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Biochemistry

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

Published: September 17, 2017 doi: 10.3791/55779
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Chemistry, Biology of Membranes, Nanoobjects, UMR5248 CNRS, Université de Bordeaux

Summary

原子分解能で分子タンパク質複合体の構造は、多様な生命現象で重要な役割のため関連性が高いです。ここで、マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (MAS SSNMR) による不溶性と非晶質高分子タンパク質複合体の高分解能構造解析を実行するためのプロトコルを提案する.

Abstract

超分子タンパク質複合体は、宿主-病原体相互作用、神経変性疾患の伝播にウイルス感染に至る生物学的プロセスの基本的な役割を果たします。このようなアセンブリは、複数の蛋白質の亜単位が様々 な細胞機能を実行したり、有害な結果を引き起こす大きい高分子オブジェクトを形成する非共有結合方法で編成で成っています。原子力洞察力アセンブリ機構、高分子アセンブリの機能が頻繁に彼らの固有の不溶性以来乏しいと非結晶性しばしば劇的にほとんどの技術から得られたデータの品質が低下構造生物学、x 線結晶構造解析や核磁気共鳴 (NMR) ソリューションなどで使用されます。我々 は原子分解能での高分子アセンブリの構造を調査するための強力な方法としてマジック角回転固体 NMR 分光法 (SSNMR) を紹介します。SSNMR は原子サイズと溶解性の制限なし組み立てられた複雑な詳細を明らかにできます。ここで提示されたプロトコルは、 13C の生産に不可欠な手順をについて説明します/15N 同位体標識高分子蛋白質アセンブリ SSNMR スペクトルとその分析と解釈の標準の獲得に。例として、糸状タンパク質アセンブリの SSNMR 構造解析のパイプラインを示します。

Introduction

マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (SSNMR) の進歩は、原子分解高分子タンパク質複合体の構造解析のための効率的なツールを提供しています。これらの蛋白質のアセンブリは、多くの生物学的プロセスに重要な役割を果たすユビキタス システムです。その分子構造と相互作用とダイナミクスの示されているように SSNMR 研究によってアクセス可能ウイルス (カプシド1) 細菌感染メカニズム (分泌システム2,3、4ピリ pili)、膜タンパク質複合体5,6,7,8と機能性アミロイド9,10,11。この型分子集合体のタンパク質が変性、アミロイドの状態で組み立てる、異常細胞の挙動や細胞死12,13の原因と神経変性疾患のように病態を引き起こすことができるも。タンパク質複合体は頻繁に対称線維、フィラメント、毛穴、チューブ、ナノ粒子など様々 な形状の大きな分子オブジェクトに蛋白質の亜単位の倍数コピー重合によって造られます。第四紀のアーキテクチャは、空間的で、一時的なアセンブリを編成し、高度な生物学的機能を可能にする蛋白質の亜単位間の弱い相互作用によって定義されます。彼らの非結晶性が従来の x 線結晶構造解析や nmr の使用を制限する非常によくとこれらのアセンブリの原子スケールでの構造の調査は高解像度技術のための挑戦の本質的な不溶性近づきます。マジック角回転 (MAS) SSNMR は不溶性高分子アセンブリの原子分解能データを取得する新興技法など複雑な生体システムの増加する数の 3 D 原子モデルを解決するその効率を証明されています細菌のフィラメント、アミロイドのアセンブリおよびウイルス粒子14,15,16,17,18,19,20、 21,22。強磁場、方法論開発、前処理技術の進歩が顕著で、生物学的に関連した、さまざまな環境で、高分子不溶性タンパク質を調査する手法に MAS SSNMR を確立します。組み立て状態や細胞膜、技術の高いクライオ電子顕微鏡法を補完するものを作るします。多くの場合、対称性の非常に高いこのようなタンパク質複合体の特徴です。Homomolecular アセンブリ内のすべてのタンパク質サブユニットが同じローカル構造であることとして、MAS SSNMR はこの機能を悪用し、したがって事実上同じ SSNMR 署名、分析の複雑さを大幅に削減します。

中程度の MAS の高分子タンパク質複合体の構造の研究のための効率的なプロトコル (< 25 kHz) SSNMR このビデオで提示し、別の手順 (図 1) に分割することができます。糸状のタンパク質のアセンブリ (図 1のステップを強調表示を参照してください)、蛋白質サブユニットの浄化を除いて各蛋白質の異なる例示 SSNMR 構造研究のワークフローの重要な段階を目指しますアセンブリが極めて重要な構造の研究とどのような専門的なチュートリアルは SSNMR 分光法で構造計算の技術・方法論の詳細に入ることがなく、利用可能なオンライン。現在のプロトコル MAS 条件下で固体 NMR 実験に焦点を当てますの使用対応して生物的環境23,24,25,26,27、配向膜などタンパク質の立体構造と膜のようなメディアの MAS 技術なし動的蛋白質間相互作用の調査を可能にします。タンパク質発現アセンブリ手順と重要な SSNMR スペクトル解析と解釈の記録を紹介します。SSNMR 法による高分子アセンブリの原子分解能構造解析を実行するリーダーを有効にする構造解析パイプラインへの洞察を提供するためを目指しています。

プロトコルには、3 つのセクションが含まれます。

1. 固体 NMR サンプル生産

固体 NMR 解析の前提条件、[表現される高分子アセンブリの必要性のタンパク質成分、同位体標識、精製され、組み立てられた生体外で(使用例は図 2) ネイティブのような複雑な状態に.確実に高感度 NMR、 13C、 15N 標識同位体濃縮は最小限細菌式培地13C や15N など、一様に13を使用して必要ですC 標識グルコース/グリセリンと15NH4Cl それぞれ。プロトコルの後の段階で選択的に13C 標識サンプル生成選択的13C 標識ソースなど (1, 3-13C)-、(2-13C)-グリセロール (または (1-13C)-、(2-13C)-ブドウ糖) NMR 解析を容易にするために使用されます。50 15n-と 50 13C 標識または 50% の等モル混合物に対応する混合ラベル サンプル (1, 3-13C)-50% (2-13C)-グルコース分子の検出を説明する導入相互作用。アセンブリ ステップの間に厳密な条件と同様、蛋白質の純度の高度は、最後のサンプルの均質構造秩序を保証するために重要な要因です。

2 一次元 (1 D) 固体 nmr 法に基づく予備の構造評価

SSNMR による構造解析のための重要な実験を紹介します。一次元 (1 D) 交差偏波 (CP) と INEPT/RINEPT28実験、 13C 核の検出を使用アセンブリでそれぞれ、剛構造と柔構造のタンパク質セグメントを検出し、構造のある程度を推定するには均一性とローカル ポリモーフィズム (の例が、図 3を参照としている場合)。

栄 > 3。立体配座解析と 3次元構造の決定

1 と 2 のサブセクションにかかわる化学シフトはローカル環境に非常に敏感なプローブとピピ/psi を予測するために蛋白質のアセンブリのすべての剛体残留 SSNMR 共鳴割り当てに基づく立体構造の解析二面角し、それによって二次構造を決定します。図 4は、蛋白質のアセンブリ.の硬質コアでシーケンシャル共鳴割り当ての例を示します3 D 構造の決定は構造のデータのコレクションなどに基づいてエンコード距離拘束高速交通 (< 7-9 Å)、内と分子間情報の両方を含みます。3 と 4 では、長距離の遠い拘束コレクションと解釈を説明します。長距離接触が生じる残渣から私 j、すると分子内13c-13C 近接電波として定義されます | i j |≥4、それによりタンパク質における立体折り単量体のサブユニットの分子間13c-13C の近接電波としての定義、アセンブリ内の蛋白質の亜単位の分子間のインターフェイスを定義します。内・分子間のインターフェイスを図 5に示します。SSNMR 拘束検出13c-13C、 15N-13C シフトリ実験は通常流行り廃り距離エンコード < 1 nm。第四款は、分子間の距離の制約の検出を説明します。対称的なタンパク質複合体、同質ラベル サンプル (すなわち一様にまたは選択的に標識 100%) の使用のサブユニットの分子間相互作用の特定の限られたのとして両方内- と間分子連絡先につながる検出信号。分子間の近接電波の明確な検出は、集計前に組み合わせる 2 つの異なるラベルのサンプルの等モル混合物を含む混合のラベル サンプルを使用して実現されます。第 5 款構造のモデリングを簡単に紹介します。

Figure 1
図 1:固体 nmr 法による原子分解能構造解析のワークフロー 。13C、 15N 同位体標識タンパク質の生産、精製サブユニット、サブユニット集合、集合体の形成、SSNMR 実験、SSNMR 実験解析、距離拘束の抽出の制御および構造のモデリングが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Protocol

1 です固体 NMR サンプル productiona

  1. 均一に 13 C の生産/15 N 標識タンパク質サブユニット
    1. 使用新鮮な変換、pET24 ペプチド 6his プラスミドを含む。大腸菌 BL21 (DE3) セル準備の寒天からそれらを収穫します
      2. 。
    2. は、1 つのコロニーに予め温めておいた LB 培地の 15 mL の前培養を接種します。200 rpm 揺れ一晩で 37 ° C で
      3. 。
    3. は予め温めておいた M9 媒体の主要な文化の 1 L に前培養を転送 (表 1 の構成を参照)、必要な同位体標識炭素・窒素ソースを含むします
      。 注: これは、一様に 13 C 標識グルコース、選択的に (1-13 C)- または (2-13 C)-グルコース 29 , 30 , 31 または (ラベルの付いた1, 3-13 C)- または (2-13 C)-グリセロール 32 , 33 のラベルします
      4. 。
    4. は、37 ° C でこれをインキュベートし、文化が濁りになるとすぐ OD 600 を測定します。外径 600 が 0.8 の値に達したら、0.75 mM IPTG 4 h とタンパク質発現を誘導する
      メモ: 別に一つの蛋白質からその最適な誘導条件の異なることができます
      5. 。
    5. G x 6000 と 4 で 30 分間の遠心分離によって細胞を回復 ° C
  2. 浄化のスケッチ (ビデオ プロトコルに非表示)
    1. リゾチームや超音波治療など標準の手法を用いた細胞を溶解し、浄化技術確立やバリアフリーを使用して蛋白質の亜単位、蛋白質のアセンブリを検討します
      。 注: タンパク質で表現できる封入体チェック蛋白質のローカリゼーションのセル換散およびその後遠心分離によって。それが封入体で蓄積されているタンパク質が細胞の残骸が堆積物で見つかった場合
      2. 。
    2. テスト式と標準の 12-15% トリス トリシン SDS-ページ、によって例えば蛋白質のサンプルの純度は、 図 2 a を参照してください。純度のタンパク質を組み立てることができますで十分な場合それ以外の場合補足の精製ステップを実行します
      3. 。
  3. 蛋白質のフィラメントのアセンブリ
    1. 精製タンパク質濃度を確認してください。タンパク質には、吸収の残基が含まれている場合、280 紫外線分光光度計での吸収を測定 nm。分光光度計校正として純粋なバッファーに挿入し、タンパク質の吸光度を測定し
      2. 。
    2. 計算蛋白質の集中の蛋白質の亜単位の吸収係数を用いた適応のビール ランベルトの法則: λ = ε λ l x 特定波長 λ; c; ここで A は光 x 密度 ε は、特定の吸収係数;l は cm で光の軌道の長さc は mol/L で濃度
    3. は、遠心ろ過ユニットで 1 mM の濃度にタンパク質を集中します。遠心フィルター ユニットにサンプルを紹介し 30 分間 4000 × g で遠心分離、フィルターで蛋白質の沈着を避けるためにピペットを使い、優しくフィルター ユニットでソリューションをミックスします。希望の濃度に到達するまでの手順を繰り返します
      。 注: 最適なアセンブリ濃度システムに依存し、(0.1 - 1 mM) の間に通常を最適化する必要があります。2 つの異なるラベルの付いたタンパク質バッチのサンプルを準備、等モル混合ラベル付けされた場合 (例えば (50/50) (u-15 N)-/(u-13 C)-ラベル) 前、にまたは確保するため濃度ステップの直後に場所を取る必要があります混合混合液の均質化します
      4. 。
    4. チューブにサンプルを転送し、室温で 1 週間撹拌下でインキュベートします
      5. 。
    5. フィラメントにサブユニットの重合通常混濁ソリューションと一緒に伴われます。たとえば電子顕微鏡 (倍率 X - 45000 X 6300) による微細な線維の形態と均質性をチェック、 図 2 b を参照してください
      6. 。
    6. G x 20000 と 4 で 1 時間サンプル遠心分離機 ° c. の削除、上清の大半はサンプルの乾燥を避けるために表面をカバーする十分な液のみを残します。紫外線分光光度計に非組み立てサブユニットの上澄みを確認してください
      7. 。
    7. 洗う H 2 O を追加してサンプルと慎重なピペットとコンテンツを再懸濁します。ボルテックスにかけないでください。22000 g x と 4 で 30 分のサンプルをスピン ° C は洗濯手順を 3 回繰り返します。すべての洗浄のステップ中にペレットを保持その側面遠心分離後で、紫外線分光光度計に非組み立てサブユニットの上澄みをチェックします
      8. 。
    8. 4 で測定まで 0.02% (w/v) アジ化ナトリウム (NaN 3) 細菌汚染を避けるために、サンプルの保存を追加 ° C
  4. 固体 NMR ローター充填
    1. x g と上清の 4 ° C 削除最大量 22000 で 30 分の 2 回遠心分離機; その結果サンプル一貫性蛋白質アセンブリによって異なります、通常ゲル状預金します
      2. 。
    2. キャピラリー ピペットを使用して SSNMR ローターにサンプルを挿入します
      。 注: ここでは、4 mm 径のローターに手順を提示します。
      1. 遠心ローター テーブルにそっとローターにサンプルを導入する遠心分離します。ローターをいっぱいになるまで、手順を繰り返します。ローター キャップとローターを閉じるに最小スペースを維持します。サンプル量が不足している場合紹介ローターでサンプル分布の均一性を確保するための残りのスペースを埋めるため市販挿入します
        。 注: 依存組み立てサンプルの一貫性に非常に密なサンプルの特に薄いヘラを使用するより適切な場合があります。中程度の MAS 周波数 2.5 〜 4 ミリメートルの直径とローターを使用します
        2. 。
    3. 内部の化学シフトと温度校正用 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic 酸 (DSS) のトレースを追加します
      4. 。
    4. 開閉装置とキャップを閉じます
      5. 。
    5. キャップも挿入し、完全に閉じた場合拡大鏡下でチェックしてください
      6. 。

Figure 2
図 2: 代表結果蛋白質サブユニットの浄化およびアセンブリ。A) 15% 蛋白質の亜単位のトリス トリシン SDS-PAGE (彼の 6 を含む-タグ) 浄化のさまざまな段階で。レーン 1 - タンパク質分子量マーカーレーン 2 - 大腸菌 BL21 (DE3) 細胞未誘導制御;レーン 3 - 大腸菌 BL21 (DE3) 細胞 0.75 mM IPTG;レーン 4 - 可溶化封入体レーン 5 - 細胞ライセート; の上清分画車線 6 - 精製割合ニッケル固定化金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー (IMAC) FPLC と脱塩後です。B) は否定的電子顕微鏡イメージングによる蛋白質の原繊維を染色しました。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

。

2 事前構造評価による一次元 (1 D) 固体 NMR

  1. 初期設定と 1 次元交差偏波 (CP)
  2. NMR 磁石にローターを挿入
    1. を開始。5 kHz の周波数でローターを回転し、± 10 Hz の安定待ち、7 kHz まで加速します。チューニング、1 H、13 C、15 N チャンネルに一致します。2-10 ° C (275-283 K) に温度を設定します。サンプル 7 kHz マスで暖房が低いと温度調整は通常この MAS 周波数で必要はありません
      2. 。
    2. 記録の 16 回のスキャンを用いた単一パルス 1 D 1 H スペクトル
      。 注意: 電力レベルする必要があります以前に最適化されている参照化合物 (13 C など/< sup > 15 N ヒスチジンまたはグリシン)、ターゲット サンプルの実験で電力レベルを最適化するための初期値を提供するためにこの手順が定期的な仕事であり、このプロトコルではスコープ外
      3. 。
    3. は、温度、DSS 信号 34 に関して一括水 1 H の共鳴の相対シフトに反映されます水和物試料中の 2-10 ° C の間のすべての実験の間に温度を保ちます。次の関係 δ (H 2 O) 温度測定 = 7.83-T/96.9 1-2 ° C 35 の精度と
      4. 。 目的を
    4. セット MAS 周波数と ± 10 Hz の安定化まで待ちます
      。 注: ここでそれは 11 の kHz の頻度の実証です
      5. 。
    5. チャンネルは再び曲と一致 1 H と 13 C と 1 D 1 H 実験の助けを借りて、温度を調整します
      6. 。
    6. 1 D 1 h-13 C CP 36 設定します
      。 注: CP 実験は、剛構造の残基から生じる信号を表示します。パルス調整と分離パラメーター最適化すること直接サンプルに感度が十分に高い未満 32 〜 スキャン後の信号を観察するとき。最初の最適化の値は参照化合物の標準的な最適化から引き継がれる。CP の接触時間と電力レベルは、最大信号強度に基づいて選択されます。蛋白質のサンプルの最適な CP の接触時間は 200 μ s と参照化合物の校正からデカップリングのパラメーターする必要があります再調整も 2 さんの通常です。
      1. 慎重に回転して与えられた MAS 周波数で側波帯の局在を観察
        2. 。
    7. 1 D スペクトル指紋として機能参照 1 D 13 C CP スペクトルを記録。代表的なパラメーターは、1 ms CP 接触時間、強さ、3 s のリサイクル遅延、25 ms の買収をデカップリング 100 kHz、128 スキャンします
      8. 。
    8. は、1 H、13 C の化学シフト IUPAC 勧告 37 次を調整します。1 H DSS 信号 (0 ppm の化学シフト) の共振周波数を決定します。13C 化学シフトは 1 H シフト (通常 〜 0.25144、1 H の共鳴周波数 37 13 C の比から派生) に参照されます
      9. 。
    9. 1 D 1 h-13 C CP アポダイゼーションすることがなく実験プロセス機能 (均一によく発注された蛋白質のアセンブリの検出のため 図 3 a と B を参照)。サンプルでは、構造秩序と同質性を示すもので線幅を推定する隔離されたピークを選択します。強磁場下でマスの下でよく整理された生物的蛋白質アセンブリの典型的な 13 C スペクトル線幅の範囲 20-150 Hz (ハーフハイト (FWHH) でのフル幅として測定).
    10. CP スペクトル信号対雑音 (S/N) 比を推定します
      。 注: S/N 比はローター、タンパク質立体構造の剛性と単一分子のコンホメーションの存在性で主にサンプルの量を含む多くの要因に依存します。親指のルールとして、サンプルに適しているべき多次元 SSNMR 分光 64 スキャンで記録、1 D 1 h-13 C CP スペクトル最適化された信号が観察される場合
      11. 。
    11. は、(主に) 165-180 ppm 間ローカライズ蛋白質のバックボーン カルボニル共鳴の分光地域にズームします。Α-ヘリックスの残基からの共鳴と蛋白質のバックボーン カルボニル共鳴の位置でアセンブリに二次構造体の内容を推定または β ストランド構造シフト敵陣やシフト、それぞれ (を参照ほとんどの α-ヘリックスのサブユニットの 図 3 b) 38.
  3. 1 D INEPT 実験
    1. 蛋白質アセンブリの高度なモバイル パーツ (サブ μ s) をプローブする 1 D 1 h-13 C 不適切な実験を設定します
      。 注: ガープが集録 39 の間にデカップリング数 kHz の一般的に使用される短い interscan の遅延を許容する (通常 1 s) プローブを損なわないで
      2. 。
    2. モバイル タンパク質セグメントの指紋として機能する参照の不適切なスペクトルを記録; 一般的なパラメーターは、128 のスキャンと 25 さんの取得時間
    3. プロセス、1 h-13 C 不適切な実験します。量と信号の位置は、それぞれモバイル残基のアミノ酸組成の量を示すもの
      。 メモ: は、信号が 1 D 不適切なスペクトルに存在する場合も 2 D 1 h-13 C 不適切な実験を記録 (例については 図 3 を参照) より特定アミノ酸識別を許可します。あいまいな割り当ての場合、溶液 nmr 法によるバッファー コンポーネント信号位置をチェックをお勧めします
      4. 。 スペクトルない場合モバイル バッファー コンポーネントのみが保持;
    4. BMRB データベース 40 を使用し、ランダム コイル構造の近くで彼らの対応するアミノ酸に共鳴を割り当てるデータ 38 を公開残基は、高度なモバイル政権
      5. 。

Figure 3
図 3: の代表の結果適切に構成された蛋白質のアセンブリの SSNMR スペクトル取得。) 13 1 h-13 C 交差偏波実験の FID を C が検出されました。B) 1 H-13 C 交差偏波実験。C) 1 H-13 硬質蛋白質アセンブリ; C 不適切な実験バッファーのコンポーネントのみが表示されます。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

。

3. 立体配座解析と 3次元構造決定

    1. の シーケンシャル共鳴割り当て 設定 2 D 13 c-13 C プロトン駆動型スピン拡散 (PDSD) 41 は側鎖を含む内残渣 13 c-13 C 相関を検出する実験します。H - 13 C CP 実験 1 D 1 から最初の 1 H-13 C 交差偏波ステップの値を引き継ぐ。
      1. 混合時間均一に 13 C ラベル サンプルを 50 ms に設定 100 ms 選択的に 13 C ラベル サンプル。5 25 ms と 15-25 ms (に代表される自由誘導減衰 (FID) 長さで目に見えるシグナルによって推定することができます固有のスペクトル分解能に依存している間直接取得と間接取得時間を設定します。 図 3 a).
      2. スペクトルの信号をノイズと解像度に関して最適な値を見つけるにいくつかの処理パラメーターをテスト、2.5-4 の正弦ベル シフト (SSB) と qsine ウィンドウ関数を使用して適切な処理を達成できる通常
        3. 。
    2. 連続 13 c-13 C 相関関係ほとんど私 - i±1 の接続を検出するレコードと 2 D 13 c-13 C PDSD 中間混合時間実験のプロセスを設定、また i±2 と i±3残基蛋白質のバックボーンの剛性と二次構造の要素によって。混合時間は、均一にラベル付けされたサンプルの 100-200 ms 間設定必要があります。その他のすべての値は、混合時間 2 D 13 c-13 C PDSD 短いから引き継ぐことができる
      3. 。
    3. は、レコードと 2D 15 N - 13 C N 私 CA 私 と N 私 CO 私 実験 CP 1 H-15 N と特定 CP 15 N-13 C 転送を使用してプロセスを設定 42。 それぞれの CA またはカルボニル地域最大強度に基づく興味のサンプルに直接 1 D ファッションの 15 N-13 C 偏波の転送を最適化します。入力ゲーム特定 CP 接触時間の cal 値 2-6 さんの間にある
    4. レコードと 2 D 15 n-(13 c) 13 C シリーズ実験割り当ての目的のためのプロセスを設定します
      。 注: 最初の 15 N-13 C 偏波転送パラメーター値引き継ぐことができる N 私 CA は 私 から N 私 CO 私 実験/。内残留物の相関関係が (CA 私) CB 私 と N 私 (CA 私) CO 私、それぞれを使用しての夢 43 PDSD 13 c-13 C N は 私 から確立します。偏光を転送します。実験では, N 私 (CO i-1) CA i-1 と N 私 (CO i-1) CX i-1 から残渣 (i) 残基 (i-1) 順次接続を取得両方 PDSD 13 c-13 C を使用して偏極移行します
      5. 。
    5. CcpNmr 解析 44 やスパーキー 45 などの選択、NMR 解析プログラム
    6. 2次元スペクトルを読み込む (CcpNmr による例示) ソフトウェアと主蛋白質シーケンスを読み込む
      7. 。
    7. は C-13 C PDSD スペクトル短い混合 13 に表示されているアミノ酸の種類の識別を開始します。接続を許可するようにスピン系の炭素原子、" 残留防止タイプ " 特定の割り当て;スレオニン残基の割り当ての 図 4 a を参照してください。限りとして多くの残余を識別します。これは蛋白質サブユニット サイズ、スペクトル分解能、分散に依存します
      8. 。
    8. オーバーレイ 13 c-13 C PDSD の中間混合スペクトルを持つ短いミキシングします
      。 注: 主から順次発生する中間混合 PDSD の表示補助のピーク (残渣残渣 i±1 i-) 連絡先。 図 4 b に 2 残基順次割り当ての例を示します。
      1. は、スピン系の共鳴ピークをマークし、他のスピン系の共鳴周波数を持つ中間混合 PDSD の相関関係を見つけます。小さなタンパク質またはペプチドで、それは 2 D 13 c-13 C PDSD 実験に基づいて全体のシーケンシャル共鳴割り当てを達成するためにことが可能です
        。 注: で β ストランド二次構造モチーフ残渣 i - 残渣 i±2 13 C - 13 C 連絡先表示される空間の近さによるシーケンシャル連絡先よりもより強い信号強烈な信号に α ヘリックスの二次構造モチーフ残渣の i - 残渣 i±3 13 C - 13 C 接点がつながることができます
        2. 。
    9. 選択的 13 C 標識サンプルの中間混合 PDSD 実験がある場合短い混合スペクトルの上に重ねて (で使用できる場合、選択的 13 C 標識サンプル) 補足を割り当てるとピーク、選択的 13 C 標識を考慮してパターン (1, 3 - 13 C と 2 - 13 C グリセリン 32 , 33 または 1-13 C と 2 の 13 C グルコース 29, 30, 31
      注: などで 2-13 C グリセロール標識アミノ酸各種が隣接する炭素せず先端位置のラベルの付いたサンプル (Cβ と C ') というラベルの付いた、したがって先端先端を優遇。隣接する残基間で転送します。選択的にラベルのサンプルで長距離 13 c-13 C 相関が既にで造り上げる中間混合 13 c-13 C PDSD 実験。ピークは、逐次相関関数では説明できない、それが長距離の接触から発生する可能性があります。高い高分子アセンブリの均質なサブユニット構造を注文、共鳴の 1 つだけセットはスペクトルで表示されるようになっています。共鳴が 13 C 原子の表示されて倍増した (またはさらに乗算) または蛋白質のバックボーン ストレッチ、原子またはアセンブリ内の一次配列ストレッチ 2 つ (またはそれ以上) 構造をとりうるが、それぞれ存在します
      10. 。
    10. は、各残基の 15 N 共振周波数を識別するために内残渣 15 N - 13 先端相関を含む 2D の NCA スペクトルを使用します。13 C の寸法での解像度が十分ではない場合は内残留物の 15 N 共振周波数を識別するために 2 D の NCACB で Cβ 共鳴に関する補足情報を使用します
      11. 。
    11. は、(i) 内残留物の 15 N 周波数を識別し、(ii) 13 c-13 C のあいまいさを解決する 2 D NCACB と NCACO スペクトル内残留物の 15 N - 13 c-13 C 相関関係を含むを使用してください。追加の 15 N の次元の助けを借りて、PDSD。夢移転に伴う信号の反転は、典型的な先端 Cβ 相関先端信号は正と負の Cβ 信号の観測に します。さらに側鎖の 13 C、スペクトルで表示されている場合は、肯定的な再び
      12. 。

Figure 4
図 4: 2 次元 13C-13 C SSNMR PDSD が均一によく注文に関する実験 13 C, 15 N 標識蛋白質のアセンブリ。A) 短い混合時間 PDSD (混合 50 ms)。B) 長いミキシング時間 PDSD (200 ms 混合) 混合時間が短い PDSD のオーバーレイを用いた 2 残基ストレッチ Ile32 - Thr33 の割り当て。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

。
  1. 二次構造決定
    1. 13 先端を使用して、二次化学を計算する 13 Cβ 化学シフト値シフト 46 ΔδCα ΔδCβ、二次構造を示す。13 - 13 先端 (ランダム コイル) と 13 Cβ(assigned) - Cα(assigned) 13 Cβ (ランダム コイル) を計算します
      。 注: ランダム コイル構造の残基の化学シフト値は 38 から入手することができます。
      1. プロット ΔδCα-ΔδCβ、正または負の値 > 行の 3 残基はそれぞれ β ストランドまたは α-ヘリックス構造を示す; グリシンとプロリン残基として珍しい化学シフト値を表示可能性があります彼らは多くの場合として " 二次構造ブレーカー ".
    2. タロス + 47 , 48 または PREDITOR 49 , 50 を使用して割り当てられた化学シフトからタンパク質二面角を予測します。ピピ/Psi、二面角を予測タンパク質 subu の二次構造を反映します。nit とモデリング プロセス全体を通じて構造的制約を使用します
      3. 。
  2. 構造制約のコレクション
    1. 設定し、2 D 13 C - 長距離 13 C を検出する長い混合時間と 13 C PDSD 実験 - 13 C の相関関係を記録します。範囲 400 ms から 1 回で典型的な混合米使用選択的 13 C ラベル サンプル、スピン希釈が遠い炭素間で偏波伝達を大幅に向上します
      2. 。
    2. オーバーレイ ロング混合 2 D 13 c-13 C PDSD 記録中間混合 13 に選択的にラベルのサンプル C-13 C PDSD、可能であれば同じ選択ラベル サンプルの記録。補足的なピークはより遠くの 13 C 原子間の相関に起因します。考慮に入れる共鳴割り当て中に選択的ラベル付けスキーム
      3. 。
    3. は、割り当てトレランス ウィンドウ、すなわち 共鳴のシグナルに貢献することができますこの特定の ppm の範囲のスペクトル分解能に依存を定義するスペクトルの解像度を慎重に評価します。割り当て精度の標準偏差は CcpNmr 分析などスパーキー NMR 割り当てプログラムで自動的に計算されます
      4. 。
    4. 信号は連続で説明できるなら (残渣残渣 i±1 - 私) または中型の範囲 13 c-13 C 連絡先 (残基-残渣私 ± 2、3 または 4)、中継された分極以来この割り当てを維持転送を説明することができます、13 c-13 C の距離が予想される表示連絡先の範囲を超える場合も相関
      5. 。
    5. は、明確かつ曖昧な周波数に長距離 13 c-13 C 連絡先の割り当てを分類します。周波数の明確な割り当て、場合 1 つだけ共鳴割り当て割り当てトレランス ウィンドウに対して可能です
      。 注: あいまいな割り当ては、許容値ウィンドウ内のすべての可能な共鳴割り当てを含みます。あいまいさして解除できます同時に構造計算時にアリアなど計算ルーチンで実行同様明確な制約のみを使用して計算予備の構造に基づく曖昧さ回避の繰り返しラウンド 51 またはユニオ 52。さらに、異なる生物物理源 (例えば 変異またはサブユニット構造を NMR や x 線結晶構造解析、長さあたりの質量測定、低温電子顕微鏡マップによって切り捨てられる) からの構造データも使えるため、あいまいさのレベルを減らすために例 1 , 3 , 53 , 54 , 55 , 56 を参照してください。, 57, 58
  3. 対称蛋白質の分子間の距離制約の検出
    1. で 2 d 15 N-13 C 痛み CP 59 実験を設定。混合 (50/50) u-15 n-/u-13 C 標識サンプル。痛み CP スペクトル上で検出された信号は、分子間の 15 N - 13 C の近接電波から起こるべき。以前割り当てられた共鳴を使用して分子間接触の割り当てを実行します
      2. 。
    2. 設定 2 D 13 c-13 C PDSD 長い混合時間 (> 600 ms) (50/50) の混合 (1, 3-13 C)-/(2-13 C)-グリセロールまたは (1-13 C)-/(2-13 C)-グルコース サンプル
      。 注: にこの 13 c-13 C スペクトル信号分子内および分子間の 13 から c-13 C 近接電波を発生します。ただし、2 つのラベル付けスキームの高い補完できます分子間接触、例えばセリン CA に起因する明確に特定共鳴組、(2-13 C)-グルコースのセリン CB を関連付けるサブユニットをラベル付け、(1 - 13 C)-グルコースのサブユニットをラベル付けします。
      1. 2D 13 c-13 C スペクトルに混合試料のスペクトルは、同質ラベルに記録されたオーバーレイがサンプル ((1,3-13C) - と (2-13 C)-グリセロールまたは (1-13 C)-、(2-13 C)-グルコースサンプルのラベル)。混合サンプルの記録されたスペクトルの分子間相互作用から生じる
        2. 。
  4. SSNMR データからモデルを構造
    1. 構造計算に必要な SSNMR 拘束リストを準備: (1) 蛋白質シーケンス;(2) 分子内の明確な距離の制約。(3) 分子内のあいまいな距離拘束;(4) タロス ベース二面角拘束;(5) 分子間の明確な距離の制約。(6) 分子間のあいまいな距離拘束;(他の生物物理学的手法 (例えば、長さあたりの質量対称性パラメーター) 7) その他のデータ
      2. 。
    2. いくつかのレビューは、相補的な構造データ 14 , 60 , 15 と組み合わせて SSNMR データに基づいた構造モデリングに対する洞察を提供 、 19 , 61 , 62 予備的な構造計算の中にあいまいな距離の制約を区別できるように注意してください明確な距離の制約に基づく構造モデル。構造精度を確保、注意深く観察構造が単一の倍に収束かどうか
      3. 。

Figure 5
図 5 : 内と分子間対称蛋白質アセンブリ内の連絡先。らせん高分子アセンブリの内 - 対 分子間 13 C - 13 C 長距離接触の模式図。サブユニットは白とサブユニットの混合ラベル; すなわち アセンブリの 2 つの異なるラベル付けスキームの 1:1 混合物が実行された前に説明するために赤で着色されている (例えば 1-13 C グルコースと 1 - 13 C グルコース). A) 分子内 13 c-13 C 長距離接触 (青い破線矢印); B) 分子間 13 c-13 C 長距離接触 (赤矢印は破線). この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

。

Representative Results

典型的な SSNMR ワークフローには、図 1に示すいくつかの手順が含まれています。通常蛋白質の亜単位はエシェリヒア属大腸菌の異種発現の in vitroによる生産・浄化・静的な条件でも揺れが時々 を組み立ています。蛋白質の亜単位の表現そして浄化は、SDS ゲル クロマトグラフィー (図 2 a) が続いています。電子顕微鏡 (EM) 解析による高分子アセンブリの形成を確認しことができます (糸状のアセンブリの例は図 2 bを参照)。

SSNMR ローターに蛋白質のアセンブリの導入後分光計にローターを挿入、MAS 周波数および温度を規制、スペクトルが記録されます。1 D SSNMR による最初の洞察が得られます。図 3は、構造的に均質な蛋白質のサンプル、 1h-13C CP スペクトル、13C 共鳴で蛋白質の亜単位の硬質コアの存在を明らかに13C のチャネル上で検出された典型的な SSNMR FID を示しています、アセンブリ、およびモバイルの残基を表す 2D 1h-13C 不適切なスペクトル。アセンブリ構造の硬質コアの原子洞察は、多次元 SSNMR 実験する必要がありますに記録される均一に、選択的に標識 SSNMR 共鳴を最初に割り当てるし、(の図 4 を参照してください長距離近接電波を検出する試料).

すべてのスペクトルは、割り当てる SSNMR 共鳴し内と分子間距離拘束条件 (図 5) を抽出する適切なソフトウェアで解析処理します。SSNMR 距離拘束が単独で使用されるかまたは相補的な技術からのデータと組み合わせて、これは、モデリング プログラムに統合できます。

SSNMR 技術によって解決高分子アセンブリの代表的な原子構造は、図 6は、細菌の付属とアミロイド線維から糸状のアセンブリのいくつかを示します。

Figure 6
図 6:固体 NMR 手法によって決定された糸状高分子構造: 細菌のフィラメントおよびアミロイド線維。A)尿路エシェリヒア属大腸菌、PDB コード 2N7H 4の 1 型線毛B) ASC フィラメント、PDB コード 2N1F 63;C) III 型分泌システム針、PDB コード 2MME、2LPZ、2MEX 2,3,64;D) AB42 β アミロイド線維、PDB コード 2NAO、5KK3、2MXU 65,66,67大阪変異 PDB コード 2MVX 57, アイオワ州変異 PDB コード 2MPZ 58;E) α-シヌクレイン線維、PDB コード 2N0A 68;F) ヘットのプリオン ドメイン、PDB コード 2RNM、2KJ3 69,70。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Discussion

固体 NMR (SSNMR) は、原子レベルで高分子タンパク質複合体を特徴付けるための選択の方法です。SSNMR ベースの構造決定の中心的な問題の 1 つは通常 (セカンダリを含む低解像度モデルに至る、様々 な高精度の 3次元構造モデルを確立することができる調査システムのスペクトルの質構造要素と小さな 3 D 情報) 疑似原子の 3 D 構造。多次元 SSNMR 実験から抽出された構造情報の質と量はアセンブリの高分解能 nmr による構造を計算するキー。

記述されていたプロトコルは、 13C-13C、 15N-13C 構造拘束高信号にノイズにいくつかの 2 D (および時々 3 D) スペクトルの記録を必要とする検出に依存します。中程度の MAS 周波数 (< 25 kHz)、サンプルがサンプル水和に依存してまで ~ 50 mg の蛋白量を可能にする 3.2 4 mm 径のローターに導入されました。ローター内サンプルの量は SSNMR スペクトルにおける信号対雑音比、長距離距離制約の検出とその明確な割り当てのための決定的な要因に直接比例します。

スペクトル分解能は、シーケンシャル共鳴割り当ておよび拘束コレクション中に重要なパラメーターです。最適な結果を得るためには、サンプルの準備パラメーターは精製サブユニットとアセンブリの条件 (pH、バッファー、振動、温度等) を中心に、最適化する必要があります。サンプルを最適化するためのいくつかの異なる条件のアセンブリを観察されている、ラベルのサンプルを準備して 1 D 1h-13C CP スペクトル (ステップ 2.1 で説明) それぞれ作製した試料を記録するをお勧めします。スペクトルはスペクトル分解能と最適条件を決定することができますに基づいて別の準備の間の分散を比較するのに役立ちます。

SSNMR データの品質は、偏光の転送手順については特に、NMR アクイジション ・ パラメーターの選択によって強く決まります。高感度、スペクトル分解能、高分子タンパク質複合体などの複雑なターゲットに直面するときに必要なは、高磁場の強さ ( 1H 周波数 ≥600 MHz) の使用が欠かせません。

多くの場合、制限要因は、分光器の可用性です。したがって、準備するサンプルの賢い選択分光器セッションを付けます。いずれにせよ、均一に13C、 15N 標識サンプル シーケンシャルと内残留共鳴割り当てを実行する前提条件であります。固体 nmr 測定法によって割り当てられたタンパク質は、「71」を参照してください。選択的13C 標識サンプルが必要です適度な MAS 周波数で高分子アセンブリの構造決定長距離13c-13C と13C ・15N 検出連絡先のサンプルに基づいて 1, 3-13C -、2-13C エステルおよび/または 1-13C -、2 -、13C グルコース ラベリングよく使用される前述のよう。2 つのラベル付けスキーム間の選択は、スペクトルの信号対雑音比と解像度に基づいています。内・分子間の長距離接触を区別するには、混合ラベルおよび希薄化後の試料は効率的で明らかにしました。

一言で言えば、原子の SSNMR 構造研究のための重要なステップは、: (i) の優れたサンプル量と品質を取得するアセンブリの最適化する必要性サブユニットの準備、(ii) 分析計フィールド強さと集録パラメーターする必要があります慎重に選ばれました。(iii) 選択的ラベリング戦略は、3 D 構造決定に必要な必要なデータの量は、データの品質と相補的なデータの可用性によって異なります。

Homomultimeric ナノオブジェクト膜タンパク質に至る超分子システムの広い範囲への適用性、にもかかわらず SSNMR 多い同位体ラベル材料の mg 量の必要性によって制限されます。超高速 MAS (≥100 kHz) SSNMR 1H 検出 NMR への道を開く技術動向とサブ mg 72,,7374最小サンプル量の限界をプッシュ。それにもかかわらず、構造を解明13C 標識サンプルが不可欠、体外組み立てサンプルまたは、セルの最小媒体で生き残る生物で表されるシステムに SSNMR のアプリケーションを制限します。SSNMR は新たな方法です (詳細レビューは、 75,,767778,を参照)。

SSNMR アプリケーションが高解像度の 3 D 構造を得るための重要な要因は、スペクトル分解能: アセンブリの構造不均質性組み込みスペクトル解像度とスペクトル解析を制限できます。残渣特定13C ラベル可能性がありますいくつかのケースで代替手段を提供 (最近の例を参照してください79,80) 構造のモデルを得るために戦略的な残留に関する特定の距離情報を取得します。

3次元定量 SSNMR はまだアプローチおよび 600-1000 MHz (1H 周波数) で週に数日システムによって、洗練された楽器に頻繁に長くデータ収集時間のいくつかのデータセットのコレクションを必要とします。分光器。したがって、分光器時間へのアクセス SSNMR オーナーシッの制限要因になることができます。

Homomultimeric 蛋白質のアセンブリの3,57,64,70, SSNMR 構造規制の高番号を識別するために十分な品質の SSNMR データにつながる場合まだ顕微鏡次元にないアクセスを与えます。したがって、homomultimeric アセンブリのde novo SSNMR 構造決定、EM または長さあたりの質量 (MPL) データ理想的にはデータを補完 SSNMR 対称性パラメーターを取得します。SSNMR データだけでは原子と分子間のインタ フェースを提供します。

SSNMR は EM または MPL の測定などの構造技術の高い補完性が、データは変異または切り捨てられたサブユニットの溶液 NMR や x 線結晶構造解析による原子構造と完全に結合できます。研究数の増加は、異なる構造データの連動が高分子アセンブリ (代表的な例については、図 6を参照) の原子の 3 D モデルを決定するため許可されている文献で見つけることができます。

構造生物学の分野、研究する有望な手法として現れる SSNMR不溶解性および非晶質アセンブリ、原子レベル、すなわち構造データを提供する原子スケールで。この点で、SSNMR はウイルスの封筒、細菌のフィラメント、アミロイド、RNA などのネイティブ環境および蛋白質のアセンブリ内膜タンパク質を含む分子の x 線結晶解析および溶液 NMR にペンダントとRNA 蛋白質の複合体 (たとえば、81を参照してください)。その汎用性の高いアプリケーションの in vitro細胞において、二次、第三紀と第四紀の構造変化の追跡などパートナー分子原子スケール (たとえば82) とインタラクション サーフェスを識別してマッピング分子動力学組み立てられた複合体のコンテキストでは、複雑な生体分子のアセンブリの将来の構造研究で SSNMR の重要な可能性を示します。

コンポーネント M9 媒体
塩化ナトリウム 0.5 グラム/L
KH2PO4 3 グラム/L
Na2HPO4 6.7 グラム/L
MgSO4 1 mM
ZnCl2 10 Μ M
した FeCl3 1 Μ M
CaCl2 100 Μ M
MEM ビタミン ミックス 100 X 10 mL/L
13C グルコース 2 グラム/L
15NH4Cl 1 グラム/L

表 1:組換え蛋白質の最小限の式中の組成の生産大腸菌 BL21 セル。

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この作品は、ANR (13-PDOC-0017-01 学と ANR-14-CE09-0020-01 アダムローリー) によって資金を供給、「未来への投資」プログラム アイデックス ボルドー/CNRS (PEP 2016 年学) 参照 ANR-10-アイデックス-03-02 学にこそ注ぐラ凝った Médicale (FRM - アダムローリーに AJE20140630090)、FP7 プログラム (FP7 の人々-2013-セエグ アダムローリーに) および欧州連合のホライゾン 2020年研究と技術革新プログラム (アダムローリー、契約なしの 639020 に付与開始 ERC) の下で欧州研究会議 (ERC) とプロジェクト」WEAKINTERACT."

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments
NMR Spectrometer (> 11.7 Tesla) Bruker -
triple resonance MAS SSNMR probehead  Bruker -
SSNMR rotors 4mm Bruker K1910
Centrifuge 5804 R  Eppendorf 5805000629
GeneQuant 1300 spectrometer Dutscher 28-9182-13
IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L Dutscher 228001
MaxQ 4450 bench top orbital shaker Dutscher 78376
Tube Revolver Agitator Dutscher 79547
sonopuls HD 3100 Bandelin 3680
MicroPulser electroporator Biorad 165-2100 
mini-PROTEAN tetra cell system Biorad 165-8000
AKTA pure system GE Healthcare 29-0182-24
capillary microman M25 pipet Gilson  F148502
Name Company Catalog Number Comments
Materials
amiconR ultra-15 sigma Z740199-8EA
capillaries and pistons Gilson  F148112
spatula Fisher 13263799
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
D-glucose 13C6 Sigma 389374
Ammonium-15N-chloride Sigma 299251
1,3 13C2 glycerol Sigma 492639
2 13C glycerol Sigma 489484
Kanamycin Sigma K1876
Carbenicillin Sigma C3416
Sodium phosphate dibasic Sigma S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655
Sodium chloride Sigma 71380
calcium chloride Sigma C1016
Magnesium sulfate Sigma 208094
Iron Chloride Sigma 157740
Zinc chloride Sigma 793523
MEM Vitamin Solution (100×) Sigma M68954
IPTG Fisher BP1755
Trizma base  Sigma T1503
Tricine Sigma T0377
SDS Sigma 436143
sodium azide sigma 71289
4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid  Sigma 178837
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Unicorn 6.3 GE Healthcare Akta systems
ccpNMR CCPN  spectrometer systems

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References

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固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究
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Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (127), e55779, doi:10.3791/55779 (2017).

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