Summary
Dit protocol geeft een analyse van de macrofage subpopulaties in het centraal zenuwstelsel van het volwassen muis door middel van flowcytometrie en is nuttig voor het bestuderen van meerdere markers die door deze cellen worden uitgedrukt.
Abstract
Talrijke studies hebben de rol van immuuncellen, in het bijzonder macrofagen, in pathologieën van het centrale zenuwstelsel (CNS) aangetoond. Er zijn twee belangrijke macrofage populaties in het CNS: (i) de microglia, die de inwendige macrofagen van het CNS zijn en afgeleid zijn van de bloedsomlooppromotoren tijdens embryogenese, en (ii) de monocyt-afgeleide macrofagen (MDM), die kunnen infiltreren Het CNS tijdens de ziekte en zijn afgeleid van beenmerg progenitors. De rollen van elke macrofage subpopulatie verschillen afhankelijk van de pathologie die wordt bestudeerd. Verder is er geen consensus over de histologische markers of de onderscheidende criteria die voor deze macrofage subpopulaties worden gebruikt. De analyse van de expressieprofielen van de CD11b- en CD45-markers door middel van flowcytometrie laat ons echter toe om de microglia (CD11b + CD45 med ) van de MDM (CD11b + CD45 high ) te onderscheiden. In dit protocol laten we zien dat de dichtheidsgradiëntcentrifugatieEn de flow cytometry analyse kan worden gebruikt om deze CNS macrofage subpopulaties te karakteriseren, en te onderzoeken verschillende markers van interesse uitgedrukt door deze cellen zoals we onlangs gepubliceerd. Zo kan deze techniek ons begrip van de rol van macrofagen in muismodellen van neurologische aandoeningen verlenen en kunnen ook gebruikt worden om medicijn effecten op deze cellen te evalueren.
Introduction
De microglia zijn de parenchymale weefsel-ingezeten macrofagen van het centrale zenuwstelsel (CNS). Ze spelen twee belangrijke functionele rollen: immuniteitsverdediging en onderhoud van de CNS homeostase. In tegenstelling tot de MDM, die voortdurend worden vernieuwd van de hematopoietische stamcellen in het beenmerg, onderscheiden de microglcellen zich van primitieve hematopoietische stamcellen die afkomstig zijn uit de dooierzak (YS) die de hersenen coloniseerde tijdens de embryonale ontwikkeling 1 , 2 , 3 . Bij knaagdieren speelt de transcriptiefactor Myb een cruciale rol in de ontwikkeling van alle botmengsel afgeleide monocyten en macrofagen, maar voor YS-afgeleide microglia is deze factor onafwendbaar en differentiatie blijft afhankelijk van de transcriptiefactor PU.14.
In het gezonde CNS zijn microglia dynamische cellen die hun omgeving constant sconenNning en opmeting voor invallende pathogenen of weefselschade 5 . De detectie van dergelijke signalen initieert een weg om het letsel op te lossen. De microglia verandert snel van een geamplificeerde morfologie naar een amoeboid, die gevolgd wordt door fagocytose en vrijlating van verschillende mediators, zoals pro- of anti-inflammatoire cytokinen. Zo kan, afhankelijk van hun microomgeving, geactiveerde microglia een spectrum van verschillende primingstaten 6 verwerven.
De microglia beïnvloedt de ontwikkeling en de voortgang van veel neurologische aandoeningen. In de knaagdiermodellen van de ziekte van Alzheimer (AD) 7 , Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) 8 , Multiple Sclerose (MS) 9 of Parkinsonziekte (PD) 10 , blijkt de microglia een dubbele rol te spelen, hetzij veroorzaken van nadelige neurotoxiciteit of het optreden van Op een neuroprotectieve manier, die afhankelijk is van oN de specifieke ziekte, het ziekte stadium en of de ziekte werd beïnvloed door het systemische immuuncompartiment 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . De meeste van de CNS-letsels waargenomen in de bovengenoemde ziekten bevatten een heterogene populatie van myeloïde cellen, waaronder niet alleen parenchymale microglia, maar ook perivasculaire en meningale macrofagen, evenals CNS-infiltrerende MDM. Deze celtypen kunnen differentieel bijdragen aan de pathofysiologische mechanismen die verband houden met verwonding en reparatie 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . De huidige uitdaging voor onderzoekers die deze ziektemodellen bestuderen, is om vast te stellen of de perifere monocyten en macrofagen het CNS infiltreren en zoDe inwoner microglia van deze cellen. Inderdaad, de microglialcellen zijn zeer plastic; Wanneer ze geactiveerd worden, herhalen de microglia markers die gewoonlijk worden uitgedrukt door perifere monocyten en macrofagen. Het probleem is derhalve gebaseerd op het identificeren van markers die de residente microglia kunnen onderscheiden van de infiltrerende monocyten en macrofagen.
De discriminatie van deze populaties op hersenplakken door immunohistologische toepassingen is beperkt door het gebrek aan specifieke antilichamen. Flowcytometrie-analyse is echter een efficiënte techniek om de expressie van verschillende markers te beoordelen en celpopulaties te onderscheiden (bijvoorbeeld lymfocyten, macrofagen / MDM CD11b + CD45 high en microglia CD11b + CD45 med ), evenals subpopulaties 16 van de cel , 17 , 18 . Dit protocol beschrijft de procedures voor het isoleren van deMononucleaire cellen uit het CNS van de muis in neurologische ziekte modellen door gebruik te maken van een geoptimaliseerde, enzymatische weefdissociatie en een dichtheidsgradiëntcentrifugatie; Evenals een methode voor het differentiëren van de microglia- en MDM-populaties in het CNS door gebruik te maken van flowcytometrie.
Een andere benadering is om de myelin te elimineren en de cellen te zuiveren door gebruik te maken van magnetische kralen geconjugeerd aan specifieke antilichamen 19 , 20 , 21 . Het verwijderen van myelin met behulp van anti-myelin magnetische kralen is duurder en beïnvloedt de levensvatbaarheid en de opbrengst van geïsoleerde cellen 22 . Deze stap en de volgende immunomagnetische scheiding van de microglia beperken verdere studies van specifieke immuuncellenpopulaties 21 , 22 .
Deze procedures bieden een makkelijke manier om de macrofage subpopulaties bij ziekteontwikkeling te bestuderen, enHet bepalen van de geneesmiddeleffecten of genmodificaties op macrofagenfenotypen en activeringsstaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier beschreven zijn, zijn goedgekeurd door het Institusioneel Diervoeder- en Gebruikskomitee bij het ICM-Instituut en door het Darwin Frans Etisch Diercommissie en zijn onder het protocol 01407.02 behandeld.
1. Bereiding
- Bereid de spijsverteringscocktail in een 1,5 ml buis door het volgende voor elke muis te combineren: 1 ml fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS); 123 μL spijsverteringsenzym (zie tabel van materialen) bij 13 wunsch / ml (voorraadoplossing), uiteindelijke concentratie 1,6 wunsch / ml; En 5 μl DNase I (zie tabel van materialen) bij 100 mg / ml (voorraadoplossing), uiteindelijke concentratie 0,5 mg / ml.
2. Perfusie en Dissectie
- Euthanize de muizen met een dodelijke dosis pentobarbital (100 μl bij 400 mg / ml).
- Plaats het dier in de rugstand en nat het lichaam met 70% ethanol.
- Snijd de ventrale huid met fijne schaar net onder het xyphoide proces om de thoracale holte bloot te stelleny.
- Maak een incisie in het diafragma en snijd de zijdelingse aspecten van de ribbekooi met een fijne schaarser in een rooster naar de radiale richting om het hart bloot te stellen (en voorkom dat andere organen worden gesneden). Identificeer de linker ventrikel (LV) en het rechter atrium (RA).
- Plaats een vlinderkatheter met een 25 G-naald in de LV. Maak een incisie op de RA met een fijne schaar en begin bij de bloedstroom perfusie bij 10 mL / min doorstroming door de LV met 20 mL PBS om cellen en bloed uit vaten te verwijderen; Succesvolle perfusie wordt genoteerd door het blancheren van de longen en de lever als bloed ontheemd wordt.
- Decapiteer het dier met een middelste schaar. Dissecteer de wervelkolom met fijne schaar en scheid het van het lichaam door de buikwandmuskulatuur op de ventrale kant van de wervelkolom te verwijderen en door de wervelkolom aan de basis van de staart te snijden.
- Plaats een 10 ml spuit met PBS en een gemonteerde 200 μL pipettip in de lumbale zijde vanDe wervelkolom en spoel het ruggenmerg aan de cervicale kant.
OPMERKING: De 200 μL pipettip is met een schaar aan het breedste punt (ongeveer 1 cm) gesneden en stevig op een 10 ml spuit die eerder met PBS is gevuld, ingebracht. - Verwijder de huid boven de schedel en gebruik tang om de hersenen bloot te stellen. Plaats een schaarblad aan de basis van de schedel en snijd het kran na de sagittale hechting. Plaats kleine tang in de snede en lig de schedel voorzichtig op. Dissect de hersenen van het hoofd van de muis en verwijder de olfactorische bol en cerebellum.
- Verzamel de hersenen en het ruggenmerg in een 1,5 ml buis die 1.128 ml PBS bevat met spijsverteringskrokie (van stap 1.1).
3. Cell Dissociation
- Snijd de hersenen en ruggenmerg in de 1,5 ml buis (stap 2.9) in 1-2 mm 3 stukken met een kleine schaar ( afbeelding 1 ).
- Incubeer de 1,5 ml buis die de gehaktweefsels gedurende 30 minuten in een incuba bevatBij 37 ° C met 5% CO 2 .
OPMERKING: Bereid de dichtheidsgradiënt op in deze stap. - Voeg 20 μL 0,5 M EDTA (voorraadoplossing), eindconcentratie 10 mM, toe aan de 1,5 ml buis om de enzymatische reactie te stoppen.
- Maak een celvering voorzichtig door pipettering omhoog en omlaag met een 5 ml pipet.
- Pas de celsuspensie door een nylon gaas (70 μm poriegrootte) in een 50 ml buis met behulp van de zuiger van een 10 ml spuit.
- Was het nylon gaas met 20 ml 5% Fetal Bovine Serum (FBS) -PBS.
- Centrifuge gedurende 7 minuten (300 xg) bij kamertemperatuur (18 ° C). Gooi de supernatant door aspiratie en ga verder naar de volgende stap. Wees uiterst voorzichtig bij het verwijderen van de supernatant; Verstoor de pellet niet, die gemakkelijk door de aspiratiepipet kan worden gezocht.
4. Dichtheid Gradiënt
- Berei een voorraadoplossing van het dichtheidsgradiëntmedium op door de juiste hoeveelheid 10x PBS toe te voegen aan het dichtheidsgradiëntmedium.
OPMERKING: voeg een deel 10X PBS toe aan negen delen dichtheidsgradiënt medium. - Verdun het voorraaddichtheidsgradiëntmedium met 1x PBS voor de verschillende percentages zoals beschreven in Tabel 1 .
- Resulteer de pellet (vanaf stap 3.7) met 4 ml 30% dichtheidsgradiëntmedium en overbrengen naar een 15 ml buis.
- Plaats een Pasteur pipette in de bodem van de 15 ml buis en langzaam onderlaag 4 ml 37% dichtheidsgradiënt medium.
- Voeg 4 ml 70% dichtheidsgradiëntmedium toe zoals hierboven beschreven.
- Centrifugeer het verloop gedurende 40 minuten (800 xg) bij kamertemperatuur (18 ° C). Zorg ervoor dat de centrifuge met minimale of geen rem stopt, zodat de interfase niet wordt gestoord.
OPMERKING: De buis wordt gestratificeerd. De cellen gelaagd bij de 70% - 37% dichtheidsgradiëntinterface zijn de mononucleaire immuuncellen (microglia en macrofage subpopulaties); De bovenste niveaus zijn respectievelijk celresten en myelin ( figuur 2 ). - Verzamel 3-4 ml van de 70-37% dichtheidsgradiënt interfase die de macrofage subpopulatie cellen bevat in een schone 15 ml buis.
- Was de cellen 3x met PBS, totaal volume van 15 ml. Zorg ervoor dat het dichtheidsgradiëntmedium dat de cellen bevat, tenminste driemaal verdund worden met PBS en gedurende 7 minuten (500 xg, 4 ° C) met de rem "aan" centrifugeren.
- Resuspendeer de celpellet met 1 ml PBS voor celmerken of voor andere functionele assays.
5. Celtikettering voor flowcytometrie
- Breng de cellen over (stap 4.10) in een flowcytometriebuis.
- Voeg 1 μl fixeerbare dode celvlekreagens toe aan elk celmonster verkregen in stap 4.10. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht.
- Was de cellen eenmaal met 2 ml PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten (300 xg, 4 ° C).
- Verwijder de supernatant en resuspende de celpelletje met400 μl PBS 1% BSA, 0,1% azide.
- Voeg 1 μg CD16 / CD32 antilichamen toe aan 100 μl van de cellen om de Fc receptoren te blokkeren. Incubeer 10-15 minuten op ijs, beschermd tegen licht.
- Bereid de primaire antilichamenmix in PBS 1% BSA, 0,1% azide of PBS 1% BSA, 0,1% azide, 0,25% saponine, voor celpermeabilisatie voor intracellulaire kleuring.
- Voeg 100 μL primair antilichamen mix (2x) toe en incubeer gedurende 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht.
OPMERKING: Alle antilichamen moeten worden getitreerd voordat u het experiment uitvoert om optimale resultaten te garanderen. - Was de cellen met 2 ml PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten (300 xg, 4 ° C). Herhaal deze stap drie keer.
- Voeg 100 μl van een secundair antilichaam toe als de primaire antilichamen niet direct geconjugeerd zijn met een fluorofoor, en incubeer gedurende 30 minuten op ijs, beschermd tegen licht.
- Was de cellen met 2 ml PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 xg bij 4 ° C). Herhaal deze stap drie keer.
- Repareer deCellen met 100 μl 1% PFA gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
OPMERKING: Let op: PFA is giftig. Gebruik in een afzuigkap en draag persoonlijke beschermingsmiddelen. - Was de cellen met 2 ml PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 xg bij 4 ° C. Herhaal deze stap drie keer.
- Resuspendeer de celpellet met 200 μl PBS en ga verder naar flow cytometrie acquisitie en analyse. Volg de gate strategie in Figuur 3 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na de dichtheidsgradiëntcentrifugatie en antilichamenkleuring werden de cellen verkregen op een stromingscytometer en geanalyseerd onder toepassing van een morfologische poortstrategie als volgt. Een eerste poort werd gedefinieerd in het dot plot Forward-Scattered-Area (FSC-A) versus Forward-Spreaded-Height (FSC-H) om enkele cellen van dubbele cellen te onderscheiden ( Figuur 3A ). De enkelvoudige cellen werden vervolgens gelicht op FOT-A versus Side-Spreaded Area (SSC-A) dot plots om celresten en pyknotische cellen uit te sluiten, gebaseerd op de relatieve celgrootte en celgranulariteit ( Figuur 3B ). De microglia en De MDM werden geïdentificeerd op basis van hun expressieniveaus van de CD11b- en CD45-markers ( Figuur 3C , 3D ). Tenslotte werden andere expressiemarkers geanalyseerd voor elke macrofage subpopulatie ( Figuur 3E -3G ). De microglIa werden gemeld om de CX3CR1 maar niet de CCR2-marker in tegenstelling tot MDM 23 uit te drukken. Recent is aangetoond dat Tmem119 een specifieke marker is voor microglia 19 . De volgende markers (Tmem119, CX3CR1 en CCR2) werden beoordeeld door stromingscytometrie met gebruikmaking van detectorantistoffen die specifiek zijn voor elke marker; Alle CD11b + CD45 met cellen bleken positief te zijn voor de Tmem119 en CX3CR1 markers, maar niet voor de CCR2-markering, die deze poortstrategie valideren ( Figuur 3E -3G ).
Bij afwezigheid van de isolatie van de dichtheidsgradiënt kon de macrofage subpopulaties niet gedefinieerd worden in de stipplot FSC-A versus SSC-A door de aanwezigheid van veel cellen en myelinresten ( Figuur 3H ). Van de opmerking veroorzaakt de permeabiliseringsbehandeling een celkrimp en aldus verschenen de macrofage subpopulaties smAllerlei in de FSC versus SSC dot plot ( Figuur 3I , J ) zoals eerder beschreven 24 . De levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald met behulp van de fixeerbare dode cel vlek kit. Na de dichtheidsgradiënt leven 85-95% cellen levend ( Figuur 3K ). De microglia- en MDM-populaties kunnen worden gedefinieerd door de CD45- en CD11b-markers op een stipplot na isolatie van de hersenen en ruggenmergcellen in een enkel monster ( Figuur 3L ) en ook alleen van de hersenen of het ruggenmerg ( Figuur 3M , 3N ).
Voor flowcytometrie-etikettering is het belangrijk om te weten of het eiwit en / of de epitoop herkend door het antilichaam intra- of extracellulair is. In het geval van intracellulaire antigenen is een permeabilisatiebuffer vereist. Tmem119 is een transmembrane eiwit maar de epitoop herkendDoor het antilichaam vlekken als intracellulaire 19 . Bij afwezigheid van celpermeabilisatie was er geen etikettering ( Figuur 3O ). Het ontbreken van deze permeabilisatie stap kan leiden tot valse negatieve resultaten. Aangezien het Tmem119 antilichaam niet direct aan een fluorofoor is geconjugeerd, werden de cellen gemerkt met een secundair antilichaam; De negatieve controle was alleen secundair antilichaam (zwarte lijn) ( Figuur 3E , 3O-3R ). Wanneer direct geconjugeerde antilichamen worden gebruikt, zijn er twee hoofdstrategieën om specifieke etikettering te beoordelen: isotype antilichamen als negatieve controle of Fluorescence Minus One (FMO) controles. FMO controles bevatten elk etiketterend antilichaam in het mengsel, behalve het controle antilichaam voor dat monster. Zo is een FMO-controle nodig voor elke marker, terwijl er slechts één etiketteringsmengsel nodig is voor het regelen van het isotype-antilichaam per monster. Voor de etikettering van de immuuncellen van de hersenen kozen we de isotControle van de antilichamen, aangezien een beperkt aantal cellen (400.000 cellen) wordt verkregen na de dichtheidsgradiënt van één muisbrein.
Figuur 1: Stappen van de Cell Dissociation Procedure. ( A ) Het weefsel werd in een buis geplaatst met digestiecocktail enzymen. ( B ) Het weefsel werd fijn gesneden in kleine stukjes met een schaar. ( C ) De kleine stukjes weefsel werden gedurende 30 minuten (37 ° C) geïncubeerd voor efficiënte weefselvertering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schema van de dichtheidsgradiënt na CenTripugatie stap. Na centrifugatie is myeline aanwezig aan de top van het dichtheidsgradiënt en immuuncellen die macrofagepopulaties bevatten, worden gevonden bij de interfase tussen de 37% en 70% dichtheidsgradientlagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve flowcytometrie analyse van macrofagen. Een logische poortstrategie werd toegepast: ( A ) De dubbeldiscriminatie verwijst naar puntplot FSC-A versus FSC-H. ( B ) De morfologische poortstrategie verwijst naar puntplot FSC-A versus SSC-A. ( C ) De macrofage subpopulaties verwijst naar dot plot CD45 versus CD11b. ( D ) De dot plot van cellen staBinnen met isotype antilichamen als een controle voor CD45 en CD11b kleuring. De analyse van de markers uitgedrukt door deze twee macrofage subpopulaties: Tmem119 ( E ), CX3CR1 ( F ) en CCR2 ( G ) (10.000 gebeurtenissen in poort P2 werden verkregen). Dot plots die de celgrootte (FSC-A) en de korrelvormigheid (SSC-A) van de hersen- en ruggenmergcellen tonen voor de dichtheidsgradiënt ( H ) of na de dichtheidsgradiëntisolatie en met permeabiliserende behandeling ( I ) of zonder ( J ) . ( K ) Flowcytometrie histogram illustreert het percentage dode cellen na de dichtheidsgradiënt. Poorten die in de stipplots worden getoond, illustreren de CD11b + CD45 met microglia populatie en de CD11b + CD45 hoge MDM populatie in de hersenen en ruggenmerg ( L ) of in de hersenen ( M ) of het ruggenmerg ( N ) afzonderlijk. Analyse van Tmem119 uitgedruktDoor de macrofage subpopulaties in de hersenen en ruggenmergcellen permeabilized ( O ) of niet-permeabilized ( P ), en in de hersenen ( Q ) of door de ruggenmerg ( R ) doorlatende cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Volume voor 1 buis (ml) | Dichtheidgradiëntmedium 1x | PBS 10x | PBS 1x |
| Dichtheidgradiëntmedium 30% | 1.5 | 0.15 | 3.35 |
| Dichtheidgradiëntmedium 37% | 1.85 | 0,185 | 2.965 |
| Dichtheidgradiëntmedium 70% | 3.5 | 0.35 | 1.15 |
Tabel 1: Samenstelling van de verschillende percentages van het dichtheidsgradiëntmedium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is aangetoond dat de microglia en MDM verschillende functies en fenotypen in het CNS hebben en daarom zijn de identificatie en analyse van deze macrofage subpopulaties essentieel om de neurologische ziekten 9 , 18 , 25 beter te begrijpen. Flowcytometrie analyse met behulp van twee markers (CD11b en CD45) maakt het onderscheid mogelijk tussen elke subpopulatie ( Figuur 3C ). Deze strategie werd eerder gevalideerd door gebruik te maken van andere specifieke markers, zoals CCR2 voor de MDM en CX3CR1 voor de microglia, en een recent ontwikkelde aanpak met een antilichaam tegen Tmem119 ( Figuur 3E - 3G ). We hebben experimenten uitgevoerd met CCR2- en CX3CR1-antilichamen ( Figuur 3F , 3G ) zoals we eerder gepubliceerd hebben 18 . De CD11b + CD45Met populatie sterk uitgedrukte Tmem119 en CX3CR1 maar niet CCR2 in tegenstelling tot de CD11b + CD45 hoge populatie. De CD11b + CD45 hoge populatie bestaat uit verschillende subpopulaties met of zonder CCR2 expressie. De identificatie en karakterisering van deze macrofage subpopulaties (perivasculaire macrofagen, infiltrerende macrofagen, enz. ) Zijn een uitgebreid onderzoekgebied. Bovendien kunnen de markers voor deze populaties afhankelijk zijn van de pathologische processen. Inderdaad, CCR2 is down-regulated wanneer de monocyten de bloedbreinbarrière 26 oversteken.
De CD45- en CD11b-antilichamen herkennen de celoppervlakantigenen, zodat de permeabilisatiebehandeling onnodig is. Daarom kan deze techniek ook worden gebruikt om elke macrofage subpopulatie te zuiveren door celsortering voor mRNA analyse of andere functionele assays. Opgemerkt wordt dat het gebruik van het enzym en de dichtheidsgraadIent kan tot op zekere hoogte microglia activering veroorzaken. We hebben eerder geconstateerd dat de microglia en macrofagen na het isoleren het induceerbare stikstofoxide synthase (iNOS) uitdrukken. Niettemin kan verhoogd iNOS-expressieniveau waargenomen in de pathologische versus de normale conditie worden gemarkeerd met behulp van deze methode 18 . Bovendien bereikt deze techniek een goed gescheiden celpopulatie (singlets) met een groot deel van levende cellen.
Voor de succesvolle replicatie van dit protocol zijn er verschillende kritische parameters. De opstelling van de gradiënt is het meest kritisch. Onze ervaring wijst erop dat het voorbereiden van de gradiënten in 15 ml buizen versus 50 ml die betere scheidingen oplevert. Als er geen cellen in de 70-37% interface worden gezien, moet de hoeveelheid CNS-weefsel die gebruikt wordt voor celisolatie, overwogen worden. We verzamelen meestal ~ 400.000 cellen van een muisbrein. Hoewel deze opbrengst verschilt van verschillende experimentele conditiesS, een voor een betere visualisatie van de 70-37% interface is het maken van de 37% dichtheidsgradientlaag met PBS en fenol rood.
Met behulp van verschillende lasers en filters in de flow cytometer kan dit protocol verschillende markers kwantificeren die uitgedrukt wordt door elk van de macrofage subpopulaties 18 . Deze techniek is ook nuttig voor het beoordelen van de betrokkenheid van andere immuuncellen, zoals T-cellen en B-cellen in hetzelfde monster. Inderdaad gebruiken technieken die immunomagnetische verrijking gebruiken, alleen de studie van de eerder geselecteerde populaties 21 .
In het algemeen is deze techniek een nuttig instrument om de verschillende macrofage subpopulaties in muismodellen van neurologische ziekten te karakteriseren. Dit unieke alternatief kan de effecten van de behandeling op ontstekingsprocessen beoordelen bij pathologische aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer en Bpifrance. Ons laboratorium wordt ook ondersteund door Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie en het programma "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Wij danken de hulp van de CELIS celcultuur kern faciliteit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25 G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
- Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
- Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target? Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
- Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
- Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
- Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
- Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
- Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
- Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).
