Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Atomic skala strukturelle studier av Macromolecular samlinger av Solid-state kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi

Published: September 17, 2017 doi: 10.3791/55779
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Chemistry, Biology of Membranes, Nanoobjects, UMR5248 CNRS, Université de Bordeaux

Summary

Strukturer av supramolecular protein samlinger atomic oppløsningen er høy relevans sin avgjørende rolle i en rekke biologiske fenomener. Her presenterer vi en protokoll for å utføre høyoppløselig strukturelle studier uløselig og ikke-krystallinske macromolecular protein samlinger av magi-vinkel spinning SSD kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi (MAS SSNMR).

Abstract

Supramolecular protein samlinger spille grunnleggende roller i biologiske prosesser fra verten-patogen interaksjon, virusinfeksjon til utbredelsen av nevrodegenerative lidelser. Slike samlinger består i flere protein underenheter organisert i en ikke-kovalente måte å danne store macromolecular objekter som kan utføre en rekke cellulære funksjoner eller forårsake ødeleggende konsekvenser. Atomic innsikt i samlingen mekanismer og funksjon av de macromolecular samlingene fortsatt ofte mangelvare siden deres iboende insolubility og ikke-crystallinity ofte drastisk reduserer kvaliteten på dataene innhentet fra de fleste teknikker brukt i strukturell biologi, som Røntgenkrystallografi og løsning kjernefysiske magnetisk resonans (NRM). Her presenterer vi magic-vinkel spinning SSD NMR spektroskopi (SSNMR) som en kraftfull metode å undersøke strukturer i macromolecular samlinger atomic oppløsning. SSNMR kan avsløre Atom detaljer om samlet komplekset uten størrelse og løselighet begrensninger. Protokollen presenteres her beskriver de grunnleggende trinnene produksjon av 13C /15N isotop-merket macromolecular protein samlinger til anskaffelsen av standard SSNMR spectra og analyse og fortolkning. Som et eksempel viser vi en SSNMR strukturell analyse av en trådformede protein forsamling pipeline.

Introduction

Fremskritt innen magi-vinkel spinning SSD kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi (SSNMR) tilbyr et effektivt verktøy for strukturelle karakterisering av macromolecular protein samlinger på en atomic oppløsning. Disse protein samlinger er allestedsnærværende systemer som spiller viktige roller i mange biologiske prosesser. Deres molekylære strukturer og interaksjoner dynamics er tilgjengelige for SSNMR studier, som har vært vist viral (capsids1) og bakteriell infeksjon mekanismer (sekresjon systemer2,3, pili4), membran protein komplekser5,6,7,8 og funksjonelle amyloids 9,10,11. Denne typen molekylær forsamlingen kan også vil provosere patologi som i nevrodegenerative sykdommer der proteiner sammen i misfolded, amyloid stater og forårsake avvikende celle atferd eller celle død 12,13. Protein samlinger er ofte bygget av den symmetriske oligomerization multipler eksemplarer av protein underenheter i store supramolecular objekter av ulike figurer inkludert fibrils, filamenter, porer, rør eller nanopartikler. Kvartær arkitekturen er definert av svake interaksjoner mellom protein tenkes å organisere samlingen romlige og tidsmessige og tillate sofistikert biologiske funksjoner. Strukturelle undersøkelser på en atomic skala på disse forsamlinger er en utfordring for høyoppløselig teknikker siden deres iboende insolubility og svært ofte deres ikke-crystallinity begrenser bruken av konvensjonelle Røntgenkrystallografi eller løsning NMR tilnærminger. Magic-vinkel spinning (MAS) SSNMR er en ny teknikk å anskaffe atomic oppløsning på uløselig macromolecular samlinger og har bevist sin effektivitet å løse 3D atomic modeller for et økende antall komplekse biomolecular systemer inkludert bakteriell filamenter, amyloid samlinger og virus partikler 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Tekniske fremskritt på høy magnetfelt, metodisk utviklingen og prøve forberedelser har etablert MAS SSNMR i en robust metode å undersøke uløselig proteiner i ulike miljøer, spesielt i deres biologisk relevante macromolecular samlet stat eller i mobilnettet membraner, gjør teknikken svært utfyllende til cryo-elektronmikroskop. I mange tilfeller er karakteriserer en svært høy grad av symmetri slik protein samlinger. MAS SSNMR utnytter denne funksjonen, som alle protein underenheter i en homomolecular samling ville ha den samme lokale strukturen og derfor nesten samme SSNMR signatur, drastisk redusere kompleksiteten i analysen.

En effektiv protokoll for strukturelle studier av macromolecular protein samlinger av moderate MAS (< 25 kHz) SSNMR presenteres i denne videoen og kan deles inn i ulike trinn (figur 1). Vi vil vise de kritiske stadiene av arbeidsflyten en SSNMR strukturelle studie eksemplifiseres på en trådformede protein forsamling (se uthevet meter i figur 1), med unntak av protein delenhet rensing, ulik for hver protein montering men av kritisk betydning for strukturelle studier, og uten å gå inn i tekniske/metodologiske detaljer om SSNMR spektroskopi og struktur beregning for hva spesialiserte guider er tilgjengelig online. Mens den nåværende protokollen primært fokusere på SSD NMR eksperimenter utført under MAS forhold, justert bruk av biologiske miljøer 23,24,25,26 , 27, som justerte bicelles, tillate etterforskningen av protein konformasjon og dynamisk protein-protein samhandling i membranen som media uten MAS teknologi. Vi vil vise protein uttrykk og montering trinn, samt opptak av de avgjørende SSNMR spectra og analyse og fortolkning. Vårt mål er å gi innsikt i rørledningen strukturelle analysen slik at leseren å utføre en atomic oppløsning strukturelle studie av en macromolecular samling av SSNMR teknikker.

Protokollen omfatter 3 deler:

1. SSD NMR eksempel produksjon

Som en forutsetning for en SSD NMR analyse, protein komponenter av macromolecular montering måtte uttrykkes, isotop-merket, renset og montert i vitro i native-lignende komplekse staten (for en eksempel se figur 2) . For å sikre høy NMR følsomhet, er isotop anriking i 13C og 15N merking nødvendig ved bruk av minimal bakteriell expression media med 13C og 15N kilder, for eksempel jevnt 13 C-merket glukose/glyserol og 15NH4Cl henholdsvis. Senere stadium av protokollen, selektivt 13C-merket prøver produsert med selektivt 13C-merket kilder som (1,3 -13C)- og (2 -13C)-glyserol (eller (1 -13C)- og (2 -13C)- glukose) brukes til å forenkle NMR analysen. Blandet merket sample tilsvarer en ekvimolare blanding av 50% 15N- og 50% 13C-merket eller 50% (1,3 -13C)- og 50% (2 -13C)-glukose er innført for å beskrive påvisning av intermolekylære interaksjoner. En høy grad av protein renhet samt strenge vilkår under montering trinn er viktige faktorer for å sikre en homogen strukturelle for siste prøven.

2. foreløpige strukturelle karakterisering basert på endimensjonal (1D) SSD NMR

Vi presenterer viktige eksperimenter for en strukturell analyse av SSNMR. Endimensjonal (1D) kryss-polarisering (CP) og INEPT / RINEPT28 eksperimenter, oppdaget på 13C kjerner brukes til å oppdage rigid og fleksibel protein segmenter i forsamlingen, henholdsvis, og til å beregne graden av strukturelle homogenitet og lokale polymorfisme (for en eksempel se Figur 3).

Rong > 3. Conformational analyse og 3D struktur besluttsomhet

Underpunktene 1 og 2 bekymring conformational analysen, som er basert på SSNMR resonans tildelingen av alle stive rester av protein forsamlingen, som kjemisk Skift er svært følsomme sonder til det lokale miljøet og kan brukes til å forutsi phi/psi dihedral vinkler og bestemme dermed sekundære strukturen. Figur 4 illustrerer et eksempel på en sekvensiell resonans tildeling i stive kjernen av en protein forsamling. Den 3D proteinstrukturer er basert på innsamling av strukturelle data som avstanden begrensninger koding lukke proximities (< 7-9 Å), som inneholder både intra- og intermolekylære informasjon. Avsnitt 3 og 4 beskriver langtrekkende fjernt tilbakeholdenhet innsamling og tolkning. Langtrekkende kontakter defineres som intramolekylære 13C -13C proximities som oppstår fra rester jeg til j, med | jeg-j | ≥4, definere dermed tertiær protein fold av den monomerisk delenhet eller intermolekylære 13C -13C proximities, definere de intermolekylære grensesnittene mellom protein underenheter i forsamlingen. Intra- og intermolekylære grensesnitt er illustrert i figur 5. SSNMR begrensninger oppdaget gjennom 13C -13C og 15N -13C recoupling eksperimenter vanligvis kode for internuclear avstander < 1 nm. Ledd 4 forklarer påvisning av intermolekylære avstanden begrensninger. I symmetrisk protein samlinger, bruk av homogent merket prøver (i.e. 100% jevnt eller selektivt merket) for identifisere intermolekylære delenhet-delenhet interaksjoner er begrenset, som begge intra - og inter - molecular kontakter føre til synlig signaler. Entydig påvisning av intermolekylære proximities oppnås ved å bruke blandet merket prøver, som inneholder en ekvimolare blanding av to annerledes merket prøver, kombinert før aggregering. Avsnittet 5 kort introduserer struktur modellering.

Figure 1
Figur 1 : Arbeidsflyten en atomic oppløsning strukturelle studie av solid-state NMR. 13 C, 15N isotop merket protein produksjon, delenhet rensing, delenhet samlingen, kontroll av montering formasjon, SSNMR eksperimenter, SSNMR eksperiment analyse og utvinning av avstanden begrensninger og struktur modellering vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

1. solid-state NMR prøve produksjonINT

  1. produksjon av jevnt 13 C / 15 N-merket protein underenheter
    1. Bruk ferske forvandlet, pET24-peptid-6his plasmider inneholder E. coli BL21 (DE3) celler, høste dem fra forberedt agar platen.
    2. Vaksinere en 15 mL pre kultur for forvarmes LB medium med en koloni. Ruge på 37 ° C med 200 rpm skjelvende natten.
    3. Overføre pre kulturen til 1 L viktigste kultur forvarmes M9 medium (se komposisjon i tabell 1), som inneholder de nødvendige isotop-merket karbon- og nitrogen kildene.
      Merk: Dette kan være jevnt 13 C-merket glukose, selektivt (1 - 13 C)- eller (2 - 13 C)-merket glukose 29 , 30 , 31 eller () 1,3 - 13 C)- eller (2 - 13 C)-merket glyserol 32 , 33.
    4. Ruge dette på 37 ° C og måler OD 600 så snart kulturen blir grumset. Når OD 600 har nådd en verdi på 0,8, indusere protein uttrykk med 0,75 mM IPTG for 4 h.
      Merk: Optimal induksjon forholdene kan variere fra en protein til en annen.
    5. Gjenopprette cellene med sentrifugering i 30 min på 6000 x g og 4 ° C.
  2. Rensing skisse (ikke vist i videoen protokollen)
    1. Lyse celler ved hjelp av for eksempel sonication eller lysozyme behandling og rense protein delenhet bruke teknikker etablert eller tilpasset for den undersøkt protein montering.
      Merk: Protein kan uttrykkes i inkludering organer, sjekk for protein lokalisering av cellen lyse og påfølgende sentrifugering. Hvis protein i sedimentet med celle rusk, har det vært samlet i inkludering organer.
    2. Test uttrykk og renhet av protein prøven for eksempel for en standard 12-15% Tris-Tricine SDS side, se figur 2A. Hvis renhet er tilstrekkelig, protein kan monteres, ellers utføre et supplerende rensing skritt.
  3. In vitro montering av protein filamenter
    1. sjekke protein konsentrasjon i renset løsningen. Hvis protein inneholder absorbere rester, måle absorpsjon i et UV spektrofotometer på 280 nm. Sett inn ren bufferen i spektrofotometer som kalibrering og måle deretter protein absorbansen.
    2. Beregn protein konsentrasjonen absorpsjon koeffisient protein delenhet med tilpasset Beer-Lambert lov: en λ = ε λ x l x c, her er den optiske densitet ved en bestemt bølgelengde λ; ε er den bestemt absorpsjon koeffisienten; l er lengden på optiske banen i cm; c er konsentrasjonen i mol/L.
    3. Konsentrere protein til en konsentrasjon av 1 mM i en sentrifugal filter enhet. Innføre prøven i sentrifugalpumper filter enhet og sentrifuge 4000 x g i 30 min, bland løsningen i filter enheten forsiktig med en Pipetter å unngå protein avsetning på filteret. Gjenta til ønsket konsentrasjonen.
      Merk: Den optimale montering konsentrasjonen system avhenger og må optimaliseres (vanligvis mellom 0,1 - 1 mM). Hvis en ekvimolare blandet merket utvalg av to ulike merket protein grupper er forberedt (f.eks (50/50) (U - 15 N)-/ (U - 13 C)-merket), blande må skje enten før eller rett etter konsentrasjon trinn å sikre homogenisering av blandet løsningen.
    4. Overføre prøven inn i et rør og ruge det under omrøring for en uke i romtemperatur.
    5. Vanligvis polymerisasjon av underenheter i filamenter ledsages av løsningen bli grumset. Sjekk mikroskopiske fibril morfologi og homogenitet for eksempel av elektronmikroskop (forstørrelse 6300 X - 45000 X), se figur 2B.
    6. Sentrifuge prøven 1t 20000 x g og 4 ° C. Fjern flertallet av nedbryting, la bare nok væske dekker overflaten for å unngå eksempel tørking. Sjekk nedbryting for ikke montert underenheter på UV spektrofotometeret.
    7. Vask eksempel ved å legge til H 2 O og forsiktig resuspend innholdet med en pipette. Gjør ikke vortex. Spin utvalget for 30 min 22000 x g og 4 ° C. Gjenta vask trinn 3 ganger. Kontroller under alle vask trinnene hvis pellet beholder sitt aspekt etter sentrifugering og nedbryting for ikke montert underenheter på UV spektrofotometeret.
    8. Legge 0.02% (w/v) Natriumazid (NaN 3) for å unngå bakteriell forurensning og lagre utvalget til mål på 4 ° C.
  4. Solid-state NMR rotoren fyller
    1. sentrifuge to ganger for 30 min på 22000 x g og 4 ° C. Fjern maksimale nedbryting av; resulterende eksempel konsistensen avhenger av samlingen protein, og er vanligvis en gel-lignende innskudd.
    2. Bruker en kapillær Pipetter sette inn prøven i SSNMR rotoren.
      Merk: Her presenterer vi prosedyren på en 4 mm diameter rotor.
      1. Sentrifuge rotoren på et bord sentrifuge å forsiktig innføre prøven i rotoren. Gjenta prosedyren til rotoren fylles. Hold minimum for å lukke rotoren med rotoren cap. Hvis prøven antallet ikke er tilstrekkelig, innføre en kommersielt tilgjengelig setter å fylle opp den gjenværende plassen å sikre eksempel distribusjon homogenitet i rotoren.
        Bemerk: Avhengig på montert prøven konsistens, kan det være mer tilstrekkelig å bruke en tynn slikkepott, spesielt for svært tett prøver. Rotorer med diameter på 2,5 til 4 mm brukes på moderat MAS frekvenser.
    3. Legge til spor av 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic syre (DSS) for intern kjemiske Skift og temperatur kalibrering.
    4. Lukker lokket med en låsemekanisme.
    5. Sjekk under et forstørrelsesglass hvis hetten er godt og helt lukket.

Figure 2
figur 2: representant resultater for protein delenhet rensing og montering. A) 15% Tris-tricine SDS-side av protein delenhet (inkludert hans 6-tag) på ulike stadier av renselse. Lane 1 - Protein molekylvekt penn; Lane 2 - E. coli BL21 (DE3) celler uninduced kontroll; Lane 3 - E. coli BL21 (DE3) celler indusert med 0,75 mM IPTG; Lane 4 - solubilized inkludering organer lane 5 - supernatant deler av celle lysate; Lane 6 - renset brøkdel etter nikkel immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC) FPLC og avsalte. B) farget negativt protein fibrils av TEM tenkelig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. foreløpige strukturelle karakteristikk basert på endimensjonal (1D) SSD NMR

  1. første oppsett og 1 D kryss-polarisering (CP)
    1. inn rotoren til NMR magnet
    2. begynner å spin rotoren med en frekvens på 5 kHz venter en stabilisering av ±10 Hz, og akselerere til 7 kHz. Stille og passer 1 H, 13 C og 15 N kanaler. Still inn temperaturen 2-10 ° c (275-283 K); eksempel oppvarming på 7 kHz MAS er lav og Luminance er vanligvis ikke nødvendig på dette MAS frekvens.
    3. Spille en single-pulsed 1D 1 H spektrum med 16 skanninger.
      Merk: Strømnivå må tidligere er optimalisert på et referanse stoff (som en 13 C / < sup > 15 N histidin eller glysin), å gi startverdiene for å optimalisere strømmen nivåene i eksperimenter på målet prøven; denne fremgangsmåten er en rutinemessig oppgave og derfor ute av omfang i denne protokollen.
    4. Holde temperaturen under alle eksperimenter 2-10 ° c, i hydrert prøver temperaturen gjenspeiles i relativ skifte av bulk vann 1 H resonans med hensyn til DSS signaler 34. Måle temperaturen etter forholdet ses (H 2 O) = 7.83-T/96.9 med en presisjon på 1-2 ° C 35.
    5. Sett opp ønsket MAS frekvens og vente til stabilisering av ±10 Hz.
      Merk: Her er det demonstrert for en frekvens 11 kHz.
    6. Melodi og kamp 1 H og 13 C kanaler nytt og justere temperaturen ved hjelp av en 1 D 1 H eksperiment.
    7. Definerer en 1D-1 H - 13 C CP 36.
      Merk: CP eksperimenter vise signaler som oppstår fra rester i en rigid conformation. Puls kalibrering og dekopling parametere kan direkte optimaliseres på prøven når følsomheten er høy nok til å observere signaler etter mindre enn ~ 32 skanninger. Første optimalisering verdiene er overtatt fra standard optimalisering på en referanse sammensatt. CP kontakt tid og strøm-nivåer er valgt basert på maksimal signal intensitet. I protein prøver er den optimale CP kontakt tid vanligvis mellom 200 µs og 2 ms. decoupling parameterne bør også nytt justeres kalibreringen på en referanse sammensatt.
      1. Nøye observere lokalisering av spinning sidebånd på gitt MAS frekvens.
    8. Registrere et referanse 1D 13 C CP spekter som fungerer som 1 D spectral fingeravtrykk. Typisk er 128 skanner, 1 ms CP kontakt tid, 100 kHz dekopling styrke, en gjenvinne forsinkelse på 3 s og 25 ms oppkjøpet.
    9. Kalibrere 1 H og 13 C kjemiske endringer etter IUPAC anbefalinger 37. Bestemme resonans frekvensen av 1 H DSS (kjemisk forskyvning av 0 ppm); 13 C kjemiske Skift refereres til 1 H Skift (vanligvis ~ 0.25144, avledet fra forholdet mellom 13 C 1 H resonans frekvens 37).
    10. Prosessen 1D 1 H - 13 C CP eksperimentere uten apodization funksjonen (se figur 3A og B for påvisning i et homogent velordnet protein samlingen). Velg en isolert topp å anslå linewidth i utvalget, indikativ strukturelle orden og homogenitet. Typisk 13 C linewidths for velordnet biologiske protein samlinger under MAS på høy magnetiske felt varierer mellom 20-150 Hz (målt som fullbreddes på halv høyde (FWHH)).
    11. Anslå signal-å-bråk (S/N) forholdet i CP spektrum.
      Merk: S/N forholdet avhenger av mange faktorer, inkludert hovedsakelig mengden sample rotoren, graden av stivhet av protein og tilstedeværelsen av en enkelt molekylære konformasjon. Som en tommelfingerregel, et utvalg bør være egnet for flerdimensjonale SSNMR spektroskopi hvis et signal er observert i en optimalisert 1D 1 H - 13 C CP spektrum med 64 skanninger.
    12. Zoom inn i spektral regionen protein ryggraden karbonyl resonanser (hovedsakelig) lokalisert mellom 165-180 ppm. Estimere sekundær innholdet i samlingen av plasseringen av protein ryggraden karbonyl resonanser med resonanser fra rester i α-spiralformede eller β-strand konformasjon flyttet downfield eller upfield, henholdsvis (se figur 3B for en mest α-spiralformede undergruppe) 38.
  2. 1 D INEPT eksperimentere
    1. satt opp en 1 D 1 H - 13 C UDUGELIG eksperiment å undersøke ultramobile deler (sub-µs) av protein.
      Merk: GARP dekopling noen kHz under oppkjøpet 39 er vanlig, å tillate kort interscan forsinkelser (vanligvis 1 s) uten å skade sonden.
    2. Registrere en referanse UDUGELIG spekteret som fungerer som fingeravtrykk for mobile protein segmentene, typisk parametere er 128 skanner og en anskaffet av 25 ms.
    3. Prosessen på 1 H - 13 C UDUGELIG eksperimenter. Mengden og plasseringen av signaler er indikativ av mobile rester og aminosyre sammensetningen henholdsvis.
      Merk: Også ta en 2D 1 H - 13 C UDUGELIG eksperiment hvis signaler i 1 D UDUGELIG spektrum (se Figur 3 c for et eksempel) å tillate en mer bestemt aminosyre identifikasjon. I tvetydig tildeling tilfeller anbefaler vi sjekke buffer komponent signal stillingene av løsningen NMR.
    4. Bruker BMRB databasen 40 og publiserte data 38 for å tilordne resonanser til deres tilsvarende aminosyre i nær tilfeldig coil konformasjon; spekteret inneholder bare mobile buffer komponenter hvis ingen rester er i en svært mobile regimet.

Figure 3
Figur 3: representant resultatene av SSNMR spectra oppkjøpet for en velstrukturert protein-samlingen. A) 13 C-oppdaget FID for en 1 H - 13 C kryss-polarisering eksperiment. B) 1 H - 13 C kryss-polarisering eksperiment. C) 1 H - 13 C UDUGELIG eksperimentet av en rigid protein forsamling. bare buffer komponenter vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

3. conformational analyse og 3D struktur besluttsomhet

  1. sekvensiell resonans tildeling
    1. satt opp en 2D 13 C - 13 C proton-drevet spinn diffusjon (PDSD) 41 eksperimenter for å oppdage intra-rester 13 C - 13 C sammenhenger, inkludert siden kjeder. Overta verdiene for det første 1 H - 13 C kryss-polarisering trinnet fra 1 D 1 H - 13 C CP eksperiment.
      1. Stilles blande 50 ms for jevnt 13 C-merket prøver og 100 ms for selektivt 13 C-merket prøver. Angi indirekte oppkjøpet tiden mellom 5-25 ms og direkte oppkjøpet mellom 15-25 ms avhengig av iboende spectral oppløsning, som kan estimeres ved synlig signalet i gratis induksjon Decay (FID) lengde (eksemplifisert i figur 3A).
      2. Test flere behandling parametere for å finne optimale verdier når det gjelder signal-til-støy og oppløsning i spekteret, vanligvis tilstrekkelig behandling kan oppnås ved hjelp av et qsine vindu funksjonen med en sinus bell Skift (SSB) 2.5-4.
    2. Satt opp, post og behandle en 2D 13 C - 13 C PDSD med et middels blande tid eksperiment å oppdage sekvensiell 13 C - 13 C sammenhenger koble det meste jeg - i±1, men også i±2 og i±3 rester, avhengig av protein ryggraden stivhet og sekundær elementer. Blande tid bør settes mellom 100-200 ms for jevnt merket prøver. Alle andre verdier kan tas fra kort blande tid 2D 13 C - 13 C PDSD.
    3. Satt opp, post og behandle en 2D 15 N - 13 C N jeg CA jeg og N jeg CO jeg eksperimentere med en CP 1 H - 15 N og en bestemt CP 15 N - 13 C overføring 42. optimalisere 15 N - 13 C polarisering overføringen i en 1 D-mote direkte på prøven av interesse, basert på maksimal intensiteten i regionen CA eller karbonyl, henholdsvis. TypiCal verdier for bestemte CP kontakt gang er mellom 2-6 ms.
    4. satt opp, post og behandle en rekke 2D 15 N-(13 C-) 13 C eksperimenter for tildeling formål.
      Merk: Første 15 N - 13 C polarisering overføre parameterverdien kan bli tatt over fra den N jeg CA jeg / N jeg CO jeg eksperimenter. Intra-rester sammenhenger opprettes fra N jeg (CA jeg) CB jeg og N jeg (CA jeg) CO jeg, med henholdsvis drømmer 43 og PDSD 13 C - 13 C polarisasjon overføringer. Rester (i) å rester (i-1) sekvensiell tilkobling hentes fra N jeg (CO i-1) CA i-1 og N jeg (CO i-1) CX i-1 eksperimenter, både med en PDSD 13 C - 13 C polarisasjon overføring.
    5. Velg en NMR analyseprogram som CcpNmr analyse 44 eller GNIST 45
    6. Legg til 2D spectra i programvaren (eksemplifisert CcpNmr analyse) og laste primære protein sekvensen.
    7. Starter med identifikasjon av aminosyre synlig i kort-miksing 13 C - 13 C PDSD spektrum. Koble karbonatomer av spin å gi den " rester-type " bestemt tildeling. se figur 4A for tildeling av en threonin rester. Identifisere så mange rester som mulig; Dette avhenger protein delenhet størrelsen, spectral oppløsning og spredning.
    8. Overlegg kort-blanding med middels-miksing 13 C - 13 C PDSD spekteret.
      Merk: Utfyllende toppene i den mellomliggende-miksing PDSD oppstår hovedsakelig fra sekvensielle (rester i - rester i±1) kontakter. Et eksempel på en to-rester Sekvensiell tilordning er illustrert i figur 4B.
      1. Markere resonans toppene av et spinn system og finne sammenhenger i de mellomliggende-miksing PDSD med resonans frekvenser av andre spin-systemer. I små proteiner eller peptider, kan det være mulig å oppnå hele sekvensiell resonans tildelingen basert på 2D 13 C - 13 C PDSD eksperimenter.
        Merk: I β-strand sekundær motiver rester i - rester i±2 13 C - 13 C kontakter kan vise mer intense signaler enn sekvensiell kontakter på grunn av deres nærhet i verdensrommet. i α-spiralformede sekundære struktur motiver rester i - rester i±3 13 C - 13 C kontakter kan også føre til intense signaler.
    9. Hvis intermediate-miksing PDSD eksperimenter på selektivt 13 C-merket prøver er tilgjengelige, overlappe dem på kort-miksing spekteret (hvis tilgjengelig den selektivt 13 C-merket utvalg) og tilordne ekstra topper, tar hensyn til selektiv 13 C merkingen mønster (1,3 - 13 C og 2 - 13 C glyserol 32 , 33 eller 1 - 13 C og 2 13 C glukose 29 , 30 , 31.
      Merk: For eksempel i en 2 - 13 C glyserol merket prøve forskjellige aminosyre er merket på Cα posisjon uten de tilstøtende karbonatomer (Cβ og C ') merket, derfor favoriserer Cα-Cα overføre mellom tilstøtende rester. I selektivt merket prøver, kan langtrekkende 13 C - 13 C sammenhenger bygge opp allerede i middels-miksing 13 C - 13 C PDSD eksperimenter. Hvis en topp ikke forklares med en sekvensiell sammenheng, kan det oppstå fra en langtrekkende kontakt. For svært bestilt homogen delenhet strukturer i samlingen macromolecular, er bare ett sett med resonanser forventet å være synlig i til spectra. Hvis doblet (eller videre multiplisert) resonansen er synlig for 13 C atomer eller protein ryggraden strekninger, to (eller flere) konformasjonen atom eller primære sekvens strekningen i forsamlingen, henholdsvis finnes.
    10. Bruk 2D NCA spekteret som inneholder intra-rester 15 N - 13 Cα sammenhenger for å identifisere 15 N resonans frekvenser for hver rester. Hvis oppløsningen i 13 C dimensjonen ikke er tilstrekkelig, bruke den utfyllende informasjonen om Cβ resonans i 2D NCACB for å identifisere intra-rester 15 N resonans frekvensen.
    11. Bruker 2D NCACB og NCACO spectra som inneholder intra-rester 15 N - 13 C - 13 C sammenhenger (i) identifisere intra-rester 15 N frekvensen og (ii) å løse tvetydigheter i 13 C - 13 C PDSD ved hjelp av ytterligere 15 N dimensjonen. Inversjon av tapsfrie drøm overføringen fører til observasjon av typiske Cα-Cβ sammenhenger som Cα signalet er positiv og Cβ signalet negative. Videre siden-kjeden 13 C, hvis det er synlig i spekteret, er positive igjen.

Figure 4
Figur 4: 2-dimensjonal 13 C - 13 C SSNMR PDSD eksperimenter på et velordnet, enhetlig 13 C, 15 N-merket protein montering. A) kort blande tid PDSD (50 ms miksing). B) tildeling av 2-rester strekningen Ile32 - Thr33 med overlegg av kort blande tiden PDSD gangen lenge blande PDSD (200 ms blande). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. sekundære proteinstrukturer
    1. bruker 13 Cα, 13 Cβ kjemiske Skift verdier for å beregne den sekundære kjemiske skifte 46 ΔδCα-ΔδCβ , indikativ av sekundær. Beregne 13 Cα(assigned) - 13 Cα (tilfeldig coil) og 13 Cβ(assigned) - 13 Cβ (tilfeldig coil).
      Merk: Kjemiske Skift verdier for rester i tilfeldig coil konformasjon kan fås fra 38.
      1. Handlingen ΔδCα-ΔδCβ, negative eller positive verdier for > 3 rester på rad angi β-strand eller α-spiralformede konformasjon henholdsvis; glysin og proline rester kan vise uvanlig kjemiske Skift verdier, som de ofte fungere som " sekundær breakers ".
    2. Forutsi protein dihedral vinkler fra den tilordnede kjemiske Skift TALOS + 47 , 48 eller PREDITOR 49 , 50. Anslått Phi/Psi dihedral vinkler reflektere sekundære struktur protein subuNit og brukes som strukturelle begrensninger gjennom du modelleringsprosessen.
  2. Samling av strukturelle begrensninger
    1. satt opp og registrere en 2D 13 C - 13 C PDSD eksperiment med en lang blande tid å oppdage langtrekkende 13 C - 13 C sammenhenger. Typisk miksing ganger spenner fra 400 ms 1 s. bruke selektivt 13 C-merket prøver, som spin fortynning forbedrer polarisering overføring blant fjernt karbonatomer.
    2. Overlegg lang-miksing 2D 13 C - 13 C PDSD registrert på selektivt merket utvalg på middels-miksing 13 C - 13 C PDSD, hvis mulig registrert på samme selektivt merket prøven. Supplerende topper oppstår fra sammenhenger mellom fjernere 13 C atomer. Under resonans tildeling, ta hensyn til selektiv merking ordningen.
    3. Nøye vurdere oppløsningen av spekteret å definere en toleranse tilordningsvinduet, dvs avhengig av spectral oppløsning klinge i en viss ppm rekkevidde dette kan bidra til signalet. Standardavviket for tildeling presisjonen beregnes automatisk i NMR tildeling programmer som CcpNmr analyse eller GNIST.
    4. Hvis et signal kan forklares med en sekvensiell (rester i - rester i±1) eller en mellomdistanse 13 C - 13 C kontakt (rester i - rester jeg ± 2, 3 eller 4), opprettholde denne tildelingen siden videresendte polarisering overføring kan forklare den korrelasjon selv om 13 C - 13 C avstanden over forventede synlig kontakt området.
    5. Klassifisere tildelingene langtrekkende 13 C - 13 C kontakter til frekvens entydig og tvetydig signaler. I frekvens entydig oppdrag, eneste resonans oppdraget er mulig med hensyn til toleranse tilordningsvinduet.
      Merk: Tvetydig tildelinger inneholder alle mulige resonans tildelinger i vinduet toleranse. Tvetydigheter kan løftes samtidig under struktur beregningen av iterativ runder med utmerkede basert på foreløpige strukturer beregnes ved hjelp av bare de entydige begrensningene, som utføres i beregningsorientert rutiner som ARIA 51 eller UNIO 52. Videre kan strukturelle data fra forskjellige Biofysiske kilder (f.eks mutert eller forkortet delenhet struktur av løsning NMR eller Røntgenkrystallografi, masse-per-lengde målinger, cryo-EM kart) også brukes til å redusere nivået av tvetydighet, for eksempler se 1 ,, 3 ,, 53 ,, 54 ,, 55 ,, 56 , 57 , 58.
  3. påvisning av intermolekylære avstanden begrensninger i en symmetrisk protein samling
    1. satt opp en 2D 15 N - 13 C smerte-CP 59 eksperiment på en blandet (50/50) U - 15 N - / U 13 C-merket utvalg. Signaler på smerte-CP spekteret skal oppstå fra Inter molekylær 15 N - 13 C proximities. Bruke tidligere tilordnede resonanser til å utføre oppdraget intermolekylære kontaktene.
    2. Definerer en 2D 13 C - 13 C PDSD lenge blande tid (> 600 ms) på en (50/50) blandet (1,3 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-glyserol eller (1 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-glukose eksempel.
      Merk: Signaler i dette 13 C - 13 C spekteret oppstår fra intra molekylære og inter molekylære 13 C - 13 C proximities. Høy komplementaritet av to merking ordningene kan imidlertid bestemt resonans par oppstår utvetydig Inter molekylær kontakter, f.eks Serine CA i den (2 - 13 C)-glukose merket underenheter som hører en Serine CB i den (1 - 13 C)-glukose merket underenheter.
      1. Overlegg spekteret av blandet prøven til 2D 13 C - 13 C spectra registrert på homogent merket prøver ((1,3-13C) - og (2 - 13 C)-glyserol eller (1 - 13 C)- og (2 - 13 C)-glukose merket prøver). Flere signaler i spekteret registrert på blandet prøven skulle oppstå fra Inter molekylære interaksjoner.
  4. Struktur modeling fra SSNMR data
    1. forberede SSNMR tilbakeholdenhet listene nødvendig for struktur beregning: (1) protein sekvens; (2) intra-molekylær entydig avstanden begrensninger; (3) intra-molekylær tvetydig avstanden begrensninger; (4) TALOS-baserte dihedral vinkel begrensninger; (5) Inter-molekylær entydig avstanden begrensninger; (6) Inter-molekylær tvetydig avstanden begrensninger; (7) ytterligere data fra andre Biofysiske teknikker (f.eks masse-per-lengde, symmetri parametere).
    2. Flere anmeldelser gi innsikt i strukturen modellering basert på SSNMR data og i forbindelse med komplementære strukturelle data 14 , 60 , 15 , 19 , 61 , 62 Merk at tvetydig avstanden begrensninger kan være disambiguated under struktur beregningen med hensyn til foreløpige strukturelle modeller basert på entydig avstanden begrensninger. For å sikre struktur nøyaktighet nøye observere hvis strukturen konvergerer til en enkelt fold.

Figure 5
figur 5 : Intra - og intermolekylære kontakter i symmetrisk protein samlinger. Skjematisk fremstilling av intra - g. intermolekylære 13 C - 13 C langtrekkende kontakter i en spiralformede macromolecular samling. Tenkes er farget i hvitt og rødt å illustrere blandet merkingen av tenkes, dvs før montering en 1:1 blanding av to ulike merking ordninger ble utført (f.eks 1 - 13 C glukose og 1 - 13 C glukose). A) intramolekylære 13 C - 13 C langtrekkende kontakter (blå stiplet pil), B) intermolekylære 13 C - 13 C langtrekkende kontakter (rød stiplet pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Representative Results

Typisk SSNMR arbeidsflyten inneholder flere fremgangsmåten er illustrert i figur 1. Vanligvis er protein underenheter produsert av i vitro heterologous uttrykk i E. coli, renset og samlet under risting, men noen ganger også i statisk forhold. Uttrykk og rensing av protein delenhet følges av SDS gel kromatografi (figur 2A). Dannelsen av macromolecular samlinger kan deretter bli bekreftet av elektronmikroskop (EM) analyse (se figur 2B et eksempel på en trådformede forsamling).

Etter innføringen av protein forsamlingen SSNMR rotoren, rotoren er satt inn i spectrometer MAS frekvens og temperatur reguleres og til spectra registreres. Første innsikt kan fås ved 1D SSNMR teknikker. Figur 3 viser en typisk SSNMR FID funnet på 13C kanalen på et strukturelt homogen protein utvalg, en 1H13C CP spektrum, avslørende13C resonanser i stive kjernen av protein delenhet i den montering, og en 2D 1H -13C UDUGELIG spekteret, som representerer de mobile rester. For Atom innsikt i stive kjernen av Samlingsstrukturen trenger flerdimensjonale SSNMR eksperimenter å bli registrert på jevnt og selektivt merket prøver å først tilordne SSNMR resonanser og oppdager langtrekkende proximities (se Figur 4 ).

Alle spektra behandles og analysert med tilstrekkelig programvare å tilordne SSNMR resonanser og ekstra intra- og intermolekylære avstanden begrensninger (figur 5). SSNMR avstanden begrensninger brukes enten alene eller sammen med data fra komplementære teknikker, som kan integreres i programmet modellering.

For representant atomic strukturer av macromolecular samlinger løst ved SSNMR teknikker illustrerer figur 6 flere trådformede samlinger fra bakteriell lemmer og amyloid fibrils.

Figure 6
Figur 6:trådformede macromolecular strukturer bestemmes av en SSD NMR tilnærming: bakteriell filamenter og amyloid protein fibrils. A) Type 1 pilus av uropathogenic E. coliPDB koden 2N7H 4; B) ASC filament, PDB koden 2N1F 63; C) Type III sekresjon systemet nåler, PDB koder 2MME, 2LPZ og 2MEX 2,3,64; D) Amyloid-beta AB42 fibrils, PDB koden 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 og Osaka mutant PDB koden 2MVX 57, Iowa mutant PDB koden 2MPZ 58; E) Alpha-synuclein fibrils, PDB koden 2N0A 68; F) HET-s prion domene, PDB koden 2RNM, 2KJ3 69,70. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

SSD NMR (SSNMR) er en metode for valg for å karakterisere macromolecular protein samlinger på en Atom-nivå. En av de sentrale spørsmålene i SSNMR-baserte proteinstrukturer er spectral kvaliteten på undersøkte systemet, som tillater å etablere 3D strukturelle modeller av ulike presisjon, vanligvis varierer fra lav oppløsning modeller (som inneholder sekundære strukturere elementer og litt 3D-informasjon) pseudo atomic 3D strukturer. Kvantitet og kvalitet av strukturell informasjon fra flerdimensjonal SSNMR eksperimenter er nøkkelen til å beregne en høyoppløselig NMR strukturen i forsamlingen.

Beskrevet protokollen er avhengig av gjenkjenning av 13C -13C og 15N -13C strukturelle begrensninger som krever innspillingen av flere 2D (og noen ganger 3D) spectra med høy signal-til-støy. På moderat MAS frekvenser (< 25 kHz), prøven er introdusert i rotorer med størrelser med 3.2-4 mm diameter slik at protein mengder opp til ~ 50 mg, avhengig av prøven hydrering. Mengden sample inne rotoren er direkte proporsjonal med signal-til-støy forholdet i SSNMR spectra, en avgjørende faktor for påvisning av langtrekkende avstanden begrensninger og entydig oppdrag.

Spectral oppløsningen er en viktig parameter under sekvensiell resonans tildelingen og samlingen begrensninger. For å oppnå optimale resultater, må prøve forberedelse parametrene være optimalisert, spesielt i rensing av delenhet og montering forhold (pH, buffer, riste, temperatur, etc.). For eksempel optimalisering anbefales det å forberede umerkede prøver for flere forskjellige forhold som forsamlingen har blitt observert og registrere en 1D 1H13C CP spektrum (beskrevet i trinn 2.1) på hver forberedt utvalg. Til spectra tjene til å sammenligne spectral oppløsning og spredning mellom de forskjellige preparater, basert på optimale forhold kan bestemmes.

Kvaliteten på SSNMR data avhenger sterkt valg av NMR oppkjøpet parametrene spesielt for polarisering overføring trinnene. Bruk av høy magnetisk feltstyrken (≥600 MHz 1H frekvens) er avgjørende for høy følsomhet og spectral oppløsning, når overfor komplekse mål som macromolecular protein samlinger.

En begrensende faktor i mange tilfeller er spectrometer tilgjengeligheten. Derfor bør en forstandig valg av prøvene å være forberedt før spectrometer økten. I alle fall, jevnt 13C, 15N-merket prøven er en forutsetning for å utføre sekvensielle og intra gjenværende resonans tildelingen. Se71proteiner av solid-state NMR teknikker. Proteinstrukturer i macromolecular samlinger på moderat MAS frekvenser krever selektivt 13C-merket prøver; for deteksjon av langtrekkende 13C -13C og 13C -15N kontakter eksempler basert på 1,3 -13C- og 2 -13C-gylcerol og/eller 1 -13C- og 2 -13C-glukose merking er brukte, som beskrevet ovenfor. Valget mellom to merking ordninger er basert på spectral signal-til-støy-forhold og oppløsning. Du kan skille mellom intra- og intermolekylære langtrekkende kontakter, har blandet med og fortynnede prøver avdekket effektiv.

Kort sagt, kritisk fremgangsmåten for en Atom SSNMR strukturelle studie er: (i) utarbeidelsen av underenheter og montering måtte være optimalisert å få utmerket eksempel kvantitet og kvalitet, (ii) spectrometer feltet styrke og oppkjøp parametere må være valgt nøye. (iii) selektiv merking strategier er nødvendig for en 3D-struktur besluttsomhet og mengden data som kreves, avhenger av datakvaliteten og tilgjengeligheten av utfyllende data.

Til tross for dens anvendelighet til et bredt spekter av supramolecular mellom membran proteiner homomultimeric nano-objekter, er SSNMR ofte begrenset av behovet for mg-mengder isotopically merket materiale. Den siste teknologiske utviklingen i ultra-rask MAS (≥100 kHz) SSNMR åpne avenyen til 1H-oppdaget NMR, og presse grensen på antall minimal prøve å sub-mg 72,73,74. Likevel for detaljert strukturelle studier er 13C-merket prøver uunnværlig, som begrenser anvendelsen av SSNMR prøver samlet i vitro eller systemer i organismer som overlever på minimal medium der i celler SSNMR er en ny metode (for anmeldelser se 75,76,77,78).

En viktig faktor i SSNMR program å få høyoppløselig 3D strukturer er spectral oppløsning: iboende conformational heterogenitet i en samling kan begrense spektral oppløsning og spectra analyse. Rester bestemt 13C merking kan i noen tilfeller gir en alternativ for å få bestemt avstandsinformasjon om strategiske rester for å få strukturelle modeller (for en nyere eksempler se 79,80).

SSNMR for 3D proteinstrukturer krever fortsatt samlingen av flere datasett med ofte lenge data samling ganger på sofistikerte instrumenter, avhengig av tilnærming og systemet flere dager til uker på en 600-1000 MHz (1H frekvens) Spectrometer. Tilgang til spectrometer tid kan derfor være en begrensende faktor i en fordypning i SSNMR.

I homomultimeric protein samlinger, fører til SSNMR data av tilstrekkelig kvalitet å identifisere et høyt antall strukturelle begrensninger som i 3,57,64,70, SSNMR likevel gir ikke tilgang til mikroskopiske dimensjoner. Derfor, i en de novo SSNMR struktur bestemmelse av en homomultimeric forsamling, EM eller masse-per-lengde (MPL) data ideelt utfyller SSNMR data for å utlede parameterne symmetri. SSNMR data alene gi atomic intra- og intermolekylære grensesnitt

SSNMR er svært utfyllende med strukturelle teknikker som EM eller MPL målinger, men dataene kan også kombineres med Atom strukturer innhentet av Røntgenkrystallografi eller løsning NMR på mutert eller avkortet underenheter. Et økende antall studier finner i litteratur der sammen med ulike strukturelle data har tillatt for å bestemme atomic 3D-modeller av macromolecular samlinger (se figur 6 for representative eksempler).

I feltet av strukturell biologi fremstår SSNMR som lovende teknikk for å studereuløselig og ikke-krystallinske samlinger på atomic nivå, dvs gir strukturelle data på atomic skalaen. I denne forbindelse er SSNMR anheng løsning NMR og Røntgenkrystallografi for molekylær samlinger, inkludert membran proteiner i deres eget miljø og protein samlinger som viral konvolutter, bakteriell filamenter eller amyloids, samt RNA og RNA-protein komplekser (se for eksempel81). Den allsidige programmer i vitro og i mobilnettet sammenheng, for eksempel sekundær, tertiær og kvartær strukturelle endringer, identifisere samhandling overflater med partner molekyler på atomic skala (for eksempel 82) og kartlegging molekylære dynamikk i sammenheng med sammensatte komplekser, vise viktig potensialet av SSNMR i fremtidige strukturelle studier på komplekse biomolecular samlinger.

Komponent M9 medium
NaCl 0,5 g/L
KH2PO4 3 g/L
Na2HPO4 6,7 finans
MgSO4 1 mM
ZnCl2 10 ΜM
FeCl3 1 ΜM
CaCl2 100 ΜM
MEM vitamin mix 100 X 10 mL/L
13 C-glukose 2 g/L
15 NH4Cl 1 g/L

Tabell 1: Sammensetningen av minimal uttrykk medium for rekombinante proteiner produksjon i E. coli BL21 celler.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er finansiert av ANR (13-PDOC-0017-01 B.H. og ANR-14-CE09-0020-01 til Al), "Investeringer for fremtiden" program IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 til B.H.) referanse ANR-10-IDEX-03-02 til B.H., Fondation pour la Recherche () Médicale FRM-AJE20140630090 til Al), FP7 programmet (FP7-folk-2013-CIG til Al) og europeiske Research Council (ERC) under EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet (ERC starter Grant til Al, avtalen ingen 639020) og " WEAKINTERACT."

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments
NMR Spectrometer (> 11.7 Tesla) Bruker -
triple resonance MAS SSNMR probehead  Bruker -
SSNMR rotors 4mm Bruker K1910
Centrifuge 5804 R  Eppendorf 5805000629
GeneQuant 1300 spectrometer Dutscher 28-9182-13
IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L Dutscher 228001
MaxQ 4450 bench top orbital shaker Dutscher 78376
Tube Revolver Agitator Dutscher 79547
sonopuls HD 3100 Bandelin 3680
MicroPulser electroporator Biorad 165-2100 
mini-PROTEAN tetra cell system Biorad 165-8000
AKTA pure system GE Healthcare 29-0182-24
capillary microman M25 pipet Gilson  F148502
Name Company Catalog Number Comments
Materials
amiconR ultra-15 sigma Z740199-8EA
capillaries and pistons Gilson  F148112
spatula Fisher 13263799
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
D-glucose 13C6 Sigma 389374
Ammonium-15N-chloride Sigma 299251
1,3 13C2 glycerol Sigma 492639
2 13C glycerol Sigma 489484
Kanamycin Sigma K1876
Carbenicillin Sigma C3416
Sodium phosphate dibasic Sigma S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655
Sodium chloride Sigma 71380
calcium chloride Sigma C1016
Magnesium sulfate Sigma 208094
Iron Chloride Sigma 157740
Zinc chloride Sigma 793523
MEM Vitamin Solution (100×) Sigma M68954
IPTG Fisher BP1755
Trizma base  Sigma T1503
Tricine Sigma T0377
SDS Sigma 436143
sodium azide sigma 71289
4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid  Sigma 178837
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Unicorn 6.3 GE Healthcare Akta systems
ccpNMR CCPN  spectrometer systems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morag, O., Sgourakis, N. G., Baker, D., Goldbourt, A. The NMR-Rosetta capsid model of M13 bacteriophage reveals a quadrupled hydrophobic packing epitope. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 971-976 (2015).
  2. Loquet, A., et al. Atomic model of the type III secretion system needle. Nature. 486 (7402), 276-279 (2012).
  3. Demers, J. P., et al. High-resolution structure of the Shigella type-III secretion needle by solid-state NMR and cryo-electron microscopy. Nat Commun. 5 (4976), (2014).
  4. Habenstein, B., et al. Hybrid Structure of the Type 1 Pilus of Uropathogenic Escherichia coli. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (40), 11691-11695 (2015).
  5. Cady, S. D., et al. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463 (7281), 689-692 (2010).
  6. Park, S. H., et al. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491 (7426), 779-783 (2012).
  7. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 649-652 (2015).
  8. Wang, S., et al. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nat Methods. 10 (10), 1007-1012 (2013).
  9. Daskalov, A., et al. Signal transduction by a fungal NOD-like receptor based on propagation of a prion amyloid fold. PLoS Biol. 13 (2), e1002059 (2015).
  10. Daskalov, A., et al. Identification of a novel cell death-inducing domain reveals that fungal amyloid-controlled cell death is related to necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2016).
  11. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  12. Knowles, T. P., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (6), 384-396 (2014).
  13. Aguzzi, A., Lakkaraju, A. K. Cell Biology of Prions and Prionoids: A Status Report. Trends Cell Biol. 26 (1), 40-51 (2016).
  14. Habenstein, B., Loquet, A. Solid-state NMR: An emerging technique in structural biology of self-assemblies. Biophys Chem. , (2015).
  15. Meier, B. H., Bockmann, A. The structure of fibrils from 'misfolded' proteins. Curr Opin Struct Biol. 30, 43-49 (2015).
  16. Miao, Y., Cross, T. A. Solid state NMR and protein-protein interactions in membranes. Curr Opin Struct Biol. 23 (6), 919-928 (2013).
  17. Tang, M., Comellas, G., Rienstra, C. M. Advanced solid-state NMR approaches for structure determination of membrane proteins and amyloid fibrils. Acc Chem Res. 46 (9), 2080-2088 (2013).
  18. Weingarth, M., Baldus, M. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Acc Chem Res. 46 (9), 2037-2046 (2013).
  19. Loquet, A., Habenstein, B., Lange, A. Structural investigations of molecular machines by solid-state NMR. Acc Chem Res. 46 (9), 2070-2079 (2013).
  20. Yan, S., Suiter, C. L., Hou, G., Zhang, H., Polenova, T. Probing structure and dynamics of protein assemblies by magic angle spinning NMR spectroscopy. Acc Chem Res. 46 (9), 2047-2058 (2013).
  21. Tycko, R., Wickner, R. B. Molecular structures of amyloid and prion fibrils: consensus versus controversy. Acc Chem Res. 46 (7), 1487-1496 (2013).
  22. Hong, M., Zhang, Y., Hu, F. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annu Rev Phys Chem. 63, 1-24 (2012).
  23. Jelinek, R., Ramamoorthy, A., Opella, S. J. High-Resolution Three-Dimensional Solid-state NMR Spectroscopy of a Uniformly 15N-Labeled Protein. J Am Chem Soc. 117, 12348-12349 (1995).
  24. Xu, J., et al. Bicelle-enabled structural studies on a membrane-associated cytochrome B5 by solid-state MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (41), 7864-7867 (2008).
  25. Durr, U. H., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem Rev. 112 (11), 6054-6074 (2012).
  26. Yamamoto, K., et al. Probing the transmembrane structure and topology of microsomal cytochrome-p450 by solid-state NMR on temperature-resistant bicelles. Sci Rep. 3, 2556 (2013).
  27. Huang, R., et al. Probing the transmembrane structure and dynamics of microsomal NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase by solid-state NMR. Biophys J. 106 (10), 2126-2133 (2014).
  28. Durr, U. H., Yamamoto, K., Im, S. C., Waskell, L., Ramamoorthy, A. Solid-state NMR reveals structural and dynamical properties of a membrane-anchored electron-carrier protein, cytochrome b5. J Am Chem Soc. 129 (21), 6670-6671 (2007).
  29. Hong, M. Determination of multiple phi-torsion angles in proteins by selective and extensive (13)C labeling and two-dimensional solid-state NMR. J Magn Reson. 139 (2), 389-401 (1999).
  30. Lundstrom, P., et al. Fractional 13C enrichment of isolated carbons using [1-13C]- or [2- 13C]-glucose facilitates the accurate measurement of dynamics at backbone Calpha and side-chain methyl positions in proteins. J Biomol NMR. 38 (3), 199-212 (2007).
  31. Loquet, A., Lv, G., Giller, K., Becker, S., Lange, A. 13C spin dilution for simplified and complete solid-state NMR resonance assignment of insoluble biological assemblies. J Am Chem Soc. 133 (13), 4722-4725 (2011).
  32. Castellani, F., et al. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Nature. 420 (6911), 98-102 (2002).
  33. Higman, V. A., et al. Assigning large proteins in the solid state: a MAS NMR resonance assignment strategy using selectively and extensively 13C-labelled proteins. J Biomol NMR. 44 (4), 245-260 (2009).
  34. Bockmann, A., et al. Characterization of different water pools in solid-state NMR protein samples. J Biomol NMR. 45 (3), 319-327 (2009).
  35. Cavanagh, J., Fairbrother, W. J., Palmer, A. G., Skelton, N. J. Protein NMR spectroscopy, principles and practice. , Academic. San Diego. (1996).
  36. Hartman, S. R., Hahn, E. L. Nuclear Double Resonance in the Rotating Frame. Phys Rev. 128 (5), 2042-2053 (1962).
  37. Harris, R. K., et al. Further conventions for NMR shielding and chemical shifts IUPAC recommendations 2008. Solid State Nucl Magn Reson. 33 (3), 41-56 (2008).
  38. Wang, Y., Jardetzky, O. Probability-based protein secondary structure identification using combined NMR chemical-shift data. Protein Sci. 11 (4), 852-861 (2002).
  39. Shaka, A. J., Baker, P. B., Freeman, R. Computer-Optimized Scheme for Wideband Applications and Low-Level Operation. J Magn Reson. 64, 547-552 (1985).
  40. BMRB - Biological Magnetic Resonance Bank. , http://bmrb.wisc.edu/ (2017).
  41. Szeverenyi, N. M., Sullivan, M. J., Maciel, G. E. Observation of Spin Exchange by Two-Dimensional Fourier-Transform C-13 Cross Polarization-Magic-Angle Spinning. J Magn Reson. 47, 462-475 (1982).
  42. Baldus, M., Petkova, A. T., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Mol Phys. 95 (5), 1197-1207 (1998).
  43. Verel, R., Ernst, M., Meier, B. H. Adiabatic dipolar recoupling in solid-state NMR: the DREAM scheme. J Magn Reson. 150 (1), 81-99 (2001).
  44. CcpNmr Analysis — Collaborative Computational Project for NMR. , http://www.ccpn.ac.uk/software/analysis (2017).
  45. Sparky - NMR Assignment and Integration Software. , https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ (2017).
  46. Luca, S., et al. Secondary chemical shifts in immobilized peptides and proteins: a qualitative basis for structure refinement under magic angle spinning. J Biomol NMR. 20 (4), 325-331 (2001).
  47. TALOS+: Prediction of Protein Backbone Torsion Angles from NMR Chemical Shift. , http://spin.niddk.nih.gov/bax/software/TALOS/ (2017).
  48. Shen, Y., Bax, A. SPARTA+: a modest improvement in empirical NMR chemical shift prediction by means of an artificial neural network. J Biomol NMR. 48 (1), 13-22 (2010).
  49. SHIFTOR Dihedral angles from chemical shifts and homology. , http://wishart.biology.ualberta.ca/shiftor/ (2017).
  50. Berjanskii, M. V., Neal, S., Wishart, D. S. PREDITOR: a web server for predicting protein torsion angle restraints. Nucleic Acids Res. 34 (Web Server issue), W63-W69 (2006).
  51. Bardiaux, B., Malliavin, T., Nilges, M. ARIA for solution and solid-state NMR. Methods Mol Biol. 831, 453-483 (2012).
  52. Guerry, P., Herrmann, T. Comprehensive automation for NMR structure determination of proteins. Methods Mol Biol. 831, 429-451 (2012).
  53. Vasa, S., et al. beta-Helical architecture of cytoskeletal bactofilin filaments revealed by solid-state NMR. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (2), E127-E136 (2015).
  54. He, L., et al. Structure determination of helical filaments by solid-state NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (3), E272-E281 (2016).
  55. Tang, M., et al. High-resolution membrane protein structure by joint calculations with solid-state NMR and X-ray experimental data. J Biomol NMR. 51 (3), 227-233 (2011).
  56. Paravastu, A. K., Leapman, R. D., Yau, W. M., Tycko, R. Molecular structural basis for polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18349-18354 (2008).
  57. Schutz, A. K., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of amyloid beta fibrils bearing the Osaka mutation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 331-335 (2015).
  58. Sgourakis, N. G., Yau, W. M., Qiang, W. Modeling an in-register, parallel "iowa" abeta fibril structure using solid-state NMR data from labeled samples with rosetta. Structure. 23 (1), 216-227 (2015).
  59. Lewandowski, J. R., De Paepe, G., Griffin, R. G. Proton assisted insensitive nuclei cross polarization. J Am Chem Soc. 129 (4), 728-729 (2007).
  60. Carlon, A., et al. How to tackle protein structural data from solution and solid state: An integrated approach. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 92-93, 54-70 (2016).
  61. Judge, P. J., Taylor, G. F., Dannatt, H. R., Watts, A. Solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy for membrane protein structure determination. Methods Mol Biol. 1261, 331-347 (2015).
  62. Wang, S., Ladizhansky, V. Recent advances in magic angle spinning solid state NMR of membrane proteins. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 82, 1-26 (2014).
  63. Sborgi, L., et al. Structure and assembly of the mouse ASC inflammasome by combined NMR spectroscopy and cryo-electron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (43), 13237-13242 (2015).
  64. Loquet, A., et al. Atomic structure and handedness of the building block of a biological assembly. J Am Chem Soc. 135 (51), 19135-19138 (2013).
  65. Walti, M. A., et al. Atomic-resolution structure of a disease-relevant Abeta(1-42) amyloid fibril. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4976-E4984 (2016).
  66. Colvin, M. T., et al. Atomic Resolution Structure of Monomorphic Abeta42 Amyloid Fibrils. J Am Chem Soc. 138 (30), 9663-9674 (2016).
  67. Xiao, Y., et al. Abeta(1-42) fibril structure illuminates self-recognition and replication of amyloid in Alzheimer's disease. Nat Struct Mol Biol. 22 (6), 499-505 (2015).
  68. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human alpha-synuclein. Nat Struct Mol Biol. 23 (5), 409-415 (2016).
  69. Wasmer, C., et al. Amyloid fibrils of the HET-s(218-289) prion form a beta solenoid with a triangular hydrophobic core. Science. 319 (5869), 1523-1526 (2008).
  70. Van Melckebeke, H., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of HET-s(218-289) amyloid fibrils by solid-state NMR spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (39), 13765-13775 (2010).
  71. BMRB Solid-state NMR entries. , http://www.bmrb.wisc.edu/data_library/solidstate.shtml (2017).
  72. Lamley, J. M., et al. Solid-state NMR of a protein in a precipitated complex with a full-length antibody. J Am Chem Soc. 136 (48), 16800-16806 (2014).
  73. Agarwal, V., et al. De novo 3D structure determination from sub-milligram protein samples by solid-state 100 kHz MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (45), 12253-12256 (2014).
  74. Stanek, J., et al. NMR Spectroscopic Assignment of Backbone and Side-Chain Protons in Fully Protonated Proteins: Microcrystals, Sedimented Assemblies, and Amyloid Fibrils. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (50), 15504-15509 (2016).
  75. Baker, L. A., Baldus, M. Characterization of membrane protein function by solid-state NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 27, 48-55 (2014).
  76. Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4 (Pt 2), 108-118 (2017).
  77. Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annu Rev Biophys. 43, 171-192 (2014).
  78. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
  79. Qiang, W., Yau, W. M., Luo, Y., Mattson, M. P., Tycko, R. Antiparallel beta-sheet architecture in Iowa-mutant beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4443-4448 (2012).
  80. Bateman, D. A., Tycko, R., Wickner, R. B. Experimentally derived structural constraints for amyloid fibrils of wild-type transthyretin. Biophys J. 101 (10), 2485-2492 (2011).
  81. Marchanka, A., Simon, B., Althoff-Ospelt, G., Carlomagno, T. RNA structure determination by solid-state NMR spectroscopy. Nat Commun. 6, 7024 (2015).
  82. Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (26), 5956-5960 (2011).

Tags

Biokjemi problemet 127 strukturell biologi macromolecular samlinger kjernefysiske magnetisk resonans solid statuser NMR magi-vinkel spinning selv-samlinger protein komplekser amyloid fibrils bakteriell filamenter
Atomic skala strukturelle studier av Macromolecular samlinger av Solid-state kjernefysiske magnetisk resonans spektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Loquet, A., Tolchard, J., Berbon,… More

Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (127), e55779, doi:10.3791/55779 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter