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Chemistry

臨床応用のためのヒト尿中の3-ニトロチロシンの小型化固相抽出およびLC-MS / MS検出の統合

doi: 10.3791/55778 Published: July 14, 2017

Summary

混合モードカチオン交換(MCX)96ウェルマイクロプレート上での効率的な固相抽出と組み合わせた選択的かつ高感度の液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS / MS)法を、遊離3-ニトロチロシンの測定のために開発した3-NT)をヒト尿中に高スループットで導入することができ、これは臨床用途に適している。

Abstract

遊離3-ニトロチロシン(3-NT)は、酸化ストレスのための可能なバイオマーカーとして広範に使用されている。広範な病理学的状態において、3-NTのレベルの上昇が報告されている。しかし、既存の方法は、3-NTの低内在レベルを確実に測定するのに必要な十分な感度および/または特異性を欠いており、臨床応用には扱いにくい。したがって、3-NTのレベルを正確に定量化し、病理学的状態における3-NTの役割を確認するためには、分析的改善が急務である。このプロトコルは、非侵襲性バイオマーカーとしてのヒト尿中の3-NTの迅速かつ正確な測定のための小型液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS / MS)検出と小型化固相抽出(SPE)酸化ストレス96ウェルプレートを使用するSPEは、退屈な誘導体化および蒸発工程なしでサンプルのクリーンアップおよび分析物の濃縮を組み合わせることによりプロセスを顕著に単純化した廃棄物処分、汚染の危険性および全体的な処理時間を削減する。 SPE溶出溶液としてのpH9での25mM酢酸アンモニウム(NH 4 OAc)の使用は、選択性を実質的に向上させた。質量分析法のシグナル応答は、多重反応モニタリング(MRM)移行の調整によって改善されました。ペンタフルオロフェニル(PFP)カラム(150mm×2.1mm、3μm)上の添加剤として0.01%HCOOHを使用すると、シグナル応答がさらに2.5倍改善され、全実行時間が7分に短縮されました。 10pg / mL(0.044nM)の定量下限(LLOQ)が達成され、報告されたアッセイより有意な感度の改善を示した。この単純化された迅速で選択的で敏感な方法により、尿試料の2つのプレート(n = 192)を24時間の時間内で処理することが可能になる。顕著に改善された分析性能、および非侵襲的かつ安価な尿サンプリングを考慮すると、提案されたアッセイは、前臨床および臨床研究。

Introduction

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酸化ストレスが臨床上のプレゼンテーションに及ぼす影響は、近年ますます重要視されています1 。探索されているバイオマーカーの1つは、3-ニトロチロシン(3-NT)であり、反応性窒素種(RNS)がチロシン、カテコールアミン神経伝達物質前駆体と相互作用するときに生成する最終安定生成物である。 3-NTは、in vivoでの RNSのためのバイオマーカーとして臨床的価値を有していてもよいがチロシンの性質及び機能の実質的な変化が悪影響を対応するタンパク質及び細胞機能1,2影響及ぼし得ます。新興の研究では、3-NTは、炎症状態で3、神経変性疾患の重要な役割を果たしていることを示唆している4、5、6心血管疾患や糖尿病7と同様に酸化ストレスに関連する状態。しかし、これらのobservations、感度及び/又は選択8、9、10、11に欠ける方法からの結果に基づいています。以前に文献に報告された生​​物学的サンプルの3-NTの濃度範囲の大部分は、深刻な分析上の問題がこれらのアッセイに関連していることを示しており、3-NTレベルを正確に定量化し、 。

生物学的マトリックス中の自由3-NTの定量化は、人間と機器8、9、10、11に特別な挑戦を提示しています。第1に、内因性3-NTのトレースレベルは、超高感度検出を必要とする。第二に、多数の構造的に類似した類似体、特にチロシンが存在し、これは非常に過剰であり、高度の選択性を必要とする。第3に、遍在する硝酸塩および亜硝酸塩によるチロシンニトロ化による3-NTの人工的形成は、3-NTの誤った過大評価を避けるために試料調製中に特別な配慮を必要とする。

3-NTを測定するために用いられる方法の多種多様な中でも、MS / MSは、その優れた感度と選択性11、12、13、14に金標準的な方法を考えてきました。ガスクロマトグラフィー(GC)は、MS / MSは、最良の感度を提供結合、しかし、必須サンプル誘導体化ステップは、臨床的有用性15、16のために効率的であることがあまりにも面倒で時間がかかります。 LC-MS / MSは複雑なサンプルの誘導体化を必要とせず、より有望な選択肢になります。それにもかかわらず、克服すべきいくつかの障害があります文献に報告されたLC-MS / MS法のnsitivity低豊富3-NT 7、17、18の測定のために改善する必要があり、比較的長いターンアラウンドタイムは、ハイスループットアプリケーション12のために短くする必要があり、13、17、19

さらに、臨床応用を考慮するとき、使用される生物学的マトリックスは重要な役割を果たす。それは簡単で得ることが安価で可能な20、21、22であれば、非侵襲性であるべきです。文献で伝統的に使用されている血漿である血漿は、臨床的に望ましいマトリックスではないので、非侵襲的かつ費用対効果の高い尿を利用する方法論が求められていた。

relを開発するためのいくつかの試みiableと特定LC-MS / MS方法論は、尿9、10、11用いて行われてきました。しかし、それらはすべて、臨床的使用のために十分に選択的、信頼できる、または効率的であるのに足りない。 3-NTの分析のためのサンプルクリーンアップが疑問視されていると強カチオン交換(SCX)と逆相C18-OHの順次SPE 6提案されているような従来の逆相カートリッジ(C18型)を用いて、優勢なSPEの有効性 7、19。最近開発されたLC-MS / MS法は、手動C18 SPE、分取高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、および3-NT 23の分析のためのオンラインSPEの多段階精製プロセスを利用した。この方法は、0.041nMのLLOQを有する臨床目的のために十分に敏感であったが、クリーンアッププロセスは集中的で面倒であり、赤色の3 mLの尿。高スループットの実現可能性が制限されています。クリーンアッププロセス14の効率を改善するために、分子的にインプリントされたポリマーをSPE吸着剤として使用したが、得られたLLOQ(0.7μg/ mL)は臨床検体にとって十分に低いものではなかった。別の方法は、0.022 nMで24の検出限界(LOD)を達成するために、2次元(2D)LC-MS / MSおよびサンプルクリーンアップのためのイムノアフィニティークロマトグラフィーを必要としました。これらの方法はすべて3-NTの評価において進歩を遂げてきましたが、臨床応用に必要な感度、信頼性、効率を達成したものはありませんでした。

3-NTの病態とその臨床的環境における酸化ストレスのバイオマーカーとしての役割を調べるために、我々はハイスループットの臨床応用が可能なシンプルで効率的で正確で正確な方法論を開発した25 。小型化された混合モードカチオンexc誘導体化、蒸発および2D-LCを必要とする既存の方法に見られる欠点を迂回して、単一の抽出で3-NTの簡便で効果的なサンプルクリーンアップおよび濃縮を達成するためにハンゲイ(MCX)96ウェル抽出マイクロプレートを実施した。移動相における添加剤として0.01%HCOOHを用いた液体クロマトグラフィーは、迅速なサイクル時間で増強されたシグナル応答を提供した。選択性は、3-NTの選択的溶出のための軽度のNH 4 OAc溶出溶液の適用、および3-NTおよび内部標準(IS)の両方のMRM転移の使用によってさらに改善された。マトリックス効果は、定量化のために好ましい量の13 C標識同位体ISを使用することによって補償された。この方法論の出現により、研究者および臨床医は、臨床状態における3-NTの役割を検証し、さらに酸化ストレスの影響を探ることができるようになる。

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Protocol

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ヒト尿サンプルを含むすべての研究は、Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board(IRB)によって承認された手順に従って実施された。

1.尿試料採取およびクレアチニン(Cr)測定

  1. 次の朝の尿サンプル5mLをca.保存まで3N HCl250μLを含む5mL輸送管Aで一晩10時間絶食させ、使用するまで-20℃で保存する。
  2. 解凍しボルテックスする5mLの輸送尿チューブと遠心分離機( 例えば Sorvall)(2297xg、10分)中で遠心分離する。
  3. 5mLの輸送管Aから2回、1mLの尿を分注する。
  4. 尿クレアチニン法によるCrの測定26

標準、ISおよび品質管理(QC)サンプルの調製

  1. 0.01%HCOOH移動相A(MA)を含む水中で100μg/ mLの3-NTのストック溶液を調製し、-20℃で保存する。
  2. メイク100μg/ mLの3-NTストック溶液をMAで希釈することにより、100ng / mLの濃度の3-NT作動標準溶液。
  3. ブランクおよび二重ブランク試料とともに、3-NTを含まない0.15M HCl酸性ブランク尿で100ng / mLの作業標準液を希釈することにより、5〜2500pg / mLの標準物質を生成する。
  4. -20℃でMAとストアと水で100μg/ mLのにある13 C 9 -3-NTのストック溶液を調製します。
  5. 100μg/ mLの13 C 9 -3-NTの希釈により500 pg / mlでで動作している溶液を作るには、MAとのストック溶液です。
  6. 酸性化されたブランク尿中の3-NT作業標準の希釈によって、LLOQ、低、中および高レベル( すなわち 、10,25,100,500および1,250 pg / mL)をカバーする5レベルのQCサンプルを確立する。

固相抽出手順

  1. 解凍し、尿サンプル、標準品およびQCサンプルをボルテックスする。
  2. 尿サンプル、標準およびQCサンプルを追加les(各250μL)を32ウェルの清潔な2mL 96ウェル収集プレートに移した。
  3. 二重ブランク試料ウェルを除く各ウェルに500 pg / mL IS作動液(50μL)を導入する。二重ブランク試料ウェルに0.01%HCOOH(50μL)を添加する。
  4. 0.1%HCOOH(250μL)を含むLC-MS / MS水を加える。
  5. 上記の混合物を8チャンネルピペットで3回混合する。
  6. SPE装填までプレートを覆う。
  7. MCX 96ウェル抽出プレートとコレクションリザーバーを陽圧プロセッサーに置きます。
  8. 抽出プレートを、流出するMeOH(200μL)で吸着剤に通す。
  9. 吸着剤に2%HCOOH(200μL)を流して平衡させる。
  10. 予め混合した各サンプルの全容積を、8チャンネルのピペットで慎重に予備条件抽出プレートにロードする。
  11. 混合物を流れさせるために陽圧プロセッサーに低い正の圧力( 例えば 3psi)を設定する吸収剤をゆっくりと摂取し、必要に応じて圧力を調整します。
  12. 2%HCOOH(200μL)を含む水を吸着剤に流してウェルを洗浄する。
  13. 吸着剤にメタノール(200μL)を流してウェルを洗浄する。
  14. 吸着剤に水(200μL)を流してウェルを洗浄する。
  15. ポジティブプレッシャープロセッサーで、正の高圧力設定( 例えば 、40 psi)でウェルを完全に乾燥させます。
  16. リザーバーを清潔な2 mL 96ウェルコレクションプレートに交換します。
  17. 抽出プレートから保持された検体およびISを溶出するために、pH 9(50μL)で25mM NH 4 OAcを適用する。
  18. 溶出液を中和するために、5%HCOOH(50μL)を含むLC-MSピペット水。
  19. 8チャンネルピペットで3回ミックスし、分析のためにLC-MS / MSステーションに提出する。

LC-MS / MS分析

  1. メスシリンダーで2000mLのLC-MS水を正確に測定し、2Lボトルに移します。
  2. P200μLの純粋なHCOOHを上記のLC-MS水を含むボトルに入れる。
  3. 完全に混合し、移動相A(MA)とラベルする。イニシャル、準備日、有効期限を記入してください。
  4. 2リットルのLC-MSメタノールボトルに入れ、開始日と有効期限のある移動相B(MB)とラベルを付けます。
  5. オートサンプラーの温度を4℃に設定します。
  6. 調製したサンプルを含むコレクションプレートをオートサンプラにセットします。
  7. オーブンにPFPカラム(150 mm x 2.1 mm id、3μm)とガードカラムを置きます。
  8. オーブンの温度を30℃に設定します。
  9. 表1に示すLCグラジエント溶出を用いた取得法を用いて10分間平衡化する。
時間(分) モジュール イベント パラメータ
0 パンプスポンプBコンク。 5
0.5 パンプスポンプBコンク。 20
1 パンプスポンプBコンク。 50
3 パンプスポンプBコンク。 80
4 パンプスポンプBコンク。 90
4.01 パンプスポンプBコンク。 95
5.5 パンプスポンプBコンク。 95
5.6 パンプスポンプBコンク。 5
7 コントローラやめる

表1: 液体クロマトグラフィーグラジエント溶出条件

  1. 以下を含むバッチリストを作成するスタンダード、QCおよび尿サンプル。
  2. 調製したサンプル(12μL)の注入によりバッチを開始する。

5.ピーク識別、統合、データ処理

  1. ソフトウェアを使用したデータの取得と処理を制御します。
  2. すべてのサンプルについて3-NTピークとISピークを特定し、統合します。
  3. 3-NTおよびISのピーク面積比対公称3-NT濃度の1 / xの重み付け係数を線形回帰することにより、3-NT定量のために10-2,500 pg / mLの範囲の標準曲線を確立する。
  4. 標準曲線を使用してすべてのサンプルを定量する。
  5. QCサンプルが確立された範囲内にあるかどうかを決定する。
  6. 検出された尿サンプルの濃度をnMまたはnmol / mmol Crの単位で最終結果に変換します。

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Representative Results

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図1は、3-NTが、これらの非常に過剰な化合物に起因する共溶出妨害を排除し、結果としてアッセイ選択性の程度を高める、最適化されたLC条件下で他の構造的に類似のチロシン類似体から完全にクロマトグラフィーで分離されることを示す。さらに、0.45mL /分の流速でのMAおよびメタノール中の添加剤としての0.01%HCOOHによる勾配溶出により、3-NT( すなわち 、7分のターンアラウンドタイムで3分)の迅速な溶出が可能になる。

図1
図1: 標準溶液中の他のチロシンアナログからの3-NTのベースラインLCクロマトグラフィー分離。Ap-チロシン; ( Bm-チロシン; ( Co -チロシン; ( D )Cl-チロシン; ( E )3-NT。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2は二重ブランク試料中に3-NTシグナルが観察されないことを示しており、プロセス全体にわたってアーチファクトな3-NTが形成されていないことを示している。 図3は、健康な個体の3-NTおよびISの代表的なMRMクロマトグラムを示す。図からわかるように、3-NTおよびISの保持時間には干渉シグナルは観察されない。さらに、亜硝​​酸塩(50μM)、硝酸塩(50μM)およびチロシン(50mg / L) 25を添加した非スパイクおよびスパイクプール尿検体間の3-NTの差は±6%未満であり、アッセイの特異性に依存する。


図2: 代表的な二重ブランク試料における3-NTおよびISのMRMクロマトグラム。A )3-NT MRM定量器227.0> 90.0; ( B )IS MRM定量器236.0> 189.0である。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図3
図3: 健常人の代表的な尿サンプルにおける3-NTおよびISのMRMクロマトグラム。A )3-NT MRM定量器227.0> 90.0; ( B )IS MRM定量器236.0> 189.0である。 彼をクリックしてくださいこの図のより大きなバージョンを表示してください。

3-NTとISのピーク面積比対3-NTのピーク面積比を線形近似でプロットすることにより、10~2500pg / mLの範囲の3-NTでスパイクした酸性化ブランク尿を抽出することによって標準曲線を確立した1 / xの重み付け。代表的な標準曲線を図4に示します 。 3より大きな信号対ノイズ比を有する最低濃度として定義されたLODは、2pg / mL(0.0088nM)であると決定された。 LLOQは、精確さの±20%以内で測定される最低濃度として10μg/ mL(0.044nM)であると決定され、10より大きい信号対雑音比で精度が決定された。

図4
図4:代表的な3-NT標準曲線10〜2500pg / mLの範囲。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

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Discussion

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以前にヒトの尿サンプル中の内因性遊離3-NTについての文献に報告された濃度の実質的なバリエーションが利用可能なアッセイ8、9、10、11に関連した方法論の問題点を明らかにする。ヒト尿中の3-NTの低い基底レベルの正確な決定は、試料調製およびLC-MS / MS分析のための特別な予防措置を必要とする困難な作業である。このプロトコールは、選択的LC-MS / MS検出と組み合わせた新規SPE手順と、高スループットでの尿3-NTの特異的かつ高感度の測定を可能にする。

MRMパラメータの注意深い選択は、3-NTの検出のための選択性を改善した。血漿27中の3-NTに対するISのMRM転移m / z 236.0> 96.0は、尿試料に対する重大な汚染を引き起こした。よりクリーンな9倍の信号増加応答はMRM転移m / z 236.0> 189.0で達成された。最も集中的な移行m / z 227.0> 181.0を用いた重大な干渉のために、MRM転移m / z 227.0> 90.0を3-NT定量のために選択した。詳細なMRM遷移および化合物パラメータを表2に要約する。

検体 MRM転移(m / z) DP(V) EP(V) CE(eV) CXP(V)
3-NT(定量化装置) 227.0> 90.0 50 10 38 13
3-NT(修飾語) 227.0> 103.9 50 10 45 16
13 C 9 -NT(1S) 236.0> 189.0 50 10 21 14
イオンスプレー電圧:2200 V;温度:600℃;カーテンガス:35; CADガス:9;ネブライザーガス(GS1):50;ヒーターガス(GS2):55。

表2:最適化されたMRM条件。

一般的に文献12に3-NTのLCクロマトグラフ分離、13、17、19のために使用される従来のC18型カラムは、典型的には、高スループットの、非導電作り、干渉を低減するための長いターンアラウンド時間を要します。このプロトコールでは、PFPカラムを、極性化合物22のその保持の強化に基づいて3-NTのLCクロマトグラフィー分離を最適化するために使用した> 27、28。移動相添加剤の濃度は、シグナル強度25、28に重要な影響を有しています。 0.01%のHCOOHは0.1%の濃度を上回る2.5倍のシグナル増加をもたらし、さらに濃度の低下したシグナル応答を減少させるので、MAにおいて最適な添加物であることが判明した。水(MA)およびメタノール(MB)中0.01%HCOOHを用いた勾配溶出プロファイルを0.45mL /分の流速で確立し、3分間で3-NTの最適分離および高速溶出を達成し、文献12、13、17、19に報告されたより複雑な生物学的マトリックス中の3-NTの著しく高速分析を可能にするだけで7分、。

従来の逆相カートリッジ(C18タイプ)pの無効性に対処するためにredominantly生体試料のSPE 6、7のために使用される、我々は最近、SPEの改善をもたらした単一のデュアル機能96ウェルMCX板27、上SPEによるヒト血漿中の3-NTを決定するためにLC-MS / MS法を開発しました効率と選択性が向上します。しかしながら、文献中の全てのSPEアプローチの明白な欠点は、労力とリスクに関連する蒸発および再構成ステップである。さらに、プラズマ法は吸着剤からの汚染を除去するために抽出プレートを余分に前洗浄する必要があった。このプロトコルでは、これらの欠点は、小型化された96ウェルマイクロプレートを用いて調整されたSPEによって排除されている。溶出液の選択は、抽出効率にとって重要であることがわかった。 MeOHの組成を変化させた一般的なNH 4 OH溶出溶液を適用することにより、尿サンプルにおいて実質的な干渉が観察された。それは、メタノール性NH 4 OH溶出溶液の強い溶出力のために被検物質と共溶出し、結果として選択性が低くなった。選択性を向上させるためには、3-NTを溶出するのに十分強く、妨害化合物の溶出を起こさないほど弱い溶液を同定する必要があった。異なるpHおよび濃度で、より基本的でないNH 4 OAcの詳細な調査の後、溶出溶液としてpH9の25mM NH 4 OAc溶液が最適であることが分かった。最適化された溶出溶液では、妨害化合物の問題は解決され、通常のメタノール性NH 4 OH溶出溶液と比較して40%の感度の増加が達成された。

表3は、生物学的マトリックスにおける遊離3-NTの測定のための他の利用可能な方法と比較した、このプロトコール25の分析性能の詳細な要約を提供する。このプロトコルはこれまでに報告されたアッセイよりもいくつかの明確な利点があります。第1に、96ウェル抽出マイクロプレートを使用することにより、SPEを含む3-NT法で典型的に必要とされる1〜5サイクルの蒸発および再構成を回避して、サンプルのクリーンアップおよび分析物の濃縮のための1ステップが達成された。第2に、SPEのサンプル当たりの溶媒使用量は、5.5〜118mLからわずか1.1mLに大幅に減少し、溶媒および廃棄物処理の5〜107倍の減少を示した。第3に、サンプル当たりのLCターンアラウンド時間は、他のアッセイと比較して2〜7倍減少し、従来のプラズマ方法より30%速かった。第4に、マトリックス効果の補償のために、好ましい13 C標識ISの10〜3,000倍低い量が必要であった。最後に、このアッセイは、尿中3-NTの定量​​のための他の従来のSPEベースのLC-MS / MS法よりも有意な感度改善を示す。

方法 "> 試料調製 分析的
方法
マトリックス LOD(nM) LOQ(nM) LC実行(分) エバップc Sol d (mL) IS(ng) Ref。 SPE(C18)
+濾過 LC-MS / MS プラズマ 0.034 0.112 20 1 13 アナログf 2 [6] SPE
(MCXプレート) LC-MS / MS プラズマ 0.0088 0.022 10 1 5.6 13 C 9 -NT 0.25 [27] PPT + SPE(MCX)+ der a HPLC-UV 血清 NA b 100 40 1 7.3 NA b NA b [12] HPLC +デア・A GC-MS / MS 尿 0.004 0.125 NA b 5 NA b d 3 -NT 4.6 [16] PPT + SPE(アミノ)+ DER LC-MS / MS 猫の尿 NA b 14.5 40 3 23 d 3 -NT 75 [17] PPT +加水分解+ SPE(SCX-C18) LC-MS / MS 尿(タンパク質) 400 NA 50 2 118 d 3 -NT 2 [19] IA-2D LC e LC-MS / MS 尿 0.022 NA 14 NA b NA b 13 C 9 -NT 0.85 [24] SPE(C18)+加水分解 HPLC-ECD 尿(合計) NA b 4 40 2 5.5 NA b NA b [13] SPE(C18)+分取LC G
+オンラインSPE LC-MS / MS 尿 0.0088 0.041 30 2 38 d 3 -NT 5 [23] SPE(MIP) HPLC-UV スパイクされた尿 700 NA 20 18 NA b NA b [14] SPE(MCXμ溶解) LC-MS / MS 尿 0.0088 0.044 7 NO 1.1 13 C 9 -NT 0.03 この作品 a der:誘導体化; b NA:利用できません。 cエバップ:蒸発; d Sol:サンプルあたりの溶媒; e IA-2D LC:イムノアフィニティークロマトグラフィーおよび二次元LC; fアナログ:o-メチル - チロシン; g分取LC:分取HPLC精製。

表3:Compari生物学的マトリックスにおける3-NTの検出のための既存のアッセイを用いてこの議定書の分析性能の息子

提案されたアッセイの分析的および臨床的妥当性は、健康な人々82人の真正尿サンプルから確立された尿3-NTの参照間隔の決定によってさらに評価された25 。改善された簡便性およびスループット方法により、尿サンプルの2つのプレート(n = 192)を24時間の時間内で処理および分析することが可能になる。単純で、迅速で、感度が高く、選択的である非侵襲的尿サンプリングを利用して開発された方法は、臨床状態における3-NTの役割を検証し、酸化的ストレスの影響をさらに調査する強力なツールであることが期待される。このプロトコルの重要なステップには、溶出緩衝液として軽度のNH 4 OAcを使用するMCXマイクロプレート上のSPE、添加物として0.01%のHCOOHを有するPFPカラム上のLC分離、および3-NT定量用のMRM選択が含まれる。方法の将来の応用は、臨床用途のために提案されたプロトコルの潜在的な落とし穴がアドレス指定されずに残っている 、そのような炎症性および神経変性疾患などの病理学的状態を有する患者において3-NT濃度を定量化するためのものです。

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Disclosures

著者らは、彼らには利益相反がないと宣言している。

Acknowledgments

著者らは、Scott HaardとAbigail Marinackがこの作業の全般的なサポートと調整について認めてくれるだろう。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Nitro-L-tyrosine Sigma N7389-5g
3-Nitro-L-tyrosine-13C9 Sigma 652296-5.0mg
Mass Spec Gold Urine Golden West Biologicals MSG 5000-1L
Oasis MCX 96-well µElution plate Waters 186001830BA
2 mL 96 well collection plate Phenomenex   AH0-7194
96 positive processor Waters  186005521
LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol   Sigma 14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV water Sigma 14263-2L
Formic acid for mass spectrometry Sigma 94318-50ML-F
Ammonium hydroxide solution Sigma 338818-1L
Ultra PFP propyl columns Restek 9179362
5500 Triple quad AB Sciex  / Contact manufacture for more detail
UFLC-XR Shimadzu  / Contact manufacture for more detail
Integra 400 Plus  Roche / Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method
LCMS certified 12 x 32 mm screw neck vial Waters 600000751CV
LCGC certified 12 x 32 mm screw neck total recovery vial Waters 186000384C
5 mL transport tube Phenix TT-3205
50 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2263
15 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2266
eLine electronic pipette Sartorius 730391
Microfuge centrifuge  Beckman Coulter A46474
OHAUS balance   Kennedy Scales, inc. 735
Vortex mixer  Bernstead Thermolyne M16715

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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臨床応用のためのヒト尿中の3-ニトロチロシンの小型化固相抽出およびLC-MS / MS検出の統合
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Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).More

Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).

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