial Waters 600000751CV
LCGC certified 12 x 32 mm screw neck total recovery vial Waters 186000384C
5 mL transport tube Phenix TT-3205
50 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2263
15 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2266
eLine electronic pipette Sartorius 730391
Microfuge centrifuge  Beckman Coulter A46474
OHAUS balance   Kennedy Scales, inc. 735
Vortex mixer  Bernstead Thermolyne M16715

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).
  2. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
  3. Baraldi, E., et al. 3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children. Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).
  4. Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association? J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).
  5. Butterfield, D. A., et al. Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease. Brain Res. 1148, 243-248 (2007).
  6. Hui, Y., et al. A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery. Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).
  7. Kato, Y., et al. Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).
  8. Duncan, M. W. A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine. Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).
  9. Ryberg, H., Caidahl, K. Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples. J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).
  10. Tsikas, D. Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry. Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).
  11. Tsikas, D., Duncan, M. W. Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective. Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).
  12. Iwasaki, Y., et al. Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).
  13. Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine. J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).
  14. Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases. Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).
  15. Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state. Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).
  16. Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).
  17. Marvin, L. F., et al. Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution. Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).
  18. Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage. J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).
  19. Chen, H. J. C., Chiu, W. L. Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).
  20. Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability. Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).
  21. Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies. Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).
  22. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples. Talanta. 159, 238-247 (2016).
  23. Chao, M. R., et al. Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).
  24. Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker. Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).
  25. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine. Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).
  26. Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. , Mannheim. Available from: https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html 2011-2011 (2011).
  27. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker. Talanta. 140, 45-51 (2015).
  28. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication. J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).

Tags

Chemistry 3-Nitrothrosine (3-NT) жидкостная хроматографическая тандемная масс-спектрометрия (LC-MS / MS) твердофазная экстракция (SPE) неинвазивный биомаркер окислительный стресс моча чувствительность селективность
Интеграция миниатюрной твердофазной экстракции и LC-MS / MS Обнаружение 3-нитротирозина в моче человека для клинических применений
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X. S., Li, S., Ahrens, M.,… More

Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter