Summary
Denne protokollen gir en analyse av makrofag subpopulasjonene i den voksne musens sentrale nervesystem ved hjelp av flytcytometri og er nyttig for studiet av flere markører uttrykt av disse cellene.
Abstract
Tallrike studier har vist rollen som immunceller, særlig makrofager, i sentralnervesystemet (CNS) patologier. Det er to hoved makrofagpopulasjoner i CNS: (i) microgliaen, som er de residente makrofager av CNS, og er avledet fra blommesekkprogenitorer under embryogenese, og (ii) de monocytt-avledede makrofager (MDM) som kan infiltrere CNS i løpet av sykdommen og er avledet fra benmarg progenitorer. Rollene til hver makrofag subpopulasjon varierer avhengig av hvilken patologi som studeres. Videre er det ingen konsensus om de histologiske markørene eller de særegne kriteriene som brukes for disse makrofag subpopulasjoner. Analysen av ekspresjonsprofilene til CD11b og CD45 markørene ved hjelp av flytcytometri tillater oss imidlertid å skille microgliaen (CD11b + CD45 med ) fra MDM (CD11b + CD45 høy ). I denne protokollen viser vi at tetthetgradient sentrifugeringOg strømningscytometrianalysen kan brukes til å karakterisere disse CNS-makrofag-subpopulasjonene, og å studere flere markører av interesse uttrykt av disse cellene som vi nylig publiserte. Denne teknikken kan således videre forstå vår rolle for makrofager i musemodeller av nevrologiske sykdommer, og kan også brukes til å evaluere medisinske effekter på disse cellene.
Introduction
Mikroglia er de parenkymale vevsbesidige makrofager i sentralnervesystemet (CNS). De spiller to viktige funksjonelle roller: immunforsvar og vedlikehold av CNS homeostasis. I motsetning til MDM, som fornyes kontinuerlig fra de hematopoietiske stamceller i beinmargen, skiller mikroglceller seg fra primitive hematopoietiske stamceller fra opprinnelsen i eggeplommesekken (YS) som koloniserte hjernen under embryonisk utvikling 1 , 2 , 3 . I gnagere spiller transkripsjonsfaktoren Myb en avgjørende rolle i utviklingen av alle knoglemarv-avledede monocytter og makrofager, men for YS-avledet mikroglia er denne faktoren dispensabel og differensiering er fortsatt avhengig av transkripsjonsfaktoren PU.14.
I den sunne CNS er microglia dynamiske celler som hele tiden prøver deres miljø, scaNning og oppmåling for invaderende patogener eller vevskader 5 . Påvisning av slike signaler initierer en vei for å løse skaden. Mikroglia bytter raskt fra en forgrenet morfologi til en amoeboid, som følges av fagocytose og frigjøring av forskjellige mediatorer, som for eksempel pro- eller antiinflammatoriske cytokiner. Således, avhengig av mikromiljøet, kan aktivert mikroglia oppnå et spektrum av forskjellige primære tilstander 6 .
Mikroglia påvirker utviklingen og utviklingen av mange nevrologiske lidelser sterkt. I gnagermodellene av Alzheimers sykdom (AD) 7 , Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) 8 , Multiple Sclerosis (MS) 9 eller Parkinsons sykdom (PD) 10 , er microglia vist å spille en dobbel rolle, enten å fremkalle skadelig nevrotoksisitet eller skape På en nevrobeskyttende måte, som er avhengig oN den spesifikke sykdommen, sykdomsstadiet, og om sykdommen var påvirket av det systemiske immunforsvaret 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . De fleste av CNS-lesjonene observert i sykdommene nevnt ovenfor, inneholder en heterogen populasjon av myeloidceller, inkludert ikke bare parenkym mikroglia, men også perivaskulære og meningeal makrofager, samt CNS-infiltrerende MDM. Disse celletyper kan differensielt bidra til patofysiologiske mekanismer relatert til skade og reparasjon 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . Den nåværende utfordringen for etterforskere som studerer disse sykdomsmodellene er å fastslå om de perifere monocytter og makrofager infiltrerer CNS og i så fall for å distanseInnlemme bosatt mikroglia fra disse cellene. Faktisk er mikroglialcellene veldig plastiske; Når de blir aktivert, uttrykker microgliaen markørene som vanligvis uttrykkes av perifere monocytter og makrofager. Problemet er derfor avhengig av å identifisere markører som kan skille den residente mikroglia fra infiltrerende monocytter og makrofager.
Diskrimineringen av disse populasjonene på hjerneskiver ved immunohistologiske anvendelser er begrenset på grunn av mangel på spesifikke antistoffer. Imidlertid er strømningscytometrianalyse en effektiv teknikk for å vurdere ekspresjonen av flere markører og å skille cellepopulasjoner (for eksempel lymfocytter, makrofager / MDM CD11b + CD45 høye og microglia CD11b + CD45 med ), så vel som celle subpopulasjoner 16 , 17 , 18 . Denne protokollen beskriver prosedyrene for å isolereMononukleære celler fra mus CNS i nevrologiske sykdomsmodeller ved å bruke en optimalisert, enzymatisk vevsdissociasjon og en tetthetgradient-sentrifugering; Samt en metode for å differensiere mikroglia- og MDM-populasjonene i CNS ved hjelp av flytcytometri.
En annen tilnærming er å eliminere myelin og rense cellene ved å bruke magnetiske perler konjugert til spesifikke antistoffer 19 , 20 , 21 . Myelinfjerning ved hjelp av anti-myelinmagnetiske perler er dyrere og påvirker levedyktigheten og utbyttet av isolerte celler 22 . Dette trinnet og den følgende immunomagnetiske separasjonen av microglia begrenser ytterligere studier av spesifikke immuncellepopulasjoner 21 , 22 .
Disse prosedyrene gir en enkel måte å studere makrofag subpopulasjoner i sykdomsutvikling, ogFor å bestemme legemiddeleffekter eller genmodifikasjoner på makrofagfenotyper og aktiveringstilstander.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her, er godkjent av Institutt for dyrepleie og bruk i ICM-instituttet og av Darwin franske etiske dyrekomite, og dekkes under protokollen 01407.02.
1. Fremstilling
- Klargjør fordøyelsesscocktailen i et 1,5 ml rør ved å kombinere følgende for hver mus: 1 ml fosfatbuffert saltvann (PBS); 123 μL fordøyelsesenzym (se tabell over materialer) ved 13 wunsch / ml (stamløsning), sluttkonsentrasjon 1,6 wunsch / ml; Og 5 μl DNase I (se tabell over materialer) ved 100 mg / ml (stamløsning), sluttkonsentrasjon 0,5 mg / ml.
2. Perfusjon og Disseksjon
- Euthaniser musene med en dødelig dose pentobarbital (100 μl ved 400 mg / mL).
- Plasser dyret i hvilestilling og fukt kroppen med 70% etanol.
- Skjær den ventrale huden med fin saks like under xyphoidprosessen for å avsløre thoracic cavity.
- Gjør et snitt i membranen og kutt sidedelen av ribbe buret med fin saksin en kaudal til rostral retning for å utsette hjertet (og unngå å kutte andre organer). Identifiser venstre ventrikel (LV) og høyre atrium (RA).
- Sett inn et butterfly kateter med en 25 G nål inne i LV. Gjør et snitt på RA med fin sakse og ved begynnelsen av blodstrømmen, start perfusjon ved 10 ml / min strømningshastighet gjennom LV med 20 mL PBS for å fjerne celler og blod fra fartøyer; Vellykket perfusjon er kjent ved blanchering av lungene og leveren som blodet er fordrevet.
- Dekapitere dyret med middelsaks. Disseksér ryggsøylen med fin saks og skille den fra kroppen ved å fjerne bukveggen muskulaturen på den ventrale siden av ryggraden og ved å kutte vertebral kolonnen i baken av halen.
- Sett inn en 10 ml sprøyte som inneholder PBS og en montert 200 μL pipettspiss i lumbalsiden avRyggsøylen og skylle ryggmargen på livmorhalskanten.
MERK: 200 μL pipettspissen er kuttet med saks i den bredeste enden (ca. 1 cm) og stramt sett på en 10 ml sprøyte tidligere fylt med PBS. - Fjern huden over skallen og bruk tetninger for å avsløre hjernen. Sett et saksblad i bunnen av skallen og kutt kranen etter sagittal sutur. Sett inn små tanger i kuttet og løft forsiktig hodeskallen. Disseksjon hjernen fra musen hode og fjern olfaktorisk pære og cerebellum.
- Samle hjernen og ryggmargen i et 1,5 ml rør som inneholder 1,128 ml PBS med fordøyelsesscocktail (fra trinn 1.1).
3. Cell Dissociation
- Fint kutt hjernen og ryggmargen i 1,5 ml røret (trinn 2.9) i 1-2 mm 3 stk med liten saks ( figur 1 ).
- Inkubér 1,5 ml røret som inneholder hakket vev i 30 minutter i en inkubTor ved 37 ° C med 5% C02.
MERK: Forbered tetthetgradienten ved dette trinnet. - Tilsett 20 μL 0,5 M EDTA (stamløsning), sluttkonsentrasjon 10 mM, til 1,5 ml rør for å stoppe den enzymatiske reaksjonen.
- Gjør en cellepensjon forsiktig ved pipettering opp og ned med en 5 ml pipette.
- Pass cellesuspensjonen gjennom et nylonmaske (70 μm porestørrelse) i et 50 ml rør ved å bruke stemplet på en 10 ml sprøyte.
- Vask nylonsnettet med 20 ml 5% føtalt bovint serum (FBS) -PBS.
- Sentrifuger i 7 minutter (300 xg) ved romtemperatur (18 ° C). Kast supernatanten ved aspirasjon og fortsett til neste trinn. Vær ekstremt forsiktig når du fjerner supernatanten; Ikke forstyrr pellet, som lett kan aspireres av aspireringspipetten.
4. Tetthet Gradient
- Forbered en stamløsning av tetthetgradientmediet ved å tilsette den passende mengde 10x PBS til tetthetgradientmediet.
MERK: Legg en del 10X PBS til ni deler tetthet gradient medium. - Fortynn lagerdensitetsgradientmediet med 1x PBS for de forskjellige prosentsatsene som beskrevet i Tabell 1 .
- Resuspender pelleten (fra trinn 3.7) med 4 ml 30% tetthetgradientmedium og overfør til et 15 ml rør.
- Plasser en Pasteur pipette i bunnen av 15 ml rør og sakte underlag 4 mL 37% tetthet gradient medium.
- Tilsett 4 ml 70% densitetsgradientmedium, som beskrevet ovenfor.
- Sentrifuger gradienten i 40 minutter (800 xg) ved romtemperatur (18 ° C). Kontroller at sentrifugen stopper med minimal eller ingen bremse, slik at interfasen ikke forstyrres.
MERK: Røret vil vises stratifisert. Cellene lagdelt ved tetthetgrensesnittet på 70% - 37% er de mononucleerte immunceller (mikroglia og makrofag subpopulasjoner); De øvre nivåene er henholdsvis celleavfall og myelin ( figur 2 ). - Samle 3-4 ml av 70-37% densitetsgradientinterfase som inneholder makrofag subpopulasjonscellene i et rent 15 ml rør.
- Vask cellene 3x med PBS, totalt volum på 15 ml. Kontroller at tetthetgradientmediet som inneholder cellene fortynnes minst tre ganger med PBS, og sentrifuger i 7 minutter (500 xg, 4 ° C) med bremsen "på".
- Resuspender cellepellet med 1 ml PBS for cellemerking eller for andre funksjonelle analyser.
5. Cellemerking for flytcytometri
- Overfør cellene (trinn 4.10) i et strømningscytometrirør.
- Tilsett 1 μl fikserbar dødecellefargereagens til hver celleprøve oppnådd i trinn 4.10. Inkubér i 30 minutter på is, beskyttet mot lys.
- Vask cellene en gang med 2 ml PBS og sentrifuger i 5 minutter (300 xg, 4 ° C).
- Fjern supernatanten, og resuspender cellepellet med400 ul PBS 1% BSA, 0,1% azid.
- Tilsett 1 μg CD16 / CD32 antistoffer til 100 μl av cellene for å blokkere Fc reseptorene. Inkubér 10-15 minutter på is, beskyttet mot lys.
- Forbered den primære antistoffblandingen i PBS 1% BSA, 0,1% azid eller PBS 1% BSA, 0,1% azid, 0,25% saponin, for cellepermeabilisering for intracellulær farging.
- Tilsett 100 μL primære antistoffer blande (2x) og inkuber i 30 minutter på is, beskyttet mot lys.
MERK: Alle antistoffer bør titreres før eksperimentet gjennomføres for å sikre optimale resultater. - Vask cellene med 2 ml PBS og sentrifuger i 5 minutter (300 xg, 4 ° C). Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Tilsett 100 μL av et sekundært antistoff dersom de primære antistoffene ikke direkte konjugeres til en fluorofor, og inkuber i 30 minutter på is, beskyttet mot lys.
- Vask cellene med 2 ml PBS og sentrifuger i 5 minutter ved 300 xg ved 4 ° C). Gjenta dette trinnet tre ganger.
- LøsCeller med 100 ul 1% PFA i 15 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys.
MERK: Forsiktig: PFA er giftig. Bruk i avtrekksdeksel og bruk personlig verneutstyr. - Vask cellene med 2 ml PBS og sentrifuger i 5 minutter ved 300 xg ved 4 ° C. Gjenta dette trinnet tre ganger.
- Resuspender cellepellet med 200 μl PBS og fortsett til flyt-cytometrioppkjøp og analyse. Følg gatingstrategien i figur 3 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter tetthetgradient sentrifugering og antistofffarging ble cellene kjøpt på et strømningscytometer og analysert ved anvendelse av en morfologisk gatingstrategi som følger. En første gate ble definert i punktpunktet Forward-Spreaded Area (FSC-A) versus Forward-Spreaded-Height (FSC-H) for å diskriminere enkeltceller fra dubletter ( Figur 3A ). Enkeltcellene ble deretter gated på punkt-spredt-område (SSC-A) DOT-plott for FSC-A versus Side-Spredt-område (SSC-A) for å ekskludere celleavfall og pyknotiske celler, basert på den relative cellestørrelse og cellegranularitet ( Figur 3B ). MDM ble identifisert basert på deres ekspressionsnivåer av CD11b- og CD45-markørene ( Figur 3C , 3D ). Til slutt ble andre ekspressionsmarkører analysert for hver makrofag subpopulasjon ( Figur 3E -3G ). MikroglIa ble rapportert å uttrykke CX3CR1, men ikke CCR2-markøren i motsetning til MDM 23 . Nylig ble det vist at Tmem119 er en spesifikk markør for microglia 19 . Følgende markører (Tmem119, CX3CR1 og CCR2) ble vurdert ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av detektorantistoffer som er spesifikke for hver markør; Alle CD11b + CD45 med celler ble vist å være positive for markørene Tmem119 og CX3CR1, men ikke for CCR2-markøren, som bekrefter denne gatingstrategien ( Figur 3E -3G ).
I fravær av tetthetgradientisolasjon kunne makrofag-subpopulasjonene ikke defineres i punktplottet FSC-A versus SSC-A på grunn av tilstedeværelsen av mange celler og myelinrester ( Figur 3H ). Av oppmerksomhet induserer permeabiliseringsbehandlingen en cellekrympning, og makrofag-subpopulasjonene opptrådte derfor smAller i FSC versus SSC dot plot ( Figur 3I , J ) som tidligere beskrevet 24 . Cellernes levedyktighet ble bestemt ved anvendelse av det fikserbare døde cellefargesett. Etter tetthetgradienten lever 85-95% av cellene ( figur 3K ). Mikroglia- og MDM-populasjonene kan defineres av CD45- og CD11b-markørene på en punktplot etter isolering av hjernen og ryggmargscellene i en enkelt prøve ( Figur 3L ), og også fra hjernen eller ryggmargen alene ( Figur 3M , 3N ).
For flowcytometrimerking er det viktig å vite om proteinet og / eller epitopen som er gjenkjent av antistoffet er intra- eller ekstracellulært. I tilfelle av intracellulære antigener er det nødvendig med en permeabiliseringsbuffer. Tmem119 er et transmembranprotein, men epitopen er anerkjentAv antistoffet flekker som intracellulær 19 . I fravær av cellepermeabilisering var det ingen merking ( Figur 3O ). Fraværet av dette permeabiliseringstrinnet kan føre til falske negative resultater. Siden Tmem119-antistoffet ikke er direkte konjugert til en fluorofor, ble cellene merket med et sekundært antistoff; Den negative kontrollen var sekundær antistoff alene (svart linje) ( Figur 3E , 3O-3R ). Når det brukes direkte konjugerte antistoffer, er det to hovedstrategier for å vurdere spesifikk merking: isotype antistoffer som en negativ kontroll eller fluorescens Minus One (FMO) kontroller. FMO kontroller inneholder hvert merking antistoff i blandingen unntatt kontrollantistoffet for den prøven. Dermed er en FMO-kontroll nødvendig for hver markør, mens bare en merkingsblanding er nødvendig for at isotypeantistoffene kontrollerer, per prøve. For merking av hjerneimmunceller valgte vi isotYp antistoffer kontroll siden et begrenset antall celler (400 000 celler) oppnås etter tetthet gradienten fra en mus hjerne.
Figur 1: Trinn av celledissosjonsprosedyren. ( A ) Vevet ble plassert i et rør med fordøyelsescocktailenzymer. ( B ) Vevet ble finskåret i små stykker med saks. ( C ) De små biter av vev ble inkubert i 30 minutter (37 ° C) for effektiv vevsfordøyning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjema av tetthetgradient etter CenTrifugering trinn. Etter sentrifugering er myelin tilstede øverst i tetthetgradienten, og immunceller som inneholder makrofagpopulasjoner finnes i interfasen mellom 37% og 70% densitetsgradientlagene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativ Flow Cytometry Analyse av Makrofager. En logisk gatingstrategi ble anvendt: ( A ) Dobbelts diskriminering refererer til punktplott FSC-A versus FSC-H. ( B ) Den morfologiske gatingstrategien refererer til punktplott FSC-A versus SSC-A. ( C ) Makrofag subpopulasjonene refererer til punktplot CD45 versus CD11b. ( D ) Dotplottet av celler staInn med isotype antistoffer som en kontroll for CD45- og CD11b-farging. Analysen av markørene uttrykt av disse to makrofag subpopulasjoner: Tmem119 ( E ), CX3CR1 ( F ) og CCR2 ( G ) (10.000 hendelser i gate P2 ble ervervet). Punkter som viser cellens størrelse (FSC-A) og granularitet (SSC-A) i hjernen og ryggmargscellene før tetthetgradienten ( H ) eller etter tetthetgradientisolasjonen og med permeabiliserende behandling ( I ) eller uten ( J ) . ( K ) Flow cytometry histogram illustrerer prosentandelen av døde celler etter tetthet gradienten. Gates vist i punktplottene illustrerer CD11b + CD45 med mikroglia-populasjonen og CD11b + CD45 høy MDM-populasjonen i hjernen og ryggmargen ( L ) eller i hjernen ( M ) eller ryggmargen ( N ) separat. Analyse av Tmem119 uttryktAv makrofag subpopulasjonene i hjernen og ryggmargen celler permeabilized ( O ) eller ikke-permeabilized ( P ), og i hjernen ( Q ) eller ryggmargen ( R ) permeabilized celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Volum for 1 rør (mL) | Tetthet gradient medium 1x | PBS 10x | PBS 1x |
| Tetthet gradient medium 30% | 1.5 | 0,15 | 3,35 |
| Tetthet gradient medium 37% | 1,85 | 0,185 | 2,965 |
| Tetthet gradient medium 70% | 3,5 | 0,35 | 1,15 |
Tabell 1: Sammensetning av de forskjellige prosentene av tetthetgradientmediet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det har blitt påvist at microglia og MDM har forskjellige funksjoner og fenotyper i CNS, og identifikasjon og analyse av disse makrofag subpopulasjonene er derfor avgjørende for å bedre forstå nevrologiske sykdommer 9 , 18 , 25 . Flowcytometrianalyse ved bruk av to markører (CD11b og CD45) gjør det mulig å skille mellom hver subpopulasjon ( figur 3C ). Denne strategien ble tidligere validert ved å bruke andre spesifikke markører, for eksempel CCR2 for MDM og CX3CR1 for microglia, og en nylig utviklet tilnærming med et antistoff mot Tmem119 ( Figur 3E - 3G ). Vi utførte eksperimenter med CCR2 og CX3CR1 antistoffer ( Figur 3F , 3G ) som vi tidligere publiserte 18 . CD11b + CD45Med populær høyt uttrykt Tmem119 og CX3CR1, men ikke CCR2 i motsetning til CD11b + CD45 høy befolkning. CD11b + CD45 høy befolkning er sammensatt av forskjellige subpopulasjoner med eller uten CCR2 ekspression. Identifikasjon og karakterisering av disse makrofag subpopulasjonene (perivaskulære makrofager, infiltrerende makrofager, etc. ) er et omfattende forskningsområde. Videre kan markørene for disse populasjonene endres avhengig av de patologiske prosessene. Faktisk er CCR2 nedregulert når monocytene krysser blodhjernebarrieren 26 .
CD45- og CD11b-antistoffene gjenkjente celloverflateantigener, så permeabiliseringsbehandlingen er unødvendig. Derfor kan denne teknikken også brukes til å rense hver makrofag subpopulasjon ved celle sortering for mRNA analyse eller andre funksjonelle analyser. Det er lagt merke til at bruken av enzymet og tetthetsgradIent kan indusere, til en viss grad mikrogliaaktivering. Vi har tidligere observert at etter isolering uttrykker microglia og makrofager den inducerbare nitrogenoksydsyntase (iNOS). Ikke desto mindre kan økt iNOS ekspressionsnivå observert i den patologiske versus den normale tilstanden bli uthevet ved hjelp av denne metoden 18 . Videre oppnår denne teknikken en vel separert cellepopulasjon (singlets) med en høy andel av levende celler.
For en vellykket replikering av denne protokollen er det flere kritiske parametere. Oppsettet av graden er mest kritisk. Vår erfaring indikerer at å forberede gradienter i 15 ml rør mot 50 ml oppnår bedre separasjoner. Hvis ingen celler ses i 70-37% grensesnittet, bør mengden av CNS-vev som brukes til celleisolering vurderes. Vi samler vanligvis ~ 400 000 celler fra en mushjerne. Selv om dette utbyttet svinger fra ulike eksperimentelle tilstanderS, en for bedre visualisering av 70-37% grensesnittet er å lage 37% tetthetgradientlaget med PBS og fenolrød.
Ved hjelp av forskjellige lasere og filtre i strømningscytometeret kan denne protokollen kvantifisere flere markører uttrykt av hver av makrofag subpopulasjonene 18 . Denne teknikken er også nyttig for å vurdere involvering av andre immunceller, slik som T-celler og B-celler i samme prøve. Faktisk tillater teknikker som bruker immunomagnetisk anrikning bare studien av populasjonene som tidligere er valgt 21 .
Samlet sett er denne teknikken et nyttig verktøy for å karakterisere de forskjellige makrofag subpopulasjoner i musemodeller av nevrologiske sykdommer. Dette unike alternativet kan vurdere effekten av behandling på inflammatoriske prosesser under patologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer og Bpifrance. Vårt laboratorium støttes også av Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie og programmet "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Vi vil gjerne takke assistansen fra CELIS-kjerne-kjernefasiliteten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25 G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
- Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
- Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target? Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
- Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
- Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
- Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
- Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
- Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
- Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).
