Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Atomär skala strukturella studier av makromolekylära sammansättningar av Solid-state kärnmagnetisk resonans-spektroskopi

Published: September 17, 2017 doi: 10.3791/55779
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Chemistry, Biology of Membranes, Nanoobjects, UMR5248 CNRS, Université de Bordeaux

Summary

Strukturer för Supramolekylära protein församlingar på atomär upplösning är av hög relevans på grund av deras avgörande roller i en mängd olika biologiska fenomen. Häri, presenterar vi ett protokoll för att utföra högupplösta strukturella studier på olösliga och icke-kristallin makromolekylära protein aggregat av magi-vinkel spinning solid-state kärnmagnetisk resonansspektroskopi (MAS SSNMR).

Abstract

Supramolekylär protein aggregat spela grundläggande roller i biologiska processer från värd-patogen interaktion, virusinfektion att förökningen av neurodegenerativa sjukdomar. Sådana församlingar bestå i flera proteinsubenheter organiserade i ett icke-kovalenta sätt att bilda stora makromolekylära objekt som kan utföra en mängd olika cellulära funktioner eller orsaka skadliga konsekvenser. Atomic insikter i mekanismerna som montering och funktion de makromolekylära församlingarna förblir ofta knappa sedan deras inneboende olöslighet och icke-kristallinitet ofta drastiskt minskar kvaliteten på de uppgifter som erhållits från de flesta tekniker används inom strukturbiologi, såsom röntgenkristallografi och lösning kärnmagnetisk resonans (NMR). Här presenterar vi magic-vinkel spinning solid-state NMR spektroskopi (SSNMR) som en kraftfull metod att undersöka strukturerna i makromolekylära församlingar på atomär upplösning. SSNMR kan avslöja Atom Detaljer på det monterade komplexet utan begränsningar storlek och löslighet. Protokollet presenteras här beskrivs de grundläggande steg från produktionen av 13C /15N isotop-märkt makromolekylära protein aggregat till förvärvet av standard SSNMR spectra och deras analys och tolkning. Som ett exempel visar vi försäljningsförloppet för en SSNMR strukturell analys av en trådformiga protein församling.

Introduction

Framsteg inom magi-vinkel spinning solid-state kärnmagnetisk resonansspektroskopi (SSNMR) erbjuder ett effektivt verktyg för strukturella karakterisering av makromolekylära protein aggregat på en atomär upplösning. Dessa protein församlingar är allestädes närvarande system som spelar viktiga roller i många biologiska processer. Deras molekylära strukturer, interaktioner och dynamik är tillgänglig genom SSNMR studier, som har visats för viral (förhoppningsvis1) och bakterieinfektion mekanismer (utsöndring system2,3, pili4), membran protein komplex5,6,7,8 och funktionella amyloid 9,10,11. Denna typ av molekylär sammansättning kan också framkalla sjukdomar såsom vid neurodegenerativa sjukdomar där proteiner samlas i felveckning, amyloid stater och orsaka avvikande cell beteende eller cell död 12,13. Protein aggregat byggs ofta av den symmetriska oligomerisering multiplar kopior av proteinsubenheter in stora supramolekylär objekt i olika former inklusive fibriller, filament, porer, rör eller nanopartiklar. Den Kvartära arkitekturen definieras av svaga interaktioner mellan proteinsubenheter att organisera den rumsliga och tidsmässiga församlingen och tillåta för sofistikerade biologiska funktioner. Strukturella utredningar på atomär nivå på dessa församlingar är en utmaning för högupplösta tekniker sedan deras inneboende olöslighet och mycket ofta deras icke-kristallinitet begränsar användningen av konventionella röntgenkristallografi eller lösning NMR tillvägagångssätt. Magic-vinkel spinning (MAS) SSNMR är en framväxande teknik att få atomär upplösning uppgifter om olösliga makromolekylära församlingar och har bevisat sin effektivitet att lösa 3D Atom modeller för ett ökande antal komplexa Biomolekylär system inklusive bakteriella filament, amyloid församlingar och viruspartiklar 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Tekniska framsteg på höga magnetfält, metodologiska utvecklingen och provberedning har etablerat MAS SSNMR till en robust metod att undersöka olösliga proteiner i olika miljöer, särskilt i deras biologiskt relevanta makromolekylära samlat statligt eller i cellulära membran, vilket gör tekniken mycket kompletterande till cryo-elektronmikroskopi. I många fall kännetecknar en mycket hög grad av symmetri sådana protein församlingar. MAS SSNMR utnyttjar denna funktion, som alla proteinsubenheter i en homomolecular församling skulle ha samma lokala struktur och därför praktiskt taget samma SSNMR signatur, drastiskt minska komplexiteten vid analysen.

En effektiv protokoll för strukturstudier av makromolekylära protein aggregat av måttlig MAS (< 25 kHz) SSNMR presenteras i denna video och kan delas in i olika steg (figur 1). Vi kommer att demonstrera de kritiska stadierna av arbetsflödet för en SSNMR strukturella studie exemplifieras på en trådformiga protein församling (se markerad steg i figur 1), med undantag av protein subenhet rening, olika för varje protein montering men av avgörande betydelse för strukturstudier och utan att gå in på teknisk/metodologiska Detaljer SSNMR spektroskopi och struktur beräkningen för vilken specialiserad självstudiekurser är tillgängliga online. Medan detta protokoll kommer fokus främst på solid-state NMR-experimenten utförs MAS villkor, anpassade användningen av biologiska miljöer 23,24,25,26 , 27, som arrangera i rak linje bicelles, Tillåt för utredning av protein konformation och dynamiska protein-protein interaktioner i membran-liknande medier utan MAS teknik. Vi kommer att Visa proteinuttryck och församlingen steg samt inspelning av avgörande SSNMR spektra och deras analys och tolkning. Vårt mål är att ge insikter i rörledningen strukturell analys gör det möjligt för läsaren att utföra en atomär upplösning strukturella studie av en makromolekylära sammansättningen av SSNMR tekniker.

Protokollet omfattar 3 sektioner:

1. solid-state NMR prov produktionen

Som en förutsättning för att en solid-state NMR analys proteinkomponenter makromolekylära sammansättningen skulle behöva uttryckas, isotop-märkt, renat och monterade in vitro- in i native-liknande komplexa staten (för ett exempel, se figur 2) . För att säkerställa hög NMR känslighet, krävs isotop anrikning i 13C och 15N märkning med hjälp av minimal bakteriell uttryck media kompletteras med 13C och 15N källor, såsom jämnt 13 C-märkt glukos/glycerol och 15NH4Cl respektive. I senare skede av protokollet, selektivt 13C-märkt prover som framställts med selektivt 13C-märkta källor såsom (1,3 -13C)- och (2 -13C)-glycerol (eller (1 -13C)- och (2 -13C)- glukos) används för att underlätta NMR analysen. Blandade märkt provet motsvarar en equimolar blandning av antingen 50% 15N- och 50% 13C-märkta eller 50% (1,3 -13C)- och 50% (2 -13C)-glukos införs för att beskriva detektion av intermolekylära interaktioner. En hög grad av protein renhet samt rigorösa villkor under montering steg är viktiga faktorer för att försäkra en homogen strukturella ordning av det slutliga provet.

2. preliminära strukturell karaktärisering baserat på endimensionell (1D) solid-state NMR

Vi presenterar de viktiga experiment för en strukturell analys av SSNMR. Endimensionell (1D) kors-polarisering (CP) och INEPT / RINEPT28 experiment, upptäckts på 13C kärnor används för att upptäcka styva och flexibla protein segment i församlingen, respektive, och att uppskatta graden av struktur homogenitet och lokala polymorfism (för ett exempel, se figur 3).

Rong > 3. Konfirmerande analys och 3D struktur bestämning

Underavsnitt 1 och 2 berör den konfirmerande analys, som är baserad på SSNMR resonans tilldelningen av alla styva rester av den protein-församlingen, som de kemiska förskjutningarna är mycket känsliga sonder till den lokala miljön och kan användas för att förutsäga den phi/psi tvåplansvinkel vinklar och avgöra därmed det sekundära strukturerar. Figur 4 illustrerar ett exempel på en sekventiell resonans tilldelning i styv kärna en protein församling. 3D-strukturen bestämningen bygger på insamling av strukturella uppgifter såsom avstånd begränsningar kodning Stäng anslutning (< 7-9 Å), som innehåller både intra- och intermolekylära information. Underavsnitt 3 och 4 beskriva långväga avlägsen återhållsamhet insamling och tolkning. Långväga kontakter definieras som intramolekylära 13C -13C anslutning som härrör från rester jag j, med | i-j | ≥4, definiera därmed högre protein luckan den monomeriska subuniten eller som intermolekylära 13C -13C anslutning, definiera de intermolekylära gränssnitt mellan proteinsubenheter i församlingen. Intra- och intermolekylära gränssnitt illustreras i figur 5. SSNMR begränsningar upptäcks genom 13C -13C och 15N -13C återkoppling experiment oftast koda för internuclear avstånd < 1 nm. Underavsnitt 4 förklarar detektion av intermolekylära avståndet begränsningar. I symmetriska protein församlingar, användning av homogeneously märkt prover (dvs 100% jämnt eller selektivt märkt) för att identifiera intermolekylära subunit-subunit interaktioner är begränsad, som både intra - och inter - molecular kontakter leda till detekterbara signaler. Otvetydig detektering av intermolekylära anslutning uppnås med hjälp av blandade märkt prover, som innehåller en equimolar blandning av två annorlunda märkt prover, kombinerade före sammanläggning. Underavsnitt 5 introducerar kort struktur modellering.

Figure 1
Figur 1 : Arbetsflödet en atomär upplösning strukturella studier av solid-state NMR. 13 C, 15N isotopen märkt proteinproduktion, subenhet rening, subenhet montering, kontroll av församlingens bildande, SSNMR experiment, SSNMR experiment analys och extraktion av avstånd begränsningar och struktur modellering visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

1. solid-state NMR prov productiona

  1. produktion av enhetligt 13 C / 15 N-märkt proteinsubenheter
    1. Använd färska omvandlas, pET24-peptid-6his plasmid-innehållande E. coli BL21 (DE3) celler, skörda dem från den beredda agarplattan.
    2. Inokulera en 15 mL före kultur av pre värmde LB medium med en koloni. Inkubera vid 37 ° C med 200 rpm skakar övernattning.
    3. Överför före kulturen till 1 L av den huvudsakliga kulturen av pre värmde M9 medium (se sammansättning i tabell 1), som innehåller de nödvändiga isotop-märkt kol och kväve källorna.
      Obs: Detta kan vara enhetligt 13 C-märkta glukos, selektivt (1 - 13 C)- eller (2 - 13 C)-märkt glukos 29 , 30 , 31 eller () 1,3 - 13 C)- eller (2 - 13 C)-märkt glycerol 32 , 33.
    4. Inkubera detta vid 37 ° C och mäta OD 600 så snart kulturen blir grumlig. När OD 600 har nått ett värde på 0,8, framkalla proteinuttryck med 0,75 mM IPTG för 4 h.
      Obs: Det optimala induktion villkor kan variera från ett protein till en annan.
    5. Återvinna cellerna genom centrifugering för 30 min vid 6000 x g och 4 ° C.
  2. Rening skiss (visas inte i protokollet video)
    1. Lyse celler använder standardtekniker såsom ultraljudsbehandling eller lysozym behandling och rena den protein subuniten använder tekniker etablerade eller anpassad för den undersökt protein montering.
      Obs: Proteinet kan uttryckas i inkludering organ, kontrollera för protein lokaliseringen av cell lysis och efterföljande centrifugering. Om proteinet finns i sedimenten med cell skräp, det har ackumulerats i organ i inkludering.
    2. Test uttryck och renhet av protein provet till exempel av en standard 12-15% Tris-Tricine SDS-PAGE, se figur 2A. Om renhetsgraden är tillräcklig, proteinet kan monteras, annars utföra en kompletterande reningssteg.
  3. In vitro montering av protein glödtrådarna
    1. Kontrollera proteinkoncentration i renat lösningen. Om proteinet innehåller absorberande rester, mäta upptaget i en UV-spektrofotometer vid 280 nm. Infoga ren bufferten i spektrofotometern som kalibrering och mät sedan protein absorbansen.
    2. Beräkna protein koncentrationen med absorptionskoefficienten av den protein-subenheten med anpassade öl-Lambert lagen: en λ = ε λ x l x c; här A är den optiska densiteten vid en viss våglängd λ; ε är den specifika absorptionskoefficient; l är längden av den optiska banan i cm; c är koncentrationen i mol/L.
    3. Koncentrat proteinet till en koncentration av 1 mM i en centrifugal filterenhet. Inför provet i centrifugal filterenheten och centrifugera vid 4000 x g i 30 min, blanda lösningen i filterenheten försiktigt med en Pipettera att undvika protein avlagring på filtret. Upprepa proceduren tills önskad koncentration uppnås.
      Obs: Optimal montering koncentrationen beror på systemet och måste optimeras (vanligtvis mellan 0,1 - 1 mM). Om en equimolar blandat märkt provet av två olika märkta proteinet partier är beredd (e.g. (50/50) (U - 15 N)-/ (U - 13 C)-märkt), blandning måste ske antingen innan eller direkt efter steget koncentration att säkerställa homogenisering av den blanda lösningen.
    4. Överför provet till en tub och inkubera det under omrörning i en vecka i rumstemperatur.
    5. Vanligtvis polymerisation av subunitsna till filament åtföljs av lösningen blir grumlig. Kontrollera de mikroskopiska fibrill morfologi och homogenitet till exempel genom elektronmikroskopi (6300 X - 45000 X förstoring), se figur 2B.
    6. Centrifugera provet för 1 h på 20000 x g och 4 ° C. ta bort majoriteten av supernatanten, lämna bara tillräckligt med vätska att täcka ytan för att undvika prov uttorkning. Kontrollera supernatanten för icke-monterade subenheter på UV spektrofotometern.
    7. Tvätta prov genom att lägga till H 2 O och försiktig Omsuspendera innehållet med en pipett. Gör inte vortex. Snurra provet för 30 min vid 22000 x g och 4 ° C. Upprepa tvätt steg 3 gånger. Kontrollera under alla tvätt steg om pelleten bevarar dess aspekt efter centrifugering och supernatanten för icke-monterade subenheter på UV spektrofotometern.
    8. Lägg till 0,02% (w/v) natriumazid (NaN 3) för att undvika bakteriell kontaminering och lagra provet tills mätning vid 4 ° C.
  4. Solid-state NMR rotor fylla
    1. Centrifugera två gånger under 30 minuter vid 22000 x g och 4 ° C. ta bort högsta belopp av supernatanten; resulterande provet konsistensen beror på församlingens protein, och är vanligtvis en gel-liknande insättning.
    2. Använda en kapillär Pipettera för att infoga provet i SSNMR rotorn.
      Obs: Här presenterar vi förfarandet på en rotor med 4 mm i diameter.
      1. Centrifug rotorn på ett bord Centrifugera försiktigt införa provet i rotorn. Upprepa proceduren tills rotorn fylls. Hålla minsta utrymme för att stänga rotorn med rotor locket. Om antalet prov inte är tillräckligt, införa en kommersiellt tillgänglig infoga att fylla upp det återstående utrymmet att säkerställa urvalet distribution homogenitet i rotorn.
        Obs: Beroende på den monterade prov konsistensen, det kan vara lämpligare att använda en tunn spatel, speciellt för mycket tät prover. Rotorer med en diameter på 2,5 till 4 mm används vid måttlig MAS frekvenser.
    3. Lägga till spår av 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic syra (DSS) för inre kemiska Skift och temperatur kalibrering.
    4. Nära den gemensamma jordbrukspolitiken med en förslutningsanordning.
    5. Kolla under ett förstoringsglas om den gemensamma jordbrukspolitiken är väl insatt och helt stängd.

Figure 2
figur 2: representativa resultat för protein subenhet rening och montering. (A) 15% Tris-tricine SDS-PAGE för protein subunit (inklusive hans 6-tagg) i olika skeden av rening. Lane 1 - Protein molekylvikt markör; Lane 2 - E. coli BL21 (DE3) celler uninduced kontroll; Lane 3 - E. coli BL21 (DE3) celler inducerad med 0,75 mM IPTG; Lane 4 - solubilized införande organ lane 5 - supernatant fraktioner av cell lysate; Lane 6 - renad fraktion efter Nickel orörlig metall affinitetskromatografi (IMAC) FPLC och avsaltning. B) målat negativt protein fibriller av TEM imaging. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. preliminära strukturella karakterisering baserat på endimensionell (1D) solid-state NMR

  1. inledande set-up och 1 D cross-polarisering (CP)
    1. Infoga rotorn i NMR magneten
    2. börjar snurra rotorn en frekvens på 5 kHz och vänta för en stabilisering av ±10 Hz, sedan accelerera fram till 7 kHz. Tune och matcha 1 H, 13 C och 15 N kanaler. Ställ in temperaturen på 2-10 ° C (275-283 K); prov värme vid 7 kHz MAS är låg och temperaturjustering krävs vanligtvis inte på denna MAS frekvens.
    3. Spela in en singel-pulsade 1D 1 H spektrum med 16 skanningar.
      Obs: Effektnivåer måste har tidigare optimerats på ett referens-förening (till exempel en 13 C / < sup > 15 N histidin eller glycin), att tillhandahålla startvärden för att optimera effektnivåer i experiment på det riktade urvalet; Detta förfarande är en rutinmässig uppgift och därför av tillämpningsområdet i detta protokoll.
    4. Hålla temperaturen under alla experiment mellan 2-10 ° C, i hydrerad prover temperaturen återspeglas i den relativa förskjutningen av bulk vatten 1 H resonansen med avseende på de DSS signal 34. Mät temperaturen efter den relation δ (H 2 O) = 7,83-T/96,9 med en noggrannhet av 1-2 ° C 35.
    5. Uppsättning upp önskad MAS frekvens och vänta tills stabilisering av ±10 Hz.
      Obs: Här är det visat för en frekvens av 11 kHz.
    6. Tune och match 1 H och 13 C kanaler igen och justera temperaturen med hjälp av en 1 D 1 H experiment.
    7. Ställa in en 1D 1 H - 13 C CP 36.
      Obs: CP experiment visar de signaler som härrör från restmängder i en styv konformation. Pulse kalibrering och frikoppling parametrarna optimeras direkt på prov när känsligheten är tillräckligt hög för att observera signaler efter mindre än ~ 32 skanningar. De ursprungliga optimering värdena tas över från standard optimering på en förening som referens. CP kontakttid och effektnivåer väljs utifrån maximal signalintensitet. I protein prover vanligen optimal CP kontakttiden mellan 200 µs och 2 ms. frikoppling parametrarna bör också justeras igen från kalibreringen på en förening som referens.
      1. Noggrant Observera localizationen av spinning sidebandsna given MAS frekvens på.
    8. Spela in en referens 1D 13 C CP spektrum som fungerar som 1 D spektrala fingeravtryck. Typiska parametrar är 128 skanningar, 1 ms CP kontakt tid, 100 kHz frikoppling styrka, 3 s återvinna försening och 25 ms förvärv.
    9. Kalibrera 1 H och 13 C kemiska förskjutningarna efter de IUPAC rekommendationer 37. Fastställa resonansfrekvensen på 1 H DSS signalen (kemisk förskjutning 0 ppm); 13 C kemiska förskjutningarna refereras till 1 H Skift (vanligtvis ~ 0.25144, härrör från förhållandet mellan den 13 C till 1 H resonans frekvens 37).
    10. Process 1D 1 H - 13 C CP experimentera utan apodisering fungerar (se bild 3A och B för att upptäcka om ett homogent välordnad protein församling). Välja en isolerad topp att uppskatta linjebredd i provet, vägledande strukturell ordning och homogenitet. Typiska 13 C linewidths för välordnad biologiska protein sammansättningar enligt MAS på höga magnetfält varierar mellan 20-150 Hz (mätt som den full bredden på halv höjd (FWHH)).
    11. Uppskatta förhållandet signal-brus (S/N) i CP spectrumen.
      Obs: Det S/N-förhållandet beror på många faktorer, inklusive främst mängden prov i rotorn, graden av styvhet protein struktur och förekomsten av en enda molekylära konformation. Som en tumregel, ett prov bör vara lämplig för flerdimensionella SSNMR spektroskopi om en signal i en optimerad 1D 1 H - 13 C CP spektrum registreras med 64 skanningar.
    12. Zooma in den spektrala-regionen av protein ryggraden karbonyl resonanser (huvudsakligen) lokaliserade mellan 165-180 ppm. Beräkna sekundärt strukturera innehållet i församlingen av placera av protein ryggraden karbonyl resonanser med resonanser från rester i α-spiralformade eller β-strand konformation skiftade downfield eller upfield, respektive (se figur 3B för en mestadels α-spiralformade subenhet) 38.
  2. 1 D INEPT experimentera
    1. inrätta en 1 D 1 H - 13 C olämplig experiment sond mycket rörliga delar (sub-µs) protein församlingens.
      Obs: GARP frikoppling av några kHz under förvärv 39 används ofta, att möjliggöra korta interscan förseningar (typiskt 1 s) utan att skada sonden.
    2. Spela in en referens ODUGLIGA spektrum som fungerar som fingeravtryck för segmenten mobila protein; typiska parametrar är 128 skanningar och en förvärv 25 ms.
    3. Process 1 H - 13 C olämplig experimentera. Beloppet och placerar av signalerna är vägledande för mängden mobila rester och aminosyra sammansättning respektive.
      Obs: Även spela in en 2D 1 H - 13 C olämplig experiment om signaler finns i 1 D olämplig spektrum (se figur 3 c för ett exempel) att medge en mer specifik aminosyra identifiering. I tvetydiga tilldelning fall, vi rekommenderar att du kontrollerar buffert komponent signal positionerna av lösning NMR.
    4. Använda BMRB databas 40 och publicerade data 38 för att tilldela resonanser till deras motsvarande aminosyra i nära slumpmässiga spolen konformation; spektrumet innehåller endast mobila buffert komponenter om ingen rester är en mycket rörlig regim.

Figure 3
figur 3: representativa resultat av SSNMR spectra förvärv för en väl strukturerad protein församling. En) 13 C-upptäckt FID av 1 H - 13 C cross-polarisering experiment. B) 1 H - 13 C cross-polarisering experiment. C) 1 H - 13 C olämplig experiment av en styv protein församling; endast komponenter som buffert är synliga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. conformational analys och 3D struktur beslutsamhet

  1. sekventiell resonans tilldelning
    1. inrätta en 2D 13 C - 13 C proton-driven spin diffusion (PDSD) 41 experimentera för att upptäcka intra-rester 13 C - 13 C korrelationer, inklusive sida kedjor. Ta över värden för det inledande 1 H - 13 C cross-polarisering steget från 1 D 1 H - 13 C CP experiment.
      1. Ställa in blandande tiden till 50 ms för enhetligt 13 C-märkta prover och 100 ms för selektivt 13 C-märkta prover. Ställ in indirekta förvärvet tiden mellan 5-25 ms och gör direkta förvärv mellan 15-25 ms beroende på inneboende spektral upplösning, som kan uppskattas av synliga signalen i gratis induktion Decay (FID) längd (exemplifieras i figur 3A).
      2. Testa flera bearbetningsparametrar för att hitta optimala värden med avseende på signal-brus- och upplösning i spektrumet, vanligtvis lämplig behandling kan uppnås med en qsine fönster funktion med en sinus bell Skift (SSB) för 2,5-4.
    2. Uppsättning upp, post och processen en 2D 13 C - 13 C PDSD med ett experiment med mellanliggande blandning i tid att upptäcka sekventiell 13 C - 13 C korrelationer ansluta mestadels i - i±1, men också i±2 och i±3 rester, beroende på protein ryggraden styvhet och sekundärt strukturera element. Blandningstid ska ställas in mellan 100-200 ms för enhetligt märkta prover. Alla andra värden kan tas över från den korta blandning tid 2D 13 C - 13 C PDSD.
    3. , Som posten och processen en 2D 15 N - 13 C N jag CA jag och N jag CO jag experimentera med en CP 1 H - 15 N och en specifik CP 15 N - 13 C överföring 42. optimera 15 N - 13 C polarisering överföringen i en 1 D-mode direkt på prov av intresse, baserat på maximal intensitet i regionen CA eller karbonyl, respektive. RöksmakCal värden för specifika CP kontakttiden är mellan 2-6 ms.
    4. inrättas, post och process som en serie 2D 15 N-(13 C-) 13 C experiment för syftet tilldelning.
      Obs: Första 15 N - 13 C polarisering överföring parametervärdet kan tas över från den N jag CA jag / N jag CO jag experiment. Intra-rester korrelationer är etablerade från N jag (CA jag) CB jag och N jag (CA jag) CO jag, med hjälp av respektive drömmer 43 och PDSD 13 C - 13 C polarisering överföringar. Rester (i) att rester (i-1) sekventiella anslutning erhålls från N jag (CO -1) CA -1 och N jag (CO -1) CX -1 experiment, båda med en PDSD 13 C - 13 C polarisering överföring.
    5. Välj ett NMR analysprogram som CcpNmr analys 44 eller SPARKY 45
    6. Läsa 2D spektra i programvaran (exemplifieras med CcpNmr analys) och ladda den primära proteinsekvens.
    7. Börja med identifiering av de amino syran typerna synliga i kort-blandning 13 C - 13 C PDSD spektrum. Anslut kolatomerna spinn system som möjliggör den " rester-typ " viss tilldelning; Se figur 4A för tilldelning av treonin rester. Identifiera så många rester som möjligt. Detta beror på protein subenhet storlek, spektral upplösning och dispersion.
    8. Overlay kort-blandning med intermediär-blandning 13 C - 13 C PDSD spektrumet.
      Obs: De kompletterande topparna som är synliga i den mellanliggande-blandning PDSD uppstår främst från sekventiell (rester i - rester i±1) kontakter. Ett exempel för en två-rester sekventiell tilldelning illustreras i figur 4B.
      1. Markera resonans topparna av ett spinn system och hitta korrelationer i den mellanliggande-blandning PDSD med resonansfrekvenser andra spin system. I små proteiner eller peptider, kan det vara möjligt att uppnå hela sekventiell resonans tilldelning baserat på 2D 13 C - 13 C PDSD experiment.
        Observera: I β-strand sekundärt strukturera motiv rester i - rester i±2 13 C - 13 C kontakter kan visa mer intensiv signaler än sekventiell kontakter på grund av sin närhet i rymden; i α-spiralformade sekundärt strukturera motiv rester i - rester i±3 13 C - 13 C kontakter kan också leda till intensiv signaler.
    9. Om intermediär-blandning PDSD experiment på selektivt 13 C-märkta prover finns tillgängliga, overlay dem på kort-blandning spektrumet (om detta finns på den selektivt 13 C-märkta prov) och tilldela kompletterande toppar, med hänsyn till selektiv 13 C märkning mönster (1,3 - 13 C och 2 - 13 C glycerol 32 , 33 eller 1 - 13 C och 2 13 C glukos 29 , 30 , 31.
      Obs: till exempel i en 2 - 13 C glycerol märkt provet flera aminosyra typer är märkt på den Cα ståndpunkten utan de intilliggande kolatomer (Cβ och C ') märkt, därför gynnar den Cα-Cα överföra mellan intilliggande rester. I selektivt märkt prover, kan långväga 13 C - 13 C korrelationer bygga upp redan i intermediär-blandning 13 C - 13 C PDSD experiment. Om en topp inte kan förklaras av en sekventiell korrelation, kunde det uppstå en långväga kontakt. För mycket beställt homogen subenhet strukturer i makromolekylära sammansättningen, är endast en uppsättning av resonanser väntat till vara synlig i spektra. Om fördubblats (eller ytterligare multiplicerade) resonanser är synliga för 13 C atomer eller protein ryggraden sträckor, två (eller fler) konformationer för Atomen eller sträckan primära sekvens i församlingen, respektive finns.
    10. Använda 2D NCA spektrumet som innehåller intra-rester 15 N - 13 Cα korrelationer för att identifiera 15 N resonansfrekvenser för varje rester. Om upplösningen i dimensionen 13 C inte är tillräcklig, använda den kompletterande informationen om Cβ resonans i den 2D NCACB för att identifiera den intra-rester 15 N resonansfrekvensen.
    11. Använder 2D NCACB och NCACO spectra som innehåller intra-rester 15 N - 13 C - 13 C korrelationer (i) identifiera intra-rester 15 N frekvensen och (ii) att lösa tvetydigheter i 13 C - 13 C PDSD med hjälp av dimensionen ytterligare 15 N. Inversionen av signalen på grund av dröm överföringen leder till observation av typiska Cα-Cβ korrelationer som Cα signalen är positiva och negativa Cβ signal. Ytterligare sidokedjan 13 C, om synliga i spektrumet, är positiva igen.

Figure 4
figur 4: 2-dimensionella 13 C - 13 C SSNMR PDSD experiment på en välordnad, enhetligt 13 C, 15 N-märkt protein församling. (A) kort blandning tid PDSD (50 ms blandning). (B) tilldelningen av 2-rester sträckan Ile32 - Thr33 med överlagring av den kort blandningstid PDSD med en lång blandningstid PDSD (200 ms blandning). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. sekundära strukturbestämning
    1. använda 13 Cα, 13 Cβ Kemisk förskjutning värden att beräkna den sekundära kemiskt Skift 46 ΔδCα-ΔδCβ , tyder på det sekundära strukturerar. Beräkna 13 Cα(assigned) - 13 Cα (random coil) och 13 Cβ(assigned) - 13 Cβ (random coil).
      Obs: Kemisk förskjutning värden för resthalter i slumpmässig spole konformation kan erhållas från 38.
      1. Handling ΔδCα-ΔδCβ, negativa eller positiva värden för > 3 rester i rad anger β-strand eller α-spiralformade konformation respektive; glycin och prolin rester kan visa ovanlig kemisk förskjutning värden, som de fungerar ofta som " sekundärt strukturera breakers ".
    2. Förutsäga protein tvåplansvinkel vinklarna från de tilldelade kemiska förskjutningarna använder TALOS + 47 , 48 eller PREDITOR 49 , 50. De förutspådda Phi/Psi tvåplansvinkel vinklarna återspeglar det sekundära strukturerar av den protein-Jannenit och används som strukturella begränsningar i hela modellprocessen.
  2. Samling av strukturella begränsningar
    1. ställa upp och spela in en 2D 13 C - 13 C PDSD experiment med en lång blandningstid att upptäcka långväga 13 C - 13 C korrelationer. Typisk blandning gånger varierar från 400 ms till 1 s. använda selektivt 13 C-märkta prover, som spin utspädning avsevärt förbättrar polarisering överföringen bland avlägsna kolatomer.
    2. Overlay lång-blandning 2D 13 C - 13 C PDSD registreras på selektivt märkt prov på den mellanliggande-blandning 13 C - 13 C PDSD, om möjligt registreras på samma selektivt märkt prov. Kompletterande toppar uppkommer korrelationer mellan mer avlägsna 13 C-atomer. Under tilldelning av resonans, ta hänsyn till den selektiva etikettschema.
    3. Noggrant utvärdera resolutionen av spektrumet att definiera en tolerans tilldelningsfönstret, dvs beroende av spektral upplösning resonanser i vissa ppm olika kan bidra till signalen. Standardavvikelsen för tilldelning precisionen beräknas automatiskt i NMR tilldelning program såsom CcpNmr analys eller SPARKY.
    4. Om en signal kan förklaras av en sekventiell (rester i - rester i±1) eller en medium-range 13 C - 13 C kontakt (rester i - rester jag ± 2, 3 eller 4), upprätthålla detta uppdrag sedan relälänkar polarisering överföring kan förklara den korrelation även om 13 C - 13 C avståndet överstiger det förväntade synliga kontakt intervallet.
    5. Klassificera tilldelningar av långväga 13 C - 13 C kontakter till frekvens entydiga och tvetydiga signaler. När det gäller frekvens entydiga uppdrag, endast en resonans uppdraget är möjligt med avseende på tolerans tilldelningsfönstret.
      Obs: Tvetydig uppdrag innehåller alla möjliga resonans tilldelningar i fönstret tolerans. Tvetydigheterna kan lyftas samtidigt under struktur beräkningen av iterativa rundor av svenskspråkiga baserat på preliminära strukturer beräknas endast de otvetydiga begränsningarna, som utförs i computational rutiner såsom ARIA 51 eller UNIO 52. Dessutom att strukturella data från olika biofysiska källor (t.ex. muterat eller trunkeras subenhet struktur genom lösning NMR eller röntgenkristallografi, mass-per-längd mätningar, cryo-EM karta) kan också användas för att minska nivån på tvetydighet, för exempel se 1 , 3 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58.
  3. upptäckt av intermolekylära avståndet begränsningar i en symmetrisk protein församling
    1. inrätta en 2D 15 N - 13 C smärta-CP 59 experiment på en blandad (50/50) U - 15 N - / U - 13 C-märkt provet. Signaler som upptäckts på smärta-CP spektrumet bör uppstå mellan molekylär 15 N - 13 C anslutning. Använda tidigare tilldelade resonanser för att utföra tilldelningen av de intermolekylära kontakterna.
    2. Ställa in en 2D 13 C - 13 C PDSD med en lång blandningstid (> 600 ms) på ett (50/50) blandat (1,3 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-glycerol eller (1 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-glukos provet.
      Obs: Signaler detekteras i detta 13 C - 13 C spektrum uppkommer inom molekylär och mellan molekylär 13 C - 13 C anslutning. Hög komplementariteten mellan de två systemen för märkning kan dock viss resonans par otvetydigt uppkommer mellan molekylär kontakter, t.ex. en serin certifikatutfärdare i den (2 - 13 C)-glukos märkt subenheter som korrelerar en serin CB i den (1 - 13 C)-glukos märkt subenheter.
      1. Overlay spectrumen av 2D 13 C - 13 C spektra blandade provet registreras på homogeneously märkt prover ((1,3-13C) - och (2 - 13 C)-glycerol eller (1 - 13 C)- och (2 - 13 C)-glukos märkt prover). Ytterligare signaler i det spektrum som registreras på blandade prov bör uppkomma mellan molekylära interaktioner.
  4. Struktur modellering från SSNMR data
    1. förbereda SSNMR återhållsamhet listorna behövs för beräkningen av strukturen: (1) proteinsekvens; (2) inom molekylär otvetydigt avstånd begränsningar; (3) inom molekylär tvetydiga avstånd begränsningar; (4) TALOS-baserade tvåplansvinkel vinkel begränsningar; (5) mellan molekylär otvetydigt avstånd begränsningar; (6) mellan molekylär tvetydiga avstånd begränsningar; (7) ytterligare data från andra biofysiska tekniker (t.ex. massa-per-längd, symmetri parametrar).
    2. Flera recensioner ge insikter i struktur modellering baserad på SSNMR data och i samband med kompletterande grunddata 14 , 60 , 15 , 19 , 61 , 62 Obs att de tvetydiga avstånd begränsningarna kan göras otvetydiga under struktur beräkning avseende preliminärt strukturella modeller baserade på otvetydigt avstånd begränsningar. För att säkerställa struktur noggrannhet, noggrant observera om strukturen konvergerar till en enda fålla.

Figure 5
figur 5 : Intra - och intermolekylära kontakter i symmetriska protein församlingar. Schematisk bild av intra - vs. intermolekylära 13 C - 13 C långväga kontakter i en spiralformad makromolekylära församling. Subunitsna är färgade i vitt och rött att illustrera blandade märkning av subunitsna; dvs innan montering en 1:1 blandning av två olika märkning system utfördes (t.ex. 1 - 13 C glukos och 1 - 13 C glukos). A) intramolekylära 13 C - 13 C långväga kontakter (blå streckad pil); B) intermolekylära 13 C - 13 C långväga kontakter (röd streckade pilar). vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Representative Results

Typiska SSNMR arbetsflödet innehåller flera steg illustreras i figur 1. Vanligtvis proteinsubenheter produceras av in vitro- heterologa uttryck i E. coli, renat och monterade under skakning men ibland även under statiska förhållanden. Uttryck och rening av den protein-subenheten följs av SDS gel kromatografi (figur 2A). Bildandet av makromolekylära församlingar kan sedan bekräftas genom elektronmikroskopi (EM) analys (se figur 2B ett exempel på en trådformiga församling).

Efter införandet av den protein-församlingen i SSNMR rotorn, rotorn sätts in spektrometern, MAS frekvens och temperatur regleras och spektra registreras. Första insikter kan erhållas genom 1D SSNMR tekniker. Figur 3 visar en typisk SSNMR FID upptäckts på 13C kanal på ett strukturellt homogen protein prov, ett 1H13C CP spektrum, avslöjar13C resonanser i styv kärna ur av den protein-subenheten i den montering och ett 2D 1H -13C olämplig spektrum, som representerar de mobila resterna. För atom insikter sammansättningsstrukturen styv kärna måste flerdimensionella SSNMR experiment registreras på jämnt och selektivt märkt prover för att tilldela först SSNMR resonanser och sedan upptäcka långväga anslutning (se figur 4 ).

Alla spectra bearbetas och analyseras med lämplig programvara för att tilldela SSNMR resonanser och extrahera intra- och intermolekylära avståndet begränsningar (figur 5). SSNMR avstånd begränsningar används antingen ensamt eller tillsammans med data från kompletterande tekniker, som kan integreras i programmet modellering.

För representativa atomära strukturer av makromolekylära församlingar löst genom SSNMR tekniker illustrerar figur 6 flera fintrådiga församlingar från bakteriell bihang och amyloida fibriller.

Figure 6
Figur 6:fintrådiga makromolekylära strukturer bestäms av en solid-state NMR-strategi: bakteriell filament och amyloid protein fibriller. A) typ1 pilus av uropathogenic E. coli, PDB kod 2N7H 4; B) ASC glödtråden, PDB kod 2N1F 63; C) typ III sekretion system nålar, PDB koder 2MME, 2LPZ och 2MEX 2,3,64; D) Amyloid-beta AB42 fibriller, PDB kod 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 och Osaka mutant PDB kod 2MVX 57, Iowa mutant PDB kod 2MPZ 58; E) alfa-synuklein fibriller, PDB kod 2N0A 68; F) HET-s prion domän, PDB kod 2RNM, 2KJ3 69,70. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Solid-State NMR (SSNMR) är en metod för val av kännetecknar makromolekylära protein aggregat på atomär nivå. En av de centrala frågorna i SSNMR-baserade strukturbestämning är den spektrala kvaliteten på det undersökta systemet, som tillåter att fastställa 3D strukturella modeller av olika precision, vanligtvis alltifrån lågupplösta modeller (som innehåller sekundärt strukturera element och lite 3D-information) till pseudo Atom 3D-strukturer. Kvantitet och kvalitet av strukturella uppgifter ur flerdimensionella SSNMR experiment är nyckeln till att beräkna en högupplösande NMR struktur av församlingen.

Protokollet beskrivs bygger på detektion av 13C -13C och 15N -13C strukturella begränsningar som kräver inspelning av flera 2D (och ibland 3D) spectra med hög signal-brus. Vid måttlig MAS frekvenser (< 25 kHz), provet införs i rotorer med storlekar 3,2-4 mm diameter möjliggör protein mängder upp till ~ 50 mg, beroende på provet hydratisering. Mängden prov släpper rotorn är direkt proportionell mot signal-brus-förhållande i SSNMR spectra, en avgörande faktor för detektion av långväga avstånd begränsningar och deras entydig tilldelning.

Den spektrala upplösningen är en avgörande parameter under sekventiell resonans uppdraget och samlingen begränsningar. För optimala resultat, måste provet beredning parametrarna optimeras, särskilt vid rening av subuniten och församlingen villkoren (pH, buffert, skakningar, temperatur, etc.). För prov optimering rekommenderas det att förbereda omärkt prover för flera skilda villkor som församlingen har observerats, och att spela in en 1D 1H -13C CP spektrum (som beskrivs i steg 2.1) på varje beredda provet. Spektra tjäna till att jämföra spektral upplösning och spridning mellan de olika förberedelserna, utifrån vilket de optimala förutsättningarna kan bestämmas.

Kvaliteten på uppgifter som SSNMR är starkt beroende av valet av NMR förvärv parametrar, särskilt för polarisering överföring stegen. Användningen av hög magnetisk fältstyrka (≥600 MHz 1H frekvens) är viktigt för hög känslighet och spektral upplösning, krävs när man står inför komplexa mål såsom makromolekylära protein församlingar.

En begränsande faktor i många fall är spektrometer tillgången. Ett klokt val av proverna förberedas bör därför föregå spektrometer sessionen. I alla fall, ett enhetligt 13C, 15N-märkt prov är en förutsättning för att utföra sekventiella och intra kvarstående resonans uppdraget. Proteiner som tilldelats av solid-state NMR tekniker finns71. Strukturbestämning av makromolekylära församlingar vid måttlig MAS frekvenser kräver selektivt 13C-märkta prover; för detektion av långväga 13C -13C och 13C -15N kontakter prover baserat på 1,3 -13C- och 2 -13C-gylcerol eller 1 -13C- och 2 -13C-glukos märkning är vanligen används, som beskrivs ovan. Valet mellan de två systemen för märkning är baserad på den spektrala signal-brus-förhållande och upplösning. För att skilja mellan intra- och intermolekylära långväga kontakter, har blandade märkta och utspädda prover visat effektiv.

Kort sagt, de kritiska steg för en atom SSNMR strukturella studie är: (i) beredning av subunitsna och församlingen behöver optimeras att få utmärkta prov kvantitet och kvalitet, (ii) spektrometer fältet parametrar för styrka och förvärvet måste vara valt noggrant; (iii) selektiv märkning strategier krävs för en 3D strukturbestämning och mängden data som krävs beror på uppgifternas kvalitet och tillgänglighet för kompletterande data.

Trots dess tillämplighet på ett brett utbud av Supramolekylära system alltifrån membranproteiner till homomultimeric nano-objekt, begränsas SSNMR ofta av behovet av mg-mängder av isotopically märkt material. Den senaste tekniska utvecklingen i ultrasnabb MAS (≥100 kHz) SSNMR öppnar upp för avenyn 1H-upptäckt NMR, och push gränsen för minimal prov kvantitet till sub-mg 72,73,74. Dock för detaljerade strukturella studier är 13C-märkta prover oumbärlig, som begränsar tillämpningen av SSNMR till prover som samlats in vitro- eller system uttrycks i organismer som överlever på minimalmedium där i cell SSNMR är en framväxande metod (för recensioner se 75,76,77,78).

En viktig faktor i SSNMR för att få högupplösta 3D-strukturer är den spektrala upplösningen: inneboende konfirmerande heterogenitet i en församling kan begränsa upplösning och spectra spektralanalys. Rester specifika 13C märkning kan i vissa fall utgöra ett alternativ att erhålla visst avståndsinformation om strategiska rester för att erhålla strukturella modeller (för en senaste exempel se 79,80).

SSNMR för bestämning av 3D-strukturen fortfarande kräver insamling av flera datamängder med ofta lång data collection gånger på sofistikerade instrument, beroende på metoden och systemet flera dagar till veckor på en 600-1000 MHz (1H frekvens) spektrometer. Därför kan tillgång till spektrometer tid vara en begränsande faktor i en fördjupningsstudie SSNMR.

När det gäller homomultimeric protein församlingar, leder till SSNMR data av tillräcklig kvalitet för att identifiera ett stort antal strukturella begränsningar såsom i 3,57,64,70, SSNMR ger fortfarande ingen tillgång till mikroskopiska mått. Därför i de novo SSNMR struktur fastställande av en homomultimeric församling komplement EM eller mass-per-längd (MPL) data idealiskt SSNMR data för att härleda parametrarna symmetri. SSNMR data enbart ge Atom intra- och intermolekylära gränssnitt

SSNMR är mycket kompletterande med strukturella tekniker såsom EM eller MPL mätningar men data kan också perfekt kombineras med atomära strukturer erhålls genom röntgenkristallografi eller lösning NMR på muterade eller trunkerade subenheter. Ett ökande antal studier kan hittas i litteraturen där konjunktionen av olika strukturella data har tillåtit för att bestämma Atom 3D-modeller av makromolekylära sammansättningar (se figur 6 för representativa exempel).

I fältet för strukturbiologi, SSNMR dyker upp som lovande teknik för att studeraolösliga och icke-kristallin församlingar på atomär nivå, dvs ge strukturella data på den atomära skalan. SSNMR är i detta avseende, hängande lösning NMR och röntgenkristallografi för molekylär sammansättningar, inklusive membranproteiner i deras infödda miljö och protein församlingar såsom viral kuvert, bakteriell filament eller amyloid, samt RNA och RNA-proteinkomplex (se till exempel81). Dess mångsidiga applikationer i vitro och i det cellulära sammanhanget, såsom spårning sekundär, tertiär och Kvartär strukturella förändringar, identifiera interaktion ytor med partner molekyler på den atomära skalan (till exempel 82) och kartläggning molekylär dynamik i samband med monterade komplex, ange SSNMR viktig potential i framtida strukturella studier av komplexa Biomolekylär församlingar.

Komponent M9 medium
NaCl 0,5 g/L
KH2PO4 3 g/L
Na2HPO4 6,7 g/L
MgSO4 1 mM
ZnCl2 10 ΜM
FeCl3 1 ΜM
CaCl2 100 ΜM
MEM vitamin mix 100 X 10 mL/L
13 C-glukos 2 g/L
15 NH4Cl 1 g/L

Tabell 1: Sammansättningen av minimal uttryck medium för rekombinant protein produktion i E. coli BL21 celler.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete finansieras av ANR (13-PDOC-0017-01 att B.H. och ANR-14-CE09-0020-01 att A.L.), ”investeringar för framtiden” programmet IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 att B.H.) referera ANR-10-IDEX-03-02 till B.H., Fondation pour la Recherche Médicale) FRM-AJE20140630090 att A.L.), FP7 programmet (FP7-personer-2013-CIG att A.L.) och den Europeiska forskningsrådet (ERC) under EU: s Horizon 2020 forskning och innovation-programmet (ERC Starting Grant att A.L., avtal nr 639020) och projektet ” WEAKINTERACT ”.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments
NMR Spectrometer (> 11.7 Tesla) Bruker -
triple resonance MAS SSNMR probehead  Bruker -
SSNMR rotors 4mm Bruker K1910
Centrifuge 5804 R  Eppendorf 5805000629
GeneQuant 1300 spectrometer Dutscher 28-9182-13
IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L Dutscher 228001
MaxQ 4450 bench top orbital shaker Dutscher 78376
Tube Revolver Agitator Dutscher 79547
sonopuls HD 3100 Bandelin 3680
MicroPulser electroporator Biorad 165-2100 
mini-PROTEAN tetra cell system Biorad 165-8000
AKTA pure system GE Healthcare 29-0182-24
capillary microman M25 pipet Gilson  F148502
Name Company Catalog Number Comments
Materials
amiconR ultra-15 sigma Z740199-8EA
capillaries and pistons Gilson  F148112
spatula Fisher 13263799
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
D-glucose 13C6 Sigma 389374
Ammonium-15N-chloride Sigma 299251
1,3 13C2 glycerol Sigma 492639
2 13C glycerol Sigma 489484
Kanamycin Sigma K1876
Carbenicillin Sigma C3416
Sodium phosphate dibasic Sigma S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655
Sodium chloride Sigma 71380
calcium chloride Sigma C1016
Magnesium sulfate Sigma 208094
Iron Chloride Sigma 157740
Zinc chloride Sigma 793523
MEM Vitamin Solution (100×) Sigma M68954
IPTG Fisher BP1755
Trizma base  Sigma T1503
Tricine Sigma T0377
SDS Sigma 436143
sodium azide sigma 71289
4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid  Sigma 178837
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
Unicorn 6.3 GE Healthcare Akta systems
ccpNMR CCPN  spectrometer systems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morag, O., Sgourakis, N. G., Baker, D., Goldbourt, A. The NMR-Rosetta capsid model of M13 bacteriophage reveals a quadrupled hydrophobic packing epitope. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 971-976 (2015).
  2. Loquet, A., et al. Atomic model of the type III secretion system needle. Nature. 486 (7402), 276-279 (2012).
  3. Demers, J. P., et al. High-resolution structure of the Shigella type-III secretion needle by solid-state NMR and cryo-electron microscopy. Nat Commun. 5 (4976), (2014).
  4. Habenstein, B., et al. Hybrid Structure of the Type 1 Pilus of Uropathogenic Escherichia coli. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (40), 11691-11695 (2015).
  5. Cady, S. D., et al. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463 (7281), 689-692 (2010).
  6. Park, S. H., et al. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491 (7426), 779-783 (2012).
  7. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 649-652 (2015).
  8. Wang, S., et al. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nat Methods. 10 (10), 1007-1012 (2013).
  9. Daskalov, A., et al. Signal transduction by a fungal NOD-like receptor based on propagation of a prion amyloid fold. PLoS Biol. 13 (2), e1002059 (2015).
  10. Daskalov, A., et al. Identification of a novel cell death-inducing domain reveals that fungal amyloid-controlled cell death is related to necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2016).
  11. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  12. Knowles, T. P., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (6), 384-396 (2014).
  13. Aguzzi, A., Lakkaraju, A. K. Cell Biology of Prions and Prionoids: A Status Report. Trends Cell Biol. 26 (1), 40-51 (2016).
  14. Habenstein, B., Loquet, A. Solid-state NMR: An emerging technique in structural biology of self-assemblies. Biophys Chem. , (2015).
  15. Meier, B. H., Bockmann, A. The structure of fibrils from 'misfolded' proteins. Curr Opin Struct Biol. 30, 43-49 (2015).
  16. Miao, Y., Cross, T. A. Solid state NMR and protein-protein interactions in membranes. Curr Opin Struct Biol. 23 (6), 919-928 (2013).
  17. Tang, M., Comellas, G., Rienstra, C. M. Advanced solid-state NMR approaches for structure determination of membrane proteins and amyloid fibrils. Acc Chem Res. 46 (9), 2080-2088 (2013).
  18. Weingarth, M., Baldus, M. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Acc Chem Res. 46 (9), 2037-2046 (2013).
  19. Loquet, A., Habenstein, B., Lange, A. Structural investigations of molecular machines by solid-state NMR. Acc Chem Res. 46 (9), 2070-2079 (2013).
  20. Yan, S., Suiter, C. L., Hou, G., Zhang, H., Polenova, T. Probing structure and dynamics of protein assemblies by magic angle spinning NMR spectroscopy. Acc Chem Res. 46 (9), 2047-2058 (2013).
  21. Tycko, R., Wickner, R. B. Molecular structures of amyloid and prion fibrils: consensus versus controversy. Acc Chem Res. 46 (7), 1487-1496 (2013).
  22. Hong, M., Zhang, Y., Hu, F. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annu Rev Phys Chem. 63, 1-24 (2012).
  23. Jelinek, R., Ramamoorthy, A., Opella, S. J. High-Resolution Three-Dimensional Solid-state NMR Spectroscopy of a Uniformly 15N-Labeled Protein. J Am Chem Soc. 117, 12348-12349 (1995).
  24. Xu, J., et al. Bicelle-enabled structural studies on a membrane-associated cytochrome B5 by solid-state MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (41), 7864-7867 (2008).
  25. Durr, U. H., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem Rev. 112 (11), 6054-6074 (2012).
  26. Yamamoto, K., et al. Probing the transmembrane structure and topology of microsomal cytochrome-p450 by solid-state NMR on temperature-resistant bicelles. Sci Rep. 3, 2556 (2013).
  27. Huang, R., et al. Probing the transmembrane structure and dynamics of microsomal NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase by solid-state NMR. Biophys J. 106 (10), 2126-2133 (2014).
  28. Durr, U. H., Yamamoto, K., Im, S. C., Waskell, L., Ramamoorthy, A. Solid-state NMR reveals structural and dynamical properties of a membrane-anchored electron-carrier protein, cytochrome b5. J Am Chem Soc. 129 (21), 6670-6671 (2007).
  29. Hong, M. Determination of multiple phi-torsion angles in proteins by selective and extensive (13)C labeling and two-dimensional solid-state NMR. J Magn Reson. 139 (2), 389-401 (1999).
  30. Lundstrom, P., et al. Fractional 13C enrichment of isolated carbons using [1-13C]- or [2- 13C]-glucose facilitates the accurate measurement of dynamics at backbone Calpha and side-chain methyl positions in proteins. J Biomol NMR. 38 (3), 199-212 (2007).
  31. Loquet, A., Lv, G., Giller, K., Becker, S., Lange, A. 13C spin dilution for simplified and complete solid-state NMR resonance assignment of insoluble biological assemblies. J Am Chem Soc. 133 (13), 4722-4725 (2011).
  32. Castellani, F., et al. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Nature. 420 (6911), 98-102 (2002).
  33. Higman, V. A., et al. Assigning large proteins in the solid state: a MAS NMR resonance assignment strategy using selectively and extensively 13C-labelled proteins. J Biomol NMR. 44 (4), 245-260 (2009).
  34. Bockmann, A., et al. Characterization of different water pools in solid-state NMR protein samples. J Biomol NMR. 45 (3), 319-327 (2009).
  35. Cavanagh, J., Fairbrother, W. J., Palmer, A. G., Skelton, N. J. Protein NMR spectroscopy, principles and practice. , Academic. San Diego. (1996).
  36. Hartman, S. R., Hahn, E. L. Nuclear Double Resonance in the Rotating Frame. Phys Rev. 128 (5), 2042-2053 (1962).
  37. Harris, R. K., et al. Further conventions for NMR shielding and chemical shifts IUPAC recommendations 2008. Solid State Nucl Magn Reson. 33 (3), 41-56 (2008).
  38. Wang, Y., Jardetzky, O. Probability-based protein secondary structure identification using combined NMR chemical-shift data. Protein Sci. 11 (4), 852-861 (2002).
  39. Shaka, A. J., Baker, P. B., Freeman, R. Computer-Optimized Scheme for Wideband Applications and Low-Level Operation. J Magn Reson. 64, 547-552 (1985).
  40. BMRB - Biological Magnetic Resonance Bank. , http://bmrb.wisc.edu/ (2017).
  41. Szeverenyi, N. M., Sullivan, M. J., Maciel, G. E. Observation of Spin Exchange by Two-Dimensional Fourier-Transform C-13 Cross Polarization-Magic-Angle Spinning. J Magn Reson. 47, 462-475 (1982).
  42. Baldus, M., Petkova, A. T., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Mol Phys. 95 (5), 1197-1207 (1998).
  43. Verel, R., Ernst, M., Meier, B. H. Adiabatic dipolar recoupling in solid-state NMR: the DREAM scheme. J Magn Reson. 150 (1), 81-99 (2001).
  44. CcpNmr Analysis — Collaborative Computational Project for NMR. , http://www.ccpn.ac.uk/software/analysis (2017).
  45. Sparky - NMR Assignment and Integration Software. , https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ (2017).
  46. Luca, S., et al. Secondary chemical shifts in immobilized peptides and proteins: a qualitative basis for structure refinement under magic angle spinning. J Biomol NMR. 20 (4), 325-331 (2001).
  47. TALOS+: Prediction of Protein Backbone Torsion Angles from NMR Chemical Shift. , http://spin.niddk.nih.gov/bax/software/TALOS/ (2017).
  48. Shen, Y., Bax, A. SPARTA+: a modest improvement in empirical NMR chemical shift prediction by means of an artificial neural network. J Biomol NMR. 48 (1), 13-22 (2010).
  49. SHIFTOR Dihedral angles from chemical shifts and homology. , http://wishart.biology.ualberta.ca/shiftor/ (2017).
  50. Berjanskii, M. V., Neal, S., Wishart, D. S. PREDITOR: a web server for predicting protein torsion angle restraints. Nucleic Acids Res. 34 (Web Server issue), W63-W69 (2006).
  51. Bardiaux, B., Malliavin, T., Nilges, M. ARIA for solution and solid-state NMR. Methods Mol Biol. 831, 453-483 (2012).
  52. Guerry, P., Herrmann, T. Comprehensive automation for NMR structure determination of proteins. Methods Mol Biol. 831, 429-451 (2012).
  53. Vasa, S., et al. beta-Helical architecture of cytoskeletal bactofilin filaments revealed by solid-state NMR. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (2), E127-E136 (2015).
  54. He, L., et al. Structure determination of helical filaments by solid-state NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (3), E272-E281 (2016).
  55. Tang, M., et al. High-resolution membrane protein structure by joint calculations with solid-state NMR and X-ray experimental data. J Biomol NMR. 51 (3), 227-233 (2011).
  56. Paravastu, A. K., Leapman, R. D., Yau, W. M., Tycko, R. Molecular structural basis for polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18349-18354 (2008).
  57. Schutz, A. K., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of amyloid beta fibrils bearing the Osaka mutation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 331-335 (2015).
  58. Sgourakis, N. G., Yau, W. M., Qiang, W. Modeling an in-register, parallel "iowa" abeta fibril structure using solid-state NMR data from labeled samples with rosetta. Structure. 23 (1), 216-227 (2015).
  59. Lewandowski, J. R., De Paepe, G., Griffin, R. G. Proton assisted insensitive nuclei cross polarization. J Am Chem Soc. 129 (4), 728-729 (2007).
  60. Carlon, A., et al. How to tackle protein structural data from solution and solid state: An integrated approach. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 92-93, 54-70 (2016).
  61. Judge, P. J., Taylor, G. F., Dannatt, H. R., Watts, A. Solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy for membrane protein structure determination. Methods Mol Biol. 1261, 331-347 (2015).
  62. Wang, S., Ladizhansky, V. Recent advances in magic angle spinning solid state NMR of membrane proteins. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 82, 1-26 (2014).
  63. Sborgi, L., et al. Structure and assembly of the mouse ASC inflammasome by combined NMR spectroscopy and cryo-electron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (43), 13237-13242 (2015).
  64. Loquet, A., et al. Atomic structure and handedness of the building block of a biological assembly. J Am Chem Soc. 135 (51), 19135-19138 (2013).
  65. Walti, M. A., et al. Atomic-resolution structure of a disease-relevant Abeta(1-42) amyloid fibril. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4976-E4984 (2016).
  66. Colvin, M. T., et al. Atomic Resolution Structure of Monomorphic Abeta42 Amyloid Fibrils. J Am Chem Soc. 138 (30), 9663-9674 (2016).
  67. Xiao, Y., et al. Abeta(1-42) fibril structure illuminates self-recognition and replication of amyloid in Alzheimer's disease. Nat Struct Mol Biol. 22 (6), 499-505 (2015).
  68. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human alpha-synuclein. Nat Struct Mol Biol. 23 (5), 409-415 (2016).
  69. Wasmer, C., et al. Amyloid fibrils of the HET-s(218-289) prion form a beta solenoid with a triangular hydrophobic core. Science. 319 (5869), 1523-1526 (2008).
  70. Van Melckebeke, H., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of HET-s(218-289) amyloid fibrils by solid-state NMR spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (39), 13765-13775 (2010).
  71. BMRB Solid-state NMR entries. , http://www.bmrb.wisc.edu/data_library/solidstate.shtml (2017).
  72. Lamley, J. M., et al. Solid-state NMR of a protein in a precipitated complex with a full-length antibody. J Am Chem Soc. 136 (48), 16800-16806 (2014).
  73. Agarwal, V., et al. De novo 3D structure determination from sub-milligram protein samples by solid-state 100 kHz MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (45), 12253-12256 (2014).
  74. Stanek, J., et al. NMR Spectroscopic Assignment of Backbone and Side-Chain Protons in Fully Protonated Proteins: Microcrystals, Sedimented Assemblies, and Amyloid Fibrils. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (50), 15504-15509 (2016).
  75. Baker, L. A., Baldus, M. Characterization of membrane protein function by solid-state NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 27, 48-55 (2014).
  76. Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4 (Pt 2), 108-118 (2017).
  77. Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annu Rev Biophys. 43, 171-192 (2014).
  78. Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
  79. Qiang, W., Yau, W. M., Luo, Y., Mattson, M. P., Tycko, R. Antiparallel beta-sheet architecture in Iowa-mutant beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4443-4448 (2012).
  80. Bateman, D. A., Tycko, R., Wickner, R. B. Experimentally derived structural constraints for amyloid fibrils of wild-type transthyretin. Biophys J. 101 (10), 2485-2492 (2011).
  81. Marchanka, A., Simon, B., Althoff-Ospelt, G., Carlomagno, T. RNA structure determination by solid-state NMR spectroscopy. Nat Commun. 6, 7024 (2015).
  82. Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (26), 5956-5960 (2011).

Tags

Problemet 127 makromolekylära församlingar strukturbiologi biokemi nukleär magnetisk resonans SSD NMR magi-vinkel spinning self-församlingar proteinkomplex amyloida fibriller bakteriell filament
Atomär skala strukturella studier av makromolekylära sammansättningar av Solid-state kärnmagnetisk resonans-spektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Loquet, A., Tolchard, J., Berbon,… More

Loquet, A., Tolchard, J., Berbon, M., Martinez, D., Habenstein, B. Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. J. Vis. Exp. (127), e55779, doi:10.3791/55779 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter