Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

임상 응용을위한 인간의 소변에서 3- 니트로 타이로신의 소형 고체 상 추출 및 LC-MS / MS 검출의 통합

doi: 10.3791/55778 Published: July 14, 2017

Summary

혼합 모드 양이온 교환 (MCX) 96- 웰 마이크로 플레이트상에서 효율적인 고체상 추출과 결합 된 선택적이고 민감한 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS)이 유리 3- 니트로 티로신의 측정을 위해 개발되었다 3-NT)을 임상 적으로 사용하기에 적합합니다.

Abstract

Free 3- nitrotyrosine (3-NT)은 산화 스트레스에 대한 가능한 바이오 마커로 광범위하게 사용되어 왔습니다. 3-NT의 증가 된 수준은 다양한 병리학 적 조건에서보고되었다. 그러나 기존의 방법은 3-NT의 낮은 내인성 수준을 안정적으로 측정하는 데 필요한 충분한 감도 및 / 또는 특이성이 결여되어 있으며 임상 적용에 너무 복잡합니다. 따라서, 3-NT의 수준을 정확히 정량화하고 병리학 적 조건에서 3-NT의 역할을 검증하기 위해서는 분석적 개선이 시급히 필요하다. 이 프로토콜은 비 침습성 바이오 마커로서 인간의 소변에서 3-NT의 신속하고 정확한 측정을위한 소형 고체상 추출 (SPE)과 결합 된 새로운 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS / MS) 검출의 개발을 제시합니다 산화 스트레스. SPE는 96- 웰 플레이트를 사용하여 지루한 유도체 화 및 증발 단계없이 샘플 클린업 및 분석 물 농축을 결합함으로써 공정을 현저히 단순화시켰다, 용매 소비, 폐기물 처리, 오염 위험 및 전반적인 처리 시간 감소. SPE 용출 용액으로서 pH 9에서 25 mM 암모늄 아세테이트 (NH 4 OAc)를 사용함으로써 선택성이 실질적으로 향상되었다. 질량 분석법 신호 응답은 다중 반응 모니터링 (MRM) 전환의 조정을 통해 향상되었습니다. 펜타 플루오로 페닐 (PFP) 컬럼 (150 mm x 2.1 mm, 3 μm)에서 첨가제로 0.01 % HCOOH를 사용하면 신호 응답이 2.5 배 향상되었고 전체 실행 시간이 7 분으로 단축되었습니다. 10 pg / mL (0.044 nM)의 정량 하한 (LLOQ)이 달성되어보고 된 분석법에 비해 현저한 민감도 향상을 나타냅니다. 이 간단하고 신속한 선택적이고 민감한 방법으로 24 시간 동안 2 장의 소변 샘플 (n = 192)을 처리 할 수 ​​있습니다. 현저하게 개선 된 분석 성능과 비 침습성 및 저렴한 소변 샘플링을 고려하면, 제안 된 분석법은 전임상 및 임상연구.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

최근 임상 연구에서 산화 스트레스의 영향이 최전방으로 치닫고 있습니다 1 . 연구되는 바이오 마커 중 하나는 반응성 질소 종 (RNS)이 티로신 (catecholamine neurotransmitter precursor)과 상호 작용할 때 형성된 안정한 제품인 3- 니트로 티로신 (3-NT)입니다. 3-NT는 생체 내 RNS의 바이오 마커로서 임상 적 가치를 가질 수 있지만 , 티로신의 성질과 기능의 실질적인 변화는 해당 단백질과 세포 기능에 악영향을 미칠 수 있습니다 1 , 2 . 신생 연구는 3-NT가 염증성 질환 3 , 신경 퇴행성 질환 4 , 5 , 심혈관 질환 6 및 당뇨병 7 뿐만 아니라 산화 스트레스와 관련된 상태에서 중요한 역할을 할 수 있다고 제안했다. 그러나, 이러한 obse민감도 및 / 또는 선택성이 결여 된 방법론 8 , 9 , 10 , 11의 결과에 근거합니다. 이전에 문헌에보고 된 생물학적 시료에 대한 거대한 3-NT 농도 범위는 심각한 분석 문제가 이러한 분석법과 관련되어 있으며 3-NT 수준을 정확하게 계량화하고 이러한 병리 현상에서의 역할을 확인하기위한 기술적 개선이 필요함을 보여줍니다 .

생물학적 기질에서 유리 3-NT의 정량은 사람과 도구 8 , 9 , 10 , 11에 특별한 도전이됩니다. 첫째, 내인성 3-NT의 추적 수준은 매우 민감한 탐지를 요구합니다. 둘째로 구조적으로 유사한 많은 유사체, 특히 티로신이 존재한다.광대 한 과잉은, 높은 선택성을 요구한다; 셋째, 유비쿼터스 질산염과 아질산염으로 티로신 니트로 화에 의한 3-NT의 인공 생성물은 3-NT의 잘못된 과대 평가를 피하기 위해 시료 준비 중에 특별한 고려가 필요하다.

3-NT를 측정하기 위해 사용 된 다양한 방법론 중에서 MS / MS는 탁월한 감도 및 선택성 11 , 12 , 13 , 14 로 인해 금 표준 방법으로 간주되었습니다. 가스 크로마토 그래피 (GC) 결합 MS / MS가 가장 우수한 감도를 제공하지만 필수적인 유도체 화 단계는 임상 유틸리티 15 , 16에 비해 너무 지루하고 시간 소모적입니다. LC-MS / MS는 복잡한 표본 유도체 화를 필요로하지 않으므로 더 유망한 옵션입니다. 그럼에도 불구하고 se와 같은 극복해야 할 몇 가지 장애물이 있습니다.낮은 농도의 3-NT 7 , 17 , 18 의 측정을 위해서는 문헌에보고 된 LC-MS / MS 방법의 사용성이 향상되어야하고 고 처리량 응용 12 , 13 , 17 , 19에 대해서는 상대적으로 긴 처리 시간을 단축해야합니다 .

또한, 임상 적용을 고려할 때, 사용 된 생물학적 기질이 중요한 역할을한다. 가능한 경우 쉽고 저렴해야하며 가능한 경우 비 침습적이어야합니다 20 , 21 , 22 . 문헌에서 전통적으로 사용 된 혈장은 임상 적으로 바람직한 매트릭스가 아니므로, 비 침습적이고 비용 효과가있는 소변을 이용하는 방법론이 필요하다.

rel 개발을위한 몇 가지 시도iable 및 특정 LC-MS / MS 방법은 소변 9 , 10 , 11을 사용하여 이루어졌습니다. 그러나, 그들은 모두 임상 적 사용을 위해 선택적이고, 신뢰할 만하 며, 효율적이지 못하다. 3 NT 분석을위한 샘플 정리 등과 같은 전통적인 역상 카트리지 (C18 타입)를 사용하여 지배적 인 SPE의 효과는 의문을 제기하고 강력한 양이온 교환의 순차적 인 SPE (SCX)와 역상 C18-OH 6 제안되었다되었습니다 7 , 19 . 한 최근 개발 된 LC-MS / MS 방법 3- NT (23)의 분석을위한 설명서 C18 SPE, 예비 고압 액체 크로마토 그래피 (HPLC), 온라인 SPE의 다단계 정제 공정을 이용했다. 이 방법은 0.041 nM의 LLOQ로 임상 목적에 충분히 민감했지만, 정화 과정은 집중적이고 지루하고 requi적색 3 mL의 소변. 높은 처리량에 대한 가능성을 제한합니다. 분자 임프린트 폴리머 정리 프로세스 (14)의 효율을 개선하기 위해 SPE 흡착제로서 사용되었지만, 생성 된 LLOQ (0.7 ㎍ / mL)의 임상 검체 충분히 낮은 아니었다. 또 다른 방법은 0.022 nM 24 의 검출 한계 (LOD)를 달성하기 위해 샘플 정화를 위해 2 차원 (2D) LC-MS / MS 및 면역 친화 크로마토 그래피가 필요했습니다. 이러한 모든 방법들이 3-NT의 평가에서 진전을 보였지만 임상 적용에 필요한 민감성, 신뢰성 및 효율성을 달성 한 것은 없습니다.

무료 3-NT의 병리 및 임상 설정에서 산화 스트레스의 바이오 마커의 역할을 조사하기 위해, 우리는 높은 처리량 임상 적용 25 수 있도록, 간단하고 효율적 정확하고 정밀한하는 방법을 개발했다. 소형화 된 혼합 모드 양이온 엑시드유도체 화, 증발 및 2D-LC를 필요로하는 기존 방법에서 나타나는 단점을 우회하여 단일 추출에서 3-NT의 간단하고 효과적인 시료 정화 및 농축을 달성하기 위해 hange (MCX) 96-well 추출 마이크로 플레이트가 구현되었습니다. 0.01 % HCOOH가 첨가 된 액체 크로마토 그래피는 신속한 사이클 시간으로 향상된 신호 응답을 제공합니다. 선택성은 3-NT의 선택적 용리 및 3-NT 및 내부 표준 (IS) 모두에 대한 MRM 전이의 사용을위한 약한 NH 4 OAc 용출 용액의 적용을 통해 더욱 향상되었다. 기질 효과는 정량화를 위해 선호되는 13 C- 동위 원소 IS의 감소 된 양을 사용함으로써 보상되었다. 이 방법론의 출현과 함께 연구원 및 임상의는 임상 적 상태에서 3-NT의 역할을 검증하고 산화 스트레스의 영향을 더 탐구 할 수있을 것이다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

인간의 소변 샘플을 포함한 모든 연구는 Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB)의 승인 절차를 거쳤습니다.

1. 소변 채취 및 크레아티닌 (Cr) 측정

  1. 다음 아침 소변 샘플 5 mL를 ca. 사용하기 전까지 -20 ° C에서 방부제 및 저장액으로 3 N HCl 250 μL를 함유하는 5 mL 수송 튜브 A에서 10 시간 하룻밤 동안 단식.
  2. 해동과 소용돌이 5 mL 수송 뇨 튜브와 원심 분리기 ( 예 : Sorvall) (2297 xg, 10 분)에서 원심 분리하십시오.
  3. 소변 1 mL를 5 mL 수송 튜브 A에서 두 번 두 번.
  4. 비뇨기 creatinine 방법으로 크롬을 결정하십시오 26 .

2. 표준, IS 및 품질 관리 (QC) 샘플 준비

  1. 0.01 % HCOOH 이동상 A (MA)가 함유 된 물에서 100 μg / mL의 3-NT의 스톡 용액을 준비하고 -20 ° C에서 보관하십시오.
  2. 하다MA로 100 μg / mL 3-NT 저장 용액을 희석하여 100 ng / mL의 농도로 3-NT 작업 표준 용액을 만듭니다.
  3. 100 ng / mL 작업 표준의 희석으로 5에서 2500 pg / mL 범위의 표준을 생성하고 0.15 M HCl 산성화 된 3-NT 공시 뇨와 공시험 시료 및 이중 여백 시료를 사용하십시오.
  4. -20 ℃에서 13 C IS MA 물에 100 ㎍ / ㎖의에 9 -3- NT 및 저장소의 스톡 용액을 제조 하였다.
  5. 100 ㎍ / ㎖의 13 C 9 -3- NT 희석하여 500 pg / ml이다에서 작동 용액을 제조는 MA와 원액이다.
  6. 산성화 된 공백 소변에서 3-NT 작업 표준을 희석하여 LLOQ, 저, 중 및 고 수준 ( , 10, 25, 100, 500 및 1,250 pg / mL)을 포함하는 5 가지 수준의 QC 시료를 만듭니다.

3. 고체상 추출 과정

  1. 해동 및 소용돌이 샘플, 표준 및 QC 샘플.
  2. 소변 샘플, 표준 및 QC samp 추가les (각각 250 μL)을 깨끗한 2 mL 96- 웰 수집 플레이트 32 웰로 옮겼습니다.
  3. 이중 빈 샘플 웰을 제외한 각 웰에 500 pg / mL IS 작동 용액 (50 μL)을 주입하십시오. 이중 빈 샘플 우물에 0.01 % HCOOH (50 μL)를 첨가한다.
  4. 0.1 % HCOOH (250 μL)가 첨가 된 LC-MS / MS 물을 넣는다.
  5. 위의 혼합물을 8 채널 피펫으로 3 번 섞는다.
  6. SPE 로딩 될 때까지 플레이트를 덮으십시오.
  7. MCX 96-well 추출 플레이트와 수집 저장소를 양압 프로세서에 놓습니다.
  8. 흡착제를 통해 MeOH (200 μL)를 흐르게하여 추출 플레이트를 컨디셔닝한다.
  9. 흡착제를 통해 2 % HCOOH (200 μL)로 물을 흐르게하여 평형을 이룬다.
  10. 8 채널 피펫을 사용하여 미리 혼합 된 각 샘플의 전체 부피를 신중하게 사전 조건화 된 추출 플레이트에로드하십시오.
  11. 혼합물이 흐를 수 있도록 양압 프로세서에서 낮은 양의 압력 ( 예 : 3 psi)을 설정하십시오흡착제를 천천히 가볍게 두드려서 필요하면 압력을 조절하십시오.
  12. 흡착제를 통해 2 % HCOOH (200 μL)로 물을 흘려 우물을 씻으십시오.
  13. 흡착제에 메탄올 (200 μL)을 흘려 우물을 씻으십시오.
  14. 흡착제에 물 (200 μL)을 흘려 우물을 씻으십시오.
  15. 양압 프로세서에서 높은 양압 설정 ( 예 : 40 psi)으로 웰을 완전히 말립니다.
  16. Reservoir를 깨끗한 2 mL 96-well collection plate로 교체하십시오.
  17. 추출 플레이트에서 보존 된 분석 물 및 IS를 용리시키기 위해 pH 9 (50 μL)에서 25 mM NH 4 OAc를 적용한다.
  18. 용리액을 중화하기 위해 5 % HCOOH (50 μL)가 함유 된 LC-MS 물을 피펫에 넣습니다.
  19. 8 채널 피펫으로 3 번 혼합하고 분석을 위해 LC-MS / MS 스테이션에 제출하십시오.

4. LC-MS / MS 분석

  1. 눈금이 매겨진 실린더로 2,000 mL의 LC-MS 물을 정확하게 측정하고 2 L 병으로 옮깁니다.
  2. 피LC - MS 물이 담긴 위의 병에 200 μL 순수 HCOOH를 넣으십시오.
  3. 철저하게 혼합하고 이동상 A (MA)로 표시하십시오. 이니셜, 준비 날짜 및 만료 날짜를 포함하십시오.
  4. LC-MS 메탄올 2 L 병을 가져 와서 시작 날짜와 만기 날짜가있는 이동상 B (MB)로 표시하십시오.
  5. 자동 샘플러의 온도를 4 ° C로 설정하십시오.
  6. 준비 샘플과 함께 수집 판을 오토 샘플러에 놓습니다.
  7. 오븐에 PFP 컬럼 (150 mm x 2.1 mm id, 3 μm)과 보호 컬럼을 놓습니다.
  8. 오븐 온도를 30 ° C로 설정하십시오.
  9. 표 1에 표시된대로 LC 그라디언트 용리로 획득 방법을 사용하여 10 분간 평형을 이룬다.
시간 (분) 기준 치수 이벤트 매개 변수
0 슬리퍼 펌프 B Conc. 5
0.5 슬리퍼 펌프 B Conc. 20
1 슬리퍼 펌프 B Conc. 50
슬리퍼 펌프 B Conc. 80
4 슬리퍼 펌프 B Conc. 90
4.01 슬리퍼 펌프 B Conc. 95
5.5 슬리퍼 펌프 B Conc. 95
5.6 슬리퍼 펌프 B Conc. 5
7 제어 장치 중지

표 1 : 액체 크로마토 그라데이션 용출 조건

  1. 다음을 포함하는 일괄 처리 목록 만들기표준, 품질 관리 및 소변 샘플.
  2. 준비 샘플 (12 μL)의 주사에 의해 배치를 시작합니다.

5. 피크 식별, 통합 및 데이터 프로세스

  1. 소프트웨어를 사용하여 데이터 수집 및 처리를 제어합니다.
  2. 모든 샘플에 대해 3-NT 및 IS 피크를 확인하고 통합하십시오.
  3. 1-x의 가중치 인자로 3-NT와 IS의 피크 면적비와 명목상 3-NT 농도의 선형 회귀에 의한 3-NT 정량을위한 10-2,500 pg / mL 범위의 표준 곡선을 확립하십시오.
  4. 표준 곡선을 사용하여 모든 샘플을 정량화하십시오.
  5. QC 샘플이 설정된 범위에 속하는지 확인하십시오.
  6. 검출 된 소변 샘플의 농도를 nM 또는 nmol / mmol Cr 단위로 최종 결과로 변환하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

그림 1 은 3-NT가 최적화 된 LC 조건 하에서 구조적으로 유사한 다른 티로신 유사체로부터 완전히 크로마토 그래피 적으로 분리되어있어 이러한 과도한 화합물로 인한 용출 간섭을 제거하여 결과적으로 분석 선택도를 향상 시킨다는 것을 보여줍니다. 또한 MA 및 메탄올의 첨가제 인 0.01 % HCOOH를 유속 0.45 mL / min로 사용하는 구배 용출은 3-NT ( , 7 분의 처리 시간으로 3 분)의 신속한 용출을 가능하게합니다.

그림 1
그림 1 : 표준 용액에서 다른 티로신 유사체로부터의 3-NT의 기준 LC 크로마토 그래피 분리. ( A ) p- 티로신; ( B ) m- 티로신; ( C ) o -티로신; ( D ) Cl- 티로신; ( E ) 3-NT. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 는 이중 공백 샘플에서 3-NT 시그널이 관찰되지 않았 음을 보여 주며 전체 프로세스 중에 인공물 3-NT가 형성되지 않음을 나타냅니다. 그림 3 은 건강한 개체에 대한 3-NT 및 IS의 대표적인 MRM 크로마토 그램을 보여줍니다. 알 수있는 바와 같이, 간섭 신호는 3-NT 및 IS의 보유 시간에서 관찰되지 않는다. 또한, 아질산염 (50 μM), 질산염 (50 μM) 및 티로신 (50 μM / L) 25를 함유 한 비 스파이크 형 및 스파이크 형 소변 샘플간에 3-NT의 ± 6 % 미만의 차이가 관찰되었으며, 분석의 특이성에


그림 2 : 대표 Double Blank 시료의 3-NT 및 IS의 MRM 크로마토 그램 ( A ) 3-NT MRM 수량 화기 227.0> 90.0; ( B )는 MRM 수량 한정자 236.0> 189.0입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 건강한 사람들의 대표적인 소변 샘플에서 3-NT 및 IS의 MRM 크로마토 그램. ( A ) 3-NT MRM 수량 화기 227.0> 90.0; ( B )는 MRM 수량 한정자 236.0> 189.0입니다. 그 사람을 클릭하십시오.이 그림의 더 큰 버전을 보려면

3-NT의 피크 면적비와 3-NT의 명목 농도 대 선형 피팅을 사용하여 10-2,500 pg / mL의 범위에서 3-NT로 스파이크 된 산성화 된 블랭크 소변을 추출하여 표준 곡선을 확립 하였다 1 / x 가중치. 그림 4 는 대표적인 표준 곡선을 보여줍니다. 3보다 큰 신호 - 대 - 잡음비를 갖는 최저 농도로 정의 된 LOD는 2 pg / mL (0.0088 nM)로 결정되었다. LLOQ는 10 pg / mL (0.044 nM)로 정해졌으며, 10보다 큰 신호 대 잡음비로 정확도와 정확도의 ± 20 % 이내에서 측정 할 최저 농도로 결정되었습니다.

그림 4
그림 4 : 대표적인 3-NT 표준 곡선10-2,500 pg / mL의 범위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

인간 소변 샘플의 내인성 자유 3-NT에 대한 문헌에서 이전에보고 된 농도의 상당한 변화는 이용 가능한 분석 8 , 9 , 10 , 11 과 관련된 방법 론적 문제점을 나타낸다. 인간 소변에서 3-NT의 낮은 기본 수준을 정확하게 결정하는 것은 시료 준비 및 LC-MS / MS 분석을위한 특별한 예방 조치가 필요한 까다로운 과제로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 높은 처리량으로 요중 3-NT의 특정하고 민감한 결정을 허용 선택적 LC-MS / MS 감지와 결합 된 새로운 SPE 절차를 설명합니다.

MRM 매개 변수를 신중하게 선택하면 3-NT 검출에 대한 선택성이 향상되었습니다. NT-3에 대한 IS의 236.0> 96.0 MRM 전이 m / z가 플라즈마 (27)에 소변 샘플 심각한 오염 발생. 더 깨끗한 9 배 신호 증가응답은 MRM 전이로 달성되었다. m / z 236.0> 189.0. 가장 집중적 인 전환 m / z 227.0> 181.0을 사용하여 심각한 간섭으로 인해 3-NT 정량을 위해 MRM 전환 m / z 227.0> 90.0이 선택되었습니다. 자세한 MRM 전환 및 복합 매개 변수는 표 2에 요약되어 있습니다.

분석 대상 MRM 전이 (m / z) DP (V) EP (V) CE (eV) CXP (V)
3-NT (수량 기호) 227.0> 90.0 50 10 38 세 13
3-NT (한정어) 227.0> 103.9 50 10 45 16
13 C 9 -NT (1S) 236.0> 189.0 50 10 21 14
이온 분무 전압 : 2200 V; 온도 : 600 ℃; 커튼 가스 : 35; CAD 가스 : 9; 분무기 가스 (GS1) : 50; 히터 가스 (GS2) : 55.

표 2 : 최적화 된 MRM 조건.

일반적으로 문헌 12 , 13 , 17 , 19 에서 3-NT의 LC 크로마토 그래피 분리에 사용되는 전통적인 C18- 유형 컬럼은 간섭을 줄이기 위해 긴 처리 시간을 필요로하므로 높은 처리량에 도움이되지 않습니다. 이 프로토콜에서, PFP 컬럼은 극성 화합물 22 의 강화 된 보유에 기초한 3-NT의 LC 크로마토 그래피 분리의 최적화를 위해 사용되었으며 ,> 27 , 28 . 이동상 첨가제의 농도는 신호 강도 25 , 28 에 중요한 영향을 미칩니다. 0.01 %의 HCOOH는 MA에서 최적의 첨가제 인 것으로 밝혀 졌는데, 이는 0.1 %의 농도보다 2.5 배의 신호 증가를 가져 왔고, 농도 감소 된 신호 응답을 더욱 감소시켰다. 물 (MA)과 메탄올 (MB)에 0.01 % HCOOH를 사용하는 구배 용출 프로필을 0.45 mL / min의 유속으로 설정하여 3 분 이내에 3-NT의 최적 분리와 빠른 용출을 달성했으며 총 실행 시간은 단 7 분으로 복잡한 생물학적 매트릭스에서 3-NT의 분석이 문헌 12 , 13 , 17 , 19 에보고 된 것보다 훨씬 빠릅니다.

기존의 역상 카트리지 (C18 유형) p의 비 효과를 해결하기 위해redominantly 생물학적 시료 (6)의 SPE 7에 사용 최근 SPE 개선 초래 한 이중 기능성 96 웰 MCX 판 (27)에 SPE에 의해 인간 혈장 3- NT를 결정하기 위해 LC-MS / MS 방법을 개발 효율성 및 선택성. 그러나 문헌에서 모든 SPE 접근법의 단점은 힘들고 위험과 관련된 증발 및 재구성 단계이다. 또한, 플라즈마 방법은 흡착제의 오염을 제거하기 위해 추출 판을 여분으로 사전 세척해야했습니다. 이 프로토콜에서, 이러한 단점은 소형 96- 웰 마이크로 플레이트를 사용하여 맞춤형 SPE에 의해 제거되었습니다. 용리액의 선택은 추출 효율에 결정적인 것으로 나타났다. MeOH의 다양한 조성을 갖는 일반적인 NH 4 OH 용출액을 적용함으로써 소변 샘플에서 실질적인 간섭이 관찰되었다. 그것은 간섭메탄올 성 NH 4 OH 용리액의 강한 용출력 때문에 분석 물질과 함께 용리되었다. 결과적으로 낮은 선택성을 초래한다. 선택성을 향상시키기 위해서는 3-NT를 용리시킬만큼 충분히 강하고 간섭 성 화합물의 용출을 일으키지 않을 정도로 약한 용액을 확인하는 것이 필요했다. 상이한 pH 및 농도에서 덜 염기성 인 NH 4 OAc를 상세히 조사한 후, pH 9를 갖는 25 mM NH 4 OAc 용액이 용리액으로서 최적 인 것으로 밝혀졌다. 최적화 된 용리 용액을 사용하면 간섭 성 화합물의 문제가 해결되었고 일반적인 메탄올 성 NH 4 OH 용리액과 비교하여 40 %의 감도 증가가 달성되었습니다.

표 3은 생물학적 매트릭스에서 유리 3-NT를 결정하기위한 다른 이용 가능한 방법과 비교 된이 프로토콜 25 의 분석 성능에 대한 상세한 요약을 제공한다. 이 프로토콜 이전에보고 된 분석법에 비해 몇 가지 뚜렷한 이점을 제공합니다. 첫째, 96-well extraction microplate를 사용하여 SPE를 포함하는 3-NT 방법에서 전형적으로 요구되는 증발 및 재구성의 1 - 5 사이클을 피하면서 시료를 깨끗하게하고 분석 물을 농축하는 단일 단계가 이루어졌습니다. 둘째, SPE에 대한 시료 당 용매 사용량은 5.5 - 118 mL에서 1.1 mL로 크게 감소하여 용매 및 폐기물 처리를 5-107 배 감소 시켰습니다. 셋째, 샘플 당 LC 처리 시간은 다른 분석법에 비해 2-7 배 감소했으며 이전 플라즈마 방법보다 30 % 더 빠릅니다. 넷째, 10-3,000는 바람직 13 C-표지 매트릭스 효과 보상을 위해 필요 하였다 낮은 양 폴드. 마지막으로,이 분석은 비뇨기 3-NT의 정량화를위한 ​​기존의 다른 SPE 기반 LC-MS / MS 방법에 비해 현저한 민감도 향상을 나타냅니다.

방법 "> 샘플 준비 분석적
방법
매트릭스 LOD (nM) LOQ (nM) LC 운전 (분) Evap c Sol d (mL) IS (ng) Ref. SPE (C18)
+ 여과 LC-MS / MS 혈장 0.034 0.112 20 1 13 아날로그 f 2 [6] SPE
(MCX 플레이트) LC-MS / MS 혈장 0.0088 0.022 10 1 5.6 13 C 9 -NT 0.25 [27] PPT + SPE (MCX) + der a HPLC-UV 혈청 NA b 100 40 1 7.3 NA b NA b [12] HPLC + 데르 GC-MS / MS 오줌 0.004 0.125 NA b 5 NA b d 3 -NT 4.6 [16] PPT + SPE (아미노기) + A 데르 LC-MS / MS 고양이 소변 NA b 14.5 40 삼 23 d 3 -NT 75 [17] PPT + 가수 분해 + SPE (SCX-C18) LC-MS / MS 소변 (단백질) 400 없음 50 2 118 d 3 -NT 2 [19] IA-2D LC e LC-MS / MS 오줌 0.022 없음 14 NA b NA b 13 C 9 -NT 0.85 [24] SPE (C18) + 가수 분해 HPLC-ECD 소변 (총) NA b 4 40 2 5.5 NA b NA b [13] SPE (C18) + LC 준비 g의
+ 온라인 SPE LC-MS / MS 오줌 0.0088 0.041 30 2 38 세 d 3 -NT 5 [23] SPE (MIP) HPLC-UV 스파이크 된 소변 700 없음 20 18 개월 NA b NA b [14] SPE (MCX μElution) LC-MS / MS 오줌 0.0088 0.044 7 아니 1.1 13 C 9 -NT 0.03 이 일 a der : 유도체 화; b NA : 사용할 수 없음. c Evap : Evaporation; d Sol : 샘플 당 용매; e IA-2D LC : 면역 친 화성 크로마토 그래피 및 2 차원 LC; f 아날로그 : o- 메틸 - 티로신; g LC 준비 : 분 취용 HPLC 정제.

도표 3 : Compari생물학적 매트릭스에서 3-NT의 검출을위한 기존의 분석법으로이 의정서의 분석 성능의 아들

제안 된 분석의 분석 및 임상 적 타당성은 또한 82 건강한 사람 (25)의 본격적인 소변 샘플에서 확립 비뇨기 -3- NT에 대한 기준 기간의 측정을 통해 평가 하였다. 개선 된 단순성 및 처리량 방법은 24 시간 내에 두 개의 소변 샘플 (n = 192)을 처리하고 분석 할 수있게합니다. 비 침습성 소변 채취법을 사용하여 개발 된 방법은 단순하고 신속하며 민감하고 선택적이어서 임상 적 상태에서의 3-NT의 역할을 검증하고 산화 스트레스의 영향을 더 연구하는 데 강력한 도구가 될 것으로 기대된다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 용리 완충액으로 약한 NH4OAc를 사용하는 MCX 마이크로 플레이트상의 SPE, 0.01 % HCOOH를 첨가제로 사용하는 PFP 칼럼에서의 LC 분리 및 3-NT 정량에 대한 MRM 선택을 포함합니다. 방법의 미래 응용 프로그램은 임상 응용 프로그램에 대한 제안 된 프로토콜의 잠재적 인 함정이 해결 될 유지 염증 및 신경 퇴행성 질환 등의 병적 상태와 환자의 3-NT 농도를 정량화를위한 것입니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

저자는 Scott Haard와 Abigail Marinack에게이 작업에 대한 일반적인 지원과 조정에 대해 인정할 것입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Nitro-L-tyrosine Sigma N7389-5g
3-Nitro-L-tyrosine-13C9 Sigma 652296-5.0mg
Mass Spec Gold Urine Golden West Biologicals MSG 5000-1L
Oasis MCX 96-well µElution plate Waters 186001830BA
2 mL 96 well collection plate Phenomenex   AH0-7194
96 positive processor Waters  186005521
LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol   Sigma 14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV water Sigma 14263-2L
Formic acid for mass spectrometry Sigma 94318-50ML-F
Ammonium hydroxide solution Sigma 338818-1L
Ultra PFP propyl columns Restek 9179362
5500 Triple quad AB Sciex  / Contact manufacture for more detail
UFLC-XR Shimadzu  / Contact manufacture for more detail
Integra 400 Plus  Roche / Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method
LCMS certified 12 x 32 mm screw neck vial Waters 600000751CV
LCGC certified 12 x 32 mm screw neck total recovery vial Waters 186000384C
5 mL transport tube Phenix TT-3205
50 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2263
15 mL Centrifuge tube Crystalgen  23-2266
eLine electronic pipette Sartorius 730391
Microfuge centrifuge  Beckman Coulter A46474
OHAUS balance   Kennedy Scales, inc. 735
Vortex mixer  Bernstead Thermolyne M16715

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. Biomarkers of oxidative damage in human disease. Clin. Chem. 52, (4), 601-623 (2006).
  2. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol. Rev. 87, (1), 315-424 (2007).
  3. Baraldi, E., et al. 3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children. Allergy. 61, (1), 90-96 (2006).
  4. Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association? J. Clin. Invest. 111, (2), 163-169 (2003).
  5. Butterfield, D. A., et al. Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease. Brain Res. 1148, 243-248 (2007).
  6. Hui, Y., et al. A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery. Electrophoresis. 33, (4), 697-704 (2012).
  7. Kato, Y., et al. Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. J. Clin. Biochem. Nutr. 44, (1), 67-78 (2009).
  8. Duncan, M. W. A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine. Amino acids. 25, (3-4), 351-361 (2003).
  9. Ryberg, H., Caidahl, K. Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples. J. Chromatogr. B. 851, (1-2), 160-171 (2007).
  10. Tsikas, D. Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry. Amino acids. 42, (1), 45-63 (2012).
  11. Tsikas, D., Duncan, M. W. Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective. Mass Spectrom. Rev. 33, (4), 237-276 (2014).
  12. Iwasaki, Y., et al. Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. Biomed. Chromatogr. 26, (1), 41-50 (2012).
  13. Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine. J. Chromatogr. A. 1217, (19), 3269-3274 (2010).
  14. Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases. Biosens. Bioelectron. 40, (1), 336-341 (2013).
  15. Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state. Anal. Biochem. 276, (2), 195-203 (1999).
  16. Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake. J. Chromatogr. B. 827, (1), 146-156 (2005).
  17. Marvin, L. F., et al. Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution. Anal. Chem. 75, (2), 261-267 (2003).
  18. Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage. J. Chromatogr. B. 799, (2), 245-254 (2004).
  19. Chen, H. J. C., Chiu, W. L. Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Toxicol. Lett. 181, (1), 31-39 (2008).
  20. Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability. Neurosci. Biobehav. Rev. 35, (3), 635-644 (2011).
  21. Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies. Anal. Bioanal. Chem. 406, (28), 7287-7297 (2014).
  22. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples. Talanta. 159, 238-247 (2016).
  23. Chao, M. R., et al. Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 28, (5), 997-1006 (2015).
  24. Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker. Anal. Biochem. 380, (1), 68-76 (2008).
  25. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine. Anal. Bioanal. Chem. 407, (25), 7703-7712 (2015).
  26. Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. Mannheim. Available from: https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html 2011-2011 (2011).
  27. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker. Talanta. 140, 45-51 (2015).
  28. Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication. J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).
임상 응용을위한 인간의 소변에서 3- 니트로 타이로신의 소형 고체 상 추출 및 LC-MS / MS 검출의 통합
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).More

Li, X. S., Li, S., Ahrens, M., Kellermann, G. Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications. J. Vis. Exp. (125), e55778, doi:10.3791/55778 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter