Summary
开发了选择性和灵敏的液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）方法与混合模式阳离子交换（MCX）96孔微量培养板上的有效固相萃取相结合，用于测量游离的3-硝基酪氨酸（ 3-NT），具有高通量，适用于临床应用。
Abstract
游离的3-硝基酪氨酸（3-NT）已广泛用作氧化应激的可能生物标志物。在各种病理状况下报道了3-NT的水平升高。然而，现有方法缺乏足够的灵敏度和/或特异性，可靠地测量3-NT的低内源水平，对于临床应用来说太麻烦了。因此，迫切需要进行分析改进，以准确量化3-NT的水平，并验证3-NT在病理状况中的作用。该方案介绍了新型液相色谱串联质谱（LC-MS / MS）检测与小型化固相萃取（SPE）的开发，用于快速准确测量人尿中3-NT作为非侵入性生物标志物用于氧化应激。使用96孔板的SPE通过组合样品净化和分析物富集显着简化了工艺，而无需繁琐的衍生化和蒸发步骤，减少溶剂消耗，废物处理，污染风险和整体处理时间。使用pH为9的25mM乙酸铵（NH 4 OAc）作为SPE洗脱溶液，显着提高了选择性。通过调整多重反应监测（MRM）转换，改善了质谱信号的响应。在五氟苯基（PFP）柱（150mm×2.1mm，3μm）上使用0.01％HCOOH作为添加剂将信号响应提高2.5倍，并将总运行时间缩短至7分钟。实现了10 pg / mL（0.044 nM）的定量下限（LLOQ），相对于所报告的测定显示出显着的灵敏度改善。这种简化，快速，选择性和敏感性方法允许在24小时的时间段内处理两个尿液样本（n = 192）。考虑到明显改善的分析性能和非侵入性和便宜的尿液采样，所提出的检测方法有利于临床前和临床学习。
Introduction
氧化应激的临床表现的影响已被推到前列，近年来1。正在探索的生物标志物之一是3-硝基酪氨酸（3-NT），当活性氮物质（RNS）与酪氨酸，儿茶酚胺神经递质前体相互作用时形成最终稳定的产物。而3-NT可以具有临床价值作为体内 RNS的生物标志物，其属性和酪氨酸的功能的显着变化可能不利地相应的蛋白质和细胞功能1,2影响。新兴的研究表明，3-NT可以在炎症条件下发挥重要作用3，神经退行性疾病4，5，心血管疾病6和7糖尿病，以及与氧化应激的条件。但是，这些都是这样的rvations基于来自缺乏灵敏度和/或选择性8，9，10，11的方法的结果。以前在文献中报道的生物样品的3-NT浓度范围巨大，显示出严重的分析问题与这些检测有关，需要进行技术改进来准确量化3-NT的水平，并验证其在这些病症的病理学中的作用。
免费3-NT生物基质的定量呈现人与仪器8，9，10，11一个特殊的挑战。首先，内源性3-NT的痕量水平要求超敏感检测;第二，存在众多结构相似的类似物，特别是酪氨酸大量过剩，需要高度的选择性;第三，通过酪氨酸硝化与无处不在的硝酸盐和亚硝酸盐的3-NT的人工形成需要在样品制备过程中特别考虑，以避免过度估计3-NT。
中的各种各样的用于测量3-NT方法的，MS / MS一直被认为是金标准方法由于其优越的灵敏度和选择性11，12，13，14。气相色谱（GC），其耦合MS / MS提供最佳的灵敏度，然而，必不可少的样品衍生步骤过于繁琐和耗时是有效的临床效用15,16。 LC-MS / MS不需要复杂的样品衍生化，使其成为更有希望的选择。尽管如此，还有几个要克服的障碍的文献中报道的LC-MS / MS方法nsitivity需要改善的测量低丰度3-NT 7，17，18和相对长的处理时间必须缩短用于高通量应用12，13，17，19 。
另外，在考虑临床应用时，所用的生物矩阵起着重要的作用。它应该是容易且廉价获得和非侵入性的如果可能的话20，21，22。等离子体是文献中传统使用的样品，不是临床上理想的基质，因此寻求利用非侵入性和成本效益的尿液的方法。
几个尝试发展reliable和特定LC-MS / MS方法已经使用尿9，10，11制成。然而，它们的选择性，可靠性或效率都不足以临床使用。已经提出使用传统反相柱（C18型）作为3-NT分析的样品清洗的主要SPE的有效性，并提出了强阳离子交换（SCX）和反相C18-OH的顺序SPE 6 ， 7，19。最近开发的LC-MS / MS方法采用手动C18 SPE，制备型高压液相色谱（HPLC）和在线SPE的多步纯化方法，用于3-NT 23的分析。尽管这种方法对于临床目的来说足够敏感，LLOQ为0.041nM，但是清除过程是密集和繁琐的，红色3 mL尿液，限制了其高通量的可行性。采用分子印迹聚合物作为SPE吸附剂，以提高清洗过程14的效率，但是所得到的LLOQ（0.7μg/ mL）对于临床标本不够低。另一种方法需要二维（2D）LC-MS / MS和免疫亲和层析来进行样品净化，以达到0.022nM 24的检测限（LOD）。虽然所有这些方法在3-NT的评估方面取得了进步，但没有一个已经实现了临床应用所需的灵敏度，可靠性和效率。
为了研究的自由3-NT病理和其在临床环境中的氧化应激的生物标志物的作用，我们已经开发出一种方法，它是简单，高效，准确，精确，可以实现高通量临床应用25。小型化混合模式阳离子实施了hange（MCX）96孔提取微孔板，以实现单次提取中简单有效的3-NT样品清除和富集，绕过了需要衍生化，蒸发和2D-LC的现有方法中看到的缺点。具有0.01％HCOOH作为流动相添加剂的液相色谱提供了快速循环时间的增强的信号响应。通过使用温和的NH 4 OAc洗脱溶液用于3-NT的选择性洗脱以及使用3-NT和内标（IS）的MRM转换，进一步改善了选择性。通过使用减少量的优选13 C-标记的同位素IS进行定量来补偿基质效应。随着这种方法的出现，研究人员和临床医生将能够验证3-NT在临床条件下的作用，并进一步探索氧化应激的影响。
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Protocol
所有涉及人体尿液样本的研究都遵循了Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board（IRB）批准的手术。
尿液样品收集和肌酐（Cr）测定
- 第二天早晨收集5 mL尿样。 10小时过夜禁食在含有250μL3 N HCl作为防腐剂的5 mL输送管A中，储存于-20°C直至使用。
- 解冻并涡旋5 mL运输尿A管和离心机离心机（ 如 Sorvall）（2297 xg，10分钟）。
- 从5 mL运输管A等分1 mL尿液两次
- 通过尿肌酐法测定Cr 26 。
2.准备标准，IS和质量控制（QC）样品
- 在含有0.01％HCOOH流动相A（MA）的水中以100μg/ mL制备3-NT的储备溶液，并储存在-20℃。
- 使通过用MA稀释100μg/ mL 3-NT储备溶液，浓度为100ng / mL的3-NT工作标准溶液。
- 通过用不含3-NT的0.15M HCl酸化空白尿以及空白和双倍空白样品稀释100ng / mL工作标准，产生5至2500pg / mL的标准品。
- 用MA在水中以100μg/ mL制备IS 13 C 9 -3-NT的储备溶液，并储存在-20℃。
- 通过用MA稀释100μg/ mL 13 C 9 -3-NT IS储备溶液，使其成为500 pg / mL的IS工作溶液。
- 通过在酸化的空白尿中稀释3-NT工作标准，建立覆盖LLOQ，低，中和高水平（ 即 10,25,100,5500和1,250pg / mL）的五个等级的QC样品。
固相萃取法
- 解冻和涡流尿样，标准品和QC样品。
- 添加尿样，标准品和QC（每个250μL）至清洁的2mL 96孔收集板的32个孔中。
- 将500pg / mL IS工作溶液（50μL）引入每个孔，除了双空白样品孔。向双层样品孔中加入0.01％HCOOH（50μL）。
- 加入0.1％HCOOH（250μL）的LC-MS / MS水。
- 将上述混合物与8通道移液管混合三次。
- 盖板，直到SPE加载。
- 将MCX 96孔提取板和收集容器放在正压处理器上。
- 通过吸附剂使流动的MeOH（200μL）对提取板进行调节。
- 用2％HCOOH（200μL）通过吸附剂进行平衡。
- 将每个预混合样品的整个体积用8通道移液管小心地装入预处理提取板上。
- 在正压处理器上设置低正压（ 例如 3 psi），以使混合物流过缓慢吸收剂，如果需要，调整压力。
- 用2％HCOOH（200μL）将水冲洗通过吸附剂清洗孔。
- 通过使甲醇（200μL）通过吸附剂清洗孔。
- 用水（200μL）通过吸附剂清洗孔。
- 在正压处理器上以高正压设置（ 例如 40 psi）完全干燥油井。
- 用干净的2 mL 96孔收集板更换储存器。
- 应用pH 9（25μL）的25 mM NH 4 OAc，从萃取板中洗脱保留的分析物和IS。
- 移取5％HCOOH（50μL）的LC-MS水中和洗脱液。
- 与8通道移液管混合三次，并提交给LC-MS / MS站进行分析。
LC-MS / MS分析
- 用量筒精确测量2,000 mL LC-MS水，并将其转移到2升瓶中。
- Pipette将200μL纯HCOOH装入含有LC-MS水的上述瓶中。
- 充分混合并标记为流动相A（MA）。包括缩写，准备日期和到期日。
- 取2升瓶的LC-MS甲醇，标记为流动相B（MB），开始日期和有效期。
- 将自动进样器的温度设置为4°C。
- 将带有准备样品的收集板放入自动进样器。
- 将PFP柱（150 mm x 2.1 mm id，3μm）和保护柱放在烤箱中。
- 将烤箱温度设置为30°C。
- 使用采集方法用LC梯度洗脱平衡10分钟，如表1所示。
| 时间（分钟） | 模 | 活动 | 参数 |
| 0 | 水泵 | 泵B浓度 | 五 |
| 0.5 | 水泵 | 泵B浓度 | 20 |
| 1 | 水泵 | 泵B浓度 | 50 |
| 3 | 水泵 | 泵B浓度 | 80 |
| 4 | 水泵 | 泵B浓度 | 90 |
| 4.01 | 水泵 | 泵B浓度 | 95 |
| 5.5 | 水泵 | 泵B浓度 | 95 |
| 5.6 | 水泵 | 泵B浓度 | 五 |
| 7 | 调节器 | 停止 |
表1： 液相色谱梯度洗脱条件
- 创建一个批处理列表，其中包括标准品，QC和尿样。
- 通过注射准备的样品（12μL）开始批次。
峰值识别，集成和数据处理
- 使用该软件控制数据采集和处理。
- 识别并整合所有样品的3-NT和IS峰。
- 通过3-NT和IS与标称3-NT浓度的峰面积比以1 / x的线性回归线性回归，建立10-2,500pg / mL范围的3-NT定量的标准曲线。
- 使用标准曲线量化所有样品。
- 确定QC样品是否落在确定的范围内。
- 将检测到的尿样浓度以nM或nmol / mmol Cr为单位转换为最终结果。
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Representative Results
图1说明，在优化的LC条件下，3-NT与其它结构相似的酪氨酸类似物完全色谱分离，这消除了由于这些极度过量的化合物引起的共洗脱干扰，从而提高了测定选择性的程度。此外，以0.01％HCOOH作为添加剂在MA和甲醇中的流动速率为0.45 mL / min的梯度洗脱可以快速洗脱3-NT（ 即 3分钟，周转时间为7分钟）。
图1： 标准溶液中3-NT与其他酪氨酸类似物的基线LC色谱分离。 （ A ） p-酪氨酸; （ B ） m-酪氨酸; （ C ） o -酪氨酸; （ D ）Cl-酪氨酸; （ E ）3-NT。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2显示在双重空白样品中没有观察到3-NT信号，表明在整个过程中没有形成假象3-NT。 图3显示了健康个体的3-NT和IS的代表性MRM色谱图 。可以看出，在3-NT和IS的保留时间内没有观察到干扰信号。此外，观察到亚硝酸盐（50μM），硝酸盐（50μM）和酪氨酸（50mg / L） 25的非加标和加标汇集尿样之间3-NT差异小于±6％，进一步支持到测定的特异性。
图2： 代表性双空白样品中3-NT和IS的MRM色谱 图 。 （ A ）3-NT MRM量词227.0> 90.0; （ B ）IS MRM量词236.0> 189.0。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3： 健康人代表性尿样中3-NT和IS的MRM色谱 图 。 （ A ）3-NT MRM量词227.0> 90.0; （ B ）IS MRM量词236.0> 189.0。 请点击他重新查看这个数字的较大版本。
通过将3-NT和IS的峰面积比与3-NT的标称浓度用线性拟合法绘制，加入3-NT的酸化空白尿在10-2,500pg / mL范围内提取标准曲线的1 / x加权。 图4中示出了代表性的标准曲线。被定义为具有大于3的信噪比的最低浓度的LOD被确定为2pg / mL（0.0088nM）。根据定义，LLOQ被确定为10pg / mL（0.044nM），作为在信噪比大于10的不精确度和精度的±20％内测量的最低浓度。
图4：代表性的3-NT标准曲线范围为10-2,500pg / mL。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在浓度实质变化先前在文献中内源性游离3-NT报导在人尿样品揭示了与可用的测定8，9，10，11相关联的方法问题。准确测定人尿中3-NT的低基础水平仍然是一项具有挑战性的任务，需要对样品制备和LC-MS / MS分析采取特殊预防措施。该协议概述了一种新型SPE程序，结合选择性LC-MS / MS检测，允许以高通量对尿3-NT进行特异性和灵敏的测定。
仔细选择MRM参数提高了3-NT检测的选择性。血浆27中 3-NT的ISM的MRM转换m / z 236.0> 96.0引起尿液样本的严重污染。更干净，信号增加9倍响应是通过MRM转换m / z 236.0> 189.0实现的。选择MRM转换m / z 227.0> 90.0由于严重干扰使用最密集的转换m / z 227.0> 181.0进行3-NT定量。详细的MRM转换和复合参数总结在表2中 。
| 分析 | MRM转换（m / z） | DP（V） | EP（V） | CE（eV） | CXP（V） |
| 3-NT（量词） | 227.0> 90.0 | 50 | 10 | 38 | 13 |
| 3-NT（限定词） | 227.0> 103.9 | 50 | 10 | 45 | 16 |
| 13 C 9 -NT（IS） | 236.0> 189.0 | 50 | 10 | 21 | 14 |
| 一个离子喷雾电压：2200 V;温度：600℃;窗帘气体：35; CAD气体：9;雾化器气体（GS1）：50;加热器气体（GS2）：55。 | |||||
表2：优化的MRM条件。
在文献12,13，17通常用于3-NT LC色谱分离传统C18型柱，19通常需要长的处理时间的减少干扰，使得它的非利于高吞吐量。在该方案中，基于其极性化合物22的增强保留，使用PFP柱优化3-NT的LC色谱分离，> 27，28。流动相添加剂的浓度对信号强度25，28有重要的影响。发现0.01％的HCOOH是MA中的最佳添加剂，因为它导致0.1％浓度的2.5倍信号增益，并且进一步降低信号响应的浓度降低。建立了使用0.01％HCOOH在水（MA）和甲醇（MB）中的梯度洗脱曲线，流速为0.45 mL / min，在3 min内达到最佳分离和3-NT快速洗脱，总运行时间仅7分钟，从而允许复杂的生物基质比文献12，13，17，19日报道的3-NT显著更快的分析。
为了解决传统反相盒（C18型）p的无效性redominantly用于生物样品6的SPE， 图7，我们最近开发的LC-MS / MS方法在单个双功能的96孔MCX板27，这导致在SPE改进确定3-NT在人血浆中由SPE效率和选择性。然而，文献中所有SPE方法的独特缺点是费力和风险相关的蒸发和重建步骤。此外，等离子体方法需要额外的预洗涤提取板以消除吸附剂的污染。在该协议中，通过使用小型化的96孔微孔板，定制的SPE已经消除了这些缺点。发现洗脱溶液的选择对提取效率至关重要。通过应用具有不同组成的MeOH的常用NH 4 OH洗脱溶液在尿样中观察到明显的干扰。假设干扰由于甲醇NH 4 OH洗脱溶液的强洗脱力，因此物质与分析物共洗脱，因此导致低选择性。为了提高选择性，有必要确定一种溶液，其强度足以洗脱3-NT，并且足够弱，不会引起干扰化合物的洗脱。在不同pH和浓度下对碱性较差的NH 4 OAc进行了详细的研究后，发现pH为9的25mM NH 4 OAc溶液作为洗脱溶液是最佳的。通过优化的洗脱溶液，解决了干扰化合物的问题，与常规甲醇NH 4 OH洗脱液相比，灵敏度提高了40％。
表3提供了本方案25的分析性能的详细总结，与用于测定生物基质中游离3-NT的其它可用方法相比。这个协议与以前报道的测定相比有几个显着的优点。首先，通过使用96孔提取微量培养板，实现了单个步骤，用于样品清除和分析物富集，避免了在涉及SPE的3-NT方法中通常需要的1-5个循环的蒸发和重构。其次，SPE样品的溶剂用量急剧下降，从5.5 - 118 mL降至1.1 mL，降低了溶剂和废物处理5-10-7倍。第三，与其他测定相比，每个样品的LC周转时间降低了2-7倍，比我们以前的等离子体方法快30％。第四，为了补偿基质效应，需要10-3,000倍以下的优选13 C标记的IS。最后，该测定法比其他常规的基于SPE的LC-MS / MS方法对尿3-NT的定量显示出显着的灵敏度改善。
方法“>方法
+过滤
（MCX板）
+在线SPE
表3：比较本议定书分析性能的儿子，用于检测生物矩阵中3-NT的现有测定
所提出的测定的分析和临床有效性通过参考间隔的从82健康人25正宗尿样建立的判定为尿3-NT进一步评估。改进的简单性和吞吐量方法允许在24小时的时间段内处理和分析两个尿液样本（n = 192）。利用非侵入性尿液采样的简便，快速，灵敏和选择性开发的方法预计将成为验证3-NT在临床条件下的作用并进一步探索氧化应激的影响的有力工具。方案的关键步骤包括使用温和的NH 4 OAc作为洗脱缓冲液的MCX微量培养板上的SPE，在具有0.01％HCOOH作为添加剂的PFP柱上进行LC分离和用于3-NT定量的MRM选择灰。该方法的未来应用是用于定量患有病理状况如炎症和神经变性疾病等的患者的3-NT浓度。所提出的临床应用方案的潜在缺陷仍有待解决。
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Disclosures
作者宣称他们没有利益冲突。
Acknowledgments
作者将承认斯科特·霍华德（Scott Howard）和阿比盖尔·马里纳克（Abigail Marinack
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Nitro-L-tyrosine | Sigma | N7389-5g | |
| 3-Nitro-L-tyrosine-13C9 | Sigma | 652296-5.0mg | |
| Mass Spec Gold Urine | Golden West Biologicals | MSG 5000-1L | |
| Oasis MCX 96-well µElution plate | Waters | 186001830BA | |
| 2 mL 96 well collection plate | Phenomenex | AH0-7194 | |
| 96 positive processor | Waters | 186005521 | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol | Sigma | 14262-2L | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV water | Sigma | 14263-2L | |
| Formic acid for mass spectrometry | Sigma | 94318-50ML-F | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | 338818-1L | |
| Ultra PFP propyl columns | Restek | 9179362 | |
| 5500 Triple quad | AB Sciex | / | Contact manufacture for more detail |
| UFLC-XR | Shimadzu | / | Contact manufacture for more detail |
| Integra 400 Plus | Roche | / | Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method |
| LCMS certified 12 x 32 mm screw neck vial | Waters | 600000751CV | |
| LCGC certified 12 x 32 mm screw neck total recovery vial | Waters | 186000384C | |
| 5 mL transport tube | Phenix | TT-3205 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2266 | |
| eLine electronic pipette | Sartorius | 730391 | |
| Microfuge centrifuge | Beckman Coulter | A46474 | |
| OHAUS balance | Kennedy Scales, inc. | 735 | |
| Vortex mixer | Bernstead Thermolyne | M16715 |
References
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