Summary
تم تطوير طريقة قياس الطيف الكتلي السائل الانتقائي والحساسي جنبا إلى جنب مع استخراج الطور الصلب الفعال على صفيحة ميكروبلات (مسكس) 96-جيدا ميكروبلات (مسكس) لقياس 3-نيتروتيروسين مجانا ( 3-نت) في البول البشري مع الإنتاجية العالية، والتي هي مناسبة للتطبيقات السريرية.
Abstract
مجانا 3-نيتروتيروسين (3-نت) وقد استخدمت على نطاق واسع باعتبارها العلامات البيولوجية المحتملة للإجهاد التأكسدي. وقد تم الإبلاغ عن مستويات متزايدة من 3-نت في مجموعة واسعة من الحالات المرضية. ومع ذلك، الطرق الحالية تفتقر إلى حساسية كافية و / أو خصوصية اللازمة لقياس مستوى الذاتية المنخفضة من 3 نت بشكل موثوق ومرهقة جدا للتطبيقات السريرية. وبالتالي، هناك حاجة ماسة للتحسين التحليلي بدقة لتحديد مستويات 3-نت والتحقق من دور 3-نت في الظروف المرضية. يعرض هذا البروتوكول تطوير اللوني السائل اللوني جنبا إلى جنب جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (لك-مس / مس) الكشف جنبا إلى جنب مع مصغر استخراج المرحلة الصلبة (سب) لقياس سريع ودقيق من 3-نت في البول البشري كعلامة بيولوجية غير الغازية للإجهاد التأكسدي. سب باستخدام لوحة 96-جيدا تبسيط ملحوظ عملية من خلال الجمع بين تنظيف العينة والتحليل تخصيب دون مشقة مملة وخطوات التبخر، والحد من استهلاك المذيبات، والتخلص من النفايات، وخطر التلوث ووقت المعالجة بشكل عام. توظيف 25 ملم خلات الأمونيوم (نه 4 أوك) في الرقم الهيدروجيني 9 كما الحل شطف سب يعزز إلى حد كبير الانتقائية. وقد تحسنت استجابة إشارة الطيف الكتلي من خلال تعديل التحولات رصد رد فعل متعددة (مرم). استخدام 0.01٪ هكوه كمادة مضافة على عمود بينتافلوروفينيل (بب) (150 مم × 2.1 مم، 3 ميكرون) تحسين استجابة إشارة آخر 2.5 أضعاف وتقصير وقت التشغيل الكلي إلى 7 دقائق. تم تحقيق الحد الأدنى من الكميات (لوق) من 10 بيكوغرام / مل (0.044 نانومتر)، مما يمثل تحسنا كبيرا في الحساسية على المقايسات المبلغ عنها. هذه الطريقة المبسطة والسريعة والانتقائية والحساسة تسمح لوحات اثنين من عينات البول (ن = 192) ليتم معالجتها في فترة 24 ساعة. وبالنظر إلى تحسن ملحوظ في الأداء التحليلي، وأخذ عينات البول غير الغازية وغير مكلفة، والفحص المقترح هو مفيد لمرحلة ما قبل السريرية والسريريةدراسات.
Introduction
وقد دفعت آثار الاكسدة على العرض السريري في طليعة في السنوات الأخيرة 1 . واحدة من المؤشرات الحيوية التي يتم استكشافها هو 3-نيتروتيروسين (3-نت)، وهو منتج مستقر نهاية تشكلت عندما تتفاعل الأنواع النيتروجين التفاعلي (رنز) مع التيروزين، وهو السلائف الناقل العصبي الكاتيكولامين. في حين أن 3-نت قد يكون القيمة السريرية كعلامة بيولوجية ل رنز في الجسم الحي، والتغيرات الكبيرة في خصائص ووظائف التيروزين قد تؤثر سلبا على البروتينات المقابلة والوظائف الخلوية 1 ، 2 . وقد اقترحت الأبحاث الناشئة أن 3-نت قد تلعب دورا هاما في الظروف الالتهابية 3 ، واضطرابات الاعصاب 4 ، 5 ، وأمراض القلب والأوعية الدموية 6 والسكري 7 وكذلك الشروط المتعلقة الإجهاد التأكسدي. ومع ذلك، هذه أوبسوتستند الروائح على نتائج من المنهجيات التي تفتقر إلى الحساسية و / أو الانتقائية 8 و 9 و 10 و 11 . وتتراوح هائلة 3-نت نطاقات تركيز للعينات البيولوجية ذكرت سابقا في الأدب أن المشاكل التحليلية الخطيرة ترتبط مع هذه المقايسات وتحتاج إلى تحسين تقني لتحديد بدقة مستويات 3-نت والتحقق من دورها في أمراض هذه الحالات .
الكميات خالية من 3-نت في المصفوفات البيولوجية يمثل تحديا خاصا للرجل والصك 8 ، 9 ، 10 ، 11 . أولا، فإن مستوى تتبع الذاتية 3-نت يتطلب الكشف فائقة الحساسية. وثانيا، وجود العديد من نظائرها مماثلة هيكليا، وخاصة التيروزين، الذي هو موجود فيالفائض الكبير، يتطلب درجة عالية من الانتقائية. ثالثا، والتشكيل الاصطناعي من 3-نت من قبل نترات التيروزين مع نترات في كل مكان والنيتريت يتطلب اهتماما خاصا أثناء إعداد العينة لتجنب المبالغة في تقدير كاذبة من 3 نت.
من بين مجموعة واسعة من المنهجيات المستخدمة لقياس 3-نت، مس / مس اعتبرت طريقة الذهب القياسية بسبب حساسية متفوقة والانتقائية 11 ، 12 ، 13 ، 14 . اللوني الغاز (غ) إلى جانب مس / مس يقدم أفضل حساسية، ومع ذلك، فإن الخطوات التي لا غنى عنها عينة مشتقة مملة جدا وتستغرق وقتا طويلا لتكون فعالة للفائدة السريرية 15 ، 16 . لك-مس / مس لا يتطلب تعقيد عينة معقدة، مما يجعلها الخيار أكثر واعدة. ومع ذلك، هناك العديد من العقبات للتغلب على مثل سينزيتيفيتي من لك-مس / مس الأساليب المذكورة في الأدب يحتاج إلى تحسين لقياس وفرة منخفضة 3-نت 7 ، 17 ، 18 ويجب تقصير فترة زمنية طويلة نسبيا لتطبيقات عالية الإنتاجية 12 ، 13 ، 17 ، 19 .
بالإضافة إلى ذلك، عند النظر في التطبيقات السريرية، والمصفوفة البيولوجية المستخدمة تلعب دورا هاما. وينبغي أن يكون من السهل وغير مكلفة للحصول على وغير الغازية إن أمكن 20 ، 21 ، 22 . البلازما، والعينة المستخدمة تقليديا في الأدب، ليست مصفوفة مرغوب فيه سريريا، لذلك تم استخدام منهجية استخدام البول الذي هو غير الغازية وفعالة من حيث التكلفة.
عدة محاولات لتطوير ريلوقد تم إجراء إيبل ومحددة لك-مس / مس المنهجيات باستخدام البول 9 ، 10 ، 11 . ومع ذلك، فقد قصروا جميعا إما أن تكون انتقائية، موثوقة أو فعالة بما فيه الكفاية للاستخدام السريري. وقد تم استجواب فعالية سب الأساسية المهيمنة باستخدام التقليدية خرطوشة المرحلة عكس (نوع C18) كما تنظيف العينة للتحليل 3-نت و سب متسلسل من تبادل الموجبة الكاتيونية قوية (سكس) والمرحلة عكس C18-أوه وقد اقترح 6 ، 7 ، 19 . استخدمت طريقة لك-مس / مس التي تم تطويرها مؤخرا عملية تنقية متعددة الخطوات من C18 سب اليدوي، اللوني عالي الضغط اللوني التحضيري (هبلك)، و سب على الانترنت لتحليل 3-نت 23 . على الرغم من أن هذه الطريقة كانت حساسة بما فيه الكفاية لأغراض سريرية، مع لوق من 0.041 نانومتر، وكانت عملية التنظيف مكثفة ومملة و ريكيالأحمر 3 مل من البول، مما يحد من جدواها لإنتاجية عالية. تم استخدام بوليمر مطبوع جزيئيا كمادة ماصة سب لتحسين كفاءة عملية التنظيف 14 ، ولكن لوق الناتج (0.7 ميكروغرام / مل) لم يكن منخفضا بما يكفي لعينات سريرية. طريقة أخرى المطلوبة ثنائي الأبعاد (2D) لك-مس / مس و اللوني المناعي لتنظيف العينة من أجل تحقيق الحد من الكشف (لود) 0.022 نانومتر 24 . في حين أن كل هذه الأساليب جعلت التقدم في تقييم 3-نت، لم تحقق أي من الحساسية والموثوقية والكفاءة اللازمة للتطبيقات السريرية.
من أجل التحقيق في علم الأمراض مجانا 3-نت ودورها كعلامة بيولوجية للإجهاد التأكسدي في البيئات السريرية، قمنا بتطوير منهجية بسيطة وفعالة ودقيقة ودقيقة، مما يتيح للتطبيقات السريرية عالية الإنتاجية 25 . A المنمنمة المختلطة الموجبة الموجبة كاتيونتم تنفيذ هانج (مسكس) 96-جيدا استخراج ميكروبلات لتحقيق تنظيف عينة بسيطة وفعالة وإثراء 3-نت في استخراج واحد تجاوز العيوب ينظر في الأساليب القائمة التي تتطلب مشتق والتبخر و 2D-لك. اللوني السائل مع 0.01٪ هكوه كمادة مضافة في المرحلة المتنقلة عرضت استجابة إشارة معززة مع دورة الزمن السريع. تم تحسين الانتقائية أيضا من خلال تطبيق معتدل نه 4 أوك شطف حل لشطف انتقائي من 3-نت، واستخدام الانتقال مرم لكلا 3-نت والمعيار الداخلي (إس). تم تعويض تأثير المصفوفة باستخدام كمية مخفضة من إس المفضل النظير 13 C المسمى نظير للتقدير الكمي. مع ظهور هذه المنهجية، والباحثين والأطباء سوف تكون قادرة على التحقق من دور 3-نت في الحالات السريرية ومواصلة استكشاف تأثير الاكسدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع الدراسات التي تنطوي على عينات البول البشري الالتزام بالإجراء الذي وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية فارماسان / علم الأعصاب (إيرب).
1. جمع عينة البول والكرياتينين (كر) تقرير
- جمع 5 مل من عينات البول صباح اليوم التالي بعد كاليفورنيا. 10 ساعة الصيام بين عشية وضحاها في أنبوب نقل 5 مل يحتوي على 250 ميكرولتر من 3 N حمض الهيدروكلوريك كمادة حافظة وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- ذوبان الجليد والدوامة 5 مل نقل البول أنبوب والطرد المركزي في جهاز للطرد المركزي (على سبيل المثال سورفال) (2297 x ج، 10 دقيقة).
- قسامة 1 مل من البول مرتين من أنبوب النقل 5 مل A.
- تحديد كر بواسطة طريقة الكرياتينين البولية 26 .
2. إعداد معيار، إس ومراقبة الجودة (ق) عينات
- إعداد محلول المخزون من 3-نت في 100 ميكروغرام / مل في الماء مع 0.01٪ هكوه المرحلة المتنقلة A (ما) وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- يصنعو 3-نت حل معيار العمل في تركيز 100 نانوغرام / مل عن طريق تمييع الحل ميكروغرام / مل 3-نت الأسهم مع ما.
- توليد معايير تتراوح بين 5 إلى 2500 بيكوغرام / مل عن طريق التخفيف من 100 نانوغرام / مل معيار العمل مع 0.15 M حمض الهيدروكلوريك حمض خالية من البول خالية من 3-نت جنبا إلى جنب مع عينات فارغة ومزدوجة فارغة.
- إعداد حل المخزون من إس 13 C 9 -3-نت في 100 ميكروغرام / مل في الماء مع ما وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- تقديم حل وتعمل في 500 جزء من الغرام / مل من التخفيف من 100 ميكروغرام / مل 13 C 9 -3-NT هو حل الأسهم مع MA.
- إنشاء خمسة مستويات من عينات مراقبة الجودة التي تغطي لوق، منخفضة ومتوسطة وعالية المستويات ( أي 10، 25، 100، 500 و 1،250 بيكوغرام / مل)، عن طريق التخفيف من 3-نت معيار العمل في البول فارغة حمضي.
3. عملية استخراج المرحلة الصلبة
- ذوبان الجليد والدوامة عينات البول، معايير وعينات مراقبة الجودة.
- إضافة عينات البول والمعايير و ق سامبليه (250 ميكرولتر لكل منهما) إلى 32 بئرا من نظيفة 2 مل 96-جيدا لوحة جمع.
- إدخال 500 بيكوغرام / مل هو حل العمل (50 ميكرولتر) إلى كل بئر ما عدا مزدوجة فارغة عينة جيدا. إضافة 0.01٪ هكوه (50 ميكرولتر) إلى عينة فارغة مزدوجة جيدا.
- إضافة لك-مس / مس المياه مع 0.1٪ هكوه (250 ميكرولتر).
- مزيج خليط أعلاه مع ماصة 8 قنوات ثلاث مرات.
- تغطية لوحة حتى تحميل سب.
- وضع لوحة استخراج مكسكس 96 جيدا ومجموعة خزان على معالج الضغط إيجابي.
- شرط لوحة استخراج مع تدفق ميوه (200 ميكرولتر) من خلال المواد الماصة.
- تتوازن عن طريق تدفق المياه مع 2٪ هكوه (200 ميكرولتر) من خلال المواد الماصة.
- تحميل حجم كامل من كل من العينات قبل مختلطة على لوحة الاستخراج قبل مكيفة بعناية مع ماصة 8 قنوات.
- تعيين ضغط إيجابي منخفض (على سبيل المثال ، 3 يسي) على المعالج الضغط الإيجابي للسماح للخليط لتتدفق ثرالعازلة ببطء، ضبط الضغط إذا لزم الأمر.
- غسل الآبار عن طريق تدفق المياه مع 2٪ هكوه (200 ميكرولتر) من خلال المواد الماصة.
- غسل الآبار التي تتدفق الميثانول (200 ميكرولتر) من خلال المواد الماصة.
- غسل الآبار عن طريق تدفق المياه (200 ميكرولتر) من خلال المواد الماصة.
- تجفيف الآبار تماما مع إعداد الضغط الإيجابي عالية (على سبيل المثال ، 40 رطل / بوصة مربعة) على المعالج الضغط الإيجابي.
- استبدال الخزان مع نظيفة لوحة جمع 96 مل 96-جيدا.
- تطبيق 25 ملي نه 4 أوك في درجة الحموضة 9 (50 ميكرولتر) إلى أزل الحليلة الاحتفاظ و إس من لوحة الاستخراج.
- ماصة لك-مس المياه مع 5٪ هكوه (50 ميكرولتر) لتحييد شطافة.
- مزيج مع ماصة 8 قنوات ثلاث مرات وتقديم إلى لك-مس / محطة مس للتحليل.
4. لك-مس / مس التحليل
- قياس دقيق 2،000 مل من المياه لك-مس مع اسطوانة متدرجة ونقله إلى زجاجة 2 لتر.
- Pإيبيت 200 ميكرولتر هكوه النقي في زجاجة أعلاه تحتوي على المياه لك-مس.
- تخلط جيدا والتسمية كما المرحلة المتنقلة A (ما). تضمين الأحرف الأولى، وتاريخ إعداد وتاريخ انتهاء الصلاحية.
- تأخذ زجاجة 2 لتر من لك-مس الميثانول والتسمية والمرحلة المتنقلة B (مب) مع تاريخ البدء وتاريخ انتهاء الصلاحية.
- تعيين درجة الحرارة لصناعة السيارات في العينات إلى 4 درجات مئوية.
- وضع لوحة جمع مع عينات أعدت في الاوتوماتيكى.
- وضع عمود بب (150 ملم × 2.1 ملم معرف، 3 ميكرون) وعمود الحرس في الفرن.
- ضبط درجة حرارة الفرن إلى 30 درجة مئوية.
- تتوازن 10 دقيقة باستخدام طريقة الاستحواذ مع شطف التدرج لك كما هو مبين في الجدول 1 .
| الوقت (بالدقائق) | وحدة | أحداث | معامل |
| 0 | مضخات | مضخة B كونك. | 5 |
| 0.5 | مضخات | مضخة B كونك. | 20 |
| 1 | مضخات | مضخة B كونك. | 50 |
| 3 | مضخات | مضخة B كونك. | 80 |
| 4 | مضخات | مضخة B كونك. | 90 |
| 4.01 | مضخات | مضخة B كونك. | 95 |
| 5.5 | مضخات | مضخة B كونك. | 95 |
| 5.6 | مضخات | مضخة B كونك. | 5 |
| 7 | مراقب | توقف |
الجدول 1: الكروماتوغرافيا السائل التدرج ظروف شطف
- إنشاء قائمة دفعات بما في ذلكالمعايير، ق وعينات البول.
- بدء دفعة عن طريق الحقن من العينات التي تم إعدادها (12 ميكرولتر).
5. تحديد الذروة، التكامل وعملية البيانات
- السيطرة على الحصول على البيانات ومعالجتها باستخدام البرنامج.
- تحديد ودمج 3-نت و إس قمم لجميع العينات.
- إنشاء منحنى القياسية مع مجموعة من 10-2،500 بيكوغرام / مل ل 3-نت الكميات عن طريق الانحدار الخطي لنسبة منطقة الذروة من 3-نت و إس مقابل التركيز الاسمي 3-نت مع عامل ترجيح 1 / س.
- قياس جميع العينات باستخدام منحنى القياسية.
- تحديد ما إذا كانت عينات مراقبة الجودة تقع في النطاق المحدد.
- تحويل تركيزات الكشف من عينات البول إلى النتائج النهائية في وحدة نم أو نمول / مليول كر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويوضح الشكل 1 أن 3-نت تماما كروماتوغرافيا فصلها عن نظائرها التيروزين مماثلة هيكليا أخرى تحت شرط لك الأمثل، مما يلغي التدخلات التي شاركت في التصفية بسبب هذه المركبات المفرطة إلى حد كبير، وبالتالي يعزز درجة الانتقائية الفحص. وبالإضافة إلى ذلك، فإن شطف التدرج مع هكوه 0.01٪ كما المضافة في ما والميثانول بمعدل تدفق 0.45 مل / دقيقة يسمح شطف السريع من 3-نت ( أي 3 دقائق مع زمن التحول من 7 دقائق).
الشكل 1: خط الأساس لك الفصل الكروماتوغرافي من 3-نت من نظائرها تيروسين أخرى في الحل القياسي. ( أ ) p -Tyrosine؛ ( ب ) م -Tyrosine. ( C ) o - التيروزين. ( D ) كل-تيروسين؛ ( E ) 3-نت. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويبين الشكل 2 أنه لم يلاحظ أي إشارة 3-نت في عينة فارغة مزدوجة، مشيرا إلى أي تشكيل من القطع الأثرية 3-نت خلال العملية برمتها. الشكل 3 يوضح كروماتوغرامز التمثيلية مرم من 3-نت و إس لفرد صحي. كما يمكن أن يرى، لا يلاحظ أي إشارات تداخل في أوقات الاحتفاظ 3-نت و إس. وعلاوة على ذلك، لوحظ وجود فرق أقل من ± 6٪ في 3-نت بين عينات البول غير المسدودة والمرتفعة التي تم جمعها مع النتريت (50 ميكرومتر)، والنترات (50 ميكرومتر) والتيروزين (50 مجم / لتر) 25 ، إلى خصوصية الفحص.
her.within الصفحات = "1"> 
الشكل 2: كروماتوغرامز مرم من 3-نت و إس في عينة مزدوجة فارغة ممثل. ( A ) 3-نت مرم كميتيون 227.0> 90.0؛ ( B ) كميتر إس مرم 236.0> 189.0. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مرم كروماتوغرامز من 3-نت و إس في عينة البول ممثل من الناس الأصحاء. ( A ) 3-نت مرم كميتيون 227.0> 90.0؛ ( B ) كميتر إس مرم 236.0> 189.0. يرجى النقر عليهإعادة لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم إنشاء منحنى القياسية عن طريق استخراج البول فارغة حمضي ارتفعت مع 3-نت في نطاق 10-2،500 بيكوغرام / مل عن طريق التآمر نسبة منطقة الذروة من 3 نت و إس مقابل التركيز الاسمي من 3 نت مع تركيب خطي من 1 / x الترجيح. ويوضح الشكل 4 منحنى معياري تمثيلي. وقد حدد اللد، الذي يعرف بأنه أقل تركيز مع نسبة إشارة إلى ضوضاء أكبر من ثلاثة، ليكون 2 بغ / مل (0.0088 نم). تم تحديد لوق على أن تكون 10 بيكوغرام / مل (0.044 نانومتر) بحكم تعريفها كأقل تركيز يتم قياسه ضمن ± 20٪ من عدم الدقة والدقة مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء أكبر من عشرة.
الشكل 4: ممثل 3-نت منحنى القياسية فيمجموعة من 10-2،500 بيكوغرام / مل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الاختلافات الكبيرة في تركيزات سبق ذكرها في الأدب عن الحرة الذاتية 3-نت في عينات البول البشرية تكشف عن المشاكل المنهجية المرتبطة المقايسات المتاحة 8 ، 9 ، 10 ، 11 . لا يزال تحديد دقيق للمستوى القاعدي المنخفض من 3-نت في البول البشري مهمة صعبة تتطلب الاحتياطات الخاصة لإعداد العينات وتحليل لك-مس / مس. هذا البروتوكول يحدد إجراء سب رواية جنبا إلى جنب مع انتقائي لك-مس / مس الكشف الذي يسمح لتحديد محددة وحساسة من البول 3-نت مع الإنتاجية العالية.
اختيار دقيق من المعلمات مرم تحسين الانتقائية للكشف عن 3-نت. نقل مرم م / ض 236.0> 96.0 من إس ل 3-نت في البلازما 27 تسبب تلوثا شديدا لعينات البول. أنظف، 9 أضعاف زيادة في إشارةتم تحقيق الاستجابة مع الانتقال مرم م / ض 236.0> 189.0. مرم ترانزميسيون m / z 227.0> تم اختيار 90.0 لتقدير كمي 3 نت بسبب التداخل الشديد باستخدام الانتقال الأكثر كثافة m / z 227.0> 181.0. ويرد في الجدول 2 ملخص للتحولات المفصلة في آلية الرصد والإبلاغ والمعلمات المركبة.
| المحللة | انتقال مرم (م / ض) | دب (V) | إب (V) | سي (إيف) | سكب (V) |
| 3-نت (كميا) | 227.0> 90.0 | 50 | 10 | 38 | 13 |
| 3-نت (مؤهل) | 227.0> 103.9 | 50 | 10 | 45 | 16 |
| 13 C 9 -NT (إس) | 236.0> 189.0 | 50 | 10 | 21 | 14 |
| رذاذ ايون الجهد: 2200 V. درجة الحرارة: 600 درجة مئوية؛ غاز الستائر: 35؛ كاد غاز: 9؛ غاز البخاخات (GS1): 50؛ غاز سخان (GS2): 55. | |||||
الجدول 2: الظروف المثلى لمقاييس الرصد واإلبالغ.
العمود التقليدي C18 من نوع يستخدم عادة ل كروماتوغرافي الفصل لك 3-نت في الأدب 12 ، 13 ، 17 ، 19 عادة ما يتطلب وقتا طويلا للحد من التدخل، مما يجعلها غير مواتية لانتاجية عالية. في هذا البروتوكول، تم استخدام عمود بب لتحسين لك الفصل الكروماتوغرافي من 3-نت على أساس الاحتفاظ المحسن للمركبات القطبية 22 ،> 27 ، 28 . تركيز الإضافات الطور المتحرك له تأثير هام على كثافة الإشارة 25 ، 28 . تم العثور على هكوه عند 0.01٪ لتكون المضافة المثلى في ماجستير ما أدى إلى كسب إشارة 2.5 أضعاف أكثر من تركيز 0.1٪، والمزيد من الانخفاض في تركيز انخفاض استجابة إشارة. تم إنشاء الملف الشخصي شطف التدرج باستخدام 0.01٪ هكوه في الماء (ما) والميثانول (مب) مع معدل تدفق 0.45 مل / دقيقة، وتحقيق فصل الأمثل وسرعة شطف من 3 نت في غضون 3 دقائق مع وقت تشغيل الكلي من فقط 7 دقائق، مما يسمح تحليل أسرع بكثير من 3-نت في المصفوفات البيولوجية المعقدة مما ورد في الأدب 12 ، 13 ، 17 ، 19 .
لمعالجة عدم فعالية خرطوشة المرحلة عكس التقليدية (نوع C18) صاستخدمنا حديثا ل سب من العينات البيولوجية 6 ، 7 ، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة لك-مس / مس لتحديد 3-نت في البلازما البشرية من قبل سب على ثنائي وظيفية لوحة 96-مسكس واحد ثنائي 27 ، مما أدى إلى تحسينات في سب والكفاءة والانتقائية. ومع ذلك، فإن عيب واضح لجميع النهج سب في الأدب هو التبخر الشاقة والخطر المرتبطة التبخر وخطوات إعادة التشكيل. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب طريقة البلازما إضافية قبل غسل لوحة الاستخراج للقضاء على التلوث من المواد الماصة. في هذا البروتوكول، تم القضاء على هذه السلبيات من قبل سب مصممة مع استخدام مصغر 96-جيدا ميكروبلات. تم العثور على اختيار الحل شطف لتكون حاسمة لكفاءة الاستخراج. لوحظت تداخلات كبيرة في عينات البول من خلال تطبيق محلول نه 4 أوه شطف مشترك مع تركيبة متنوعة من ميوه. وقد افترض أن التدخلتم إزالتها مع المواد الحليلة بسبب قوة شطف قوية من الحل الميثانولي نه 4 أوه شطف، مما أدى بالتالي إلى انتقائية منخفضة. لتحسين الانتقائية، كان من الضروري تحديد الحل الذي سيكون على حد سواء قوية بما فيه الكفاية لإلقاء 3-نت و ضعيفة بما فيه الكفاية لعدم تسبب شطف من المركبات المسببة للتداخل. بعد تحقيق مفصل من أقل الأساسي NH 4 OAC في درجة الحموضة وتركيزات مختلفة، تم العثور على OAC حل 25 ملي NH 4 مع الرقم الهيدروجيني 9 ليكون الأمثل كحل شطف. مع حل شطف الأمثل، تم حل مسألة المركبات المسببة للتداخل وحققت مكاسب بنسبة 40٪ في الحساسية مقارنة مع الميثانوليك نه 4 أوه حل شطف منتظم.
الجدول 3 يقدم ملخصا تفصيليا للأداء التحليلي لهذا البروتوكول 25 مقارنة مع غيرها من الطرق المتاحة لتحديد الحرة 3-نت في المصفوفات البيولوجية. هذا البروتوكول من العديد من المزايا المتميزة على المقايسات المبلغ عنها سابقا. أولا، من خلال توظيف ميكروبلات استخراج 96 جيدا، تم تحقيق خطوة واحدة لتنظيف العينة والتحليل تخصيب، وتجنب دورات 1-5 من التبخر وإعادة تشكيل المطلوبة عادة في أساليب 3-نت التي تنطوي على سب. وثانيا، انخفض استخدام المذيب لكل عينة ل سب بشكل كبير، من 5.5 - 118 مل إلى 1.1 مل فقط، وهو ما يمثل خفض 5-107 مرات في المذيبات والتخلص من النفايات. وثالثا، تم تقليل زمن الاستجابة لكل عينة بمقدار 2-7 أضعاف مقارنة مع المقايسات الأخرى، وكان أسرع بنسبة 30٪ من طريقة البلازما السابقة. رابعا، كان مطلوبا كمية أقل من 10-3000 أضعاف من الأفضل 13 C المسمى المسمى "إس" لتعويض تأثير المصفوفة. وأخيرا، يمثل هذا الفحص تحسنا كبيرا في الحساسية على أساليب التقليدية الأخرى لك-مس / مس القائم على سب لالكمي من البول 3-نت.
طرق ">طريقة
+ الترشيح
(لوحة مسكس)
+ سب على الانترنت
الجدول 3: كومباريابن الأداء التحليلي لهذا البروتوكول مع الفحوصات الحالية للكشف عن 3-نت في المصفوفات البيولوجية
تم تقييم الصدقية التحليلية والسريرية للمقايسة المقترحة من خلال تحديد الفاصل الزمني المرجعي للبول 3-نت التي أنشئت من عينات البول الأصيلة من 82 شخصا أصحاء 25 . يسمح تحسين البساطة وطريقة الإنتاجية اثنين من لوحات عينات البول (ن = 192) ليتم معالجتها وتحليلها في فترة زمنية 24 ساعة. ومن المتوقع أن تكون الطريقة المتقدمة باستخدام أخذ العينات البول غير الغازية، كونها بسيطة وسريعة وحساسة وانتقائية، أداة قوية في التحقق من دور 3-نت في الظروف السريرية ومواصلة استكشاف تأثير الاكسدة. الخطوات الحاسمة للبروتوكول تشمل سب على ميكروسكوب مسكس باستخدام NH4OAc خفيفة كما العازلة شطف، لك الانفصال على عمود بب مع 0.01٪ هكوه كخيار المضافة و مرم ل 3-نت كوانيفيكانشوئها. التطبيق المستقبلي لهذه الطريقة هو لقياس 3-نت تركيزات في المرضى الذين يعانون من الحالات المرضية مثل الاضطرابات الالتهابية والتعصبية، وما إلى ذلك لا تزال المزالق المحتملة للبروتوكول المقترح للتطبيقات السريرية التي يتعين معالجتها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنه لا يوجد لديهم أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وسوف يعترف المؤلفان بسكوت هوارد وأبيغيل ماريناك على الدعم والتنسيق العامين لهذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Nitro-L-tyrosine | Sigma | N7389-5g | |
| 3-Nitro-L-tyrosine-13C9 | Sigma | 652296-5.0mg | |
| Mass Spec Gold Urine | Golden West Biologicals | MSG 5000-1L | |
| Oasis MCX 96-well µElution plate | Waters | 186001830BA | |
| 2 mL 96 well collection plate | Phenomenex | AH0-7194 | |
| 96 positive processor | Waters | 186005521 | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol | Sigma | 14262-2L | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV water | Sigma | 14263-2L | |
| Formic acid for mass spectrometry | Sigma | 94318-50ML-F | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | 338818-1L | |
| Ultra PFP propyl columns | Restek | 9179362 | |
| 5500 Triple quad | AB Sciex | / | Contact manufacture for more detail |
| UFLC-XR | Shimadzu | / | Contact manufacture for more detail |
| Integra 400 Plus | Roche | / | Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method |
| LCMS certified 12 x 32 mm screw neck vial | Waters | 600000751CV | |
| LCGC certified 12 x 32 mm screw neck total recovery vial | Waters | 186000384C | |
| 5 mL transport tube | Phenix | TT-3205 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2266 | |
| eLine electronic pipette | Sartorius | 730391 | |
| Microfuge centrifuge | Beckman Coulter | A46474 | |
| OHAUS balance | Kennedy Scales, inc. | 735 | |
| Vortex mixer | Bernstead Thermolyne | M16715 |
References
- Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).
- Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
- Baraldi, E., et al. 3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children. Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).
- Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association? J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).
- Butterfield, D. A., et al. Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease. Brain Res. 1148, 243-248 (2007).
- Hui, Y., et al. A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery. Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).
- Kato, Y., et al. Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).
- Duncan, M. W. A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine. Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).
- Ryberg, H., Caidahl, K. Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples. J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).
- Tsikas, D. Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry. Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).
- Tsikas, D., Duncan, M. W. Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective. Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).
- Iwasaki, Y., et al. Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).
- Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine. J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).
- Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases. Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).
- Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state. Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).
- Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).
- Marvin, L. F., et al. Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution. Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).
- Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage. J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).
- Chen, H. J. C., Chiu, W. L. Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).
- Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability. Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).
- Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies. Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples. Talanta. 159, 238-247 (2016).
- Chao, M. R., et al. Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).
- Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker. Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine. Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).
- Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. , Mannheim. Available from: https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html 2011-2011 (2011).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker. Talanta. 140, 45-51 (2015).
- Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication. J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).
