Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Atomar skala strukturelle undersøgelser af makromolekylære forsamlinger af Solid-state Kernemagnetisk resonans-spektroskopi

doi: 10.3791/55779 Published: September 17, 2017

Summary

Strukturer af Supramolekylær protein forsamlinger på atomare opløsning er for høj relevans på grund af deres afgørende roller i en række forskellige biologiske fænomener. Heri, præsenterer vi en protokol til at udføre høj opløsning strukturelle studier på uopløseligt og ikke-krystallinsk makromolekylære protein forsamlinger af magic-angle spinning solid-state Kernemagnetisk resonans-spektroskopi (MAS SSNMR).

Abstract

Supramolekylær kemi protein forsamlinger spiller en grundlæggende rolle i biologiske processer lige fra vært-patogen interaktion, viral infektion for udbredelse af neurodegenerative sygdomme. Sådanne forsamlinger består i flere protein underenheder organiseret i en ikke-kovalente måde at danne store makromolekylære objekter, der kan udføre en række cellulære funktioner eller forårsage skadelige konsekvenser. Atomic indsigt i forsamlingen mekanismer og driften af disse makromolekylære forsamlinger forbliver ofte knappe siden deres iboende kan og ikke-crystallinity ofte drastisk reducerer kvaliteten af oplysningerne fra de fleste teknikker bruges i strukturbiologi, såsom røntgenkrystallografi og løsning Kernemagnetisk resonans (NMR). Her præsenterer vi magic angle spinning solid-state NMR spektroskopi (SSNMR) som en kraftfuld metode til at undersøge strukturer af makromolekylære forsamlinger på atomare opløsning. SSNMR kan afsløre atomic detaljer på de forsamlede kompleks uden størrelse og opløselighed begrænsninger. Protokollen præsenteres her beskriver de væsentlige skridt fra produktionen af 13C /15N isotop-mærket makromolekylære protein forsamlinger til erhvervelse af standard SSNMR spektra og deres analyse og fortolkning. Som et eksempel viser vi pipeline af en SSNMR strukturel analyse for en tråddannende protein forsamling.

Introduction

Fremskridt i magic angle spinning solid-state Kernemagnetisk resonans-spektroskopi (SSNMR) tilbyder et effektivt redskab til strukturel karakterisering af makromolekylære protein forsamlinger på en atomic opløsning. Disse protein forsamlinger er allestedsnærværende systemer, der spiller en afgørende rolle i mange biologiske processer. Deres molekylære strukturer, interaktioner og dynamik er tilgængelig af SSNMR undersøgelser, som har været vist viral (capsids1) og bakteriel infektion mekanismer (sekretion systemer2,3, pili4), membran protein komplekser5,6,7,8 og funktionelle amyloids 9,10,11. Denne type af molekylære forsamling kan også provokere patologier såsom i neurodegenerative sygdomme, hvor proteiner samles i fejlfoldede, amyloid stater og forårsage afvigende celle adfærd eller celle død 12,13. Protein forsamlinger er ofte bygget af den symmetriske oligomerisering af multipla kopier af protein-underenheder i store Supramolekylær objekter af forskellige figurer herunder fibriller, filamenter, porer, rør eller nanopartikler. Kvaternære arkitekturen er defineret af svage interaktioner mellem protein underenheder til at organisere den rumlige og tidsmæssige forsamling og giver mulighed for avancerede biologiske funktioner. Strukturelle undersøgelser på en atomar skala på disse forsamlinger er en udfordring for høj opløsning teknikker siden deres iboende kan og meget ofte deres ikke-crystallinity begrænser brugen af konventionelle røntgenkrystallografi eller løsning NMR tilgange. Magic angle spinning (MAS) SSNMR er en spirende teknik til at opnå atomare opløsning data om uopløselige makromolekylære forsamlinger og har bevist sin effektivitet til at løse 3D atomic modeller for et stigende antal komplekse Biomolekylær systemer herunder bakteriel filamenter, amyloid forsamlinger og viruspartikler 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Tekniske fremskridt på høje magnetfelter, metodologiske udviklinger og prøveforberedelse har etableret MAS SSNMR i en robust metode til at undersøge uopløselige proteiner i forskellige miljøer, især i deres biologisk relevante makromolekylære samlet stat eller i cellemembranerne, hvilket gør teknikken meget komplementære til kryo-elektronmikroskopi. I mange tilfælde karakteriserer en meget høj grad af symmetri sådanne protein forsamlinger. MAS SSNMR udnytter denne funktion, som alle protein underenheder i en homomolecular forsamling ville have den samme lokale struktur og derfor stort set samme SSNMR signatur, drastisk at reducere kompleksiteten af analysen.

En effektiv protokol for strukturelle undersøgelser af makromolekylære protein forsamlinger af moderat MAS (< 25 kHz) SSNMR præsenteres i denne video og kan opdeles i forskellige trin (figur 1). Vi vil demonstrere de kritiske stadier af arbejdsprocessen en SSNMR strukturelle studier eksemplificeret på en tråddannende protein Forsamling (se det markerede skridt i figur 1), med undtagelse af protein-underenheder rensning, forskellige for hver protein forsamling men af afgørende betydning for strukturelle studier, og uden at gå nærmere ind på tekniske/metodiske SSNMR spektroskopi og struktur beregning for hvad specialiserede tutorials er tilgængelige online. Mens denne protokol vil primært fokusere på solid-state NMR eksperimenter udført MAS betingelser, tilpasset brug af biologiske miljøer 23,24,25,26 , 27, såsom justeret bicelles, giver mulighed for undersøgelse af protein kropsbygning og dynamisk protein-protein interaktion i membran-lignende medier uden MAS teknologi. Vi vil vise protein udtryk samt forsamlingen trinene og optagelse af afgørende SSNMR spektra og deres analyse og fortolkning. Vores mål er at give indsigt i den strukturelle analyse pipeline gør det muligt for læseren at udføre en atomic-opløsning strukturelle undersøgelse af en makromolekylære forsamling af SSNMR teknikker.

Protokollen omfatter 3 sektioner:

1. solid-state NMR prøve produktion

Som en forudsætning for en solid-state NMR-analyse, proteinkomponenter makromolekylære forsamling skal udtrykkes, isotop-mærket, renset og samlet i vitro i native-lignende kompleks tilstand (for et eksempel Se figur 2) . For at sikre høj NMR følsomhed, er isotop berigelse i 13C og 15N mærkning påkrævet ved brug af minimal bakteriel expression media suppleret med 13C og 15N kilder, såsom ensartet 13 C-mærket glukose/glycerol og 15NH4Cl henholdsvis. I det senere i protokollen-selektivt 13C-mærket prøver fremstillet med selektivt 13C-mærket kilder såsom (1,3 -13C)- og (2 -13C)-glycerol (eller (1 -13C)- og (2 -13C)- glukose) bruges til at lette NMR-analyse. Blandet mærket stikprøve svarende til en equimolar blanding af enten 50% 15N- og 50% 13C-mærket eller 50% (1,3 -13C)- og 50% (2 -13C)-glucose er indført for at beskrive påvisning af intermolekylære interaktioner. En høj grad af protein renhed samt strenge betingelser under trinnet forsamling er vigtige faktorer til at forsikre en homogen strukturel orden af slutprøven.

2. foreløbig strukturel karakterisering baseret på endimensional (1D) solid-state NMR

Vi præsenterer de væsentlige forsøg for en strukturel analyse af SSNMR. Endimensional (1D) Kors-polarisering (CP) og INEPT / RINEPT28 eksperimenter, fundet på 13C kerner bruges til at registrere stive og fleksible protein segmenter i forsamlingen, henholdsvis og vurdere graden af struktur ensartethed og lokale polymorfisme (for et eksempel Se figur 3).

Rong > 3. Konformationelle analyse og 3D struktur bestemmelse

Underafdeling 1 og 2 vedrører den konformationelle analyse, som er baseret på SSNMR resonans tildeling af alle stiv rester af protein forsamling, som de kemiske Skift er meget følsomme sonder til det lokale miljø og kan bruges til at forudsige phi/psi planer vinkler og bestemme derved den sekundær struktur. Figur 4 viser et eksempel på en sekventiel resonans tildeling i stive kernen af en protein forsamling. 3D-struktur bestemmelse er baseret på indsamling af strukturelle oplysninger såsom afstand begrænsninger kodning lukke nærliggende (< 7-9 Å), der indeholder både intra- og intermolekylære oplysninger. Underafdeling 3 og 4 beskriver langtrækkende Fjern tilbageholdenhed indsamling og fortolkning. Langtrækkende kontakter er defineret som intramolekylære 13C -13C nærliggende som følge af restkoncentrationer jeg j, med | i-j | ≥4, definere dermed tertiære protein fold af monomere subunit, eller som intermolekylære 13C -13C proximities, definere de intermolekylære grænseflader mellem protein underenheder i forsamlingen. Intra- og intermolekylære grænseflader er illustreret i figur 5. SSNMR begrænsninger opdaget gennem 13C -13C og 15N -13C produktionsnedgang eksperimenter normalt indkode for internuclear afstande < 1 nm. Underafdeling 4 forklarer påvisning af intermolekylære afstand begrænsninger. I symmetriske protein forsamlinger, brugen af administrationsprocedurerne mærket prøver (dvs. 100% ensartet eller selektivt mærket) for at identificere intermolekylære subunit-subunit interaktioner er begrænset, som både intra - og Inter-Diesel - molecular kontakter føre til påviselige signaler. Entydig påvisning af intermolekylære proximities er opnået ved hjælp af blandet mærket prøver, indeholdende en equimolar blanding af to anderledes mærket prøver, kombineret inden sammenlægning. Underafdeling 5 kort introducerer strukturen modellering.

Figure 1
Figur 1 : Arbejdsproces en atomic-opløsning strukturelle studier af solid-state NMR. 13 C, 15N isotop mærket protein produktion, subunit rensning, subunit forsamling, kontrol af forsamling dannelse, SSNMR forsøg, SSNMR eksperiment analyse og udvinding af afstand begrænsninger og struktur modellering er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. Faststof NMR prøve productiona

  1. produktion af ensartet 13 C / 15 N-mærket protein underenheder
    1. Brug frisk omdannet, pET24-peptid-6his plasmid-holdige E. coli BL21 (DE3) celler, høst dem fra den forberedte agar plade.
    2. Podes en 15 mL før kultur præ varmede LB medie med en koloni. Der inkuberes ved 37 ° C med 200 rpm ryster natten.
    3. Overføre pre-kulturen i 1 L af de vigtigste kultur præ varmede M9 medium (Se sammensætning i tabel 1), der indeholder de nødvendige isotop-mærket kulstof og kvælstof kilder.
      Bemærk: Dette kan være ensartet 13 C-mærket glukose, selektivt (1 - 13 C)- eller (2 - 13 C)-mærket glukose 29 , 30 , 31 eller () 1,3 - 13 C)- eller (2 - 13 C)-mærket glycerol 32 , 33.
    4. Det der inkuberes ved 37 ° C og måle OD 600, så snart kulturen bliver grumset. Når OD 600 har nået en værdi på 0.8, fremkalde protein udtryk med 0,75 mM IPTG for 4 h.
      Bemærk: Optimale induktion betingelser kan variere fra én protein til en anden.
    5. Genoprette cellerne ved centrifugering i 30 min. ved 6000 x g og 4 ° C.
  2. Rensning skitse (ikke vist i video-protokollen)
    1. Lyse celler ved hjælp af standard teknikker såsom sonikering eller lysozym behandling og rense protein-underenheder ved hjælp af teknikker etableret eller tilpasset til den undersøgt protein forsamling.
      Bemærk: Protein kan udtrykkes i inklusion organer, tjek for protein lokalisering af celle lysis og efterfølgende centrifugering. Hvis proteinet er fundet i sediment med celle debris, det er blevet akkumuleret i inklusion organer.
    2. Test udtryk og renhed af protein prøven for eksempel af en standard 12-15% Tris-Tricine SDS-PAGE, se figur 2A. Hvis renhed er tilstrækkeligt, at protein kan samles, ellers udføre en supplerende rensning trin.
  3. In vitro forsamling af protein filamenter
    1. kontrollere proteinkoncentration i opløsningen renset. Hvis proteinet indeholder absorberende rester, måle absorption i Spektrofotometer UV på 280 nm. Indsæt den ren buffer i spektrofotometrets som kalibrering og måle derefter protein absorbans.
    2. Beregne proteinkoncentration ved hjælp af absorptionskoefficienten af protein-underenheder med tilpasset øl-Lambert loven: en λ = ε λ x l x c; her A er den optiske densitet ved en givet bølgelængde λ; ε er den specifikke absorptionskoefficient; l er længden af den optiske bane i cm; c er koncentrationen i mol/L.
    3. Koncentrere protein til en koncentration på 1 mM i en centrifugal filterenhed. Indføre prøven i den centrifugale filterenhed og centrifugeres ved 4000 x g i 30 min, bland løsning i filterenhed forsigtigt med en pipette til at undgå protein deposition på filteret. Gentag proceduren, indtil den ønskede koncentration opnås.
      Bemærk: Den optimale forsamling koncentration afhænger af systemet og skal optimeres (normalt mellem 0,1 - 1 mM). Hvis en equimolar blandet mærket udsnit af to forskellige mærket protein batcher er forberedt (f.eks. (50/50) (U - 15 N)-/ (U - 13 C)-mærket), blanding skal finde sted enten inden eller lige efter koncentration skridt til at sikre homogenisering af den blandede opløsning.
    4. Overføre prøven til et rør og inkuberes det under agitation for én uge ved stuetemperatur.
    5. Normalt polymerisering af underenheder i filamenter er ledsaget af løsningen bliver grumset. Kontrollere de mikroskopiske fibril morfologi og ensartethed for eksempel ved elektronmikroskopi (forstørrelse 6300 X - 45000 X), se figur 2B.
    6. Centrifugeres prøven i 1 h på 20000 x g og 4 ° C. Fjern størstedelen af supernatanten, forlader kun nok væske til at dække overfladen for at undgå prøve udtørring. Kontrollere supernatanten for usamlede underenheder på UV Spektrofotometer.
    7. Vask prøve ved at tilføje H 2 O og omhyggelig resuspend indhold med en pipette. Gør ikke vortex. Spin prøve for 30 min på 22000 x g og 4 ° C. Gentag trinnet vask 3 gange. Kontroller under alle vask trin hvis pellet bevarer sin aspekt efter centrifugering og kontroller supernatanten for usamlede underenheder på UV Spektrofotometer.
    8. Tilsættes 0,02% (w/v) natriumazid (NaN 3) for at undgå bakteriel forurening og gemme prøven indtil måling ved 4 ° C.
  4. Faststof NMR rotor fylde
    1. centrifugeres to gange i 30 min. ved 22000 x g og 4 ° C. Fjern maksimale mængde supernatant; den resulterende prøve sammenhæng afhænger af protein forsamling, og er normalt en gel-lignende depositum.
    2. Bruger en kapillær pipette til at indsætte prøven i SSNMR rotor.
      Bemærk: Vi præsenterer her, proceduren på en 4 mm diameter rotor.
      1. Centrifuge rotor på et bord centrifuge forsigtigt indføre prøven ind i rotoren. Gentag proceduren, indtil rotoren er fyldt. Holde minimum plads for at lukke rotor med rotoren cap. Hvis vareprøveantal ikke er tilstrækkelig, indføre en kommercielt tilgængelig Indsæt til at fylde den resterende plads til at sikre prøve distribution homogenitet i rotoren.
        Bemærk: Afhængig på den samlede prøve konsistens, kan det være mere passende at bruge en tynd spatel, især for meget tætte prøver. Rotorer med diameter 2,5-4 mm anvendes ved moderat frekvenser og MAS.
    3. Tilføj spor af 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic syre (DSS) til indre kemiske Skift og temperatur kalibrering.
    4. Luk hætten med en lukkeanordning.
    5. Tjekke under et forstørrelsesglas, hvis fælles landbrugspolitik er godt indsat og helt lukket.

Figure 2
figur 2: repræsentant resultater af protein-underenheder rensning og montering. A) 15% Tris-tricine SDS-PAGE af protein-underenheder (herunder hans 6-tag) på forskellige stadier af rensning. Lane 1 - Protein molekylvægt markør; Lane 2 - E. coli BL21 (DE3) celler uninduced kontrol; Lane 3 - E. coli BL21 (DE3) celler inducerede med 0,75 mM IPTG; Lane 4 - solubilized optagelse organer lane 5 - supernatanten brøkdele af celle lysate; Lane 6 - renset fraktion efter nikkel immobiliseret metal affinitet kromatografi (IMAC) FPLC og afsaltning. B) plettet negativt protein fibriller af TEM billeddannelse. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

2. foreløbige strukturel karakterisering baseret på endimensional (1D) solid-state NMR

  1. første set-up og 1 D cross-polarisering (CP)
    1. indsætte rotoren til NMR-magnet
    2. begynde at dreje rotoren med en hyppighed på 5 kHz og vente på en stabilisering af ±10 Hz, så fremskynde indtil 7 kHz. Tune og match 1 H, 13 C og 15 N kanaler. Indstil temperaturen til 2-10 ° C (275-283 K); eksempel opvarmning på 7 kHz MAS er lav og temperatur tilpasning er sædvanligvis ikke påkrævet på dette MAS frekvens.
    3. Indspille en single-pulserende 1D 1 H spektrum ved hjælp af 16 scanninger.
      Bemærk: Magt niveauer skal er tidligere blevet optimeret på en reference sammensatte (såsom en 13 C / < sup > 15 N histidin eller glycin), til at angive startværdier for at optimere effektniveauer i eksperimenter på målstikprøven; denne procedure er en rutineopgave og derfor ude af anvendelsesområdet i denne protokol.
    4. Holde temperaturen under alle eksperimenter mellem 2-10 ° C, i hydreret prøver temperaturen er afspejlet i den relative forskydning af bulk vand 1 H resonans med hensyn til DSS signal 34. Måle temperaturen efter forholdet δ (H 2 O) = 7.83-T/96,9 med en præcision på 1-2 ° C 35.
    5. Sæt op den ønskede MAS frekvens og vent, indtil stabilisering ±10 Hz.
      Bemærk: Her er det viste til en frekvens på 11 kHz.
    6. Tune og match 1 H og 13 C-kanaler igen og justere temperaturen med hjælp fra en 1 D 1 H eksperiment.
    7. Oprettet en 1D 1 H - 13 C CP 36.
      Bemærk: CP eksperimenter viser signaler som følge af restkoncentrationer i en stiv kropsbygning. Puls kalibrering og afkobling parametre kan være direkte optimeret på prøve når følsomhed er høj nok til at iagttage signalerne efter mindre end ~ 32 scanninger. Indledende optimering værdier er overtaget fra den standard optimering på en reference sammensatte. CP kontakttid og magt niveauer er valgt på baggrund af maksimal signal intensitet. I protein prøver er den optimale CP kontakttid normalt mellem 200 µs og 2 ms. de afkobling parametre bør også justeres igen fra kalibrering på en reference sammensatte.
      1. Omhyggeligt observere lokalisering af spinning sidebands med given MAS frekvens.
    8. Optage en reference 1D 13 C CP spektrum, der fungerer som 1 D spektrale fingeraftryk. Typiske parametre er 128 scanninger, 1 ms CP kontakttid, 100 kHz afkobling styrke, genanvende med 3 s forsinkelse og 25 ms anskaffelsestidspunktet.
    9. Kalibrere 1 H og 13 C kemiske Skift efter IUPAC anbefalinger 37. Bestemme resonansfrekvens 1 H DSS signal (kemiske skift af 0 ppm); 13 C kemiske Skift er refereres til 1 H forskydninger (normalt ~ 0.25144, afledt af forholdet 13 C 1 H resonans frekvens 37).
    10. Proces 1D 1 H - 13 C CP eksperimentere uden apodization funktion (Se figur 3A og B for registrering på et homogent velordnet protein forsamling). Vælg en isoleret peak til at estimere linewidth i prøven, vejledende af strukturel orden og homogenitet. Typiske 13 C linjebredder for velordnet biologiske protein forsamlinger under MAS på høje magnetfelter variere mellem 20-150 Hz (målt som fuld bredden i halv højde (FWHH)).
    11. Anslår signal-støj (S/N) forholdet i CP spektrum.
      Bemærk: S/N-forhold afhænger af mange faktorer, herunder primært mængden af prøven i en rotor, graden af stivhed af protein struktur og tilstedeværelsen af en enkelt molekylære kropsbygning. Som en tommelfingerregel, en prøve skal være egnet til multidimensional SSNMR spektroskopi hvis et signal er observeret i en optimeret 1D 1 H - 13 C CP spektrum indspillet med 64 scanninger.
    12. Zoom ind på den spektrale region af protein rygraden carbonyl resonanser (hovedsageligt) lokaliseret mellem 165-180 ppm. Estimere sekundærstruktur indhold i forsamlingen af placeringen af protein rygraden carbonyl resonanser med resonansen fra restkoncentrationer i α-cylindrisk eller β-strand kropsbygning flyttet downfield eller upfield, henholdsvis (jf. figur 3B til en for det meste α-spiralformet subunit) 38.
  2. 1 D INEPT eksperimentere
    1. oprettet en 1 D 1 H - 13 C UDUELIGE eksperiment at sonde meget mobile dele (sub-µs) forsamlingsfrihed protein.
      Bemærk: GARP afkobling af et par kHz under erhvervelse 39 er almindeligt anvendt til at give mulighed for korte interscan forsinkelser (typisk 1 s) uden at beskadige i probe.
    2. Optage en UDUELIG referencespektrum der fungerer som fingeraftryk for mobile protein segmenter; typisk parametre er 128 scanninger og en erhvervelse tid af 25 ms.
    3. Proces på 1 H - 13 C UDUELIGE eksperimentere. Mængden og holdninger af signalerne, der er vejledende for mængden af mobile restkoncentrationer og aminosyresammensætning henholdsvis.
      Bemærk: Også optage en 2D 1 H - 13 C UDUELIGE eksperiment, hvis signaler er til stede i 1 D UDUELIGE spektrum (Se figur 3 c for et eksempel) en mere specifik aminosyre identificering. I tvetydige tildeling tilfælde, vi anbefale at checke buffer komponent signal positioner af løsning NMR.
    4. Bruger BMRB database 40 og offentliggjort data 38 for at tildele resonanser til deres tilsvarende aminosyre i nær tilfældige coil kropsbygning; spektret indeholder kun mobil buffer komponenter hvis ingen rester er i en meget mobile regime.

Figure 3
figur 3: repræsentative resultater af SSNMR spektre anskaffelsessum for en velstruktureret protein forsamling. En) 13 C-opdaget FID for en 1 H - 13 C cross-polarisering eksperiment. B) 1 H - 13 C cross-polarisering eksperiment. C) 1 H - 13 C UDUELIGE forsøget med en stiv protein forsamling; kun buffer komponenter er synlige. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

3. konformationelle analyse og 3D struktur bestemmelse

  1. sekventielle resonans tildeling
    1. oprettet en 2D 13 C - 13 C proton-drevet spin diffusion (PDBU) 41 eksperiment for at opdage intra-rest 13 C - 13 C sammenhænge, herunder sidekæder. Overtage værdier for det oprindelige 1 H - 13 C cross-polarisering skridt fra 1 D 1 H - 13 C CP eksperiment.
      1. Sæt den blanding tid 50 ms for ensartet 13 C-mærket prøver og 100 ms for selektivt 13 C-mærket prøver. Indstille den indirekte erhvervelse tid mellem 5-25 ms og direkte erhvervelse mellem 15-25 ms afhængig af den iboende spektrale opløsning, der kan estimeres ved den synlige signal i gratis induktion henfald (FID) længde (eksemplificeret i figur 3A).
      2. Test flere behandling parametre for at finde optimale værdier med hensyn til signal-støj og opløsning i spektret, typisk passende behandling kan opnås ved hjælp af en qsine vindue funktion med en sinus bell Skift (SSB) 2,5-4.
    2. Sæt op, post og proces en 2D 13 C - 13 C PDBU med et mellemliggende blanding tid eksperiment at opdage sekventielle 13 C - 13 C korrelationer tilslutning for det meste i - i±1, men også i±2 og i±3 rester, afhængigt af protein rygraden stivhed og sekundær struktur elementer. Den blanding gang skal angives mellem 100-200 ms for ensartet mærket prøver. Alle andre værdier kan overtages fra den korte blanding tid 2D 13 C - 13 C PDBU.
    3. Oprette, post og proces en 2D 15 N - 13 C N jeg CA jeg og N jeg CO jeg eksperimentere med en CP 1 H - 15 N og specifikke CP 15 N - 13 C overførsel 42. optimere 15 N - 13 C polarisering overførsel i en 1 D mode direkte på prøve af interesse baseret på maksimal intensitet i regionen CA eller carbonyl henholdsvis. NørCal værdier for den specifikke CP kontakt tid er mellem 2-6 ms.
    4. oprettet, post og proces en række 2D 15 N-(13 C-) 13 C eksperimenter til tildeling formål.
      Bemærk: Den første 15 N - 13 C polarisering overførsel parameterværdi kan tages fra N jeg CA jeg / N jeg CO jeg eksperimenter. Intra-rester korrelationer er etableret fra N jeg (CA jeg) CB jeg og N jeg (CA jeg) CO jeg, ved hjælp af henholdsvis DREAM 43 og PDBU 13 C - 13 C polarisering overførsler. Rest a til restkoncentrationer (i-1) sekventielle connectivity er fremstillet af N jeg (CO i-1) CA i-1 og N jeg (CO i-1) CX i-1 eksperimenter, både ved hjælp af en PDBU 13 C - 13 C polarisering overførsel.
    5. Vælg en NMR analyse program som CcpNmr analyse 44 eller SPARKY 45
    6. Indlæse de 2D spektre i softwaren (eksemplificeret med CcpNmr analyse) og indlæse den primære protein sekvens.
    7. Starter med identifikation af typerne aminosyre synlige i den blanding af korte 13 C - 13 C PDBU spektrum. Tilslut kulstofatomer af systemernes spin at gøre det muligt den " rest-type " bestemt tildeling; Se figur 4A for tildeling af en rest, threonin. Identificere så mange rester som muligt; Dette vil afhænge af protein-underenheder størrelse, spektrale opløsning og dispersion.
    8. Overlay kort-blanding med mellemliggende blanding 13 C - 13 C PDBU spektrum.
      Bemærk: Supplerende toppene synlige i de mellemliggende blanding PDBU opstår for det meste fra sekventielle (rest jeg - rest i±1) kontakter. Et eksempel på en to-rester sekventielle tildeling er illustreret i figur 4B.
      1. Mark resonans toppene af en spin system og finde korrelationer i den blanding af mellemliggende PDBU med resonans frekvenser af andre spin systemer. I små proteiner eller peptider, kan det være muligt at opnå den hele sekventielle resonans tildeling på basis af 2D 13 C - 13 C PDBU eksperimenter.
        Bemærk: I β-strand sekundærstruktur motiver rester jeg - rest i±2 13 C - 13 C kontakter kan vise mere intense signaler end sekventielle kontakter på grund af deres nærhed i rummet; i α-spiralformet sekundærstruktur motiver rester jeg - rest i±3 13 C - 13 C kontakter kan også føre til intense signaler.
    9. Hvis intermediate-blanding PDBU eksperimenter på selektivt 13 C-mærket prøver er tilgængelige, overlay dem ind på det kort-blanding spektrum (hvis det findes på den selektivt 13 C-mærket prøve) og tildele den supplerende toppe, under hensyntagen til selektiv 13 C mærkning mønster (1,3 - 13 C og 2 - 13 C glycerol 32 , 33 eller 1 - 13 C og 2 13 C glukose 29 , 30 , 31.
      Bemærk: For eksempel, i en 2 - 13 C glycerol mærket prøve flere aminosyre typer er mærket på Cα holdning uden de tilstødende kulstofatomer (Cβ og C ') mærket, derfor favorisere Cα-Cα overførsel mellem tilstødende restkoncentrationer. I selektivt mærket prøver, kan langtrækkende 13 C - 13 C sammenhænge opbygge allerede i intermediate-blanding 13 C - 13 C PDBU eksperimenter. Hvis et højdepunkt ikke kan forklares ved en sekventiel korrelation, kunne det skyldes en langtrækkende kontakt. For meget bestilt homogene subunit strukturer i makromolekylære forsamling, forventes kun ét sæt af resonanser kan ses i spektre. Hvis fordoblet (eller yderligere ganges) resonanser er synlige for 13 C-atomer eller protein rygraden strækninger, to (eller flere) konformationer for atomet eller den primære sekvens strækning i forsamlingen, henholdsvis findes.
    10. Bruge 2D NCA spektret indeholdende intra-rester 15 N - 13 Cα sammenhænge til at identificere 15 N resonans frekvenser for hver restkoncentration. Hvis opløsningen i dimensionen 13 C ikke er tilstrækkelig, bruge de supplerende oplysninger om Cβ resonansen i 2D NCACB til at identificere intra-rester 15 N resonansfrekvens.
    11. Bruge 2D NCACB og NCACO spektrene indeholdende intra-rester 15 N - 13 C - 13 C korrelationer (i) identificere intra-rester 15 N frekvens og (ii) at løse uklarheder i 13 C - 13 C PDBU ved hjælp af yderligere 15 N dimension. Inversion af signalet på grund af drøm overførslen fører til observation af typiske Cα-Cβ sammenhænge som Cα signalet er positive og Cβ signalet negative. Side-chain 13 C, hvis synlige i spektrum, er yderligere positive igen.

Figure 4
figur 4: 2-dimensionelle 13 C - 13 C SSNMR PDBU eksperimenter på et ordnet, ensartet 13 C, 15 N-mærket protein forsamling. A) kort blande tid PDBU (50 ms blanding). B) tildeling af 2-rester strækning Ile32 - Thr33 ved hjælp af overlejring af kort blande tiden PDBU med en lang blanding tid PDBU (200 ms blanding). venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. sekundær struktur bestemmelse
    1. bruge 13 Cα, 13 Cβ kemiske Skift værdier til at beregne den sekundære kemiske Skift 46 ΔδCα-ΔδCβ , vejledende af sekundær struktur. Beregne 13 Cα(assigned) - 13 Cα (tilfældige coil) og 13 Cβ(assigned) - 13 Cβ (tilfældige coil).
      Bemærk: Kemiske Skift værdier for restkoncentrationer i tilfældige coil kropsbygning kan fås fra 38.
      1. Plot ΔδCα-ΔδCβ, negative eller positive værdier for > 3 rester i en række angiver β-strand eller α-spiralformet kropsbygning henholdsvis; glycin og prolin rester kan vise usædvanlige kemiske Skift værdier, som de fungerer ofte som " sekundær struktur breakers ".
    2. Forudsige protein planer vinkler fra de tildelte kemiske Skift bruger TALOS + 47 , 48 eller PREDITOR 49 , 50. De forudsagte Phi/Psi planer vinkler afspejler protein Mikkel sekundære strukturnit og bruges som strukturelle begrænsninger i hele modelleringsprocessen.
  2. Samling af strukturelle begrænsninger
    1. sat op og optage en 2D 13 C - 13 C PDBU eksperiment med en lang blanding tid at opdage langtrækkende 13 C - 13 C sammenhænge. Typisk blanding gange spænder fra 400 ms til 1 s. bruge selektivt 13 C-mærket prøver, som spin fortynding i høj grad forbedrer polarisering overførsel blandt Fjern kulstofatomer.
    2. Overlay den længe-blanding 2D 13 C - 13 C PDBU indspillet på selektivt mærket prøve på den blanding af mellemliggende 13 C - 13 C PDBU, hvis det er muligt registreres på samme selektivt mærket prøve. Supplerende toppe opstår fra korrelationer mellem fjernere 13 C-atomer. Under resonans tildeling, tage hensyn til den selektive mærkning ordningen.
    3. Omhyggeligt evaluere opløsning af spektret til at definere en tolerance tildelingsvinduet, dvs afhænger af de spektrale opløsning resonanser i en bestemt ppm interval dette kan bidrage til signalet. Standardafvigelsen af tildeling præcision beregnes automatisk i NMR opgaven programmer såsom CcpNmr analyse eller SPARKY.
    4. Hvis et signal kan forklares ved en sekventiel (rester jeg - rest i±1) eller et medium-range 13 C - 13 C kontakt (rest jeg - rest jeg ± 2, 3 eller 4), opretholde denne tildeling siden transmitteret polarisering overførsel kan forklare den korrelation selvom 13 C - 13 C afstanden er over det forventede synlige kontakt række.
    5. Klassificere tildelinger af langtrækkende 13 C - 13 C kontakter til frekvens utvetydige og tvetydige signaler. For så vidt angår hyppigheden utvetydig tildelinger, kun én resonans tildeling er muligt med hensyn til tolerance tildelingsvinduet.
      Bemærk: Tvetydige tildelinger indeholde alle mulige resonans tildelinger i vinduet tolerance. Uklarhederne kan løftes samtidig under beregningen af strukturen af iterative runder af flertydig baseret på foreløbige strukturer beregnes ved hjælp af kun de entydige begrænsninger, som udføres i computational rutiner som ARIA 51 eller UNIO 52. Derudover kan strukturelle data fra forskellige biofysiske kilder (f.eks. muteret eller afkortet subunit struktur af løsning NMR eller røntgenkrystallografi, masse pr. længde målinger, cryo-EM kort) også bruges til at reducere niveauet af tvetydighed, for eksempler Se 1 , 3 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58.
  3. påvisning af intermolekylære afstand begrænsninger i en symmetrisk protein forsamling
    1. oprettet en 2D 15 N - 13 C smerte-CP 59 eksperiment på en blandet (50/50) U - 15 N - / U - 13 C-mærket prøve. Signaler registreret på smerte-CP spektrum bør skyldes mellem molekylære 15 N - 13 C proximities. Bruge de tidligere tildelte resonanser for at udføre tildelingen af de intermolekylære kontakter.
    2. Oprettet en 2D 13 C - 13 C PDBU med en lang blanding tid (> 600 ms) på en (50/50) blandet (1,3 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-glycerol eller (1 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-glucose prøven.
      Bemærk: Signaler registreret i denne 13 C - 13 C spektrum opstår fra intra molekylære og indbyrdes molekylære 13 C - 13 C proximities. Men med høje komplementariteten af de to ordninger for mærkning kan særlig resonans par utvetydigt skyldes mellem molekylære kontakter, fx Serin CA i den (2 - 13 C)-glucose mærket underenheder, der korrelerer en Serin CB i den (1 - 13 C)-glucose mærket underenheder.
      1. Overlay spektrum af blandet prøven til 2D 13 C - 13 C spektre registreres på administrationsprocedurerne mærket prøver ((1,3-13C) - og (2 - 13 C)-glycerol eller (1 - 13 C)- og (2 - 13 C)-glukose mærket prøver). Yderligere signaler i spektret indspillet på blandet prøve bør skyldes mellem molekylære interaktioner.
  4. Struktur modellering fra SSNMR data
    1. forberede listerne SSNMR tilbageholdenhed nødvendige for beregningen af struktur: (1) protein sekvens; (2) intra-Molekylær utvetydig afstand begrænsninger; (3) intra-Molekylær tvetydige afstand begrænsninger; (4) TALOS-baseret planer vinkel begrænsninger; (5) mellem molekylære utvetydig afstand begrænsninger; (6) mellem molekylære tvetydige afstand begrænsninger; (7) yderligere data fra andre biofysiske teknikker (f.eks. masse pr. længde, symmetri parametre).
    2. Flere anmeldelser give indsigt i strukturen modeller baseret på SSNMR data og i forbindelse med supplerende strukturelle data 14 , 60 , 15 , 19 , 61 , 62 Bemærk at tvetydigt afstand begrænsninger kan være entydige under struktur beregning med hensyn til indledende strukturelle modeller baseret på utvetydig afstand begrænsninger. For at sikre struktur nøjagtighed, omhyggeligt observere hvis strukturen konvergerer mod en enkelt fold.

Figure 5
figur 5 : Intra - og intermolekylære kontaktpersoner i symmetrisk protein forsamlinger. Skematisk fremstilling af intra - vs. intermolekylære 13 C - 13 C langtrækkende kontakter i en spiralformet makromolekylære forsamling. Underenheder er farvet i hvid og rød til at illustrere den blandede mærkning af underenheder, dvs. før forsamlingen en 1:1 blanding af to forskellige mærkning ordninger blev udført (f.eks. 1 - 13 C glukose og 1 - 13 C glukose). A) intramolekylære 13 C - 13 C langtrækkende kontakter (blå stiplet pil); B) intermolekylære 13 C - 13 C langtrækkende kontakter (rød stiplede pile). venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Representative Results

Den typiske SSNMR workflow omfatter flere trin illustreret i figur 1. Normalt er protein-underenheder produceret ved in vitro- Heterolog ekspression i E. coli, renset og samlet under omrystning, men undertiden også under statiske forhold. Proteinekspression og -oprensning af protein-underenheder er efterfulgt af SDS gel kromatografi (figur 2A). Dannelsen af makromolekylære forsamlinger kan derefter bekræftes ved elektronmikroskopi (EM) analyse (Se figur 2B for et eksempel på en tråddannende forsamling).

Efter indførelsen af protein forsamlingen i SSNMR rotor, rotoren er indsat i spektrometeret, MAS frekvens og temperatur reguleres og spektre registreres. Første indsigt kan opnås ved 1D SSNMR teknikker. Figur 3 viser en typisk SSNMR FID opdaget på 13C-kanal på et strukturelt homogene protein prøve, en 1H -13C CP spektrum, afslørende13C resonanser i stive kernen af protein-underenheder i den forsamling, og en 2D 1H -13C UDUELIGE spektrum, der repræsenterer de mobile restkoncentrationer. Atomic indsigt i de stive kerne af samlingsstrukturen skal multidimensional SSNMR eksperimenter registreres på ensartet og selektivt mærket prøver først tildele SSNMR resonanser og derefter registrere langtrækkende proximities (Se figur 4 ).

Alle spektre behandles og analyseres med passende software til at tildele SSNMR resonanser og udtrække intra- og intermolekylære afstand begrænsninger (figur 5). SSNMR afstand begrænsninger anvendes enten alene eller sammen med data fra supplerende teknikker, som kan integreres i programmet modellering.

For repræsentative atomic strukturer af makromolekylære forsamlinger løst af SSNMR teknikker illustrerer figur 6 flere trådet samlinger fra bakteriel vedhæng og amyloid fibriller.

Figure 6
Figur 6:trådformede makromolekylære strukturer bestemmes af en solid-state NMR tilgang: bakteriel filamenter og amyloid protein fibriller. A) Type 1 pilus af uropathogenic E. coli, FBF kode 2N7H 4; B) ASC glødetråd, FBF kode 2N1F 63; C) Type III sekretion system nåle, FBF koder 2MME, 2LPZ og 2MEX 2,3,64; D) Amyloid beta AB42 fibriller, FBF kode 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 og Osaka mutant FBF kode 2MVX 57, Iowa mutant FBF kode 2MPZ 58; E) Alpha-synuclein fibriller, FBF kode 2N0A 68; F) HET-s prion domæne, FBF kode 2RNM, 2KJ3 69,70. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Solid-State NMR (SSNMR) er en metode til kendetegner makromolekylære protein forsamlinger på atomare niveau. Et af de centrale spørgsmål i SSNMR-baserede struktur bestemmelse er den spektrale kvaliteten af den undersøgte ordning, der giver mulighed for oprettelse af 3D strukturelle modeller af forskellige præcision, typisk lige fra lav opløsning modeller (indeholdende sekundært Strukturere elementer og lille 3D-oplysninger) til pseudo atomic 3D strukturer. Mængden og kvaliteten af strukturelle oplysninger fra multi-dimensionelle SSNMR eksperimenter er nøglen til at beregne en høj opløsning NMR strukturen i forsamlingen.

Den beskrevne protokol er baseret på påvisning af 13C -13C og 15N -13C strukturelle begrænsninger der kræver registrering af flere 2D (og undertiden 3D) spektre med høj signal til støj. Ved moderat frekvenser og MAS (< 25 kHz), prøven er indført i rotorer med størrelser på 3.2-4 mm i diameter giver mulighed for protein mængder på op til ~ 50 mg, afhængig af prøven hydrering. Mængden af prøven inde rotoren er direkte proportional med signal-støj-forholdet i SSNMR spektre, en afgørende faktor for påvisning af langtrækkende afstand begrænsninger og deres entydige tildeling.

Den spektrale opløsning er et afgørende parameter under sekventiel resonans tildeling og samlingen begrænsninger. For at opnå optimale resultater skal skal prøve forberedelse parametrene optimeres, navnlig i rensning af subunit og forsamling betingelser (pH, buffer, rysten, temperatur, osv.). For eksempel optimering anbefales det at forberede umærkede prøverne for flere forskellige betingelser som forsamling er blevet observeret og registrere en 1D 1H -13C CP spektrum (beskrevet i trin 2.1) på hver forbehandlede prøve. Spektre tjene til at sammenligne spektrale opløsning og spredningen mellem de forskellige præparater, baseret på hvor de optimale betingelser kan bestemmes.

Kvaliteten af SSNMR dataene afhænger stærkt valg af NMR erhvervelse parametre, især for polarisering overførsel trin. Brugen af høj magnetisk feltstyrke (≥600 MHz 1H frekvens) er afgørende for høj følsomhed og spektrale opløsning, kræves, når står over for komplekse mål såsom makromolekylære protein forsamlinger.

En begrænsende faktor i mange tilfælde er spektrometer tilgængelighed. Derfor bør et velovervejet valg af prøverne forberedes forud spektrometer session. I hvert fald, en ensartet 13C, 15N-mærket prøve er en forudsætning for at udføre den sekventielle og intra resterende resonans tildeling. Se71for proteiner tildelt af solid-state NMR teknikker. Struktur bestemmelse af makromolekylære assemblies ved moderat frekvenser og MAS kræver selektivt 13C-mærket prøver; til påvisning af langtrækkende 13C -13C og 13C -15N kontakter prøver baseret på 1,3 -13C- og 2 -13C-gylcerol og/eller 1 -13C- og 2 -13C-glucose mærkning er almindeligvis anvendes, som beskrevet ovenfor. Valget mellem de to mærkning ordninger er baseret på den spektrale signal / støj-forhold og opløsning. For at skelne mellem intra- og intermolekylære langtrækkende kontakter, har blandet mærket og fortyndede prøver afsløret effektivt.

Kort sagt, de kritiske trin for en atomic SSNMR strukturelle undersøgelse er: (i) udarbejdelse af underenheder og forsamling skal optimeres til at opnå fremragende prøve mængde og kvalitet, (ii) spektrometer felt styrken og Køb parametre skal være valgt omhyggeligt; (iii) selektive mærkning strategier er nødvendig for en 3D-struktur beslutsomhed og mængden af krævede data afhænger af oplysningernes kvalitet og tilgængelighed af supplerende data.

Trods dens anvendelighed til en bred vifte af Supramolekylær systemer spænder fra Membranproteiner til homomultimeric nano-objekter, er SSNMR ofte begrænset af behovet for mg-mængder af brændselsfremstilling navngivet materiale. Seneste teknologiske udvikling i ultra-hurtig MAS (≥100 kHz) SSNMR åbne op avenue til 1H-opdaget NMR, og tryk grænsen for minimal vareprøveantal og sub-mg 72,73,74. Ikke desto mindre for detaljerede strukturelle studier er 13C-mærket prøver uundværlig, som begrænser anvendelsen af SSNMR til prøverne samles i in vitro eller systemer udtrykt i organismer, der overlever på minimal medium hvor i celle SSNMR er en spirende metode (for anmeldelser Se 75,76,77,78).

En vigtig faktor i SSNMR ansøgning om at få høj opløsning 3D strukturer er den spektrale opløsning: iboende konformationelle heterogenitet i en forsamling kan begrænse opløsning og spectra spektralanalyse. Rest specifikke 13C mærkning kan i nogle tilfælde give et alternativ for at få specifikke afstand oplysninger om strategiske restkoncentrationer for at opnå strukturelle modeller (for en nyere eksempler Se 79,80).

SSNMR for 3D-struktur bestemmelse kræver stadig indsamling af flere datasæt med ofte lange data indsamling gange på avancerede instrumenter, afhængigt af tilgangen og system flere dage til uger på en 600-1000 MHz (1H frekvens) spektrometer. Adgang til spektrometer tid kan derfor være en begrænsende faktor i en SSNMR undersøgelse.

I tilfælde af homomultimeric protein forsamlinger, fører til SSNMR data af tilstrækkelig kvalitet til at identificere et stort antal af strukturelle begrænsninger såsom i 3,57,64,70, SSNMR stadig giver ikke adgang til de mikroskopiske dimensioner. Derfor, i en de novo SSNMR struktur bestemmelse af en homomultimeric forsamling, EM eller masse pr. længde (MPL) data ideelt supplement SSNMR data for at udlede symmetri parametrene. SSNMR data alene give atomic intra- og intermolekylære grænseflader

SSNMR er et stærkt supplement med strukturelle teknikker som EM eller MPL målinger, men data kan også perfekt kombineres med atomic strukturer fremkommer ved røntgenkrystallografi eller løsning NMR på muterede eller afkortede underenheder. Et stigende antal undersøgelser kan findes i litteraturen hvor sammen af forskellige strukturelle data har lov til at bestemme atomic 3D modeller af makromolekylære forsamlinger (Se figur 6 for repræsentative eksempler).

Inden for strukturbiologi fremstår SSNMR som lovende teknik til at studereuopløseligt og ikke-krystallinsk forsamlinger på det atomare niveau, dvs giver strukturelle data på atomar skala. I denne henseende, SSNMR er vedhæng til løsning NMR og røntgenkrystallografi for Molekylær forsamlinger, herunder Membranproteiner i deres oprindelige miljø og protein forsamlinger såsom viral konvolutter, bakteriel filamenter eller amyloids, samt RNA og RNA-protein komplekser (Se for eksempel81). Dens meget alsidige programmer i in vitro og i cellulære forbindelse, såsom sporing af sekundær, tertiær og kvaternære strukturelle ændringer, identificere interaktion overflader med partner molekyler på atomar skala (for eksempel 82) og kortlægning af Molekylær dynamik i forbindelse med samlet komplekser, angive SSNMR vigtigt potentiale i fremtidige strukturelle undersøgelser af komplekse Biomolekylær forsamlinger.

Komponent M9 medium
NaCl 0,5 g/L
KH2PO4 3 g/L
Na2HPO4 6,7 g/L
MgSO4 1 mM
ZnCl2 10 ΜM
FeCl3 1 ΜM
CaCl2 100 ΜM
MEM vitamin mix 100 X 10 mL/L
13 C-glukose 2 g/L
15 NH4Cl 1 g/L

Tabel 1: Sammensætning af minimal udtryk medium for rekombinante protein produktion i E. coli BL21 celler.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde er finansieret af ANR (13-PDOC-0017-01 til B.H. og ANR-14-CE09-0020-01 til A.L.), "Investeringer for fremtiden"-programmet IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 til B.H.) reference ANR-10-IDEX-03-02 til B.H., Fondation pour la Recherche Médicale ( FRM-AJE20140630090 til A.L.), FP7 programmet (RP7-folk-2013-CIG til A.L.) og det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EUs Horisont 2020 forskning og innovation program (ERC starter tilskud til A.L., aftale nej 639020) og projektet " WEAKINTERACT."

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments
NMR Spectrometer (> 11.7 Tesla) Bruker -
triple resonance MAS SSNMR probehead  Bruker -
SSNMR rotors 4mm Bruker K1910
Centrifuge 5804 R  Eppendorf 5805000629
GeneQuant 1300 spectrometer Dutscher 28-9182-13
IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L Dutscher 228001
MaxQ 4450 bench top orbital shaker Dutscher 78376
Tube Revolver Agitator Dutscher 79547
sonopuls HD 3100 Bandelin 3680
MicroPulser electroporator Biorad 165-2100 
mini-PROTEAN tetra cell system Biorad 165-8000
AKTA pure system GE Healthcare 29-0182-24
capillary microman M25 pipet Gilson  F148502
Name Company Catalog Number Comments
Materials
amiconR ultra-15 sigma Z740199-8EA
capillaries and pistons Gilson  F148112
spatula Fisher 13263799
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
D-glucose 13C6 Sigma 389374
Ammonium-15N-chloride Sigma 299251
1,3 13C2 glycerol Sigma 492639
2 13C glycerol Sigma 489484
Kanamycin Sigma K1876
Carbenicillin Sigma C3416
Sodium phosphate dibasic Sigma S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655
Sodium chloride Sigma 71380
calcium chloride Sigma C1016
Magnesium sulfate Sigma 208094
Iron Chloride Sigma 157740
Zinc chloride Sigma 793523
MEM Vitamin Solution (100×) Sigma M68954
IPTG Fisher BP1755
Trizma base  Sigma T1503
Tricine Sigma T0377
SDS Sigma 436143
sodium azide sigma 71289
4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid  Sigma 178837
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Unicorn 6.3 GE Healthcare Akta systems
ccpNMR CCPN  spectrometer systems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morag, O., Sgourakis, N. G., Baker, D., Goldbourt, A. The NMR-Rosetta capsid model of M13 bacteriophage reveals a quadrupled hydrophobic packing epitope. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (4), 971-976 (2015).
  2. Loquet, A., et al. Atomic model of the type III secretion system needle. Nature. 486, (7402), 276-279 (2012).
  3. Demers, J. P., et al. High-resolution structure of the Shigella type-III secretion needle by solid-state NMR and cryo-electron microscopy. Nat Commun. 5, (4976), (2014).
  4. Habenstein, B., et al. Hybrid Structure of the Type 1 Pilus of Uropathogenic Escherichia coli. Angew Chem Int Ed Engl. 54, (40), 11691-11695 (2015).
  5. Cady, S. D., et al. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463, (7281), 689-692 (2010).
  6. Park, S. H., et al. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491, (7426), 779-783 (2012).
  7. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12, (7), 649-652 (2015).
  8. Wang, S., et al. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nat Methods. 10, (10), 1007-1012 (2013).
  9. Daskalov, A., et al. Signal transduction by a fungal NOD-like receptor based on propagation of a prion amyloid fold. PLoS Biol. 13, (2), e1002059 (2015).
  10. Daskalov, A., et al. Identification of a novel cell death-inducing domain reveals that fungal amyloid-controlled cell death is related to necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. (2016).
  11. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, (2), 339-350 (2012).
  12. Knowles, T. P., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (6), 384-396 (2014).
  13. Aguzzi, A., Lakkaraju, A. K. Cell Biology of Prions and Prionoids: A Status Report. Trends Cell Biol. 26, (1), 40-51 (2016).
  14. Habenstein, B., Loquet, A. Solid-state NMR: An emerging technique in structural biology of self-assemblies. Biophys Chem. (2015).
  15. Meier, B. H., Bockmann, A. The structure of fibrils from 'misfolded' proteins. Curr Opin Struct Biol. 30, 43-49 (2015).
  16. Miao, Y., Cross, T. A. Solid state NMR and protein-protein interactions in membranes. Curr Opin Struct Biol. 23, (6), 919-928 (2013).
  17. Tang, M., Comellas, G., Rienstra, C. M. Advanced solid-state NMR approaches for structure determination of membrane proteins and amyloid fibrils. Acc Chem Res. 46, (9), 2080-2088 (2013).
  18. Weingarth, M., Baldus, M. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Acc Chem Res. 46, (9), 2037-2046 (2013).
  19. Loquet, A., Habenstein, B., Lange, A. Structural investigations of molecular machines by solid-state NMR. Acc Chem Res. 46, (9), 2070-2079 (2013).
  20. Yan, S., Suiter, C. L., Hou, G., Zhang, H., Polenova, T. Probing structure and dynamics of protein assemblies by magic angle spinning NMR spectroscopy. Acc Chem Res. 46, (9), 2047-2058 (2013).
  21. Tycko, R., Wickner, R. B. Molecular structures of amyloid and prion fibrils: consensus versus controversy. Acc Chem Res. 46, (7), 1487-1496 (2013).
  22. Hong, M., Zhang, Y., Hu, F. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annu Rev Phys Chem. 63, 1-24 (2012).
  23. Jelinek, R., Ramamoorthy, A., Opella, S. J. High-Resolution Three-Dimensional Solid-state NMR Spectroscopy of a Uniformly 15N-Labeled Protein. J Am Chem Soc. 117, 12348-12349 (1995).
  24. Xu, J., et al. Bicelle-enabled structural studies on a membrane-associated cytochrome B5 by solid-state MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 47, (41), 7864-7867 (2008).
  25. Durr, U. H., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem Rev. 112, (11), 6054-6074 (2012).
  26. Yamamoto, K., et al. Probing the transmembrane structure and topology of microsomal cytochrome-p450 by solid-state NMR on temperature-resistant bicelles. Sci Rep. 3, 2556 (2013).
  27. Huang, R., et al. Probing the transmembrane structure and dynamics of microsomal NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase by solid-state NMR. Biophys J. 106, (10), 2126-2133 (2014).
  28. Durr, U. H., Yamamoto, K., Im, S. C., Waskell, L., Ramamoorthy, A. Solid-state NMR reveals structural and dynamical properties of a membrane-anchored electron-carrier protein, cytochrome b5. J Am Chem Soc. 129, (21), 6670-6671 (2007).
  29. Hong, M. Determination of multiple phi-torsion angles in proteins by selective and extensive (13)C labeling and two-dimensional solid-state NMR. J Magn Reson. 139, (2), 389-401 (1999).
  30. Lundstrom, P., et al. Fractional 13C enrichment of isolated carbons using [1-13C]- or [2- 13C]-glucose facilitates the accurate measurement of dynamics at backbone Calpha and side-chain methyl positions in proteins. J Biomol NMR. 38, (3), 199-212 (2007).
  31. Loquet, A., Lv, G., Giller, K., Becker, S., Lange, A. 13C spin dilution for simplified and complete solid-state NMR resonance assignment of insoluble biological assemblies. J Am Chem Soc. 133, (13), 4722-4725 (2011).
  32. Castellani, F., et al. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Nature. 420, (6911), 98-102 (2002).
  33. Higman, V. A., et al. Assigning large proteins in the solid state: a MAS NMR resonance assignment strategy using selectively and extensively 13C-labelled proteins. J Biomol NMR. 44, (4), 245-260 (2009).
  34. Bockmann, A., et al. Characterization of different water pools in solid-state NMR protein samples. J Biomol NMR. 45, (3), 319-327 (2009).
  35. Cavanagh, J., Fairbrother, W. J., Palmer, A. G., Skelton, N. J. Protein NMR spectroscopy, principles and practice. Academic. San Diego. (1996).
  36. Hartman, S. R., Hahn, E. L. Nuclear Double Resonance in the Rotating Frame. Phys Rev. 128, (5), 2042-2053 (1962).
  37. Harris, R. K., et al. Further conventions for NMR shielding and chemical shifts IUPAC recommendations 2008. Solid State Nucl Magn Reson. 33, (3), 41-56 (2008).
  38. Wang, Y., Jardetzky, O. Probability-based protein secondary structure identification using combined NMR chemical-shift data. Protein Sci. 11, (4), 852-861 (2002).
  39. Shaka, A. J., Baker, P. B., Freeman, R. Computer-Optimized Scheme for Wideband Applications and Low-Level Operation. J Magn Reson. 64, 547-552 (1985).
  40. BMRB - Biological Magnetic Resonance Bank. http://bmrb.wisc.edu/ (2017).
  41. Szeverenyi, N. M., Sullivan, M. J., Maciel, G. E. Observation of Spin Exchange by Two-Dimensional Fourier-Transform C-13 Cross Polarization-Magic-Angle Spinning. J Magn Reson. 47, 462-475 (1982).
  42. Baldus, M., Petkova, A. T., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Mol Phys. 95, (5), 1197-1207 (1998).
  43. Verel, R., Ernst, M., Meier, B. H. Adiabatic dipolar recoupling in solid-state NMR: the DREAM scheme. J Magn Reson. 150, (1), 81-99 (2001).
  44. CcpNmr Analysis — Collaborative Computational Project for NMR. http://www.ccpn.ac.uk/software/analysis (2017).
  45. Sparky - NMR Assignment and Integration Software. https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ (2017).
  46. Luca, S., et al. Secondary chemical shifts in immobilized peptides and proteins: a qualitative basis for structure refinement under magic angle spinning. J Biomol NMR. 20, (4), 325-331 (2001).
  47. TALOS+: Prediction of Protein Backbone Torsion Angles from NMR Chemical Shift. http://spin.niddk.nih.gov/bax/software/TALOS/ (2017).
  48. Shen, Y., Bax, A. SPARTA+: a modest improvement in empirical NMR chemical shift prediction by means of an artificial neural network. J Biomol NMR. 48, (1), 13-22 (2010).
  49. SHIFTOR Dihedral angles from chemical shifts and homology. http://wishart.biology.ualberta.ca/shiftor/ (2017).
  50. Berjanskii, M. V., Neal, S., Wishart, D. S. PREDITOR: a web server for predicting protein torsion angle restraints. Nucleic Acids Res. 34, (Web Server issue), W63-W69 (2006).
  51. Bardiaux, B., Malliavin, T., Nilges, M. ARIA for solution and solid-state NMR. Methods Mol Biol. 831, 453-483 (2012).
  52. Guerry, P., Herrmann, T. Comprehensive automation for NMR structure determination of proteins. Methods Mol Biol. 831, 429-451 (2012).
  53. Vasa, S., et al. beta-Helical architecture of cytoskeletal bactofilin filaments revealed by solid-state NMR. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (2), E127-E136 (2015).
  54. He, L., et al. Structure determination of helical filaments by solid-state NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (3), E272-E281 (2016).
  55. Tang, M., et al. High-resolution membrane protein structure by joint calculations with solid-state NMR and X-ray experimental data. J Biomol NMR. 51, (3), 227-233 (2011).
  56. Paravastu, A. K., Leapman, R. D., Yau, W. M., Tycko, R. Molecular structural basis for polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (47), 18349-18354 (2008).
  57. Schutz, A. K., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of amyloid beta fibrils bearing the Osaka mutation. Angew Chem Int Ed Engl. 54, (1), 331-335 (2015).
  58. Sgourakis, N. G., Yau, W. M., Qiang, W. Modeling an in-register, parallel "iowa" abeta fibril structure using solid-state NMR data from labeled samples with rosetta. Structure. 23, (1), 216-227 (2015).
  59. Lewandowski, J. R., De Paepe, G., Griffin, R. G. Proton assisted insensitive nuclei cross polarization. J Am Chem Soc. 129, (4), 728-729 (2007).
  60. Carlon, A., et al. How to tackle protein structural data from solution and solid state: An integrated approach. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 92-93, 54-70 (2016).
  61. Judge, P. J., Taylor, G. F., Dannatt, H. R., Watts, A. Solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy for membrane protein structure determination. Methods Mol Biol. 1261, 331-347 (2015).
  62. Wang, S., Ladizhansky, V. Recent advances in magic angle spinning solid state NMR of membrane proteins. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 82, 1-26 (2014).
  63. Sborgi, L., et al. Structure and assembly of the mouse ASC inflammasome by combined NMR spectroscopy and cryo-electron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (43), 13237-13242 (2015).
  64. Loquet, A., et al. Atomic structure and handedness of the building block of a biological assembly. J Am Chem Soc. 135, (51), 19135-19138 (2013).
  65. Walti, M. A., et al. Atomic-resolution structure of a disease-relevant Abeta(1-42) amyloid fibril. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, (34), E4976-E4984 (2016).
  66. Colvin, M. T., et al. Atomic Resolution Structure of Monomorphic Abeta42 Amyloid Fibrils. J Am Chem Soc. 138, (30), 9663-9674 (2016).
  67. Xiao, Y., et al. Abeta(1-42) fibril structure illuminates self-recognition and replication of amyloid in Alzheimer's disease. Nat Struct Mol Biol. 22, (6), 499-505 (2015).
  68. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human alpha-synuclein. Nat Struct Mol Biol. 23, (5), 409-415 (2016).
  69. Wasmer, C., et al. Amyloid fibrils of the HET-s(218-289) prion form a beta solenoid with a triangular hydrophobic core. Science. 319, (5869), 1523-1526 (2008).
  70. Van Melckebeke, H., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of HET-s(218-289) amyloid fibrils by solid-state NMR spectroscopy. J Am Chem Soc. 132, (39), 13765-13775 (2010).
  71. BMRB Solid-state NMR entries. http://www.bmrb.wisc.edu/data_library/solidstate.shtml (2017).
  72. Lamley, J. M., et al. Solid-state NMR of a protein in a precipitated complex with a full-length antibody. J Am Chem Soc. 136, (48), 16800-16806 (2014).
  73. Agarwal, V., et al. De novo 3D structure determination from sub-milligram protein samples by solid-state 100 kHz MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53, (45), 12253-12256 (2014).
  74. Stanek, J., et al. NMR Spectroscopic Assignment of Backbone and Side-Chain Protons in Fully Protonated Proteins: Microcrystals, Sedimented Assemblies, and Amyloid Fibrils. Angew Chem Int Ed Engl. 55, (50), 15504-15509 (2016).
  75. Baker, L. A., Baldus, M. Characterization of membrane protein function by solid-state NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 27, 48-55 (2014).
  76. Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4, (Pt 2), 108-118 (2017).
  77. Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annu Rev Biophys. 43, 171-192 (2014).
  78. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158, (2), 244-253 (2007).
  79. Qiang, W., Yau, W. M., Luo, Y., Mattson, M. P., Tycko, R. Antiparallel beta-sheet architecture in Iowa-mutant beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (12), 4443-4448 (2012).
  80. Bateman, D. A., Tycko, R., Wickner, R. B. Experimentally derived structural constraints for amyloid fibrils of wild-type transthyretin. Biophys J. 101, (10), 2485-2492 (2011).
  81. Marchanka, A., Simon, B., Althoff-Ospelt, G., Carlomagno, T. RNA structure determination by solid-state NMR spectroscopy. Nat Commun. 6, 7024 (2015).
  82. Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angew Chem Int Ed Engl. 50, (26), 5956-5960 (2011).
Atomar skala strukturelle undersøgelser af makromolekylære forsamlinger af Solid-state Kernemagnetisk resonans-spektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (127), e55779, doi:10.3791/55779 (2017).More

Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (127), e55779, doi:10.3791/55779 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter