Summary
Denne protokol tilvejebringer en analyse af makrofag subpopulationerne i det voksne mus-centralnervesystem ved hjælp af flowcytometri og er nyttig til undersøgelsen af flere markører udtrykt af disse celler.
Abstract
Talrige undersøgelser har vist rollen som immunceller, især makrofager, i sygdomme i centralnervesystemet (CNS). Der er to hovedmakrofagpopulationer i CNS: (i) microgliaen, som er de residente makrofager i CNS og er afledt af æggeblomme-progenitorer under embryogenese, og (ii) de monocyt-afledte makrofager (MDM), som kan infiltrere CNS under sygdom og er afledt af knoglemarvsprogere. Rollerne i hver makrofag subpopulation varierer afhængigt af den patologi, der undersøges. Desuden er der ingen konsensus om de histologiske markører eller de kendetegnende kriterier, der anvendes til disse makrofag subpopulationer. Analysen af ekspressionsprofilerne af CD11b- og CD45-markørerne ved hjælp af flowcytometri tillader os imidlertid at skelne microglia (CD11b + CD45 med ) fra MDM (CD11b + CD45 høj ). I denne protokol viser vi, at densitetsgradientcentrifugeringenOg flowcytometrianalysen kan anvendes til at karakterisere disse CNS-makrofag-subpopulationer og at studere flere markører af interesse udtrykt af disse celler, som vi for nylig offentliggjorde. Således kan denne teknik fremme vores forståelse af makrofagens rolle i musemodeller af neurologiske sygdomme og kan også bruges til at evaluere lægemiddelvirkninger på disse celler.
Introduction
Mikroglia er de parenkymvæv-residente makrofager i centralnervesystemet (CNS). De spiller to vigtige funktionelle roller: immunforsvar og vedligeholdelse af CNS homeostasen. I modsætning til MDM, der fornyes kontinuerligt fra de hæmatopoietiske stamceller i knoglemarven, adskiller mikrogialcellerne sig fra primitive hæmatopoietiske stamceller, der stammer fra æggeblommehalsen (YS), der koloniserede hjernen under embryonisk udvikling 1 , 2 , 3 . I gnavere spiller transkriptionsfaktoren Myb en afgørende rolle i udviklingen af alle knoglemarv-afledte monocytter og makrofager, men for YS-afledt microglia er denne faktor dispensabel, og differentiering forbliver afhængig af transkriptionsfaktoren PU.14.
I det sunde CNS er microglia dynamiske celler, der konstant prøver deres miljø, scaNning og opmåling til invaderende patogener eller vævsskade 5 . Påvisningen af sådanne signaler initierer en vej for at løse skaden. Mikrogliaen skifter hurtigt fra en forgrenet morfologi til en amoeboid, som efterfølges af fagocytose og frigivelse af forskellige mediatorer, såsom pro- eller antiinflammatoriske cytokiner. Afhængigt af deres mikro-miljø kan således aktiveret microglia erhverve et spektrum af forskellige primertilstande 6 .
Mikroglia påvirker dybt udviklingen og udviklingen af mange neurologiske lidelser. I gnavermodellerne af Alzheimers sygdom (AD) 7 , Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) 8 , Multiple Sclerose (MS) 9 eller Parkinsons sygdom (PD) 10 , er microgliane vist at spille en dobbelt rolle, hvilket enten inducerer skadelig neurotoksicitet eller handler På en neuroprotektiv måde, som er afhængig oN den specifikke sygdom, sygdomsfasen og om sygdommen var påvirket af det systemiske immunrum 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . De fleste af de CNS-læsioner, der observeres i ovennævnte sygdomme, indeholder en heterogen population af myeloidceller, herunder ikke kun parenkymisk mikroglia, men også perivaskulære og meningeal-makrofager såvel som CNS-infiltrerende MDM. Disse celletyper kan differentielt bidrage til de patofysiologiske mekanismer relateret til skade og reparation 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . Den nuværende udfordring for forskere, der studerer disse sygdomsmodeller, er at fastslå om de perifere monocytter og makrofager infiltrerer CNS og i så fald at distancereIndusish den residente microglia fra disse celler. Faktisk er mikrogialcellerne meget plastiske; Når de aktiveres, gentager microglia markørerne, der normalt udtrykkes af perifere monocytter og makrofager. Spørgsmålet er derfor baseret på at identificere markører, der kan skelne den residente mikroglia fra de infiltrerende monocytter og makrofager.
Diskrimineringen af disse populationer på hjerneskiver ved immunohistologiske anvendelser er begrænset på grund af manglen på specifikke antistoffer. Flowcytometrianalyse er imidlertid en effektiv teknik til at vurdere ekspressionen af adskillige markører og at skelne cellepopulationer (for eksempel lymfocytter, makrofager / MDM CD11b + CD45 høj og microglia CD11b + CD45 med ) såvel som cellepopulationer 16 , 17 , 18 . Denne protokol beskriver procedurerne for isolering afMononukleære celler fra muse-CNS i neurologiske sygdomsmodeller ved anvendelse af en optimeret enzymatisk vævsdissociation og en densitetsgradientcentrifugering; Såvel som en metode til differentiering af mikroglia- og MDM-populationerne i CNS ved anvendelse af flowcytometri.
En anden fremgangsmåde er at eliminere myelin og rense cellerne ved anvendelse af magnetiske perler konjugeret til specifikke antistoffer 19 , 20 , 21 . Myelinfjernelse ved anvendelse af anti-myelinmagnetiske perler er dyrere og påvirker levedygtigheden og udbyttet af isolerede celler 22 . Dette trin og den følgende immunomagnetiske adskillelse af microglia begrænser yderligere undersøgelser af specifikke immuncellepopulationer 21 , 22 .
Disse procedurer giver en nem måde at studere makrofag subpopulations på i sygdomsudvikling, ogAt bestemme lægemiddelvirkningerne eller genmodifikationerne på makrofagfænotyper og aktiveringstilstande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er godkendt af Instituttet for Dyrpleje og Brug ved ICM-instituttet og af Darwin Fransk Etisk Dyreudvalg og er omfattet af protokol 01407.02.
1. Fremstilling
- Forbered fordøjelsesscocktailen i et 1,5 ml rør ved at kombinere følgende for hver mus: 1 ml phosphatbufferet saltvand (PBS); 123 μL fordøjelsesenzym (se tabel over materialer) ved 13 wunsch / ml (stamopløsning), slutkoncentration 1,6 wunsch / ml; Og 5 μl DNase I (se tabel over materialer) ved 100 mg / ml (stamopløsning), slutkoncentration 0,5 mg / ml.
2. Perfusion og Dissektion
- Euthaniser musene med en dødelig dosis pentobarbital (100 μl ved 400 mg / ml).
- Placer dyret i rygtilstand og våd kroppen med 70% ethanol.
- Skær den ventrale hud med en fin saks lige under xyphoidprocessen for at eksponere thoracic cavity.
- Lav et snit i membranen og skær siderne af ribbeholderen med fint saksin en kaudal til rostral retning for at udsætte hjertet (og undgå at skære andre organer). Identificer venstre ventrikel (LV) og højre atrium (RA).
- Indsæt et sommerfuglkateter med en 25 G nål inde i LV. Lav et snit på RA med fin saks, og i begyndelsen af blodgennemstrømning, start perfusion ved 10 ml / min strømningshastighed gennem LV med 20 ml PBS for at fjerne celler og blod fra fartøjer; Vellykket perfusion ses ved blanchering af lungerne og leveren, da blodet er fordrevet.
- Dekapitere dyret med middel saks. Dissect rygsøjlen med fin saks og adskille den fra kroppen ved at udtage bukvægs muskulaturen på den ventrale side af rygsøjlen og ved at skære rygsøjlen i bunden af halen.
- Indsæt en 10 ml sprøjte indeholdende PBS og en monteret 200 μL pipettespids ind i lændehalsiden afRygsøjlen og skylle rygmarven på livmoderhalsen.
BEMÆRK: 200 μL pipettippen skæres med saks i den bredeste ende (ca. 1 cm) og strammes på en 10 ml sprøjte, der tidligere er fyldt med PBS. - Fjern huden over kraniet og brug tang for at afsløre hjernen. Sæt et saksblad i bunden af kraniet og skær kranen efter sagittal suturen. Indsæt små tang i skæret og løft forsigtigt kraniet. Dissect hjernen fra musen hovedet og fjern olfactory pære og cerebellum.
- Saml hjernen og rygmarven i et 1,5 ml rør indeholdende 1,128 ml PBS med fordøjelsesscocktail (fra trin 1.1).
3. Celldissociation
- Finskær hjernen og rygmarven i 1,5 ml rør (trin 2.9) i 1-2 mm 3 stk. Med lille sakse ( figur 1 ).
- Inkubér det 1,5 ml rør indeholdende hakket væv i 30 minutter i en incubaTor ved 37 ° C med 5% C02.
BEMÆRK: Forbered densitetsgradienten på dette trin. - Tilsæt 20 μL 0,5 M EDTA (stamopløsning), slutkoncentration 10 mM, til 1,5 ml rør for at stoppe den enzymatiske reaktion.
- Lav forsigtigt en cellesuspension ved pipettering op og ned med en 5 ml pipette.
- Pass cellesuspensionen gennem et nylonnet (70 μm porestørrelse) i et 50 ml rør ved anvendelse af stemplet på en 10 ml sprøjte.
- Vask nylonnet med 20 ml 5% føtalt bovint serum (FBS) -PBS.
- Centrifuge i 7 minutter (300 xg) ved stuetemperatur (18 ° C). Kassér supernatanten ved aspiration og fortsæt til næste trin. Vær yderst forsigtig, når du fjerner supernatanten; Forstyr ikke pelleten, som let kan aspireres af aspirationspipetten.
4. Density Gradient
- Forbered en stamopløsning af densitetsgradientmediet ved at tilsætte den passende mængde 10x PBS til densitetsgradientmediet.
BEMÆRK: Tilsæt en del 10X PBS til ni dele densitetsgradientmedium. - Fortynd lagerdensitetsgradientmediet med 1x PBS for de forskellige procentsatser som beskrevet i tabel 1 .
- Resuspender pelleten (fra trin 3.7) med 4 ml 30% densitetsgradientmedium og overfør til et 15 ml rør.
- Anbring en Pasteur pipette i bunden af 15 ml rør og langsomt underlag 4 ml 37% densitetsgradientmedium.
- Tilsæt 4 ml 70% densitetsgradientmedium som beskrevet ovenfor.
- Centrifuger gradienten i 40 minutter (800 xg) ved stuetemperatur (18 ° C). Sørg for, at centrifugen stopper med minimal eller ingen bremse, så interfasen ikke forstyrres.
BEMÆRK: Røret vises stratificeret. Cellerne lagdelt ved grænsefladen 70% - 37% densitetsgradient er de mononucleerede immunceller (mikroglia og makrofag subpopulationer); De øvre niveauer er henholdsvis celleaffald og myelin ( figur 2 ). - Saml 3-4 ml af 70-37% densitetsgradientinterphase indeholdende makrofag subpopulationscellerne i et rent 15 ml rør.
- Vask cellerne 3 gange med PBS, samlet volumen på 15 ml. Sørg for, at densitetsgradientmediet indeholdende cellerne fortyndes mindst tre gange med PBS og centrifuger i 7 minutter (500 xg, 4 ° C) med bremsen "på".
- Resuspender cellepellet med 1 ml PBS til celle mærkning eller til andre funktionelle assays.
5. Cellemærkning til flowcytometri
- Overfør cellerne (trin 4.10) i et flowcytometri-rør.
- Tilsæt 1 μl fikserbar dødcellefarvningsreagens til hver celleprøve opnået i trin 4.10. Inkubér i 30 minutter på is, beskyttet mod lys.
- Vask cellerne en gang med 2 ml PBS og centrifuger i 5 minutter (300 xg, 4 ° C).
- Fjern supernatanten, og resuspender cellepellet med400 μl PBS 1% BSA, 0,1% azid.
- Tilsæt 1 μg CD16 / CD32 antistoffer til 100 μl af cellerne for at blokere Fc receptorer. Inkubér 10-15 min på is, beskyttet mod lys.
- Forbered den primære antistofblanding i PBS 1% BSA, 0,1% azid eller PBS 1% BSA, 0,1% azid, 0,25% saponin, til cellepermeabilisering til intracellulær farvning.
- Tilsæt 100 μL primære antistoffer blande (2x) og inkuber i 30 minutter på is, beskyttet mod lys.
BEMÆRK: Alle antistoffer bør titreres før eksperimentet gennemføres for at sikre optimale resultater. - Vask cellerne med 2 ml PBS og centrifuger i 5 minutter (300 xg, 4 ° C). Gentag dette trin tre gange.
- Tilsæt 100 μl af et sekundært antistof, hvis de primære antistoffer ikke direkte konjugeres til en fluorofor og inkuberes i 30 minutter på is, beskyttet mod lys.
- Vask cellerne med 2 ml PBS og centrifuger i 5 minutter ved 300 xg ved 4 ° C). Gentag dette trin tre gange.
- Fix denCeller med 100 μl 1% PFA i 15 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.
BEMÆRK: Forsigtig: PFA er toksisk. Brug i en dampplade og brug personlige værnemidler. - Vask cellerne med 2 ml PBS og centrifuger i 5 minutter ved 300 xg ved 4 ° C. Gentag dette trin tre gange.
- Resuspender cellepellet med 200 μl PBS og fortsæt til flowcytometriopkøb og analyse. Følg gatingstrategien i figur 3 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter densitetsgradientcentrifugering og antistoffarvning blev cellerne erhvervet på et flowcytometer og analyseret under anvendelse af en morfologisk gatingstrategi som følger. En første port blev defineret i punktprotot Forward-Spreaded Area (FSC-A) versus Forward-Spreaded-Height (FSC-H) for at diskriminere enkeltceller fra dubletter ( figur 3A ). Enkeltcellerne blev dernæst gated på DSC-A versus Side-Spreaded Area (SSC-A) punkterne for at udelukke celleaffald og pyknotiske celler baseret på den relative cellestørrelse og cellegranularitet ( Figur 3B ). MDM blev identificeret baseret på deres ekspressionsniveauer af CD11b- og CD45-markørerne ( figur 3C , 3D ). Endelig blev andre ekspressionsmarkører analyseret for hver makrofag subpopulation ( Figur 3E -3G ). MikroglIa blev rapporteret at udtrykke CX3CR1, men ikke CCR2-markøren i modsætning til MDM 23 . For nylig blev det påvist, at Tmem119 er en specifik markør for microglia 19 . De følgende markører (Tmem119, CX3CR1 og CCR2) blev vurderet ved hjælp af flowcytometri ved anvendelse af detektorantistoffer specifikke for hver markør; Alle CD11b + CD45 med celler viste sig at være positive for markørerne Tmem119 og CX3CR1, men ikke for CCR2-markøren, som validerer denne gatingstrategi ( figur 3E -3G ).
I fravær af densitetsgradientisoleringen kunne makrofag-subpopulationerne ikke defineres i punktplottet FSC-A versus SSC-A på grund af tilstedeværelsen af mange celler og myelinrester ( Figur 3H ). Bemærk, at permeabiliseringsbehandlingen fremkalder en cellekrympning, og makrofag subpopulationerne forekom smAller i FSC versus SSC dot plot ( Figur 3I , J ) som tidligere beskrevet 24 . Cellernes levedygtighed blev bestemt under anvendelse af det fixerbare døde cellefarvesæt. Efter densitetsgradienten lever 85-95% af cellerne ( figur 3K ). Mikroglia- og MDM-populationerne kan defineres af CD45- og CD11b-markørerne på en prikplot efter isolering af hjernen og rygmarvscellerne i en enkelt prøve ( Figur 3L ) og kun fra hjernen eller rygmarven alene ( Figur 3M , 3N ).
For flowcytometri-mærkning er det vigtigt at vide, om proteinet og / eller epitopen genkendt af antistoffet er intra- eller ekstracellulært. I tilfælde af intracellulære antigener kræves en permeabiliseringspuffer. Tmem119 er et transmembranprotein, men epitopen genkendesAf antistoffet pletter som intracellulær 19 . I fravær af cellepermeabilisering var der ingen mærkning ( Figur 3O ). Fraværet af dette permeabiliseringstrin kan føre til falske negative resultater. Da Tmem119-antistoffet ikke direkte konjugeres til en fluorofor, blev cellerne mærket med et sekundært antistof; Den negative kontrol var alene sekundært antistof (sort linje) ( figur 3E , 3O-3R ). Når der anvendes direkte konjugerede antistoffer, er der to hovedstrategier til vurdering af specifik mærkning: isotypeantistoffer som negativ kontrol eller fluorescensminus en (FMO) kontrol. FMO kontroller indeholder hvert mærkning antistof i blandingen bortset fra kontrolantistoffet for den prøve. Således er en FMO-kontrol nødvendig for hver markør, mens kun en mærkningsmængde er nødvendig for at kontrollere isotypeantistofferne pr. Prøve. Til mærkning af hjernens immunceller valgte vi isotYp antistoffer kontrol, da et begrænset antal celler (400.000 celler) opnås efter densitetsgradienten fra en mushjerne.
Figur 1: Trin af celledissociation Procedure. ( A ) Vævet blev anbragt i et rør med fordøjelsesscocktail enzymer. ( B ) Vævet blev fint skåret i små stykker med saks. ( C ) De små stykker væv blev inkuberet i 30 minutter (37 ° C) til effektiv vævsfordøjelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Diagram af tætheden gradient efter CenTrifugering Trin. Efter centrifugering er myelin til stede ved toppen af densitetsgradienten, og immunceller indeholdende makrofagpopulationer findes ved interfasen mellem 37% og 70% densitetsgradientlagene. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentativ flowcytometrisk analyse af makrofager. En logisk gatingstrategi blev anvendt: ( A ) Dobletdiskriminationen refererer til punktplot FSC-A versus FSC-H. ( B ) Den morfologiske gatingstrategi refererer til punktplot FSC-A versus SSC-A. ( C ) Makrofag subpopulationerne refererer til punktplot CD45 mod CD11b. ( D ) Dotplot af celler staInd med isotype antistoffer som en kontrol for CD45 og CD11b farvning. Analysen af markørerne udtrykt af disse to makrofag subpopulationer: Tmem119 ( E ), CX3CR1 ( F ) og CCR2 ( G ) (10.000 hændelser i port P2 blev erhvervet). Punkter, der viser cellens størrelse (FSC-A) og granularitet (SSC-A) i hjernen og rygmarvcellerne inden densitetsgradienten ( H ) eller efter densitetsgradientisoleringen og med permeabiliserende behandling ( I ) eller uden . ( K ) Flowcytometri histogram illustrerer procentdelen af døde celler efter densitetsgradienten. Gates vist i punktplotterne illustrerer CD11b + CD45 med microglia populationen og CD11b + CD45 høj MDM populationen i hjernen og rygmarven ( L ) eller i hjernen ( M ) eller rygmarven ( N ) separat. Analyse af Tmem119 udtryktAf makrofag subpopulationerne i hjernen og rygmarvcellerne permeabiliseres ( O ) eller ikke-permeabiliseret ( P ) og i hjernen ( Q ) eller rygmarv ( R ) permeabiliserede celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Volumen for 1 rør (mL) | Densitetsgradientmedium 1x | PBS 10x | PBS 1x |
| Densitetsgradientmedium 30% | 1.5 | 0,15 | 3,35 |
| Densitetsgradientmedium 37% | 1,85 | 0,185 | 2,965 |
| Densitetsgradientmedium 70% | 3.5 | 0,35 | 1,15 |
Tabel 1: Sammensætning af de forskellige procentdele af densitetsgradientmediet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har vist sig, at microglia og MDM har forskellige funktioner og fænotyper i CNS, og identifikation og analyse af disse makrofag subpopulationer er derfor essentielle for bedre at forstå neurologiske sygdomme 9 , 18 , 25 . Flowcytometrianalyse ved anvendelse af to markører (CD11b og CD45) muliggør sondringen mellem hver subpopulation ( figur 3C ). Denne strategi blev tidligere valideret ved anvendelse af andre specifikke markører, såsom CCR2 for MDM og CX3CR1 for microgliaen og en nyligt udviklet tilgang med et antistof mod Tmem119 ( Figur 3E - 3G ). Vi udførte forsøg med CCR2 og CX3CR1 antistoffer ( Figur 3F , 3G ) som vi tidligere offentliggjorde 18 . CD11b + CD45Med populær højt udtrykt Tmem119 og CX3CR1, men ikke CCR2 i modsætning til CD11b + CD45 høj populationen. CD11b + CD45 høj population er sammensat af forskellige subpopulationer med eller uden CCR2-ekspression. Identifikationen og karakteriseringen af disse makrofag-subpopulationer (perivaskulære makrofager, infiltrerende makrofager, etc. ) er et omfattende forskningsområde. Desuden kan markørerne for disse populationer ændre sig afhængigt af de patologiske processer. Faktisk er CCR2 nedreguleret, når monocytterne krydser blodhjernebarrieren 26 .
CD45- og CD11b-antistofferne genkendte celleoverfladeantigener, så permeabiliseringsbehandlingen er unødvendig. Derfor kan denne teknik også anvendes til at oprense hver makrofag subpopulation ved celle sortering til mRNA analyse eller andre funktionelle assays. Det bemærkes, at anvendelsen af enzymet og densitetsgradenIent kan i et vist omfang inducere microglia-aktivering. Vi har tidligere observeret, at microglia og makrofager efter isolering udtrykker den inducerbare nitrogenoxidsyntase (iNOS). Ikke desto mindre kan øget iNOS ekspressionsniveau observeret i den patologiske versus den normale tilstand fremhæves ved hjælp af denne metode 18 . Desuden opnår denne teknik en velafskilt cellepopulation (singlets) med en høj andel af levende celler.
For den vellykkede replikering af denne protokol er der flere kritiske parametre. Opstillingen af graden er mest kritisk. Vores erfaring viser, at forberedelsen af gradienterne i 15 ml rør mod 50 ml opnår bedre separationer. Hvis der ikke ses nogen celler i 70-37% grænsefladen, bør mængden af CNS væv anvendt til celleisolering overvejes. Vi samler normalt ~ 400.000 celler fra en mus hjerne. Selv om dette udbytte svinger fra forskellige eksperimentelle forholdS, en til en bedre visualisering af 70-37% grænsefladen er at lave 37% densitetsgradientlaget med PBS og phenolrød.
Ved hjælp af forskellige lasere og filtre i flowcytometeret kan denne protokol kvantificere flere markører udtrykt af hver af makrofag-subpopulationerne 18 . Denne teknik er også nyttig til vurdering af involvering af andre immunceller, såsom T-celler og B-celler i den samme prøve. Faktisk tillader teknikker, der anvender immunomagnetisk berigelse, kun undersøgelsen af de tidligere udvalgte populationer 21 .
Samlet set er denne teknik et nyttigt værktøj til at karakterisere de forskellige makrofag subpopulationer i musemodeller af neurologiske sygdomme. Dette unikke alternativ kan vurdere virkningerne af behandling på inflammatoriske processer under patologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Agence National pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer og Bpifrance. Vores laboratorium støttes også af Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie og programmet "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Vi vil gerne takke hjælpen fra CELIS cellekultur kernen facilitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25 G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
- Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
- Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target? Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
- Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
- Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
- Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
- Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
- Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
- Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).
