Summary
يوفر هذا البروتوكول تحليلا للقطاعات السكانية البلاعم في الماوس الكبار الجهاز العصبي المركزي عن طريق التدفق الخلوي ومفيد لدراسة علامات متعددة التي أعربت عنها هذه الخلايا.
Abstract
وقد أظهرت دراسات عديدة دور الخلايا المناعية، وخاصة الضامة، في الجهاز العصبي المركزي (نس) الأمراض. هناك نوعان من البلاعم الرئيسية في الجهاز العصبي المركزي: (1) الخلايا الدبقية الصغيرة، والتي هي الضامة المقيمين من الجهاز العصبي المركزي وتستمد من أسلاف الكيس المحي خلال التطور الجنيني، و (2) الضامة المستمدة الوحيدات (مدم)، والتي يمكن أن تتسلل الجهاز العصبي المركزي أثناء المرض وتستمد من الأسلاف نخاع العظم. الأدوار من كل فرعية بلاعم تختلف اعتمادا على علم الأمراض التي تجري دراستها. وعلاوة على ذلك، لا يوجد توافق في الآراء حول علامات النسيجية أو المعايير المميزة المستخدمة لهذه المجموعات السكانية البلاعم. ومع ذلك، فإن تحليل ملامح التعبير من علامات CD11b و CD45 عن طريق التدفق الخلوي يسمح لنا لتمييز الخلايا الدبقية الصغيرة (CD11b + CD45 ميد ) من مدم (CD11b + CD45 عالية ). في هذا البروتوكول، وتبين لنا أن كثافة الطرد المركزي التدرجوتحليل التدفق الخلوي يمكن استخدامها لتوصيف هذه المجموعات السكانية الفرعية البلاعم نس، ودراسة عدة علامات من الفائدة التي أعربت عنها هذه الخلايا كما نشرنا مؤخرا. وهكذا، فإن هذه التقنية يمكن أن تزيد فهمنا لدور الضامة في نماذج الماوس من الأمراض العصبية ويمكن أيضا أن تستخدم لتقييم آثار المخدرات على هذه الخلايا.
Introduction
الخلايا الدبقية الصغيرة هي الضامة المنسوجة الأنسجة المتضخم من الجهاز العصبي المركزي (نس). أنها تلعب دورين وظيفيين رئيسيين: الدفاع المناعي وصيانة التوازن الجهاز العصبي المركزي. على النقيض من مدم، التي تجدد باستمرار من الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع العظام، والخلايا ميكروغليال التفريق بين الخلايا البدائية المكونة للدم السلف التي تنشأ في كيس المحي (يس) التي استعمرت الدماغ خلال التطور الجنيني 1 ، 2 ، 3 . في القوارض، عامل النسخ ميب يلعب دورا حاسما في تطوير جميع الخلايا النخاعية المستمدة من العظام والضامة، ولكن ل يس المستمدة الدبقية الصغيرة، وهذا العامل هو الاستغناء عن والتمايز يبقى يعتمد على عامل النسخ PU.1 4 .
في الجهاز العصبي المركزي صحية، الدبقية الصغيرة هي خلايا ديناميكية التي باستمرار عينة بيئتهم، سكانينغ والمسح لغزو مسببات الأمراض أو تلف الأنسجة 5 . الكشف عن مثل هذه الإشارات يبدأ مسار لحل الاصابة. تتحول الخلايا الدبقية الصغيرة بسرعة من التشكل التشعب إلى واحد أموبويد، الذي يتبعه البلعمة وإطلاق سراح مختلف الوسطاء، مثل السيتوكينات الموالية أو المضادة للالتهابات. وهكذا، اعتمادا على المكروية الخاصة بهم، يمكن أن الدبقية الصغيرة تنشيطها الحصول على مجموعة من الدول فتيلة متميزة 6 .
الدبقية الصغيرة تؤثر تأثيرا عميقا على تطور وتقدم العديد من الاضطرابات العصبية. في نماذج القوارض من مرض الزهايمر (أد) 7 ، التصلب الجانبي الضموري (ألس) 8 ، التصلب المتعدد (مس) 9 أو مرض باركنسون (بد) 10 ، وتظهر الدبقية الصغيرة للعب دور مزدوج، إما إحداث العصبية الضارة أو التمثيل في طريقة اعصاب، والتي تعتمد سن مرض معين، ومرحلة المرض، وعما إذا كان هذا المرض يتأثر مقصورة المناعة المناعية 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 . معظم الآفات الجهاز العصبي المركزي لوحظ في الأمراض المذكورة أعلاه تحتوي على السكان غير متجانسة من خلايا الدم النخاعي، بما في ذلك ليس فقط الدبقية الصغيرة متني، ولكن أيضا الضامة المحيطة بالأوعية والسحايا، وكذلك نس-ترشح مدم. هذه الأنواع من الخلايا قد تساهم بشكل تفاضلي في الآليات الفيزيولوجية المرضية المتعلقة إصابة وإصلاح 7 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 . التحدي الحالي للمحققين الذين يدرسون هذه النماذج المرض هو تحديد ما إذا كانت أحيدات الطرفية والضامة التسلل في الجهاز العصبي المركزي وإذا كان الأمر كذلك، إلى ديستإنغويش الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمين من هذه الخلايا. في الواقع، خلايا ميكروغليال هي البلاستيك جدا. عندما يتم تنشيطها، الخلايا الدبقية الصغيرة إعادة التعبير عن علامات التي يتم التعبير عنها عادة من قبل وحيدات الطرفية والضامة. وبالتالي، فإن المسألة تعتمد على تحديد علامات التي يمكن أن تميز الخلايا الدبقية الصغيرة المقيمين من حيدات تسلل والضامة.
التمييز بين هؤلاء السكان على شرائح الدماغ عن طريق التطبيقات المناعية محدودة بسبب عدم وجود الأجسام المضادة المحددة. ومع ذلك، وتحليل التدفق الخلوي هو تقنية فعالة لتقييم التعبير عن عدة علامات والتمييز بين السكان الخلية (على سبيل المثال، الخلايا الليمفاوية، الضامة / مدم CD11b + CD45 عالية ، والدبقية الصغيرة CD11b + CD45 ميد )، فضلا عن المجموعات السكانية الفرعية 16 ، 17 ، 18 . يصف هذا البروتوكول إجراءات لعزلخلايا وحيدات النوى من الجهاز العصبي المركزي الماوس في نماذج الأمراض العصبية باستخدام الأمثل، والتفكك الأنسجة الأنزيمية والطرد المركزي التدرج الكثافة. وكذلك، وسيلة للتمييز بين الخلايا الدبقية الصغيرة و مدم في الجهاز العصبي المركزي باستخدام التدفق الخلوي.
نهج آخر هو القضاء على المايلين وتنقية الخلايا باستخدام الخرز المغناطيسي مترافق لأجسام مضادة محددة 19 ، 20 ، 21 . إزالة الميلين باستخدام المضادة للمايلين الخرز المغناطيسي هو أكثر تكلفة ويؤثر على بقاء وعائد الخلايا المعزولة 22 . هذه الخطوة والفصل إمونوماغنيتيك التالية من الخلايا الدبقية الصغيرة، والحد من دراسات أخرى من السكان الخلايا المناعية محددة 21،22.
هذه الإجراءات توفر وسيلة سهلة لدراسة المجموعات السكانية الفرعية البلاعم في تطور المرض، ولتحديد آثار المخدرات أو التعديلات الجينات على الظواهر البلاعم والدول التنشيط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة على جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدامها في معهد إيسم ولجنة داروين الأخلاقية الفرنسية الحيوان، وتغطي بموجب البروتوكول 01407.02.
1. إعداد
- إعداد كوكتيل الهضم في أنبوب 1.5 مل من خلال الجمع بين ما يلي لكل الماوس: 1 مل الفوسفات مخزنة المالحة (بس). 123 ميكرولتر انزيم الهضم (انظر الجدول من المواد) في 13 وونشش / مل (حل الأسهم)، والتركيز النهائي 1.6 وونشش / مل. و 5 ميكرولتر الدناز الأول (انظر جدول المواد) في 100 ملغ / مل (محلول المخزون)، والتركيز النهائي 0.5 ملغ / مل.
2. الإرواء وتشريح
- الموت ببطء الفئران مع جرعة قاتلة من بينتوباربيتال (100 ميكرولتر في 400 ملغ / مل).
- وضع الحيوان في موقف ضعيف ورطب الجسم مع الايثانول 70٪.
- قطع الجلد البطني مع مقص غرامة أقل من عملية زيفويد لفضح كافيت الصدريذ.
- إجراء شق في الحجاب الحاجز وقطع الجوانب الجانبية للقفص الصدري مع غرامة سسيسورسين الذيلية إلى الاتجاه منقاري لكشف القلب (وتجنب قطع الأجهزة الأخرى). تحديد البطين الأيسر (لف) والأذين الأيمن (را).
- إدراج قسطرة فراشة مع إبرة 25 G داخل لف. إجراء شق على را مع مقص غرامة وفي بداية تدفق الدم، تبدأ نضح في معدل تدفق 10 مل / دقيقة من خلال لف مع 20 مل برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا والدم من السفن. ويلاحظ نضح ناجحة من قبل ابيضاض الرئتين والكبد مع نزوح الدم.
- قطع رأس الحيوان مع مقص المتوسطة. تشريح العمود الفقري مع مقص غرامة وفصله عن الجسم عن طريق استئصال عضلات جدار البطن على الجانب البطني من العمود الفقري وعن طريق قطع العمود الفقري في قاعدة الذيل.
- إدراج حقنة 10 مل تحتوي على برنامج تلفزيوني ومثبتة 200 ميكرولتر ماصة طرف في الجانب القطني منالعمود الفقري وتدفق الحبل الشوكي على الجانب عنق الرحم.
ملاحظة: يتم قطع 200 ماصة ميكرولتر ماصة مع مقص في أوسع حد لها (حوالي 1 سم) وإدراجها بإحكام على حقنة 10 مل مملوءة سابقا بس. - إزالة الجلد فوق الجمجمة واستخدام ملقط لفضح الدماغ. إدراج شفرة مقص في قاعدة الجمجمة وقطع الجمجمة بعد خياطة السهمي. إدراج ملقط صغير في قطع ورفع بلطف الجمجمة. تشريح الدماغ من رأس الماوس وإزالة لمبة الشم والمخيخ.
- جمع الدماغ والحبل الشوكي في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 1.128 مل بس مع كوكتيل الهضم (من الخطوة 1.1).
3. خلية التفكك
- قطع بدقة الدماغ والحبل الشوكي في أنبوب 1.5 مل (الخطوة 2.9) إلى 1-2 ملم 3 قطع مع مقص صغير ( الشكل 1 ).
- احتضان أنبوب 1.5 مل تحتوي على أنسجة المفروم لمدة 30 دقيقة في حضانةتور عند 37 درجة مئوية مع 5٪ كو 2 .
ملاحظة: إعداد التدرج الكثافة في هذه الخطوة. - إضافة 20 ميكرولتر 0.5 M إدتا (حل المخزون)، والتركيز النهائي 10 ملم، إلى أنبوب 1.5 مل لوقف رد الفعل الأنزيمية.
- جعل بلطف تعليق خلية بيبتينغ صعودا وهبوطا مع ماصة 5 مل.
- تمرير تعليق الخلية من خلال شبكة النايلون (70 ميكرون حجم المسام) في أنبوب 50 مل باستخدام المكبس من حقنة 10 مل.
- غسل شبكة النايلون مع 20 مل 5٪ مصل بقري جنيني (فبس) -PBS.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق (300 x ج) في درجة حرارة الغرفة (18 درجة مئوية). تجاهل طاف عن طريق الشفط والانتقال إلى الخطوة التالية. كن حذرا للغاية عند إزالة طاف. لا تخل بيليه، والتي يمكن بسهولة أن يستنشق من ماصة الشفط.
4. الكثافة التدرج
- إعداد حل المخزون من وسط التدرج الكثافة بإضافة كمية مناسبة من برنامج تلفزيوني 10X إلى المتوسطة التدرج الكثافة.
ملاحظة: إضافة جزء واحد 10X بس إلى تسعة أجزاء كثافة التدرج المتوسطة. - تمييع المتوسط التدرج كثافة الأسهم مع برنامج تلفزيوني 1X لنسب مختلفة كما هو موضح في الجدول 1 .
- ريسوسبيند بيليه (من الخطوة 3.7) مع 4 مل 30٪ كثافة التدرج المتوسطة ونقل إلى أنبوب 15 مل.
- وضع ماصة باستور في الجزء السفلي من أنبوب 15 مل وبطء ببطء 4 مل من 37٪ كثافة التدرج المتوسطة.
- إضافة 4 مل من 70٪ الكثافة المتوسطة التدرج، كما هو موضح أعلاه.
- الطرد المركزي التدرج لمدة 40 دقيقة (800 x ج) في درجة حرارة الغرفة (18 درجة مئوية). تأكد من أن أجهزة الطرد المركزي تتوقف مع الحد الأدنى أو أي فرامل بحيث لا تتزعزع بين الطور البيني.
ملاحظة: سوف تظهر أنبوب طبقية. الخلايا الطبقات في 70٪ - 37٪ كثافة واجهة التدرج هي الخلايا المناعية أحادية النواة (الخلايا الدبقية الصغيرة والقطاعات الفرعية بلعم). المستويات العليا هي الحطام الخلية والميلين، على التوالي ( الشكل 2 ). - جمع 3-4 مل من 70-37٪ الكثافة التدرج البيني تحتوي على الخلايا السكانية فرعية البلاعم إلى أنبوب 15 مل نظيفة.
- غسل الخلايا 3X مع برنامج تلفزيوني، إجمالي حجم 15 مل. تأكد من أن المتوسطة التدرج الكثافة التي تحتوي على الخلايا هو المخفف ثلاث مرات على الأقل مع برنامج تلفزيوني، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 7 دقائق (500 x ج، 4 درجات مئوية) مع الفرامل "على".
- ريسوسبيند بيليه الخلية مع برنامج تلفزيوني 1 مل لوضع العلامات الخلية أو لمقايسات وظيفية أخرى.
5. خلية وصفها للتدفق الخلوي
- نقل الخلايا (الخطوة 4.10) في أنبوب التدفق الخلوي.
- إضافة 1 ميكرولتر من كاشف وصمة عار الخلية الميتة قابلة للتثبيت لكل عينة الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 4.10. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد، ومحمية من الضوء.
- غسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 2 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق (300 x ج، 4 درجات مئوية).
- إزالة طاف، و ريسوسبيند بيليه الخلية مع400 ميكرولتر بس 1٪ بسا، 0.1٪ أزيد.
- إضافة 1 ميكروغرام CD16 / CD32 الأجسام المضادة إلى 100 ميكرولتر من الخلايا لمنع مستقبلات فك. احتضان 10-15 دقيقة على الجليد، ومحمية من الضوء.
- إعداد مزيج الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني 1٪ بسا، 0.1٪ أزيد أو بس 1٪ بسا، 0.1٪ أزيد، 0.25٪ سابونين، ل بيرمابيليزاتيون الخلية للتلطيخ داخل الخلايا.
- إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مزيج (2X) واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد، ومحمية من الضوء.
ملاحظة: يجب معايرة جميع الأجسام المضادة قبل إجراء التجربة لضمان أفضل النتائج. - غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 2 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق (300 x ج، 4 درجات مئوية). كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية إذا لم تترافق الأجسام المضادة الأولية مباشرة إلى فلورفور، واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد، ومحمية من الضوء.
- غسل الخلايا مع 2 مل برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ج في 4 درجات مئوية). كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- أصلح الالخلايا مع 100 ميكرولتر 1٪ بفا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
ملاحظة: الحذر: بفا سامة. استخدام في غطاء الدخان وارتداء معدات الوقاية الشخصية. - غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 2 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ج في 4 درجات مئوية. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- ريسوسبيند بيليه الخلية مع 200 ميكرولتر بس والمضي قدما في التدفق الخلوي اكتساب وتحليل. اتبع استراتيجية التابح في الشكل 3 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد كثافة الطرد المركزي التدرج وتلطيخ الأجسام المضادة، تم الحصول على الخلايا على مقياس التدفق الخلوي وتحليلها باستخدام استراتيجية الصرف المورفولوجية على النحو التالي. تم تعريف البوابة الأولى في مؤامرة نقطة إلى الأمام متناثرة منطقة (فسك-A) مقابل الأمام متناثرة الطول (فسك-H) للتمييز خلايا واحدة من دوبلتس ( الشكل 3A ). وبعد ذلك كانت البوابات واحدة على بوابات فسك-A مقابل الجانب متناثرة منطقة (سك-A) نقطة المؤامرات لاستبعاد الخلايا الحطام والخلايا بينوتيك، استنادا إلى حجم الخلية النسبية وحببية الخلية ( الشكل 3B ) .ثم، الخلايا الدبقية الصغيرة و تم تحديد مدم على أساس مستويات التعبير عن CD11b و CD45 علامات ( الشكل 3C ، 3D ). وأخيرا، تم تحليل علامات التعبير الأخرى لكل سوبوبولاتيون البلاعم ( الشكل 3E -3G ). و ميكروغلتم الإبلاغ عن يا للتعبير عن CX3CR1 ولكن ليس علامة CCR2 على النقيض من مدم 23 . في الآونة الأخيرة، ثبت أن Tmem119 علامة محددة للدبقية الصغيرة 19 . تم تقييم علامات التالية (Tmem119، CX3CR1، و CCR2) عن طريق التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة للكشف محددة لكل علامة. تم عرض جميع الخلايا CD11b + CD45 ميد لتكون إيجابية للعلامات Tmem119 و CX3CR1 ولكن ليس لعلامة CCR2، الذي يتحقق من صحة هذه الاستراتيجية للابحار ( الشكل 3E -3G ).
في غياب العزلة الكثافة التدرج، لا يمكن تعريف المجموعات السكانية البلاعم في نقطة مؤامرة فسك-A مقابل سك-A بسبب وجود العديد من الخلايا وحطام المايلين ( الشكل 3H ). من المذكرة، والعلاج بيرمابيليزاتيون يؤدي إلى انكماش الخلية وبالتالي ظهرت المجموعات السكانية البلاعم سمألر في فسك مقابل سك نقطة مؤامرة ( الشكل 3I ، J ) كما هو موضح سابقا 24 . تم تحديد جدوى الخلايا باستخدام مجموعة من الخلايا اللطخة الميتة القابلة للتثبيت. بعد التدرج الكثافة، 85-95٪ من الخلايا على قيد الحياة ( الشكل 3K ). يمكن تعريف الخلايا الدبقية الصغيرة و مدم من قبل علامات CD45 و CD11b على مؤامرة نقطة بعد عزل الدماغ وخلايا الحبل الشوكي في عينة واحدة ( الشكل 3L )، وأيضا من الدماغ أو الحبل الشوكي وحده ( الشكل 3M ، 3N ).
لتدفق الخلوي وضع العلامات، فمن المهم أن نعرف ما إذا كان البروتين و / أو حاتمة المعترف بها من قبل الأجسام المضادة هو داخل أو خارج الخلية. في حالة المستضدات داخل الخلايا، مطلوب العازلة بيرمابيليزاتيون. Tmem119 هو بروتين الغشاء ولكن حاتمة المعترف بهامن البقع الأجسام المضادة كما داخل الخلايا 19 . في غياب بيرمابيليزاتيون الخلية، لم يكن هناك وضع العلامات ( الشكل 3O ). عدم وجود هذه الخطوة بيرمابيليزاتيون يمكن أن يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة. وبما أن الجسم المضاد Tmem119 لا يترافق مباشرة مع فلورفور، فقد وصفت الخلايا بجسم مضاد ثانوي؛ وكانت السيطرة السلبية الأجسام المضادة الثانوية وحدها (الخط الأسود) ( الشكل 3E ، 3O-3R ). عند استخدام الأجسام المضادة المترافقة مباشرة، هناك نوعان من الاستراتيجيات الرئيسية لتقييم وضع العلامات محددة: الأجسام المضادة النمط النظري كسيطرة سلبية أو الضوابط الإسفار ناقص واحد (فمو). ضوابط فمو تحتوي على كل الأجسام المضادة وضع العلامات في الخليط باستثناء الأجسام المضادة السيطرة لتلك العينة. وبالتالي، فإن مراقبة فمو ضروري لكل علامة، في حين أن هناك حاجة فقط واحد خليط وضع العلامات للأجسام المضادة إيزوتيب السيطرة، لكل عينة. لوسم الخلايا المناعية في الدماغ، اخترنا إيسوتيب مكافحة الأجسام المضادة منذ عدد محدود من الخلايا (400،000 الخلايا) يتم الحصول عليها بعد التدرج الكثافة من الدماغ الماوس واحد.
الشكل 1: خطوات إجراء تفكك الخلية. ( A ) وضعت الأنسجة في أنبوب مع انزيمات كوكتيل الهضم. ( ب ) تم قطع الأنسجة بدقة إلى قطع صغيرة مع مقص. ( C ) تم تحضين قطع صغيرة من الأنسجة لمدة 30 دقيقة (37 درجة مئوية) لهضم الأنسجة كفاءة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط التدرج الكثافة بعد سينتريفوجاتيون الخطوة. بعد الطرد المركزي، المايلين موجود في الجزء العلوي من التدرج الكثافة والخلايا المناعية التي تحتوي على السكان البلاعم وجدت في البيني بين 37٪ و 70٪ الكثافة طبقات التدرج. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل التدفق الخلوي ممثل الضامة. وتم تطبيق استراتيجية منطقية للابحار: ( أ ) يشير التمييز المزدوج إلى النقطة المؤامرة فسك-A مقابل فسك-H. ( B ) يشير استراتيجية الصرف المورفولوجية إلى نقطة مؤامرة فسك-A مقابل سك-A. ( C ) المجموعات السكانية الفرعية البلاعم يشير إلى نقطة مؤامرة CD45 مقابل CD11b. ( D ) مؤامرة نقطة من الخلايا ستاإنيد مع الأجسام المضادة إيزوتيب كعنصر تحكم ل CD45 و CD11b تلطيخ. وقد تم الحصول على تحليل علامات أعرب عن هذه المجموعات السكانية الفرعية بلعم: Tmem119 ( E )، CX3CR1 ( F )، و CCR2 ( G ) (10،000 الأحداث في بوابة P2). (سك-A) من المخ وخلايا الحبل الشوكي قبل التدرج الكثافة ( H ) أو بعد عزل التدرج الكثافة ومع المعالجة بيرمابليزينغ ( I ) أو بدون ( J ) . ( K ) التدفق الخلوي الرسم البياني يوضح نسبة الخلايا الميتة بعد التدرج الكثافة. البوابات المبينة في مؤامرات النقاط توضح CD11b + CD45 ميد الخلايا الدبقية الصغيرة والسكان CD11b + CD45 عالية مدم في الدماغ والحبل الشوكي ( L ) أو في الدماغ ( M ) أو الحبل الشوكي ( N ) بشكل منفصل. وأعرب تحليل Tmem119 من قبل المجموعات السكانية في البلاعم في الدماغ وخلايا الحبل الشوكي بيرمابيليزد ( O ) أو غير بيرمابيليزد ( P )، وفي الدماغ ( Q ) أو الحبل الشوكي ( R ) خلايا بيرمابيليزد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| حجم ل 1 أنبوب (مل) | كثافة التدرج المتوسطة 1X | بس 10X | بس 1X |
| كثافة التدرج المتوسطة 30٪ | 1.5 | 0.15 | 3.35 |
| الكثافة المتوسطة التدرج 37٪ | 1.85 | 0.185 | 2.965 |
| كثافة التدرج المتوسطة 70٪ | 3.5 | 0.35 | 1.15 |
إب-together.within-بادج = "1"> الجدول 1: تكوين النسب المئوية المختلفة لتدرج الكثافة المتوسطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد ثبت أن الخلايا الدبقية الصغيرة و مدم لها وظائف مختلفة والمظاهر الظاهرية في الجهاز العصبي المركزي، وبالتالي تحديد وتحليل هذه المجموعات السكانية البلاعم ضرورية من أجل فهم أفضل الأمراض العصبية 9 ، 18 ، 25 . تحليل التدفق الخلوي باستخدام اثنين من علامات (CD11b و CD45) يسمح للتمييز بين كل سكانية ( الشكل 3C ). تم التحقق من صحة هذه الاستراتيجية سابقا باستخدام علامات محددة أخرى، مثل CCR2 ل مدم و CX3CR1 للدبقية الصغيرة، ونهج وضعت مؤخرا مع الأجسام المضادة ل Tmem119 ( الشكل 3E - 3G ). أجرينا تجارب مع CCR2 و CX3CR1 الأجسام المضادة ( الشكل 3F ، 3G ) كما نشرنا سابقا 18 . CD11b + CD45ميد أعرب للغاية Tmem119 و CX3CR1 ولكن ليس CCR2 على النقيض من CD11b + CD45 السكان عالية . يتكون CD11b + CD45 السكان عالية من مجموعات سكانية فرعية مختلفة مع أو بدون التعبير CCR2. تحديد وتوصيف هذه المجموعات السكانية الفرعية بلعم (الضامة حول الأوعية، تسلل الضامة، وما إلى ذلك ) هي مجال واسع من البحوث. وعلاوة على ذلك، علامات لهذه السكان يمكن أن تتغير اعتمادا على العمليات المرضية. في الواقع، CCR2 هو أسفل تنظيم عندما حيدات عبور حاجز الدم في الدماغ 26 .
اعترفت الأجسام المضادة CD45 و CD11b المستضدات سطح الخلية، وبالتالي فإن العلاج بيرمابيليزاتيون لا لزوم لها. لذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لتنقية كل كتلة فرعية البلاعم عن طريق الفرز الخلية لتحليل مرنا أو فحوصات وظيفية أخرى. ومن الجدير بالذكر أن استخدام الانزيم والكثافة غرادإينت يمكن أن تحفز، إلى حد ما، تفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة. لقد لاحظنا سابقا أنه بعد العزلة، فإن الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة تعبر عن سينتاس أكسيد النيتريك محرض (إينوس). ومع ذلك، يمكن إبراز مستوى التعبير إينوس زيادة لوحظ في المرضية مقابل الحالة العادية باستخدام هذا الأسلوب 18 . وعلاوة على ذلك، فإن هذه التقنية يحقق السكان خلية منفصلة جيدا (سينغليتس) مع نسبة عالية من الخلايا الحية.
لنجاح النسخ المتماثل من هذا البروتوكول، وهناك العديد من المعلمات الحرجة. إعداد التدرج هو الأكثر أهمية. تجربتنا تشير إلى أن إعداد التدرجات في 15 مل أنابيب مقابل 50 مل منها يحقق فصل أفضل. إذا لم ينظر إلى أي خلايا في واجهة 70-37٪، وينبغي النظر في كمية الأنسجة نس المستخدمة لعزل الخلية. نحن عادة جمع ~ 400،000 خلايا من الدماغ الماوس واحد. على الرغم من أن هذا العائد يتقلب من مختلف الظروف التجريبيةثانية، واحدة لتصور أفضل من واجهة 70-37٪ هو جعل طبقة التدرج الكثافة 37٪ مع برنامج تلفزيوني والفينول الأحمر.
مع مساعدة من ليزر مختلفة والمرشحات في تدفق عداد الكريات، وهذا البروتوكول يمكن تحديد عدة علامات أعرب عنها كل من المجموعات السكانية الفرعية بلعم 18 . هذه التقنية هي أيضا مفيدة لتقييم مشاركة الخلايا المناعية الأخرى مثل الخلايا التائية و B الخلايا في نفس العينة. في الواقع، التقنيات باستخدام إثراء إمونوماغنيتيك تسمح فقط لدراسة السكان التي سبق اختيارها 21 .
عموما، وهذا الأسلوب يشكل أداة مفيدة لتوصيف المجموعات السكانية الفرعية البلاعم مختلفة في نماذج الماوس من الأمراض العصبية. هذا البديل الفريد يمكن تقييم آثار العلاج على العمليات الالتهابية في الحالات المرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من الوكالة الوطنية للبحث العلمي (أنر-12-مالز-0003-02-P2X7RAD)، ورابطة فرنسا الزهايمر وببيفرانس. ويدعم مختبرنا أيضا من قبل إنسيرم، نرس، جامعة بيير وماري كوري وبرنامج "إنفستسيمنتس أفينير" أنر-10-إايهو-06 (إيهو-A-إيسم). نود أن نشكر المساعدة من مرفق سيليس ثقافة الخلية الأساسية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25 G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
- Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
- Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target? Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
- Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
- Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
- Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
- Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
- Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
- Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).
