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Chemistry

नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए मानव मूत्र में 3-नाइट्रोटोसाइन की लघुकृत चरण के निष्कर्षण और एलसी-एमएस / एमएस की जांच का एकीकरण

doi: 10.3791/55778 Published: July 14, 2017

Summary

मिश्रित-मोड केशन-एक्सचेंज (एमसीएक्स) 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्रेट पर एक कुशल ठोस चरण निष्कर्षण के साथ मिलकर एक चयनात्मक और संवेदनशील तरल क्रोमैटोग्राफी अग्रानुक्रमित स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) विधि मुक्त 3-नाइट्रोटोसाइन की माप के लिए विकसित की गई थी 3-एनटी) मानव मूत्र में उच्च थ्रूपूट के साथ, जो नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है।

Abstract

मुक्त 3-नाइट्रोटोसाइन (3-एनटी) ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए एक संभावित बायोमार्कर के रूप में बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। 3-एनटी के बढ़ते स्तरों की विस्तृत विविधता में बताया गया है। हालांकि, मौजूदा तरीकों में 3 एनटी के कम अंतर्जात स्तर को मज़बूती से मापने के लिए आवश्यक पर्याप्त संवेदनशीलता और / या विशिष्टता की कमी होती है और नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए बहुत बोझिल होते हैं। इसलिए, 3-एनटी के स्तर को सटीक रूप से मापने के लिए विश्लेषणात्मक सुधार की आवश्यकता होती है और 3-एनटी की स्थिति में रोग की स्थितियों की पुष्टि करता है। यह प्रोटोकॉल एक गैर-इनवेसिव बायोमार्कर के रूप में मानव-मूत्र में 3-एनटी के तीव्र और सटीक माप के लिए एक लघु ठोस तरल निष्कर्षण (एसपीई) के साथ मिलाकर एक उपन्यास तरल क्रोमैटोग्राफी अग्रानुक्रमिक स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) का पता लगाता है। ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए एक 96-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग करके एसपीई स्पेशलाइज्ड डेरिवेटिशन और वाष्पीकरण कदमों के बिना नमूना सफाई और विश्लेषक संवर्धन को जोड़कर प्रक्रिया को सरल बनाया।, विलायक खपत को कम करने, अपशिष्ट निपटान, संदूषण का खतरा और समग्र प्रसंस्करण समय। पीएच 9 पर 25 एमएम अमोनियम एसीटेट (एनएच 4 ओएएसी) के रोजगार के रूप में एसपीई अल्यूशन समाधान ने चयन क्षमता को बढ़ाया। मास स्पेक्ट्रोमेट्री संकेत प्रतिक्रिया कई प्रतिक्रिया निगरानी (एमआरएम) संक्रमण के समायोजन के माध्यम से सुधार हुई थी। 0.01% एचसीओईएच का उपयोग पेंटाफ्लोरोफेनिल (पीएफपी) कॉलम (150 मिमी x 2.1 मिमी, 3 माइक्रोन) में जोड़कर किया गया है, जो सुधार संकेत प्रतिक्रिया 2.5 गुना और समग्र रन समय को 7 मिनट तक छोटा किया गया है। 10 पीजी / एमएल (0.044 एनएम) के क्वालिटेन (एलएलओयू) की एक सीमा कम की गई, रिपोर्ट किए गए एशेज में महत्वपूर्ण संवेदनशीलता में सुधार का प्रतिनिधित्व किया गया। यह सरलीकृत, तेज़, चयनात्मक और संवेदनशील तरीके से मूत्र नमूनों (एन = 1 9 2) के दो प्लेट्स को 24 घंटे के समय में संसाधित किया जा सकता है। स्पष्ट रूप से सुधारित विश्लेषणात्मक प्रदर्शन और गैर-आक्रामक और सस्ती मूत्र नमूना को देखते हुए प्रस्तावित परख पूर्व-नैदानिक ​​और नैदानिक ​​के लिए फायदेमंद हैअध्ययन करते हैं।

Introduction

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क्लिनिकल प्रस्तुति पर ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रभाव हाल के वर्षों 1 में सबसे आगे हैं। जैवमार्करों में से एक का पता लगाया जा रहा है 3-नाइट्रोटोस्सिन (3-एनटी), एक अंत स्थिर उत्पाद होता है, जब प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियां (आरएनएस) एक कैटेकोलामाइन न्यूरोट्रांसमीटर अग्रदूत के साथ बातचीत करती हैं। जबकि 3-एनटी में विवो में आरएनएस के लिए बायोमार्कर के रूप में क्लिनिकल वैल्यू हो सकता है , गुणों के गुणों में परिवर्तन और टाइरोसिन के कार्य में प्रतिकूल प्रोटीन और सेलुलर फ़ंक्शंस 1 , 2 पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ सकता है। उभरते अनुसंधान ने सुझाव दिया है कि 3-एनटी भड़काऊ परिस्थितियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं 3 , न्यूरोडिगेनेरेटिव विकार 4 , 5 , हृदय रोग 6 और मधुमेह 7 और साथ ही ऑक्सीडेटिव तनाव से संबंधित स्थितियां। हालांकि, ये ऑब्ज़Rvations संवेदना और / या चयनात्मकता 8 , 9 , 10 , 11 में कमी के तरीके से परिणाम पर आधारित हैं। पहले से साहित्य में जैविक नमूनों के लिए 3-एनटी एकाग्रता श्रेणी का पता चलता है कि गंभीर विश्लेषणात्मक समस्याएं इन assays से जुड़े हैं और तकनीकी सुधार के लिए 3-एनटी के स्तर को सटीक रूप से मापने और इन स्थितियों के विकृति में इसकी भूमिका की पुष्टि करने की आवश्यकता है ।

जैविक मैट्रिक्स में नि: शुल्क 3-एनटी का मात्रा मनुष्य और साधन के लिए एक विशेष चुनौती प्रस्तुत करता है 8 , 9 , 10 , 11 । सबसे पहले, अंतर्जात 3-एनटी के स्तर का पता लगाने के लिए अति-संवेदनशील पहचान की आवश्यकता होती है; दूसरा, कई संरचनात्मक रूप से समान समानताएं, विशेष रूप से टायरोसिन का अस्तित्व, जो वर्तमान में मौजूद हैविशाल अतिरिक्त, एक उच्च स्तर की चयनात्मकता की आवश्यकता होती है; तीसरा, 3-एनटी का सर्वव्यापी गठन सर्वव्यापक नाइट्रेट और नाइट्राइट के साथ टाइरोसिन नाइट्रेशन द्वारा 3-एनटी के झूठी आक्षेप से बचने के लिए नमूना तैयार करने के दौरान विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है।

3-एनटी, एमएस / एमएस को मापने के लिए नियोजित विभिन्न प्रकारों में अपनी श्रेष्ठ संवेदनशीलता और चुनिंदा 11 , 12 , 13 , 14 के कारण स्वर्ण मानक विधि माना गया है। गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) युग्मित एमएस / एमएस सबसे अच्छी संवेदनशीलता प्रदान करता है, तथापि, अपरिहार्य नमूना व्युत्पन्न कदम बहुत थकाऊ होते हैं और नैदानिक ​​उपयोगिता 15 , 16 के लिए कुशल होने के लिए समय लेने वाली होती हैं। एलसी-एमएस / एमएस को जटिल नमूना व्युत्पत्ति की आवश्यकता नहीं है, जिससे यह और अधिक होनहार विकल्प बनता है। बहरहाल, इस तरह से दूर करने के लिए कई बाधाएं हैंसाहित्य में एलसी-एमएस / एमएस विधियों की संवेदनशीलता को कम प्रचुर मात्रा में 3-एनटी 7 , 17 , 18 के माप के लिए सुधार करने की जरूरत है और उच्च-थ्रुपुट अनुप्रयोगों के अपेक्षाकृत लंबा बदलाव समय 12 , 13 , 17 , 1 9

इसके अतिरिक्त, नैदानिक ​​अनुप्रयोगों पर विचार करते समय, जैविक मैट्रिक्स का इस्तेमाल किया गया एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यदि संभव हो तो प्राप्त करने के लिए आसान और सस्ती होना चाहिए और गैर-इनवेसिव होना चाहिए 20 , 21 , 22 । प्लाज्मा में पारंपरिक रूप से इस्तेमाल किया नमूना, एक नैदानिक ​​रूप से वांछनीय मैट्रिक्स नहीं है, इसलिए मूत्र का उपयोग करने वाला एक तरीका है जो गैर-इनवेसिव और लागत प्रभावी है।

रिले को विकसित करने के कई प्रयासयोग्य और विशिष्ट एलसी-एमएस / एमएस पद्धतियां मूत्र 9 , 10 , 11 के द्वारा बनाई गई हैं। हालांकि, वे सभी नैदानिक ​​उपयोग के लिए चुनिंदा, विश्वसनीय या कुशल होने के लिए कम हो गए हैं। पारंपरिक उलट चरण कारतूस 3-NT विश्लेषण के लिए नमूना सफाई के रूप में (C18 प्रकार) का उपयोग करते हुए प्रमुख एसपीई की प्रभावशीलता पर सवाल उठाया गया है और मजबूत कटियन विनिमय के एक अनुक्रमिक एसपीई (SCX) और उलट चरण C18-OH 6 प्रस्ताव किया गया है, 7 , 1 9 हाल ही में विकसित एलसी-एमएस / एमएस पद्धति ने मैनुअल सी 18 एसपीई, तैयार करने वाले उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) की बहु-चरण शुद्धि प्रक्रिया का इस्तेमाल किया और 3-एनटी 23 के विश्लेषण के लिए ऑनलाइन एसपीई यद्यपि यह विधि क्लिनिकल प्रयोजनों के लिए पर्याप्त संवेदनशील थी, लेकिन 0.041 एनएम के एलएलओएक के साथ, सफाई प्रक्रिया गहन और थकाऊ थी और आवश्यक थीलाल मूत्र के 3 एमएल, उच्च-थ्रूपुट के लिए इसकी व्यवहार्यता को सीमित करना। शुद्धिकरण प्रक्रिया 14 की दक्षता में सुधार के लिए एक आणविक रूप से अंकित किए गए बहुलक को एसपीई sorbent के रूप में कार्यरत किया गया था, लेकिन जिसके परिणामस्वरूप एलएलयूएक्स (0.7 माइक्रोग्राम / एमएल) नैदानिक ​​नमूनों के लिए पर्याप्त नहीं था। 0.022 एनएम 24 की पहचान (एलओडी) की सीमा को प्राप्त करने के लिए नमूना सफाई के लिए दो-आयामी (2 डी) एलसी-एमएस / एमएस और इम्यूनोफाफ़िनी क्रोमैटोग्राफी की आवश्यकता है। हालांकि इन सभी विधियों ने 3-एनटी के आकलन में प्रगति की है, लेकिन कोई भी नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक संवेदनशीलता, विश्वसनीयता और दक्षता हासिल नहीं कर पाया है।

नि: शुल्क 3-एनटी और नैदानिक ​​सेटिंग्स में ऑक्सीडेटिव तनाव के बायोमार्कर के रूप में इसकी भूमिका की जांच के लिए हमने एक पद्धति विकसित की है जो सरल, कुशल, सटीक और सटीक है, जो उच्च-थ्रूप्थ नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए सक्षम है 25 । एक छोटा मिश्रित मिश्रित मोड cationहेंज (एमसीएक्स) 96-अच्छी तरह से निष्कर्षण माइक्रोप्लेट को एक निष्कर्षण में 3-एनटी की सरल और प्रभावी नमूना सफाई और संवर्धन प्राप्त करने के लिए कार्यान्वित किया गया था जो कि मौजूदा विधियों में देखा जाने वाले दोष को दरकिनार करते हैं, जिन्हें व्युत्पत्ति, वाष्पीकरण और 2 डी-एलसी की आवश्यकता होती है। 0.01% एचसीयूएच के साथ तरल क्रोमैटोग्राफी मोबाइल चरण में एक योजक के रूप में तेजी से चक्र समय के साथ एक उन्नत संकेत प्रतिक्रिया की पेशकश की। 3-एनटी के चयनात्मक क्षीणन के लिए हल्के एनएच 4 ओएक एल्यूशन समाधान के उपयोग से और 3-एनटी और आंतरिक मानक (आईएस) दोनों के लिए एमआरएम संक्रमण का उपयोग करके चयन को और सुधार किया गया। मात्रा का ठहराव के लिए पसंदीदा 13 सी-लेबिलिड समस्थानिक IS के कम मात्रा का उपयोग करके मैट्रिक्स प्रभाव को मुआवजा दिया गया था। इस पद्धति के आगमन के साथ, शोधकर्ताओं और चिकित्सक 3-एनटी की नैदानिक ​​परिस्थितियों में भूमिका की पुष्टि कर सकते हैं और ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रभाव का पता लगा सकते हैं।

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Protocol

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मानव मूत्र नमूनों से सम्बंधित सभी अध्ययन Pharmasan / Neuroscience संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा अनुमोदित प्रक्रिया का पालन किया गया था।

1. मूत्र नमूना संग्रह और क्रिएटिनिन (सीआर) निर्धारण

  1. सीए के बाद अगली सुबह के मूत्र नमूनों के 5 एमएल लीजिए। 10 घंटे रात भर उपवास 5 एमएल परिवहन ट्यूब ए जिसमें 250 μL 3 एन एचसीएल को परिरक्षक और 20 डिग्री सेल्सियस तक का उपयोग करें।
  2. पिघलना और भंवर 5 एमएल परिवहन मूत्र एक ट्यूब और एक अपकेंद्रित्र में अपकेंद्रित्र ( उदाहरण के लिए Sorvall) (2297 xg, 10 मिनट)।
  3. 5 मिलीलीटर परिवहन ट्यूब ए से विभाज्य 1 एमएल का मूत्र दो बार
  4. एक मूत्र क्रिएटिनिन विधि 26 द्वारा सीआर निर्धारित करें।

2. मानक, आईएस और गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) नमूनों की तैयारी

  1. 0.01% एचसीओओएच मोबाइल चरण ए (एमए) के साथ 3-एनटी के 100 मीटर / एमएल में स्टॉक समाधान तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. बनानाएमए के साथ 100 μg / mL 3-NT स्टॉक समाधान को कम करके 100 एनजी / एमएल की एकाग्रता पर एक 3-एनटी काम मानक समाधान
  3. 0.15 एम एचसीएल के साथ 100 एनजी / एमएल वर्किंग स्टिकर के साथ 5 से 2500 पीजी / एमएल तक के मानकों को उत्पन्न करें और 3-एनटी के अम्लीकृत खाली मूत्र खाली और डबल रिक्त नमूने के साथ।
  4. एमएसए के साथ पानी में 100 μg / एमएल पर आईएस 13 सी 9 -3-एनटी का स्टॉक समाधान तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. 100 ग्राम / एमएल 13 सी 9 -3-एनटी एमआई के साथ स्टॉक समाधान के कमजोर पड़ने से 500 पीजी / एमएल पर एक आईएस कामकाज समाधान बनायें
  6. एलओएलएसी, कम, मध्यम और उच्च स्तर ( यानी , 10, 25, 100, 500 और 1250 पीजी / एमएल) को कवर किए गए क्यूसी नमूनों के पांच स्तरों की स्थापना, एसिडिफाइड खाली मूत्र में 3-एनटी कामकाजी मानक के कमजोर पड़ने से।

3. ठोस चरण निष्कर्षण प्रक्रिया

  1. पिघलना और भंवर मूत्र के नमूने, मानकों और क्यूसी नमूनों
  2. मूत्र के नमूनों, मानकों और क्यूसी नमक जोड़ेंएक साफ 2 एमएल 96-अच्छी तरह से संग्रह प्लेट के 32 कुओं के लिए लेस (250 μL प्रत्येक)
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से डबल रिक्त नमूना को छोड़कर 500 ग्राम / एमएल का कार्य समाधान (50 μL) का परिचय दें। 0.01% एचसीयूएच (50 μL) को डबल रिक्त नमूना को अच्छी तरह से जोड़ें।
  4. 0.1% एचसीओईएचएच (250 μL) के साथ एलसी-एमएस / एमएस पानी जोड़ें।
  5. एक 8-चैनल विंदुक के साथ उपरोक्त मिश्रण को तीन बार मिलाएं।
  6. जब तक SPE लोड हो रहा है तब तक प्लेट को कवर करें।
  7. एक एमसीएक्स 96-अच्छी निष्कर्षण प्लेट और सकारात्मक दबाव प्रोसेसर पर एक संग्रह जलाशय रखें।
  8. शोर के माध्यम से मेओएच (200 μL) बहने वाली निकासी प्लेट।
  9. शर्बत के माध्यम से 2% एचसीयूओएच (200 μL) के साथ पानी बहकर संतुलित करें।
  10. प्री-कंडीशन्ड निष्कर्षण प्लेट पर 8-चैनल विंदुक के साथ पूर्व-मिश्रित नमूनों में से प्रत्येक की पूरी मात्रा लोड करें।
  11. सकारात्मक दबाव प्रोसेसर पर कम सकारात्मक दबाव ( उदाहरण के लिए , 3 साई) सेट करें जिससे मिश्रण को थ्रोन को प्रवाह करने की अनुमति मिल सकेधीरे-धीरे शर्बत को धीरे-धीरे दबाएं, यदि आवश्यक हो तो दबाव को समायोजित करें
  12. शर्बत के माध्यम से 2% एचसीयूएचएच (200 μL) के साथ पानी बहकर कुओं को धो लें
  13. शर्बत के माध्यम से मेथनॉल (200 μL) बहकर कुओं को धो लें
  14. शर्बत के माध्यम से पानी बहने वाले कुओं (200 μL) को धो लें
  15. सकारात्मक दबाव प्रोसेसर पर उच्च सकारात्मक दबाव सेटिंग ( जैसे , 40 साई) के साथ पूरी तरह से कुओं को सूखा।
  16. जलाशय को साफ 2 एमएल 96-अच्छी तरह से संग्रह प्लेट के साथ बदलें
  17. पीएच 9 (50 μL) पर 25 एमएम एनएच 4 ओएसी लागू करें और बनाए रखने वाले विश्लेषक को नमस्कार और निष्कर्षण प्लेट से है।
  18. 5% एचसीयूओएच (50 μL) के साथ पाइपेट एलसी-एमएस पानी को अलगाव को निष्क्रिय करने के लिए
  19. 8 बार चैनल पिपेट के साथ तीन बार मिक्स करें और विश्लेषण के लिए एलसी-एमएस / एमएस स्टेशन पर जमा करें।

4. एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण

  1. सटीक रूप से स्नातक की उपाधि वाले सिलेंडर के साथ 2,000 एमएल एलसी-एमएस पानी को मापते हैं और इसे 2 एल बोतल में स्थानांतरित कर देते हैं।
  2. पीआईपीटीई 200 μL शुद्ध एचसीओओएच एलसी-एमएस पानी युक्त उपरोक्त बोतल में।
  3. अच्छी तरह मिक्स करें और मोबाइल चरण ए (एमए) के रूप में लेबल करें। आरंभिक, तैयारी की तारीख और समाप्ति तिथि शामिल करें
  4. एलसी-एमएस मेथनॉल की 2 एल बोतल लें और मोबाइल चरण बी (एमबी) की शुरुआत और समाप्ति तिथि के साथ लेबल लें।
  5. ऑटो-सैंपलर का तापमान 4 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें
  6. ऑटोडसप्लर में तैयार किए गए नमूने के साथ संग्रह प्लेट रखें।
  7. ओवन में एक पीएफपी स्तंभ (150 मिमी x 2.1 मिमी आईडी, 3 माइक्रोन) और गार्ड कॉलम रखें।
  8. ओवन का तापमान 30 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें
  9. तालिका 1 में दिखाए गए अनुसार एलसी ग्रेडिएंट अल्यूशन के साथ अधिग्रहण विधि का उपयोग करके 10 मिनट का सार बनाना
समय (मिनट) मॉड्यूल आयोजन पैरामीटर
0 पंप्स पम्प बी कॉनक 5
0.5 पंप्स पम्प बी कॉनक 20
1 पंप्स पम्प बी कॉनक 50
3 पंप्स पम्प बी कॉनक 80
4 पंप्स पम्प बी कॉनक 90
4.01 पंप्स पम्प बी कॉनक 95
5.5 पंप्स पम्प बी कॉनक 95
5.6 पंप्स पम्प बी कॉनक 5
7 नियंत्रक रुकें

तालिका 1: तरल क्रोमैटोग्राफी ग्रेडियेंट एल्यूशन स्थितियां

  1. बैच की सूची भी शामिल करेंमानकों, क्यूसी और मूत्र के नमूने
  2. तैयार नमूने (12 μL) के इंजेक्शन द्वारा बैच को प्रारंभ करें

5. पीक पहचान, एकता और डेटा प्रक्रिया

  1. सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा अधिग्रहण और प्रसंस्करण को नियंत्रित करें
  2. सभी नमूनों के लिए 3-एनटी और आईएस चोटियों को पहचानें और एकीकृत करें।
  3. 3-एनटी के चोटी क्षेत्र के अनुपात के रैखिक प्रतिगमन द्वारा 3-एनटी मात्रा के लिए 10-2,500 पीजी / एमएल की सीमा के साथ एक मानक वक्र स्थापित करें और 1 / x के भार वाले कारक के साथ नाममात्र 3-एनटी एकाग्रता बनाम बनाइए।
  4. मानक वक्र का उपयोग करके सभी नमूनों को बढ़ाएं
  5. निर्धारित करें कि क्यूसी नमूनों की स्थापना की सीमा में गिरावट आई है।
  6. मूत्र के नमूनों के एनएम या एनएमएल / एमएमओएल सीआर की इकाई में अंतिम परिणाम के लिए पता लगाया गया सांद्रता परिवर्तित करें

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Representative Results

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चित्रा 1 चित्रा 1 दिखाता है कि 3-एनटी पूरी तरह से क्रोमैटोग्राफ़िक रूप से अन्य संरचनात्मक रूप से इसी तरह के टाइरोसिन एनालॉग्स से अनुकूलित एलसी हालत के तहत अलग है, जो इन बेहद अत्यधिक यौगिकों के कारण सह-विलक्षण अंतरण को समाप्त करता है और इसके परिणामस्वरूप परख चयनात्मकता की डिग्री को बढ़ाता है। इसके अलावा, 0.45 एमएल / मिन की प्रवाह दर पर एमए और मेथनॉल में 0.01% एचसीओओएचएच के रूप में ढालदार अव्यवस्था 3-एनटी ( यानी , 7 मिनट के एक बदलाव की अवधि के साथ 3 मिनट) के त्वरित क्षीणन की अनुमति देता है।

आकृति 1
चित्रा 1: एक मानक समाधान में अन्य टाइरोसिन एनालॉग से 3-एनटी की बेसलाइन एलसी क्रोमैटोग्राफिक पृथक्करण। ( ) पी- टेरोसिन; ( बी ) एम- टेरोसिन; ( सी ) -tyrosine; ( डी ) सीएल-टायरोसिन; ( ) 3-एनटी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 2 से पता चलता है कि कोई 3-एनटी सिग्नल डबल रिक्त नमूना में नहीं देखा गया है, जो पूरे प्रक्रिया के दौरान आर्टेफैक्टीकल 3-एनटी का गठन नहीं करता है। चित्रा 3 में 3-एनटी के प्रतिनिधि एमआरएम क्रोमैटोग्राम और एक स्वस्थ व्यक्ति के लिए IS है। जैसा कि देखा जा सकता है, 3-एनटी और आईएस के प्रतिधारण समय पर कोई हस्तक्षेप नहीं किया जाता है। इसके अलावा, नाइट्राइट (50 माइक्रोग्राम), नाइट्रेट (50 माइक्रोग्राम) और टायरोसिन (50 एमजी / एल) 25 के साथ गैर-बालीदार और बालीदार पूल मूत्र नमूनों के बीच 3-एनटी में ± 6% अंतर से कम देखा गया, जो आगे समर्थन प्रदान करता है परख की विशिष्टता के लिए


चित्रा 2: 3-एनटीएम के एमआरएम क्रोमैटोग्राम और एक प्रतिनिधि डबल रिक्त नमूने में IS है। ( ) 3-एनटी एमआरएम क्वांटिफायर 227.0> 90.0; ( बी ) एमआरएम क्वांटिफ़ायर 236.0> 18 9.0 है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: 3-एनटीएम के एमआरएम क्रोमैटोग्राम और एक प्रतिनिधि मूत्र में आई है स्वस्थ लोगों का नमूना ( ) 3-एनटी एमआरएम क्वांटिफायर 227.0> 90.0; ( बी ) एमआरएम क्वांटिफ़ायर 236.0> 18 9.0 है। कृपया उसे क्लिक करेंइस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए फिर से।

मानक वक्र 3-एनटी के चोटी क्षेत्र अनुपात की साजिश रचने से 10-2,500 पीजी / एमएल की श्रेणी में 3-एनटी के साथ अम्लीकृत खाली मूत्र निकालने के द्वारा स्थापित किया गया था और 3-एनटी की नाममात्र एकाग्रता बनाकर एक रैखिक फिटिंग 1 / एक्स भार का एक प्रतिनिधि मानक वक्र चित्रा 4 में दिखाया गया है। एलओडी, जिसे तीन से अधिक सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ सबसे कम एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया था, 2 पीजी / एमएल (0.0088 एनएम) होने का निर्धारण किया गया था। एलएलयूएक परिभाषित द्वारा 10 पीजी / एमएल (0.044 एनएम) होने का निर्धारण किया गया था क्योंकि कम से कम एकाग्रता को दस से अधिक सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ ± 20% की अशुद्धता और सटीकता के बीच मापा जाना चाहिए।

चित्रा 4
चित्रा 4: एक प्रतिनिधि 3-एनटी मानक वक्र में10-2,500 पीजी / एमएल की रेंज इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

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मानवीय मूत्र नमूनों में अंतर्जात मुक्त 3-NT के लिए पहले साहित्य में सांद्रता में उल्लेखनीय विविधताएं उपलब्ध एनाल्स 8 , 9 , 10 , 11 के साथ जुड़ी हुई पद्धति संबंधी समस्याएं दर्शाती हैं। मानव मूत्र में 3-NT के कम बेसल स्तर का सटीक निर्धारण एक चुनौतीपूर्ण कार्य है जो नमूना तैयार करने और एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए विशेष सावधानी की आवश्यकता है। यह प्रोटोकॉल एक उपन्यास एसपीई प्रक्रिया को एक चयनात्मक एलसी-एमएस / एमएस डिटेक्शन के साथ जोड़ता है जो कि उच्च-थ्रुथ के साथ मूत्र 3-एनटी के विशिष्ट और संवेदनशील निर्धारण की अनुमति देता है।

एमआरएम मापदंडों का ध्यानपूर्वक चयन 3-एनटी की पहचान के लिए बेहतर चुनिंदा। एमआरएम संक्रमण एम / जेड 236.0> प्लाज्मा में 3-एनटी के लिए आईएस के 96.0 आई 27 ने मूत्र नमूनों के लिए गंभीर संदूषण किया। एक क्लीनर, संकेत में 9 गुना वृद्धिप्रतिक्रिया एमआरएम संक्रमण एम / जी 236.0> 18 9.0 के साथ हासिल की गई थी। एमएमआर संक्रमण एम / जेड 227.0> 90.0 का चयन 3-एनटी मात्रा का ठहराव के लिए किया गया था क्योंकि गहन हस्तक्षेप के कारण सबसे गहन संक्रमण m / z 227.0> 181.0 का उपयोग किया गया था। विस्तृत एमआरएम संक्रमण और मिश्रित पैरामीटर तालिका 2 में संक्षेप हैं

analyte एमआरएम संक्रमण (एम / जेड) डीपी (वी) ईपी (वी) सीई (ईवी) सीएक्सपी (वी)
3-एनटी (क्वांटिफायर) 227.0> 90.0 50 10 38 13
3-एनटी (योग्यता) 227.0> 103.9 50 10 45 16
13 सी 9- एनटी (आईएस) 236.0> 18 9.0 50 10 21 14
एक आयन स्प्रे वोल्टेज: 2200 वी; तापमान: 600 डिग्री सेल्सियस; परदा गैस: 35; सीएडी गैस: 9; छिटकानेवाला गैस (जीएस 1): 50; हीटर गैस (जीएस 2): 55

तालिका 2: अनुकूलित एमआरएम शर्तें

आमतौर पर पारंपरिक 12 , 13 , 17 , 1 9 के साहित्य में 3-एनटी के एलसी क्रोमैटोग्राफिक अलग होने के लिए पारंपरिक सी 18-टाइप कॉलम को आम तौर पर हस्तक्षेप को कम करने के लिए एक लंबा समय की आवश्यकता होती है, जो इसे उच्च-थ्रुपुट के लिए गैर-अनुकूल बनाता है। इस प्रोटोकॉल में, पीएफपी कॉलम को 3-एनटी के एलसी क्रोमैटोग्राफिक अलग होने के अनुकूलन के लिए नियोजित किया गया था, जो ध्रुवीय यौगिकों 22 की अपनी उन्नत धारणा के आधार पर था ,> 27 , 28 मोबाइल चरण योजक की एकाग्रता का संकेत तीव्रता 25 , 28 पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव है। एचसीओओएच में 0.01% एमए में इष्टतम एडिटिटिव पाया गया क्योंकि इसके परिणामस्वरूप 0.1 गुना एकाग्रता में 2.5 गुना सिग्नल प्राप्त हुआ, और एकाग्रता कम संकेत प्रतिक्रिया में और घट जाती है। पानी (एमए) और मेथनॉल (एमबी) में 0.01% एचसीयूओएच का इस्तेमाल करते हुए एक ढाल की छलनी प्रोफ़ाइल 0.45 एमएल / मिनट की प्रवाह दर के साथ स्थापित की गई, एक इष्टतम जुदाई को प्राप्त करने और 3-एनटी के 3 मिनट में तेजी से क्षीणन को कुल रन समय के साथ 3 मिनट साहित्य में 12 , 13 , 17 , 1 9 में रिपोर्ट की तुलना में जटिल जैविक मैट्रिक्स में 3-एनटी के काफी तेजी से विश्लेषण की अनुमति देकर केवल 7 मिनट।

पारंपरिक उलट-चरण कारतूस (सी 18 प्रकार) पी की अप्रभावीता को संबोधित करने के लिएजैविक नमूनों 6 , 7 के एसपीई के लिए इस्तेमाल की गई रीढ़ की हड्डी का इस्तेमाल, हमने हाल ही में एक एकल दोहरे-कार्यात्मक 96-अच्छी तरह एमसीएक्स प्लेट 27 पर एसपीई द्वारा मानव प्लाज्मा में 3-एनटी निर्धारित करने के लिए एलसी-एमएस / एमएस पद्धति विकसित की, जिससे एसईपी में सुधार हुआ दक्षता और चयनात्मकता हालांकि, साहित्य में सभी एसपीई दृष्टिकोण का एक अलग दोष कठिन है और जोखिम से जुड़ा वाष्पीकरण और पुनर्गठन के कदम हैं। इसके अतिरिक्त, प्लाज्मा विधि को सॉर्बेंट से प्रदूषण को खत्म करने के लिए निष्कर्षण प्लेट की एक अतिरिक्त पूर्व धोने की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल में, इन कमियों का उपयोग एक सिलवाया एसपीई द्वारा समाप्त किया गया है, जिसमें एक लघुकृत 96-अच्छी तरह माइक्रोफ़्लैट का इस्तेमाल किया गया है। उत्क्रांति समाधान के चयन निष्कर्षण दक्षता के लिए महत्वपूर्ण पाया गया था। सामान्य एनएच 4 ओह क्षालन समाधान को मेओएच की विभिन्न संरचनाओं के साथ पेश करके मूत्र के नमूनों में पर्याप्त अंतर देखा गया। यह परिकल्पना की गई थी कि हस्तक्षेप करनामेथनॉल एनएच 4 ओह क्षीणन समाधान की मजबूत क्षीणता शक्ति के कारण विश्लेषक के साथ-साथ पदार्थों को जोड़ दिया गया था, परिणामस्वरूप कम चयनात्मकता उत्पन्न हुई। चयनात्मकता में सुधार करने के लिए, समाधान की पहचान करना आवश्यक था जो कि 3-एनटी को लुभाने के लिए पर्याप्त रूप से पर्याप्त और कमजोर रूप से मिश्रित यौगिकों के लुप्त होने का कारण नहीं होने के लिए पर्याप्त कमजोर होगा। विभिन्न पीएच और सांद्रता में कम बुनियादी एनएच 4 ओएसी की विस्तृत जांच के बाद, पीएच 9 के साथ 25 एमएम एनएच 4 ओएसी समाधान समाधान के समाधान के रूप में इष्टतम पाया गया। अनुकूलित क्षालन समाधान के साथ, हस्तक्षेप करने वाले यौगिकों के मुद्दे को हल कर दिया गया और नियमित मेथनॉल एनएच 4 ओह क्षीणन समाधान की तुलना में संवेदनशीलता में 40% लाभ हासिल किया गया।

तालिका 3 जैविक मैट्रिक्स में नि: शुल्क 3-NT के निर्धारण के लिए अन्य उपलब्ध तरीकों की तुलना में इस प्रोटोकॉल 25 के विश्लेषणात्मक प्रदर्शन का विस्तृत सारांश प्रदान करता है। का यह प्रोटोकॉल पूर्व में रिपोर्ट किए गए assays पर कई अलग-अलग फायदे हैं। सबसे पहले, 96-अच्छी तरह से निकासी माइक्रोप्रोलेट को नियोजित करके, नमूना सफाई और विश्लेषक संवर्धन के लिए एक एकल चरण प्राप्त किया गया, विशेष रूप से एसपीई से जुड़े 3-एनटी विधियों में आवश्यक वाष्पीकरण और पुनर्गठन के 1-5 चक्रों से बचने। दूसरा, एसपीई के लिए प्रति नमूना विलायक का उपयोग 5.5 - 118 एमएल से केवल 1.1 एमएल तक घट गया था, जो विलायक और अपशिष्ट निपटान में 5-107 बार की कमी का प्रतिनिधित्व करता है। तीसरा, अन्य नमूने के मुकाबले एलसी प्रतिवर्ती प्रति नमूना 2-7 गुना कम हो गया था और यह हमारे पिछले प्लाज्मा विधि से 30% अधिक तेज था। चौथा, मैट्रिक्स प्रभाव के मुआवजे के लिए बेहतर 13 सी-लेबल आईएस की 10-3,000 गुना कम राशि की आवश्यकता थी। अंत में, यह परख मूत्राशय 3-एनटी के मात्रा के लिए अन्य पारंपरिक एसपीई-आधारित एलसी-एमएस / एमएस विधियों पर एक महत्वपूर्ण संवेदनशीलता सुधार का प्रतिनिधित्व करता है।

तरीके "> नमूना तैयार करना विश्लेषणात्मक
तरीका
मैट्रिक्स लोद (एनएम) LOQ (एनएम) एलसी रन (मिनट) ईप्पन सी सोल डी (एमएल) आईएस (एनजी) रेफरी। एसपीई (C18)
+ निस्पंदन LC-एमएस / एमएस प्लाज्मा 0.034 0.112 20 1 13 एनालॉग एफ 2 [6] एसपीई
(एमसीएक्स प्लेट) LC-एमएस / एमएस प्लाज्मा 0.0088 0.022 10 1 5.6 13 सी 9- एनटी 0.25 [27] पीपीटी + एसपीई (एमसीएक्स) + डेर एचपीएलसी-यूवी सीरम एनए बी 100 40 1 7.3 एनए बी एनए बी [12] एचपीएलसी + डर जीसी एमएस / एमएस मूत्र 0.004 0.125 एनए बी 5 एनए बी3- एनटी 4.6 [16] पीपीटी + एसपीई (एमिनो) + डेर एक LC-एमएस / एमएस बिल्ली मूत्र एनए बी 14.5 40 3 23 घ 3- एनटी 75 [17] पीपीटी + हाइड्रोलिसिस + एसपीई (एससीएक्स-सी 18) LC-एमएस / एमएस मूत्र (प्रोटीन) 400 NA 50 2 118 घ 3- एनटी 2 [19] आईए -2 डी एलसी LC-एमएस / एमएस मूत्र 0.022 NA 14 एनए बी एनए बी 13 सी 9- एनटी 0.85 [24] एसपीई (सी 18) + हाइड्रोलिसिस एचपीएलसी-ईसीडी मूत्र (कुल) एनए बी 4 40 2 5.5 एनए बी एनए बी [13] एसपीई (सी 18) + प्रीप एलसी जी
+ ऑनलाइन एसपीई LC-एमएस / एमएस मूत्र 0.0088 0.041 30 2 38 घ 3- एनटी 5 [23] एसपीई (एमआईपी) एचपीएलसी-यूवी बालीदार मूत्र 700 NA 20 18 एनए बी एनए बी [14] एसपीई (एमसीएक्स μElution) LC-एमएस / एमएस मूत्र 0.0088 0.044 7 नहीं 1.1 13 सी 9- एनटी 0.03 इस काम एक डेर: डेरिवेटिशन; बी एनए: उपलब्ध नहीं; सी इवोप: वाष्पीकरण; डी सोल: सॉलेंट प्रति नमूना; आईए -2 डी एलसी: इम्यूनोएफ़िफिन क्रोमैटोग्राफी और दो-आयामी एलसी; एनालॉग: ओ-मिथाइल-टायरोसिन; जी तैयारी एलसी: प्रारंभिक एचपीएलसी शुद्धि

तालिका 3: तुलनाबायोलॉजिकल मैट्रिक्स में 3-एनटी की जांच के लिए मौजूदा असलों के साथ इस प्रोटोकॉल के विश्लेषणात्मक निष्पादन का बेटा

प्रस्तावित परख की विश्लेषणात्मक और नैदानिक ​​वैधता का मूल्यांकन 25 स्वस्थ लोगों 25 के प्रामाणिक मूत्र नमूनों से स्थापित मूत्र 3-एनटी के लिए संदर्भ अंतराल के निर्धारण के माध्यम से किया गया था। सुधार की सरलता और थ्रूपुट पद्धति, मूत्र नमूनों (एन = 1 9 2) के दो प्लेटों को 24 घंटे के समय में संसाधित और विश्लेषण करने की अनुमति देती है। गैर-इनवेसिव मूत्र नमूनाकरण का उपयोग करते हुए विकसित विधि, सरल, तेज, संवेदनशील और चुनिंदा होने के कारण, 3-एनटी की नैदानिक ​​स्थितियों में भूमिका की पुष्टि करने और ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रभाव की जांच करने में एक शक्तिशाली उपकरण होने की उम्मीद है। प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरण में एक एमसीएक्स माइक्रोप्रेट पर एसईपी पर एक हल्के एनएच 4 ओएसी का उपयोग एल्यूशन बफर के रूप में, पीएफपी कॉलम पर एलसी अलगाव को 0.01% एचसीयूएचएच के साथ-साथ 3-एनटी कोंफिफ़िका के लिए एक योजक और एमआरएम चयन के रूप में किया जाता है।tion। विधि के भविष्य के आवेदन में सूजन और neurodegenerative विकार जैसे रोगों के साथ रोगियों में 3-एनटी सांद्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए है, आदि । नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए प्रस्तावित प्रोटोकॉल के संभावित नुकसान संबोधित होने के लिए रहते हैं।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास ब्याज का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने इस कार्य के सामान्य समर्थन और समन्वय के लिए स्कॉट हावर्ड और अबीगैल मेरिनाक को स्वीकार किया होगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Nitro-L-tyrosine Sigma N7389-5g
3-Nitro-L-tyrosine-13C9 Sigma 652296-5.0mg
Mass Spec Gold Urine Golden West Biologicals MSG 5000-1L
Oasis MCX 96-well µElution plate Waters 186001830BA
2 mL 96 well collection plate Phenomenex   AH0-7194
96 positive processor Waters  186005521
LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol   Sigma 14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV water Sigma 14263-2L
Formic acid for mass spectrometry Sigma 94318-50ML-F
Ammonium hydroxide solution Sigma 338818-1L
Ultra PFP propyl columns Restek 9179362
5500 Triple quad AB Sciex  / Contact manufacture for more detail
UFLC-XR Shimadzu  / Contact manufacture for more detail
Integra 400 Plus  Roche / Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method
LCMS certified 12 x 32 mm screw neck vial Waters 600000751CV
LCGC certified 12 x 32 mm screw neck total recovery vial Waters 186000384C
5 mL transport tube Phenix TT-3205
50 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2263
15 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2266
eLine electronic pipette Sartorius 730391
Microfuge centrifuge  Beckman Coulter A46474
OHAUS balance   Kennedy Scales, inc. 735
Vortex mixer  Bernstead Thermolyne M16715

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References

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नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए मानव मूत्र में 3-नाइट्रोटोसाइन की लघुकृत चरण के निष्कर्षण और एलसी-एमएस / एमएस की जांच का एकीकरण
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Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).More

Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).

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