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Immunology and Infection

Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso

Published: June 22, 2017 doi: 10.3791/55781

Summary

Questo protocollo fornisce un'analisi delle subpopulazioni del macrofage nel sistema nervoso centrale del mouse adulto mediante citometria a flusso ed è utile per lo studio di marcatori multipli espressi da queste cellule.

Abstract

Numerosi studi hanno dimostrato il ruolo delle cellule immunitarie, in particolare dei macrofagi, nelle patologie del sistema nervoso centrale (CNS). Esistono due principali popolazioni di macrofagi nel CNS: (i) la microglia, che sono i macrofagi residenti del CNS e sono derivate da progenitori di sacchi di tuorlo durante l'embriogenesi e (ii) i macrofagi derivanti da monociti (MDM), che possono infiltrarsi Il CNS durante la malattia e sono derivate da progenitori del midollo osseo. I ruoli di ciascuna sottopopolazione dei macrofagi variano a seconda della patologia studiata. Inoltre, non esiste un consenso sui marcatori istologici o sui criteri distintivi utilizzati per queste sottopopolazioni macrofagi. Tuttavia, l'analisi dei profili di espressione dei marker CD11b e CD45 mediante citometria a flusso ci consente di distinguere la microglia (CD11b + CD45 med ) dall' MDM (CD11b + CD45 alta ). In questo protocollo mostriamo che la centrifugazione di gradiente di densitàE l'analisi della citometria a flusso può essere utilizzata per caratterizzare queste subpopulazioni del macrofago del CNS e per studiare diversi marcatori di interesse espressi da queste cellule come abbiamo recentemente pubblicato. Così, questa tecnica può ulteriormente comprendere il ruolo dei macrofagi nei modelli di topi di malattie neurologiche e può anche essere usato per valutare gli effetti della droga su queste cellule.

Introduction

La microglia sono i macrofagi del tissue-residuo parenchimale del sistema nervoso centrale (CNS). Essi svolgono due ruoli funzionali chiave: difesa immunitaria e mantenimento dell'omeostasi CNS. In contrasto con l'MDM, che vengono continuamente rinnovate dalle cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo, le cellule microgliali si differenziano dalle cellule progenitrici primitive ematopoietiche originate dal sacco di tuorlo (YS) che colonizzarono il cervello durante lo sviluppo embrionale 1 , 2 , 3 . Nei roditori il fattore di trascrizione Myb svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo di tutti i monociti e macrofagi derivanti dal midollo osseo, ma per Yglia microglia, questo fattore è dispensabile e la differenziazione rimane dipendente dal fattore di trascrizione PU.1.

Nel sano CNS, microglia sono cellule dinamiche che continuamente esemplare il loro ambiente, scaNning e indagini per l'invasione di patogeni o danni ai tessuti 5 . La rilevazione di tali segnali inizia un percorso per risolvere il danno. La microglia va rapidamente da una morfologia ramificata a quella amoboide, seguita da fagocitosi e rilascio di vari mediatori, come citochine pro o anti-infiammatorie. Pertanto, a seconda del loro microambiente, la microglia attivata può acquisire uno spettro di stati distinti di preparazione 6 .

La microglia influenza profondamente lo sviluppo e la progressione di molti disturbi neurologici. Nei modelli roditori della malattia di Alzheimer (AD) 7 , della sclerosi laterale amyotrofica (ALS) 8 , della sclerosi multipla (MS) 9 o della malattia di Parkinson (PD) 10 , la microglia dimostra di svolgere un ruolo doppio, o indurre neurotossicità dannosa o agire In modo neuroprotettivo, che è dipendente oN la malattia specifica, la fase della malattia e se la malattia è stata influenzata dal vano immunitario sistemico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . La maggior parte delle lesioni CNS osservate nelle malattie citate sopra contengono una popolazione eterogenea di cellule mieloide, tra cui non solo microglia parenchimale, ma anche macrofagi perivascolari e meningiali, nonché MDM infiltrante CNS. Questi tipi di cellule possono contribuire in modo differenziato ai meccanismi patofisiologici legati alla lesione e alla riparazione 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . La sfida attuale per gli investigatori che stanno studiando questi modelli di malattia è stabilire se i monociti e i macrofagi periferici si infiltrano nel CNS e, in caso affermativo, a distInguiare la microglia residente da queste cellule. Infatti, le cellule microgliali sono molto plastiche; Quando sono attivati, i marcatori di re-espressione di microglia che sono solitamente espressi da monociti e macrofagi periferici. La questione si basa pertanto sull'individuazione di marcatori che possono distinguere la microglia residente dai monociti infiammatori e dai macrofagi.

La discriminazione di queste popolazioni sulle fette del cervello mediante applicazioni immunohistologiche è limitata a causa della mancanza di anticorpi specifici. Tuttavia, l'analisi della citometria a flusso è una tecnica efficace per valutare l'espressione di diversi marcatori e per distinguere le popolazioni cellulari (ad esempio, i linfociti, i macrofagi / MDM CD11b + CD45 e microglia CD11b + CD45 med ), così come le sottopopolazioni di cellule 16 , 17 , 18 . Questo protocollo descrive le procedure per l'isolamentoCellule mononucleari del topo CNS nei modelli di malattia neurologica utilizzando una dissociazione tissutale ottimizzata e enzimatica e una centrifugazione di gradiente di densità; Nonché un metodo per differenziare le popolazioni di microglia e MDM nel CNS utilizzando la citometria a flusso.

Un altro approccio è quello di eliminare la mielina e purificare le cellule utilizzando perline magnetiche coniugate a specifici anticorpi 19 , 20 , 21 . La rimozione della mielina usando le perline magnetiche anti-mieline è più costosa e influenza la vitalità e la resa delle cellule isolate 22 . Questo passaggio e la seguente separazione immunomagnetica della microglia, limitano ulteriori studi di popolazioni specifiche delle cellule immunitarie 21 , 22 .

Queste procedure forniscono un modo semplice per studiare le sottopopolazioni dei macrofagi nello sviluppo delle malattie, ePer determinare gli effetti farmacologici o le modificazioni geniche sui fenotipi macrofagi e sugli stati di attivazione.

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Protocol

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Istituto ICM e dal Comitato per gli animali etnici di Darwin, e sono trattati con il protocollo 01407.02.

1. Preparazione

  1. Preparare il cocktail di digestione in un tubo da 1,5 ml combinando le seguenti forme per ogni topo: 1 mL di fosfato bucidato salina (PBS); 123 μL di enzima di digestione (vedere tabella dei materiali) a 13 wunsch / mL (soluzione di riserva), concentrazione finale 1,6 wunsch / mL; E 5 μL DNasi I (vedere tabella dei materiali) a 100 mg / ml (soluzione di scorta), concentrazione finale 0,5 mg / ml.

2. Perfusione e dissezione

  1. Eutanizzare i topi con una dose letale di pentobarbital (100 μL a 400 mg / ml).
  2. Posizionare l'animale in posizione supina e bagnare il corpo con il 70% di etanolo.
  3. Tagliare la pelle ventrale con forbici sottili appena al di sotto del processo xifoide per esporre la cavità toracicay.
  4. Effettuare un'incisione nel diaframma e tagliare gli aspetti laterali della gabbia con una raffinata scissorsin in direzione caudale-rostrala per esporre il cuore (evitando di tagliare altri organi). Identificare il ventricolo sinistro (LV) e l'atrio destro (RA).
  5. Inserire un catetere a farfalla con un ago da 25 G all'interno del LV. Effettuare un'incisione sulla RA con forbici finissime e all'inizio del flusso sanguigno, iniziare la perfusione a 10 mL / min di portata attraverso il LV con 20 mL di PBS per rimuovere le cellule e il sangue dalle vasi; La perfusione efficace è nota dal blanching dei polmoni e del fegato in quanto il sangue viene spostato.
  6. Decapitare l'animale con forbici medio. Disseccare la colonna vertebrale con forbici fine e separarla dal corpo escitando la muscolatura della parete addominale sul lato ventrale della colonna vertebrale e tagliando la colonna vertebrale alla base della coda.
  7. Inserire una siringa da 10 ml contenente PBS e una punta pipetta montata da 200 μL nel lato lombare diLa colonna vertebrale e sciacquare il midollo spinale sul lato cervicale.
    NOTA: La punta della pipetta da 200 μL viene tagliata con forbici alla sua estremità più larga (circa 1 cm) e strettamente inserita su una siringa da 10 ml precedentemente riempita con PBS.
  8. Rimuovere la pelle sopra il cranio e utilizzare le pinze per esporre il cervello. Inserire una lama di forbice alla base del cranio e tagliare il cranio seguendo la sutura sagittale. Inserire piccole pinze nel taglio e sollevare delicatamente il cranio. Disseccare il cervello dalla testa del mouse e rimuovere la lampadina olfattiva e il cervelletto.
  9. Raccogliere il cervello e il midollo spinale in un tubo da 1,5 mL contenente 1,128 ml di PBS con il cocktail di digestione (dal punto 1.1).

3. Dissociazione delle cellule

  1. Tagliare finemente il cervello e il midollo spinale nel tubo da 1,5 ml (passo 2.9) in 1-2 mm 3 pezzi con forbici piccole ( figura 1 ).
  2. Incubare il tubo da 1,5 ml contenente i tessuti macinati per 30 minuti in un incubatoA 37 ° C con 5% di CO 2 .
    NOTA: Preparare il gradiente di densità a questo punto.
  3. Aggiungere 20 μl 0,5 M EDTA (soluzione di riserva), concentrazione finale 10 mM, al tubo da 1,5 mL per fermare la reazione enzimatica.
  4. Creare delicatamente una sospensione cellulare pipettando su e giù con una pipetta da 5 ml.
  5. Passare la sospensione cellulare attraverso una maglia di nylon (dimensioni di pori da 70 μm) in un tubo da 50 ml utilizzando lo stantuffo di una siringa da 10 ml.
  6. Lavare la maglia di nylon con 20 ml di 5% Fetal Bovine Serum (FBS) -PBS.
  7. Centrifugare per 7 minuti (300 xg) a temperatura ambiente (18 ° C). Scartare il surnatante aspirando e procedere alla fase successiva. Prestare particolare attenzione quando si rimuove il surnatante; Non disturbare il pellet, che può essere facilmente aspirato dalla pipetta aspirante.

4. Gradiente di densità

  1. Preparare una soluzione di scorta del mezzo di gradiente di densità aggiungendo la quantità appropriata di 10x PBS al mezzo di gradiente di densità.
    NOTA: Aggiunta di una parte di 10X PBS a nove parti di gradiente di densità.
  2. Diluire il medium di gradiente di densità di stock con 1x PBS per le diverse percentuali come descritto nella Tabella 1 .
  3. Riposizionare il pellet (dal punto 3.7) con 4 mL di 30% di gradiente di densità e trasferire in un tubo da 15 mL.
  4. Posizionare una pipetta Pasteur nel fondo del tubo da 15 ml e sottovalutare lentamente 4 mL di mezzo di gradiente di densità del 37%.
  5. Aggiungere 4 mL di media di gradiente di densità del 70%, come descritto in precedenza.
  6. Centrifugare il gradiente per 40 min (800 xg) a temperatura ambiente (18 ° C). Assicurarsi che la centrifuga si arresti con un minimo o nessun freno in modo che l'interfaccia non sia disturbata.
    NOTA: il tubo sarà stratificato. Le cellule stratificate all'interfaccia di gradiente di densità del 70% -37% sono le cellule immunitarie mononucleate (sottopopolazioni microglia e macrofagi); I livelli superiori sono detriti cellulari e mielina, rispettivamente ( Figura 2 ).
  7. Raccogliere 3-4 mL della interfaccia di gradiente di densità del 70-37% contenente le cellule di subpopulazioni del macrofage in un tubo pulito da 15 mL.
  8. Lavare le cellule 3x con PBS, volume totale di 15 ml. Assicurarsi che il mezzo di gradiente di densità contenente le cellule sia diluito almeno tre volte con PBS e centrifughi per 7 minuti (500 xg, 4 ° C) con il freno "on".
  9. Resuspendere il pellet cellulare con 1 ml di PBS per l'etichettatura delle cellule o per altri dosaggi funzionali.

5. Etichettatura cellulare per la citometria di flusso

  1. Trasferire le celle (punto 4.10) in un tubo di citometria a flusso.
  2. Aggiungere 1 μl di reagente per la macchiatura della cellula morta fissabile a ciascun campione di cellule ottenuto al punto 4.10. Incubare per 30 minuti in ghiaccio, protetto dalla luce.
  3. Lavare le cellule una volta con 2 ml di PBS e centrifugare per 5 min (300 xg, 4 ° C).
  4. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di cellula con400 μl PBS 1% BSA, 0,1% azide.
  5. Aggiungere 1 μg di anticorpi CD16 / CD32 a 100 μL delle cellule per bloccare i recettori Fc. Incubare 10-15 min su ghiaccio, protetto dalla luce.
  6. Preparare la miscela anticorpale primaria in PBS 1% BSA, 0,1% azide o PBS 1% BSA, 0,1% azide, 0,25% saponin, per la permeabilizzazione delle cellule per la colorazione intracellulare.
  7. Aggiungere 100 μL di anticorpi primari mescolare (2x) e incubare per 30 minuti in ghiaccio, protetto dalla luce.
    NOTA: Tutti gli anticorpi devono essere titolati prima di condurre l'esperimento per garantire risultati ottimali.
  8. Lavare le cellule con 2 ml di PBS e centrifugare per 5 min (300 xg, 4 ° C). Ripetere questo passaggio tre volte.
  9. Aggiungere 100 μL di un anticorpo secondario se gli anticorpi primari non sono direttamente coniugati a un fluoroforo e incubare per 30 minuti in ghiaccio, protetti dalla luce.
  10. Lavare le cellule con 2 ml di PBS e centrifugare per 5 min a 300 xg a 4 ° C). Ripetere questo passaggio tre volte.
  11. Fissare ilCellule con 100 μl 1% PFA per 15 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce.
    NOTA: Attenzione: il PFA è tossico. Usare in una cappa aspirante e indossare equipaggiamento protettivo personale.
  12. Lavare le cellule con 2 ml di PBS e centrifugare per 5 min a 300 xg a 4 ° C. Ripetere questo passaggio tre volte.
  13. Resuspendere il pellet cellulare con 200 μl di PBS e procedere all'acquisizione e all'analisi della citometria a flusso. Seguire la strategia di gating in Figura 3 .

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Representative Results

Dopo la centrifugazione di gradiente di densità e la colorazione degli anticorpi, le cellule sono state acquisite su un citometro di flusso e analizzate utilizzando una strategia di gating morfologica come segue. Un primo cancello è stato definito nella zona di puntamento di Forward-Spattered-Area (FSC-A) rispetto alla Forward-Spattered-Height (FSC-H) per discriminare singole celle da dublets ( Figura 3A ). Le singole cellule sono state quindi gated su FSC-A versus Side-Spattered-Area (SSC-A) dot plot per escludere detriti cellulari e cellule pyknotic, basata sulla relativa dimensione cellulare e granularità cellulare ( Figura 3B ). Quindi, la microglia e L'MDM è stato identificato sulla base dei loro livelli di espressione dei marker CD11b e CD45 ( Figura 3C , 3D ). Infine, altri marcatori di espressione sono stati analizzati per ogni sottopopolazione dei macrofagi ( Figura 3E -3G ). Il microglSono stati riportati per esprimere il CX3CR1 ma non il marker CCR2 in contrasto con MDM 23 . Recentemente, è stato dimostrato che Tmem119 è un marker specifico per microglia 19 . I seguenti marcatori (Tmem119, CX3CR1 e CCR2) sono stati valutati mediante citometria a flusso utilizzando anticorpi rivelatori specifici per ciascun marker; Tutte le cellule CD11b + CD45 med sono state dimostrate positive per i marker Tmem119 e CX3CR1, ma non per il marker CCR2, che convalida questa strategia di gating ( Figura 3E -3G ).

In assenza dell'isolamento di gradiente di densità, le subpopulazioni del macrofage non potevano essere definite nel punteggio FSC-A rispetto a SSC-A a causa della presenza di molte cellule e residui di mielina ( Figura 3H ). Da notare, il trattamento di permeabilizzazione induce un ritiro delle cellule e quindi le sottopopolazioni di macrofage sono apparse smAller nella FSC versus punteggio SSC ( Figura 3I , J ) come descritto in precedenza 24 . La vitalità delle cellule è stata determinata usando il kit di macchia morta fissabile. Dopo il gradiente di densità, l'85-95% delle cellule sono vive ( Figura 3K ). Le microglie e le popolazioni MDM possono essere definite dai marker CD45 e CD11b su un plot di punti dopo l'isolamento del cervello e delle cellule del midollo spinale in un solo campione ( Figura 3L ) e anche dal cervello o dal midollo spinale ( Figura 3M , 3N ).

Per l'etichettatura della citometria a flusso, è importante sapere se la proteina e / o l'epitopo riconosciuto dall'anticorpo sono intra- o extracellulari. Nel caso di antigeni intracellulari è necessario un tampone di permeabilizzazione. Tmem119 è una proteina transmembrana ma l'epitopo è riconosciutoDalle macchie degli anticorpi come intracellulari 19 . In assenza di permeabilizzazione delle cellule, non vi era alcuna etichettatura ( Figura 3O ). L'assenza di questa fase di permeabilizzazione potrebbe portare a falsi risultati negativi. Poiché l'anticorpo Tmem119 non è direttamente coniugato ad un fluoroforo, le cellule sono state etichettate con un anticorpo secondario; Il controllo negativo è stato solo anticorpo secondario (linea nera) ( Figura 3E , 3O-3R ). Quando vengono utilizzati anticorpi coniugati direttamente, ci sono due strategie principali per valutare l'etichettatura specifica: anticorpi isotipici come controlli negativi o controlli di fluorescenza minus (FMO). I controlli FMO contengono ogni anticorpo di etichettatura nella miscela tranne l'anticorpo di controllo per quel campione. Pertanto, è necessario un controllo FMO per ciascun marcatore, mentre è necessaria una sola miscela di etichettatura per il controllo degli anticorpi isotipici, per campione. Per l'etichettatura delle cellule immunitarie del cervello, abbiamo scelto l'isotControllando che un numero limitato di cellule (400.000 celle) si ottiene dopo il gradiente di densità da un cervello del mouse.

Figura 1
Figura 1: Fasi della procedura di dissociazione delle celle. ( A ) Il tessuto è stato collocato in un tubo con enzimi del cocktail di digestione. ( B ) Il tessuto è stato finemente tagliato in piccoli pezzi con forbici. ( C ) I piccoli pezzi di tessuto sono stati incubati per 30 minuti (37 ° C) per una digestione tissutale efficiente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Schema del gradiente di densità dopo CenFase di trifugazione. Dopo la centrifugazione, la mielina è presente nella parte superiore del gradiente di densità e le cellule immunitarie contenenti popolazioni di macrofagi si trovano all'interfaccia tra i livelli di gradiente di densità del 37% e 70%. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Analisi della citometria rappresentativa dei macrofagi. È stata applicata una strategia di logica logica: ( A ) La discriminazione dei doppi si riferisce al punto grafico FSC-A rispetto a FSC-H. ( B ) La strategia di gancio morfologico si riferisce al punto grafico FSC-A rispetto a SSC-A. ( C ) Le sottopopolazioni di macrofagi si riferiscono al punto grafico CD45 contro CD11b. ( D ) Il puntino di cellule staIned con anticorpi isotipici come controllo per la colorazione CD45 e CD11b. L'analisi dei marcatori espressi da queste due subpopulazioni di macrofage: Tmem119 ( E ), CX3CR1 ( F ) e CCR2 ( G ) (10.000 eventi in porta P2). ( J ) o dopo l'isolamento del gradiente di densità e con il trattamento permeabilizzante ( I ) o senza ( J ), i diagrammi di punti indicanti la dimensione cellulare (FSC-A) e la granularità (SSC-A) delle cellule del cervello e del midollo spinale prima del gradiente di densità . ( K ) L'istogramma della citometria a flusso illustra la percentuale di cellule morte dopo il gradiente di densità. Le porte mostrate nei diagrammi a punti illustrano la popolazione CD11b + CD45 med microglia e la popolazione MDM alta CD11b + CD45 nel cervello e nel midollo spinale ( L ) o nel cervello ( M ) o nel midollo spinale ( N ) separatamente. Analisi di Tmem119 espresseDalle sottopopolazioni macrofagi nel cervello e nelle cellule del midollo spinale permeabilizzate ( O ) o non permeabilizzate ( P ), e nel cervello ( Q ) o nelle cellule permeabilizzate del midollo spinale ( R ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Volume per 1 tubo (mL) Media di gradiente di densità 1x PBS 10x PBS 1x
Densità media gradiente 30% 1.5 0.15 3.35
Densità media gradiente 37% 1.85 0,185 2.965
Densità media gradiente 70% 3.5 0.35 1.15

Tabella 1: Composizione delle diverse percentuali del medium di gradiente di densità.

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Discussion

È stato dimostrato che la microglia e l'MDM hanno funzioni e fenotipi diversi nel CNS e quindi l'identificazione e l'analisi di queste subpopulazioni macrofagi sono essenziali per meglio capire le malattie neurologiche 9 , 18 , 25 . L'analisi della citometria a flusso utilizzando due marcatori (CD11b e CD45) consente la distinzione tra ciascuna sottopopolazione ( Figura 3C ). Questa strategia è stata precedentemente convalidata utilizzando altri marcatori specifici, come CCR2 per MDM e CX3CR1 per la microglia e un approccio recentemente sviluppato con un anticorpo a Tmem119 ( Figura 3E - 3G ). Abbiamo eseguito esperimenti con anticorpi CCR2 e CX3CR1 ( Figura 3F , 3G ) come abbiamo precedentemente pubblicato 18 . Il CD11b + CD45Med popolazione altamente espresso Tmem119 e CX3CR1 ma non CCR2 in contrasto con la popolazione alta CD11b + CD45. La popolazione elevata di CD11b + CD45 è composta da varie sottopopolazioni con o senza espressione di CCR2. L'identificazione e la caratterizzazione di queste subpopulazioni macrofagi (macrofagi perivascolari, macrofagi infiltrati, ecc. ) Sono un'ampia area di ricerca. Inoltre, i marcatori di queste popolazioni possono cambiare a seconda dei processi patologici. Infatti, la CCR2 viene ridotta quando i monociti attraversano la barriera ematoca 26 .

Gli anticorpi CD45 e CD11b hanno riconosciuto gli antigeni della superficie cellulare, quindi il trattamento permeabilizzante non è necessario. Pertanto, questa tecnica potrebbe anche essere usata per purificare ogni sottopopolazione dei macrofagi mediante la selezione delle cellule per l'analisi mRNA o altri dosaggi funzionali. È da notare che l'uso dell'enzima e della densità gradIenti possono indurre, in una certa misura, l'attivazione di microglia. Abbiamo già osservato che dopo l'isolamento, la microglia e i macrofagi esprimono l'indottabile sintesi dell'ossido nitrico (iNOS). Tuttavia, aumentato il livello di espressione iNOS osservato nella patologia rispetto alla condizione normale può essere evidenziato utilizzando questo metodo 18 . Inoltre, questa tecnica raggiunge una popolazione cellulare ben separata (singlet) con una elevata percentuale di cellule vive.

Per la replica di questo protocollo, sono presenti diversi parametri critici. L'impostazione del gradiente è più importante. La nostra esperienza indica che la preparazione dei gradienti in tubi da 15 mL contro quelli di 50 mL ottiene migliori separazioni. Se non si vedono cellule nell'interfaccia del 70-37%, la quantità di tessuto CNS utilizzato per l'isolamento cellulare dovrebbe essere considerata. Di solito raccogliamo ~ 400.000 cellule da un cervello del mouse. Sebbene questa resa fluttua da varie condizioni sperimentaliUno per una migliore visualizzazione dell'interfaccia del 70-37% è quello di rendere il livello di gradiente di densità del 37% con PBS e fenolo rosso.

Con l'aiuto di diversi laser e filtri nel citometro di flusso, questo protocollo può quantificare diversi marcatori espressi da ciascuna delle sottopopolazioni 18 dei macrofagi. Questa tecnica è utile anche per valutare il coinvolgimento di altre cellule immunitarie come le cellule T e le cellule B nello stesso campione. Infatti, le tecniche usando l'arricchimento immunomagnetico consentono solo lo studio delle popolazioni precedentemente selezionate 21 .

Nel complesso, questa tecnica costituisce uno strumento utile per caratterizzare le diverse subpopulazioni dei macrofagi nei modelli di topi di malattie neurologiche. Questa alternativa unica può valutare gli effetti del trattamento sui processi infiammatori in condizioni patologiche.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Agenzia Nazionale per la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), l'Associazione Francia Alzheimer e Bpifrance. Il nostro laboratorio è anche supportato da Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie Curie e il programma "Investigations d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Vorremmo ringraziare l'assistenza della centrale CELIS per la coltura delle cellule.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 month-old Mice Janvier C57BL/6J
Liberase TL Research Grade Sigma-Aldrich 5401020001 Digestion enzyme
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
Percoll GE Healthcare Life Sciences 17-0891-01 Density gradient medium
Cell Strainer size 70 µm Nylon Corning 731751
Venofix 25 G BRAUN 4056370
Piston syringe 10 mL Terumo SS+10ES1
Pasteur pipette 230 mm Dustcher 20420
1.5 mL tube Eppendorf 0030 123.328
15 mL tube TPP 91015
50 mL tube TPP 91050
5 mL polystyrene round bottom tube BD Falcon 352054
D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14190-094
D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+ Thermo Fisher Scientific 14200-067
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 10270-106
EDTA Sigma-Aldrich E4884
Bovine Serum Albumin solution 30% Sigma-Aldrich A7284
Paraformaldehyde 32% Solution Electron Microscopy Sciences 15714-S Caution -Toxic
Saponin Sigma-Aldrich S2002
Sodium Azide Sigma-Aldrich 47036
PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) eBioscience 45-0112
Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 eBioscience 45-4031
BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) BD Biosciences 563890
BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO BD Biosciences 562603
Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3) Abcam ab209064
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG Life Technologies A31573
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified eBioscience 14-0161 Mouse Fc Block
Fixable Dead Cell Stain Kits Invitrogen L34969
Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody R&D FAB5538A
Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control R&D IC013A
Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody R&D FAB5825P
Goat IgG PE-conjugated Antibody R&D IC108P
Centrifuge Eppendorf 5804R
Cell analyzer BD Biosciences BD FACSVERSE
Data Analysis Software FlowJo LLC FlowJo
Fine scissors F.S.T 14090-11
Standard Pattern Forceps F.S.T 11000-13
Mayo Scissors F.S.T 14010-15
Dumont #5 Forceps F.S.T 11251-20

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Immunologia Numero 124 Microglia macrofagi infiltrato cerebrale sistema nervoso centrale citometria di flusso gradiente di densità modello del topo
Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso
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Martin, E., El-Behi, M., Fontaine,More

Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (124), e55781, doi:10.3791/55781 (2017).

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