Summary
Bu protokol, akış sitometrisi ile yetişkin fare merkezi sinir sisteminde makrofaj alt popülasyonlarının bir analizini sağlar ve bu hücrelerin eksprese ettiği çoklu belirteçlerin çalışması için yararlıdır.
Abstract
Birçok çalışma, merkezi sinir sistemi (CNS) patolojilerinde bağışıklık hücrelerinin, özellikle makrofajların rolünü göstermiştir. CNS'de iki ana makrofaj popülasyonu vardır: (i) MSS'nin yerleşik makrofajları olan ve embriyogenez sırasında sarı kese öncülerinden türetilen mikroglia ve (ii) sızıntı yapabilen monosit türevi makrofajlar (MDM) Hastalık sırasında MSS'dir ve kemik iliği progenitörlerinden türemiştir. Her makrofaj alt popülasyonunun rolü, incelenen patolojiye göre değişir. Dahası, histolojik belirteçler veya bu makrofaj alt popülasyonları için kullanılan ayırt edici kriterler üzerinde fikir birliği bulunmamaktadır. Bununla birlikte, akış sitometrisi ile CD11b ve CD45 markörlerinin ekspresyon profillerinin analizi, mikrogliayı (CD11b + CD45 med ) MDM'den (CD11b + CD45 yüksek ) ayırmamızı sağlar. Bu protokolde, yoğunluk gradyanı santrifüjününVe akış sitometri analizi bu CNS makrofaj alt popülasyonlarını karakterize etmek için ve yakınlarda yayınladığımız gibi bu hücreler tarafından ifade edilen birkaç ilgi işaretçisini incelemek için kullanılabilir. Bu nedenle bu teknik, nörolojik hastalıkların fare modellerinde makrofajların rolünü daha iyi anlayabilir ve ayrıca bu hücreler üzerindeki ilaç etkilerini değerlendirmek için de kullanılabilir.
Introduction
Mikrogram, merkezi sinir sisteminin (MSS) parenkimal dokuya ait makrofajlarıdır. İki önemli fonksiyonel rol oynuyorlar: Bağışıklık savunması ve SSS homeostazisinin korunması. Kemik iliğindeki hematopoietik kök hücrelerden sürekli olarak yenilenen MDM'den farklı olarak, mikroglial hücreler embriyonik gelişme sırasında beyinde koloni oluşturan yolk kesesinden (YS) kaynaklanan ilkel hematopoietik progenitör hücrelerden ayırırlar 1 , 2 , 3 . Kemirgenlerde, transkripsiyon faktörü Myb, tüm kemik iliği kaynaklı monositlerin ve makrofajların gelişiminde çok önemli bir rol oynamaktadır, ancak YS türevi mikroglia için bu faktör gerekli değildir ve farklılaşma, transkripsiyon faktörü PU.14'e bağımlıdır.
Sağlıklı CNS'de, mikroglia, çevrede sürekli olarak örnek olan dinamik hücrelerdir, scaPatojenleri veya doku hasarını işlemek için nning ve survey 5 . Bu tür sinyaller algılanması, yaralanmanın çözüm yolunu başlatır. Mikroglia, hızlıca ayrılmış bir morfolojiden amoeboid bir fogositoza ve ardından pro-veya anti-inflamatuar sitokinler gibi çeşitli mediatörlerin salınmasını izler. Böylece, mikro çevreye bağlı olarak aktive edilmiş mikroglia farklı priming durumlarından 6 oluşan bir spektrum kazanabilir.
Mikroglia, birçok nörolojik rahatsızlığın gelişimini ve ilerlemesini derinden etkilemektedir. Alzheimer hastalığının (AD) 7 , Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) 8 , Multipl Skleroz (MS) 9 veya Parkinson hastalığının (PD) 10 kemirgen modellerinde mikroglia'nın zararlı nörotoksisite indükleyen ya da etki eden iki rol oynadığı gösterilmiştir Nöroprotektif bir tarzda, bağımlı olanSpesifik hastalık, hastalık evresi ve hastalığın sistemik bağışıklık bölmesinden 7 , 8 , 9 , 10 , 11 etkilenip etkilenmediği. Yukarıda belirtilen hastalıklarda gözlenen CNS lezyonlarının çoğunda sadece parankimal mikrogram değil aynı zamanda perivasküler ve meningeal makrofajların yanı sıra CNS-sızıntılı MDM de dahil olmak üzere heterojen bir myeloid hücre popülasyonu bulunur. Bu hücre tipleri, yaralanma ve onarım ile ilişkili patofizyolojik mekanizmalara farklı şekilde katkıda bulunabilir 7,12,13,14,15. Bu hastalık modellerini inceleyen araştırmacılar için mevcut zorluk, periferik monositlerin ve makrofajların MSS'ye sızdığını ve eğer öyleyse distBu hücrelerden ikamet eden mikrogliaları kucaklayın. Aslında mikroglial hücreler çok plastiktir; Aktive edildiğinde, mikrogram genellikle periferik monositler ve makrofajlar tarafından eksprese edilen belirteçleri yeniden ifade eder. Bu nedenle, konu, yerleşik mikroglianın sızma monositleri ve makrofajları ayırt edebilen belirteçlerin belirlenmesine dayanır.
Bu popülasyonların beyin dilimleri üzerindeki immünohistolojik uygulamaları ile ayrımcılık spesifik antikorların olmaması nedeniyle sınırlıdır. Bununla birlikte, akış sitometrisi analizi, çeşitli belirteçlerin ekspresyonunu değerlendirmek ve hücre popülasyonlarını (örneğin, lenfositler, makrofajlar / MDM CD11b + CD45 yüksekleri ve mikroglia CD11b + CD45 med ) ayırmak için etkili bir teknik yanı sıra hücre alt popülasyonları 16 , 17 , 18 . Bu protokol,Optimize edilmiş, enzimatik bir doku ayrışması ve bir yoğunluk gradiyentli santrifüjleme kullanarak nörolojik hastalık modellerinde fare CNS'den alınan mononükleer hücreler; Hem de flow sitometri kullanarak CNS'de mikroglia ve MDM popülasyonlarını ayırt etmek için bir yöntem.
Bir diğer yaklaşım, miyelin'i yok etmek ve spesifik antikorlara 19 , 20 , 21 konjuge edilmiş manyetik boncuklar kullanarak hücreleri saflaştırmaktır. Anti-miyelin manyetik boncuklar kullanan miyelin giderimi daha pahalıdır ve canlılığı ve izole edilmiş hücrelerin verimi 22'yi etkiler. Bu adım ve mikroglianın izleyen immünomanyetik ayrımı, spesifik bağışıklık hücre popülasyonları 21 , 22 için ileri araştırmaları sınırlandırır.
Bu prosedürler, hastalık gelişiminde makrofaj alt popülasyonlarının incelenmesi için kolay bir yol sağlar veMakrofaj fenotipleri ve aktivasyon durumlarındaki ilaç etkilerini veya gen modifikasyonlarını belirlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler, ICM Enstitüsünde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından ve Darwin Fransız Etik Hayvan Komitesi tarafından onaylanmıştır ve 01407.02 protokolüyle kapsanmıştır.
1. Hazırlık
- Sindirim kokteylini her fare için aşağıdakileri birleştirerek 1.5 mL'lik bir tüp içerisinde hazırlayın: 1 mL Fosfat Tamponlu Salin (PBS); 13 wunsch / mL'de (stok çözeltisi) 123 uL sindirim enzimi (materyal tablosuna bakınız), son konsantrasyon: 1.6 w / sn; Ve 100 mg / mL'de (stok çözeltisi) 5 uL DNaz I (bakınız tablo), nihai konsantrasyon 0.5 mg / mL.
2. Perfüzyon ve Diseksiyon
- Fareleri ölümcül bir pentobarbital dozu (400 mg / mL'de 100 μL) ile euthanize edin.
- Hayvanı yatırın ve vücudu% 70 etanol ile ıslatın.
- Göğüs boşluğunu açığa çıkarmak için ventral cildi, xyphoid prosesin hemen altındaki ince makaslarla kesin.y.
- Diyaframa bir kesi yapın ve kalbi ortaya çıkarmak için (ve diğer organları kesmekten kaçınmak için) rostral yönde kaudal bir şekilde ince makasla göğüs kafesinin yanal yönlerini kesin. Sol ventrikül (LV) ve sağ atriyumun (RA) tanımlanması.
- LV'nin içine 25 G iğne ile bir kelebek kateteri takın. İnce makaslarla RA'ya bir kesi yapın ve kan akışının başlangıcında, damarlardan hücreleri ve kanları çıkarmak için 20 mL PBS ile LV boyunca 10 mL / dakika akış oranında perfüzyona başlayın; Başarılı bir perfüzyon akciğerlerin ve karaciğerin kanlanması nedeniyle göğüs gerilmesi ile belirtilir.
- Hayvanı orta makasla dekapatlayın. Omurga sütununu ince makaslarla parçalara ayırın ve omuriliğin ventral tarafındaki karın duvar kaslarını çıkararak ve kuyruk tabanındaki vertebral kolonu keserek vücudundan ayırın.
- PBS içeren bir 10 mL'lik şırınga yerleştirin ve bel desteğine 200 ml'lik bir pipet yerleştirin.Omurga kolu ve omurili servikal taraftan boşaltın.
NOT: 200 mcL pipet ucu en geniş ucunda (yaklaşık 1 cm) makasla kesilir ve daha önce PBS ile dolu 10 mL şırıngaya sıkıca yerleştirilir. - Kafatasının üstündeki cildi çıkarın ve beyni ortaya çıkarmak için forseps kullanın. Kafatasının tabanına bir makas bıçağı takın ve sagital sütürü takiben kafatayı kesin. Kesime küçük forseps yerleştirin ve kafatasını hafifçe kaldırın. Fare kafasından beyni ayırın ve koku ampulünü ve serebellumu çıkarın.
- Sindirim kokteyli (1. adımdan itibaren) 1.128 mL PBS içeren 1.5 mL'lik bir tüp içerisinde beyin ve omurilik toplayın.
3. Hücre Ayrışımı
- Küçük makasla 1-2 mm 3 parçaya ( Şekil 1. ) 1,5 mL tüpün (adım 2.9) beyin ve omurili ince şekilde kesin.
- Öğütülmüş dokuları içeren 1.5 mL tübü bir incuba'da 30 dakika inkübe edin37 ° C'de% 5 CO 2 ile yıkayın.
NOT: Bu adımda yoğunluk derecesini hazırlayın. - Enzimatik reaksiyonu durdurmak için 20 ml 0.5 M EDTA (stok solüsyonu), nihai konsantrasyon 10 mM, 1.5 mL tüp ekleyin.
- 5 mL pipetle aşağı yukarı pipetle hafifçe hücre süspansiyonu yapın.
- 10 mL şırınganın pistonu kullanarak 50 mL'lik bir tüpteki hücre süspansiyonunu bir naylon ağ (70 um gözenek boyutu) üzerinden geçirin.
- Naylon örgüyü 20 mL% 5 Fetal Sığır Serumu (FBS) -PBS ile yıkayın.
- Oda sıcaklığında (18 ° C) 7 dakika boyunca (300 xg) santrifüjleyin. Süpernatantı aspirasyon ile atın ve sonraki adıma geçin. Süpernatantı çıkartırken son derece dikkatli olun; Pelet rahatsız etmeyin, pellet, aspirasyon pipetiyle kolaylıkla aspire edilebilir.
4. Yoğunluk Dereceli
- Yoğunluk gradyan ortamına uygun miktarda 10x PBS ekleyerek yoğunluk gradyanı ortam stok solüsyonu hazırlayın.
NOT: Dokuz parçalı yoğunluk gradyanı ortamına bir parça 10X PBS ekleyin. - Stok yoğunluğu gradyan ortamını Tablo 1'de açıklandığı gibi farklı yüzdeler için 1x PBS ile seyreltin.
- 4 mL% 30 yoğunluk gradyan ortamı ile pelletini (adım 3.7'den) tekrar süspansiyon haline getirin ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- 15 mL'lik tüpün altına bir Pasteur pipeti yerleştirin ve yavaşça% 37'lik yoğunluk derecesi ortamının 4 mL'sini altına yerleştirin.
- Yukarıda tarif edildiği gibi 4 mL% 70 yoğunluk dereceli ortam ekleyin.
- Degrade oda sıcaklığında (18 ° C) 40 dakika boyunca (800 xg) santrifüjleyin. Santrifüjün az veya hiç frenle durduğundan emin olun, böylece ara faz rahatsız edilmez.
NOT: Boru katmanlı görünecektir. % 70 -% 37 yoğunluk gradyan arayüzünde tabakalanmış hücreler, mononükleize edilen immün hücrelerdir (mikroglia ve makrofaj alt popülasyonları); Üst düzeyler sırasıyla hücre döküntüsü ve miyelindir ( Şekil 2 ). - Temiz bir 15 mL tüp içine makrofaj alt popülasyon hücreleri içeren 3-4 mL% 70-37 yoğunluk gradiyent ara fazı toplayın.
- PBS ile hücreleri 3 kez yıkayın, toplam hacmi 15 mL. Hücrelerin bulunduğu yoğunluk gradyan ortamının PBS ile en az üç kez seyreltildiğinden ve fren "açık" konumdayken 7 dakika (500 xg, 4 ° C) santrifüje tabi tutulduğundan emin olun.
- Hücre etiketleme veya diğer fonksiyonel testler için hücre pelletini 1 mL PBS ile tekrar süspanse edin.
5. Akış Sitometrisi için Hücre Etiketleme
- Hücreleri (adım 4.10) bir akış sitometri tüpüne aktarın.
- Adım 4.10'da elde edilen her bir hücre örneğine 1 μL sabitlenebilir ölü hücre lekesi reaktifi ekleyin. Işıktan korunarak buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
- Hücreleri bir kez 2 mL PBS ve 5 dakika boyunca santrifüjle yıkayın (300 xg, 4 ° C).
- Süpernatıtıyı çıkarın ve hücre peletini400 uL PBS% 1 BSA,% 0.1 azid.
- Fc reseptörlerini bloke etmek için 100 uL hücreye 1 μg CD16 / CD32 antikoru ekleyin. Buz üzerinde 10-15 dakika inkübe edin, ışığa karşı korunun.
- İntraselüler boyama için hücre permeabilization için birincil antikor karışımı PBS% 1 BSA,% 0.1 azid veya PBS% 1 BSA,% 0.1 azid,% 0.25 saponin hazırlayın.
- Birincil antikor karışımı (2x) 100 uL ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, ışığa karşı koruyun.
NOT: Optimum sonuçların elde edilmesi için deney yapılmadan önce tüm antikorlar titrasyona tabi tutulmalıdır. - 2 mL PBS ile hücreleri yıkayın ve 5 dakika boyunca santrifüjleyin (300 xg, 4 ° C). Bu adımı üç kez tekrarlayın.
- Birincil antikorlar doğrudan bir floroforla konjuge edilmediyse 100 uL ikincil bir antikor ekleyin ve ışıktan korunarak buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
- 2 mL PBS ile hücreleri yıkayın ve 4 ° C'de 300 xg'de 5 dakika santrifüjleyin. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
- Tamir etOda sıcaklığında 15 dakika oda sıcaklığında 100 μL% 1 PFA ile yıkanır.
NOT: Dikkat: PFA toksiktir. Duman kabininde kullanın ve kişisel koruyucu ekipman giyin. - 2 mL PBS ile hücreleri yıkayın ve 4 ° C'de 300 xg'de 5 dakika santrifüjleyin. Bu adımı üç kez tekrarlayın.
- 200 uL PBS ile hücre topağı tekrar süspansiyon ve akış sitometri edinimi ve analizi devam edin. Şekil 3'deki geçiş stratejisini izleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ve antikor boyama işleminden sonra hücreler bir akış sitometresinde tutuldu ve aşağıdaki gibi bir morfolojik geçiş stratejisi kullanılarak analiz edildi. Tek hücrelerin çiftleşmelerden ayırt edilmesi için, İleri-Dağılmış-Alan (FSC-A) ve İleri-Dağılmış Yükseklik (FSC-H) karşılaştırması için bir ilk kapı tanımlanmıştır ( Şekil 3A ). Tek hücreler daha sonra göreceli hücre büyüklüğü ve hücre parçacıklığına ( Şekil 3B ) dayanılarak hücre döküntülerini ve piknotik hücreleri hariç tutmak için FSC-A'ya Karşı Yan Bölgesel Alan (SSC-A) nokta grafiklerine kapatıldılar ( Şekil 3B ). Bunun üzerine mikroglia ve MDM, CD11b ve CD45 markörlerinin ekspresyon seviyelerine dayanarak tanımlandı ( Şekil 3C , 3D ). Son olarak, diğer ifade markerlerinin her makrofaj alt popülasyonu için analiz edildi ( Şekil 3E -3G ). MikroorganizmaIa'nın MDM 23'ün aksine CCR2 markeri değil CX3CR1'i ifade ettiği bildirildi. Son zamanlarda, Tmem119'un mikroglia 19 için spesifik bir belirteç olduğu gösterilmiştir. Aşağıdaki belirteçler (Tmem119, CX3CR1 ve CCR2) her marköre spesifik detektör antikorları kullanılarak akış sitometrisi ile değerlendirildi; Tüm CD11b + CD45 med hücrelerinin, Tmem119 ve CX3CR1 markörleri için pozitif olduğu gösterildi; bu geçiş stratejisini doğrulayan CCR2 markeri için değil ( Şekil 3E -3G ) gösterildi.
Yoğunluk gradyan izolasyonun yokluğunda, birçok hücrenin ve miyelin enkazının varlığı nedeniyle, makrofaj alt popülasyonları, SSC-A'ya karşı FSC-A noktalı çizimde tanımlanamamıştır ( Şekil 3H ). Not, permeabilizasyon tedavisi hücre büzülmesine neden olur ve dolayısıyla makrofaj alt popülasyonları sm olarak görülürDaha önce tanımlanan 24 SSC nokta çizelgesine ( Şekil 3I , J ) kıyasla FSC'de aller. Hücrelerin canlılığı, sabitlenebilir ölü hücre lekesi kiti kullanılarak belirlendi. Yoğunluk gradientinden sonra, hücrelerin% 85-95'i canlıdır ( Şekil 3K ). Mikroglia ve MDM popülasyonları, tek bir numunede ( Şekil 3L ) beyin ve omurilik hücrelerinin izole edilmesinden sonra nokta işareti üzerinde CD45 ve CD11b belirteçleri ile tanımlanabilir ( Şekil 3M , 3N ).
Akış sitometrisi etiketlemesi için, antikor tarafından tanınan proteinin ve / veya epitopun hücre içi veya hücre dışı olup olmadığını bilmek önemlidir. Hücre içi antijenler söz konusu olduğunda, bir permeabilizasyon tamponu gereklidir. Tmem119 bir transmembran proteindir, ancak tanımlanan epitopAntikor lekeleri tarafından hücre içi 19 olarak . Hücrenin permeabilizasyonu yokluğunda hiçbir etiketleme olmamıştır ( Şekil 30 ). Bu permeabilizasyon adımının olmaması yanlış negatif sonuçlara yol açabilir. Tmem119 antikoru doğrudan bir flüoroforla konjuge edilmediğinden, hücreler bir ikincil antikorla işaretlenmiştir; Negatif kontrol tek başına ikincil antikordu (siyah çizgi) ( Şekil 3E , 3O-3R ). Doğrudan konjuge antikorlar kullanıldığında, spesifik etiketlemeyi değerlendirmek için iki ana stratejisi vardır: negatif kontrol olarak izotip antikorları veya Floresan Eksi Bir (FMO) kontrolleri. FMO kontrolleri, bu numune için kontrol antikoru haricinde karışımdaki her etiketleme antikorunu içerir. Bu nedenle, her markör için bir FMO kontrolü gereklidir, örnek başına izotip antikor kontrolü için sadece bir etiketleme karışımı gereklidir. Beyin bağışıklık hücrelerinin etiketlenmesi için izotermi seçtik.Bir fare beyininden yoğunluk gradiyentinden sonra sınırlı sayıda hücre (400.000 hücre) elde edildiğinden antikorların kontrolü.
Şekil 1: Hücre Ayrılma Prosedürünün Basamakları. ( A ) Doku, sindirim kokteyl enzimleri olan bir tüp içine yerleştirildi. ( B ) Doku ince makaslarla küçük parçalara kesildi. ( C ) Küçük dokular, etkili doku sindirimi için 30 dakika boyunca (37 ° C) inkübe edildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Cen'den Sonra Yoğunluk Derecesinin ŞemasıTrifugasyon Adımı. Santrifüjden sonra miyelin yoğunluk gradyanının en üstünde bulunur ve makrofaj popülasyonları içeren bağışıklık hücreleri,% 37 ve% 70 yoğunluk gradyan katmanları arasındaki ara evrede bulunur. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Makrofajların Temsilci Akış Sitometrisi Analizi. Mantıklı bir geçitlendirme stratejisi uygulanmıştır: ( A ) Çifte ayırma , FSC-H'ye karşı FSC-A nokta grafiğine işaret etmektedir. ( B ) Morfolojik geçiş stratejisi , SSC-A'ya kıyasla FSC-A nokta çizelgesini belirtir. ( C ) Makrofaj alt popülasyonları nokta çizimi CD45'e karşı CD11b'ye karşılık gelir. ( D ) hücrelerin nokta çizimi staCD45 ve CD11b boyama için bir kontrol olarak izotip antikorları ile yerleştirilmiştir. Bu iki makrofaj alt popülasyonunda ifade edilen belirteçlerin analizi: Tmem119 ( E ), CX3CR1 ( F ) ve CCR2 ( G ) (P2 kapısında 10.000 olay elde edildi). Yoğunluk gradyanı ( H ) öncesi veya yoğunluk gradiyent izolasyonundan önce ve permeabilize edici tedaviyle ( I ) veya olmadan ( J ) beyin ve omurilik hücrelerinin hücre büyüklüğünü (FSC-A) ve parçacıklığını (SSC-A) gösteren nokta grafikleri, . ( K ) Akış sitometrisi histogramı, yoğunluk gradiyentinden sonra ölü hücrelerin yüzdesini göstermektedir. Nokta çizgilerinde gösterilen kapılar, beyinde ve omurilikte ( L ) veya beyinde ( M ) veya omuriliğe ( N ) ayrı ayrı CD11b + CD45 med mikrogram popülasyonu ve CD11b + CD45 yüksek MDM popülasyonunu göstermektedir. Tmem119'un analizi analiz edildiBeyinde ve omurilik hücrelerinde makrofaj alt popülasyonları tarafından permeabilize edildi ( O ) veya geçirgenleştirilmemiş ( P ) ve beyinde ( Q ) veya omurilik ( R ) permeabilize hücrelerde. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
| 1 tüpün hacmi (mL) | Yoğunluk gradyan ortamı 1x | PBS 10x | PBS 1x |
| Yoğunluk gradyan ortamı% 30 | 1.5 | 0.15 | 3.35 |
| Yoğunluk gradyan ortamı% 37 | 1.85 | 0.185 | 2,965 |
| Yoğunluk gradyan ortamı% 70 | 3.5 | 0.35 | 1.15 |
Tablo 1: Yoğunluk Gradyan Ortamının Farklı Yüzdelerinin Bileşimi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroglia ve MDM'nin MSS'de farklı işlevlere ve fenotiplere sahip oldukları gösterildi ve bu nedenle bu makrofaj alt popülasyonlarının tanımlanması ve analizi, nörolojik hastalıkları daha iyi anlamak için gereklidir 9 , 18 , 25 . İki belirteç (CD11b ve CD45) kullanılarak yapılan akış sitometrisi analizi, her alt popülasyon arasındaki ayrımı mümkün kılar ( Şekil 3C ). Bu strateji daha önce MDM için CCR2 ve mikroglia için CX3CR1 gibi diğer spesifik belirteçleri ve Tmem119'a karşı bir antikor ile son zamanlarda geliştirilen bir yaklaşımı kullanarak doğrulanmıştır ( Şekil 3E - 3G ). Daha önce 18 yayınladığımız gibi CCR2 ve CX3CR1 antikorları ( Şekil 3F , 3G ) ile deneyler yaptık. CD11b + CD45Med popülasyonu CD11b + CD45 yüksek nüfusunun aksine Tmem119 ve CX3CR1'i yüksek oranda ifade etti, ancak CCR2'yi ifade etmedi. CD11b + CD45 yüksek popülasyonu, CCR2 ekspresyonu olan ya da olmayan çeşitli alt popülasyondan oluşur. Bu makrofaj alt popülasyonlarının tanımlanması ve karakterizasyonu (perivasküler makrofajlar, sızıntı makrofajlar, vb. ) Kapsamlı bir araştırma alanıdır. Ayrıca, bu popülasyonlar için belirteçler patolojik süreçlere bağlı olarak değişebilir. Aslında, monositler kan beyin bariyeri 26'yı geçtiğinde CCR2 aşağı regüle edilir.
CD45 ve CD11b antikorları hücre yüzeyi antijenlerini tanımıştır, bu nedenle permeabilizasyon işlemi gereksizdir. Bu nedenle, bu teknik, mRNA analizi veya diğer fonksiyonel testler için hücre sınıflandırması ile her makrofaj alt popülasyonunun saflaştırılması için de kullanılabilir. Not, enzim ve yoğunluk derecesinin kullanımıBir dereceye kadar mikroglia aktivasyonunu indükleyebilir. İzolasyon sonrasında mikroglia ve makrofajların indüklenebilir nitrik oksit sentazını (iNOS) eksprese ettiğini daha önce görmüştük. Bununla birlikte, normal koşula karşı patolojik olarak artmış iNOS ekspresyon seviyesi, bu yöntem kullanılarak vurgulanabilir 18 . Dahası, bu teknik canlı hücrelerin yüksek oranda iyi ayrılmış bir hücre popülasyonuna (tekli) ulaşır.
Bu protokolün başarıyla çoğaltılması için birkaç kritik parametre vardır. Degradenin oluşumu en kritik. Deneyimimiz, degradelerin 15 mL'lik tüplere 50 mL'ye göre hazırlanmasının daha iyi ayrılmalar sağladığını göstermektedir. % 70-37 arayüzünde hiçbir hücre görülmezse, hücre izolasyonu için kullanılan CNS dokusu miktarı düşünülebilir. Genellikle bir fare beyninde ~ 400.000 hücre toplarız. Bu verim çeşitli deney koşullarından dalgalansa daS,% 70 yoğunluk gradyan katmanı PBS ve fenol kırmızı yapmak için% 70-37 arayüzü daha iyi bir görüntüleme için bir.
Akış sitometresinde farklı lazerler ve filtreler yardımıyla, bu protokol, makrofaj alt popülasyonlarının her biri tarafından ifade edilen birkaç işaretçiyi niceleyebilir. Bu teknik, aynı numunedeki T hücreleri ve B hücreleri gibi diğer bağışıklık hücrelerinin dahil edilmesinin değerlendirilmesinde de yararlıdır. Gerçekten, immunomanyetik zenginleştirme kullanan teknikler, daha önce seçilen popülasyonların çalışılmasına izin verir 21 .
Genel olarak bu teknik, nörolojik hastalıkların fare modellerinde farklı makrofaj alt popülasyonlarının karakterize edilmesi için yararlı bir araçtır. Bu eşsiz alternatif, patolojik koşullardaki iltihaplanma süreçleri üzerindeki etkilerini değerlendirebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa edecekleri bir şeyleri yok
Acknowledgments
Bu çalışma, Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer ve Bpifrance'in hibeleriyle desteklendi. Laboratuarımızda ayrıca Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie ve "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM) programı desteklenmektedir. CELIS hücre kültürü çekirdeğinin desteğine teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 month-old Mice | Janvier | C57BL/6J | |
| Liberase TL Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401020001 | Digestion enzyme |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17-0891-01 | Density gradient medium |
| Cell Strainer size 70 µm Nylon | Corning | 731751 | |
| Venofix 25 G | BRAUN | 4056370 | |
| Piston syringe 10 mL | Terumo | SS+10ES1 | |
| Pasteur pipette 230 mm | Dustcher | 20420 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 0030 123.328 | |
| 15 mL tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL tube | TPP | 91050 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube | BD Falcon | 352054 | |
| D-PBS (1x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| D-PBS (10x) without Ca2+/Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| Bovine Serum Albumin solution 30% | Sigma-Aldrich | A7284 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Caution -Toxic |
| Saponin | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 45-0112 | |
| Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-4031 | |
| BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | BD Biosciences | 563890 | |
| BV421 Rat IgG2b, κ Isotype Control RUO | BD Biosciences | 562603 | |
| Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28 - 3) | Abcam | ab209064 | |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG | Life Technologies | A31573 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Mouse Fc Block |
| Fixable Dead Cell Stain Kits | Invitrogen | L34969 | |
| Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody | R&D | FAB5538A | |
| Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control | R&D | IC013A | |
| Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody | R&D | FAB5825P | |
| Goat IgG PE-conjugated Antibody | R&D | IC108P | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Cell analyzer | BD Biosciences | BD FACSVERSE | |
| Data Analysis Software | FlowJo LLC | FlowJo | |
| Fine scissors | F.S.T | 14090-11 | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| Mayo Scissors | F.S.T | 14010-15 | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T | 11251-20 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).
- Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).
- Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
- Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
- Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
- Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
- Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target? Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
- Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
- Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
- Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
- Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
- Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
- Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
- Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
- Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
- Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
- Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).
