Summary
Kemirgen içindeki meme bezi gelişimi tipik olarak tanımlayıcı değerlendirmeler kullanılarak veya temel fiziksel özellikleri ölçerek değerlendirilmiştir. Dallanma yoğunluğu, meme gelişiminin objektif olarak ölçülmesi güç bir göstergesidir. Bu protokol, meme bezi dallanma özelliklerinin niceliksel değerlendirmesi için güvenilir bir yöntem tanımlamaktadır.
Abstract
Artan sayıdaki çalışmalar kemirgen meme bezini bir kimyasal maruziyetin gelişimsel toksisitesini değerlendirmek için bir son nokta olarak kullanmaktadır. Bu maruziyetlerin meme bezi gelişimine olan etkileri tipik olarak ya basit boyutlu ölçümler kullanılarak ya da morfolojik özellikleri puanlayarak değerlendirilir. Bununla birlikte, gelişimsel değişiklikleri yorumlama yöntemleri geniş kapsamlı laboratuarlarda tutarsız çevirilere yol açabilir. Yaygın bir değerlendirme yöntemi gereklidir; böylece, verilerin araştırmalar arasında karşılaştırılmasından uygun yorumlamalar oluşturulabilir. Bu çalışmada meme bezi dallanma özelliklerini belirlemek için Sholl analizi yöntemi uygulanmıştır. Sholl yöntemi başlangıçta nöronal dendritik kalıpların nicelleştirilmesinde kullanılmak üzere geliştirildi. ImageJ, bir açık kaynak görüntü analiz yazılım paketi ve bu analiz için geliştirilmiş bir eklenti kullanarak, meme bezi dallanma yoğunluğu ve ameliyatın karmaşıklığıPeripubertal dişi bir sıçandan meme bezi tespit edildi. Burada açıklanan yöntemler Sholl analizinin, meme bezi gelişiminin önemli bir özelliğinin nicelenmesinde etkili bir araç olarak kullanılmasını sağlayacaktır.
Introduction
Meme bezi dallanma, bez gelişiminin bir göstergesi olarak yaygın olarak değerlendirilen bir özelliktir, ancak objektif olarak nicelik kazanmak zordur. 1953 yılında, Sholl 1 kedi görsel ve motor korteks nöronal dendritik arborization ölçülmesi için bir yöntem tarif edilmiştir ve bu yöntem için bir eklenti Ferriera ve arkadaşları 2 tarafından geliştirilmiştir. Hem nöronlar hem de meme bezleri benzer ağaç benzeri bir yapı sergilediğinden eklenti, peripubertal sıçan meme bezinin 2D görüntülerinde meme epitelyal dallanma yoğunluğunu belirlemek için kullanılmıştır. Peripubertal evre analiz için seçilmiştir, çünkü sütten kesme akademik laboratuvarlarda ve test kılavuz çalışmalarında değerlendirilen bir yaşam evresidir. Sholl analizi, ek eklentileri içeren, açık kaynak görüntü işleme paketi ImageJP olan FIJI ile dağıtılan bir eklentidir. Eklenti, bir predefin çevresini saran konsantrik halkalar dizisi oluşturur(Tipik olarak bir nöronun soma ya da bir meme bezinin birincil kanalının kaynağı) ve nesnenin en uzaktaki kısmına (çevreleyen yarıçap) uzanan bir bölgedir. Ardından halkaların her birinde oluşan kesişme sayısını (N) sayar. Eklenti ayrıca, epitel dallanmasının bozulma hızının bir ölçüsü olan bir Sholl geri dönüşüm katsayısı ( k ) döndürür.
ImageJ kullanılarak, bir meme bezinin tümüyle monte edildiği bir iskelet görüntüsü oluşturulur ve meme epitelyal alanı (MEA) ölçülür. Görüntü, Sholl analizi eklentisi kullanılarak analiz edilir ve burada kullanılmayan diğer değerler arasında N ve k için değerler iade edilir. Göğüs epitelyal dallanma yoğunluğu N / MEA hesaplanarak belirlenir. Dallanma, glandüler epitelin dış bölgelerinde ne kadar devam ettiği dallanma karmaşıklığına eşittir ve üniform distal epitel büyümesinin bir göstergesidir. K , epiteki distal azalmanın bir ölçütüdürDallanma karmaşıklığının etkili bir ölçümüdür ve meme gelişiminin güvenilir bir göstergesidir.
Bu protokol, peripubertal erkek ve dişi sıçanlarda, meme bezi tüm montajlarının iskelet görüntülerini oluşturmak ve meme dallanma özelliklerini kantitatif olarak değerlendirmek için bilgisayar destekli bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yöntem nispeten hızlıdır ve özel mikroskopi ekipmanı kullanılmasını gerektirmez. Bu yöntemin geliştirilmesi ve geçerliliği Stanko ve ark. (2015) 3 . Bu rapor aynı zamanda sıçan meme bezi bütününün hazırlanışını anlatıyor = bağlar. Benzer meme tüm montaj prosedürleri, Assis ve ark. (2010) 4 ve Plante ve ark. (2011) 5 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma için kullanılan tüm hayvan kullanımı ve prosedürleri, NIEHS Laboratuar Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve Laboratuar Hayvan Bakıcılığının akredite edilmiş bir kuruluşunun Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu için bir Kuruluşta yürütülmüştür.
1. Muayene Meme Bezleri
- Tüm slaytları ksilol geçirmez bir yöntem kullanarak önceden etiketleyin (kalem en iyi sonucu verir). Etiketi korumak için sonuna montaj çözeltisi ile örtün.
- Hayvanı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış yöntemi kullanarak euthanize edin.
- Ötenazi bittikten sonra, hayvanı bir diseksiyon tahtası üzerine sırtına yerleştirin ( Şekil 1 ). Arka kollar ters V (tutma iğneleri veya küçük iğne iğneleri iyi çalışır) ile dört uzuvun tümünü gerin ve pimleyin.
- Saçları meme örneğinden uzak tutmak için karnın% 70 etanol ile bolca püskürtülmesi.
- Forseps kullanarak, orta hatta karın cildi yukarı çekin ve ile küçük bir kesi yapmakMakasla diseksiyon yaparak, peritonun delinmemesine dikkat edin.
- İnsiziteden başlayarak, cildi boyun bölgesine kadar ve daha sonra ön ekstremiteye kadar kesiniz. Kasıktaki bölgeye kesin ve aynı taraftaki arka eklemin birinci eklemine kadar uzaklaşın; Bu kesi genellikle meme bezlerini 5 ve 6'yı ayırır. Periton kesilmesinden kaçının.
- Makasları kesmenin kör ucunu kullanarak nazikçe peritondan ayıran, forseps kullanarak bağlı meme yağ padi ile cildi geri çekin. Bildiğim kadarıyla dorsal mümkün olduğunca tamamen deri altındaki inguinal meme bezlerinde inci 4. ve 5. ortaya çıkarmak için ayırın; Cildi diseksiyon tahtasına tutturun ( Şekil 2 ).
- Yavaşça kavisli bir forseps yuvarlatılmış yan kenarı ile 5. bezinin meme dokusu kavrayarak yavaşça nick için bezi veya cilt dikkat ederek, deriden uzak bezi kesin.
- Döşeme işlemine devam et,4 ve 5. bezleri tamamen deriden kaldırılana kadar dorsal hareket ettirilmesi. Sholl analizi için başlangıç noktası olarak görev yaptığı için bezin geri kalan kısmı ile emzik bölgesinin kaldırıldığından emin olun. Meme dokusunu, bezine 4 bağlandığı vücudun dışına kesin.
- Bez bezden çıkarıldıktan sonra, eşit derecede elektrostatik yüklü, 25 mm x 75 mm x 1 mm mikroskopik bir slayt üzerine serin ve cilde temas ettiği tarafı aşağıya bakacak şekilde yerleştirin.
NOT: Yaşlı veya emzikli hayvanların bezleri için 51 x 75 x 1 mm'lik bir kayma gerekebilir. - Eldiven takarken, hava kabarcıklarını yavaşça sıkıştırın. Bezi bir plastik parafin film ve başka bir mikroskop lamı ile kapatın ve bezi slayta yapıştırmak için sıkıştırın.
NOT: Su ile dolu 50 mL'lik konik bir tüp uygun bir ağırlık olarak işlev görür. Sürgüye uymak için gereken süre, bezin kalınlığına bağlıdır. İnce, postnahTal günde (PND) 4 bez en az 30 dakika sıkıştırılmalıdır; kalın, yetişkin bezleri ise 2-5 saat kadar sürebilir.
2. Meme Tam Montajları Hazırlayın
- Kaynatma ve soğutma gerektiren karmin alum çözeltisini en az 24 saat önceden hazırlayın.
- Kırmızı alum 1 g damıtılmış su, 500 mL, alüminyum potasyum sülfat, 2.5 g (alk (SO4) 2 • 12H 2 O) çözündürülür ve 1 L'lik bir şişede, 20 dakika daha kaynatılır. Damıtılmış su kullanarak son hacmi 500 mL'ye getirin.
- Çözeltiyi bir vakum altında filtre kağıdından süzün ve saklama için soğutun.
NOT: Carmine şap çözeltisi tekrar kullanılabilir ancak renk sönmeye başlarsa atılmalıdır.
- Sabitlemeden önce, bezin slayttan çekilmemesine dikkat ederek parafin filmini bezden soyun. Slaytları bir cam sürgü boyama kavanozuna yerleştirin ve fiksatif maddeye (% 100 etan) daldırınOl, kloroform ve glasiyal asetik asit 6: 3: 1 oranda) 12-48 saat süreyle salgılandı ve bezlerin kalınlığına bağlı olarak azaltıldı.
- Sabitleyiciyi boşaltın ve 15 dakika boyunca% 70 etanol bezlerini ıslatın. Etan solüsyonunun 1 / 3'ünü dökerek ve damıtılmış suyla değiştirerek bezlerini yavaş yavaş su haline getirin. 5 dakika boyunca ıslatın. Bu işlemi üç kez tekrarlayın.
- Son durulamadan sonra, tüm etanol / su solüsyonunu boşaltın ve% 100 damıtılmış su ile değiştirin. Bezleri 5 dk bekletin.
- Damıtılmış suyu boşaltın ve bezleri karamin alum çözeltisine batırın. Kalınlığa bağlı olarak bezleri 12-24 saat boyunca boyayın.
NOT: Bezler aşırı boyanamaz, ancak çok sayıda yığın boyama zamanı aynı olmalı, böylece boyama yoğunluğu aynı olacaktır. - Karin alum çözeltisini boşaltın ve salgı bezlerini% 100 damıtılmış suda 30 s yıkayın. Boğazları 15 dakika boyunca% 70 etanol, 15 dakika süreyle% 95 etanol,20 dakika% 100 etanol.
- Kalınlığa bağlı olarak 12-72 saat boyunca ksilende ıslatarak yağ bezlerini temizleyin.
NOT: Bezler saydam olmalı (açık) olmalıdır. Herhangi bir opak (beyazımsı) alan kalırsa, yarı saydam oluncaya kadar ksilen ıslanmaya devam edin. Laktasyum veya çok kalın bezler lekelenir ve temizlenirse, bezleri tamamen temizlemek için ksilen bir kez değiştirilmelidir. - Slaytları, koldan örtmek için yeterli miktarda pipetle bir ksilen esaslı montaj ortamı ile monte edin. Hiçbir hava kabarcıklarının oluşmaması için bir lamel ekleyin.
- Slaytların kurumasına izin verin. Montaj malzemesi kururken, lamelin altına katılır ve ek montaj ortamı eklemek gerekebilir. Ek ortam olmadığında, slaytların tamamen kurumasına izin verin; Bu 2-3 hafta sürebilir.
- Slaytlar tamamen kuruduktan sonra kalan herhangi bir montaj ortamı pamuklu çubukla ve az miktarda ksilenle çıkartılabilir. Kullanmamaya dikkat edinÇok fazla ksilen, bu montaj ortamını eritebilir ve lamelleri gevşetebilir. Bu olur ve hava kabarcıkları lamel altına toplanırsa, lamel ksilen içinde çıkarılmalı ve montaj işlemi tekrar edilmelidir.
3. Analiz için bütünüyle monte edilmiş görüntüleri hazırlayın
- Makroskop veya diseksiyon mikroskopu ve uygun bir yazılım ile bir dijital kamera kullanarak tüm montajların görüntülerini ( Şekil 3 ) yakalayın.
NOT: Tüm glandüler epitel'i yakalayan herhangi bir büyütme seçilebilirken, aynı büyütmede birbiriyle karşılaştırılacak tüm tümüyle monte edilen görüntüleri yakalamak zorunludur. - ImageJ yazılımını (veya FIJI yazılımı) indirin 6 .
- "Dosya" → "Aç" ı tıklayarak ImageJ'deki mammary tüm montaj resmini açın. Freehand aletini seçin ve glandüler epitel etrafında iz yapın. "Düzenle" yi seçin & #8594; "Dışarıda temizle."
- Lenf düğümlerini düğüm etrafında dolaşarak ve Freehand aracını ve "Düzenle" → "Kes" i kullanarak çıkarın.
- "Görüntü" → "Renk" → "Kanalları Böl" i seçerek renk kanallarını ayırın. En iyi karşıtlığa sahip kanalı, tipik olarak mavi kanalı seçin.
NOT: Bir RGB görüntüsü, o görüntünün kırmızı, yeşil ve mavi bileşenlerinden oluşan bir yığıntan oluşur. Bu eylem, bu bileşenleri üç 8-bit gri tonlamalı görüntülere ayırır. - Arka planı "İşlem" i seçerek çıkartın → "Arka Planı Çıkart". İstediğiniz parametreleri seçin ve değişiklikleri önizlemek için "Önizleme" ye tıklayın.
NOT: "Çıktı Artır" seçeneği düzgün ve sürekli arka planları kaldırır. Buna ek olarak, kontrast yaratmak için "İşlem" → "Filters" → "Unsharp Mask" kullanılabilir. - Th biri seçin Aşağıdaki gürültüyü otomatik olarak gidermek için aşağıdaki yöntemleri uygulayın: şekilsizleştirin veya ayıktıkları çıkarın.
NOT: ImageJ, otomatik gürültü giderme için üçüncü bir yöntem sunmaktadır: NaN'leri kaldırın. Bununla birlikte, 32-bit görüntüleri kullandığı için NaNs kaldır komutu geçerli değildir ve geçerli yöntem 8-bit görüntüleri kullanmaktadır.- "İşlem" → "Gürültü" → "Çalkalama" seçeneklerinden birini tıklayarak despeckle komutunu kullanarak gürültüyü giderebilirsiniz.
NOT: Bu, her bir pikseli 3 × 3 mahalledeki medyan değerle değiştiren bir medyan filtre eklemeye eşdeğerdir. - "İşlem" → "Gürültü" → "Dışarı Unsurları Kaldır" ı seçerek dışlayıcıları kaldır komutunu kullanarak gürültüyü giderme.
NOT: Bu işlem bir pikseli medyandan belirli bir değerden (eşik) fazla saparsa, hemen çevredeki piksellerin ortanca ile değiştirir.
- "İşlem" → "Gürültü" → "Çalkalama" seçeneklerinden birini tıklayarak despeckle komutunu kullanarak gürültüyü giderebilirsiniz.
- Kalan parazitleri manuel olarak çıkarın (Lass = "xfig"> Şekil 4).
- Orijinal görüntünün bir kopyasını açın ve bunu neyin ve neyin gürültülü olmadığının bir kılavuzu olarak kullanın. Araç çubuğunun en sağındaki çift kırmızı ok düğmesini tıklayın. Çizim Araçları'nı seçin; Çizim Aracı düğmeleri araç çubuğunda görünecektir.
- Silgi aracını tıklayın. Silgi aletini sağ tıklayarak Silgi çapını ayarlayın. Gürültüyü silmek için sol fare tuşunu basılı tutun.
NOT: Tek bir silme oturumu geri alınabilir. Sol fare düğmesi serbest bırakıldıktan ve tekrar tıklandıktan sonra, önceki silme işlemi geri alınamaz.
- "Görüntü" → "Ayarla" → "Eşik" i seçerek eşiği ayarlayın. Bezin yeterli gösterimi elde edilinceye kadar kaydırıcıları minimum (üst kaydırıcı) ve maksimum (alt kaydırıcı) eşik değerlerini ayarlamak için hareket ettirin.
NOT: Eşik değer ayarını yapmak, gri tonlamalı görüntüleri ilgi ve arka plan özelliklerine ayırır.- Uygula'ya tıklayın. Gerekirse, 3.6.1 ve 3.6.2 adımlarını takip ederek bu noktada ek gürültüyü giderin.
- Glandüler epitelin eşik değerler ve gürültü giderme ile çıkarılan bölümlerini yeniden yapılandırın ( Şekil 5 ).
- Orijinal imajın bütünlüğünü korumak için görüntü yeniden yapılandırmayı dikkatlice ve en az düzeyde gerçekleştirin. Epitel nedir ve neyin olmadığı konusunda bir referans için orijinal görüntüye bakın.
- Püskürtme Can aracı (Çizim Araçları araç çubuğunda) üzerine tıklayın. Püskürtme Cihazı alet düğmesine sağ tıklayarak püskürtme çapını ve hızını ayarlayın. Sol fare düğmesini tıklayarak veya basılı tutarak bezin eksik bölümlerini dikkatlice doldurun.
- Sholl Analizini gerçekleştirmek için bezin iskelet görüntüsünü oluşturun. Eşleştirilmiş görüntünün ikili olduğundan emin olun "İşlem" → "İkili" → "B Yap inary."
- Resim siyah bir zeminde beyaz ise, "İşlem" → "İkili" → "Seçenekler" i seçin ve "Siyah Arka Plan" ı işaretini kaldırın. "İşlem" → "İkili" → "İskelet haline getir" i seçerek görüntüyü iskelet haline getirin.
NOT: Bu, art arda pikselleri, tek piksel genişliğine sahip bir şekle indirilinceye kadar ikili görüntünün kenarlarından kaldırır. - "İşlem" → "İkili" → "Dilate" seçeneklerini seçerek görüntüyü bir kez genişletin.
NOT: Bu, ikili görüntülerin kenarlarına piksel ekleyerek eşik değerleme ve iskelet oluşturmayla oluşan boşlukları doldurur.
- Resim siyah bir zeminde beyaz ise, "İşlem" → "İkili" → "Seçenekler" i seçin ve "Siyah Arka Plan" ı işaretini kaldırın. "İşlem" → "İkili" → "İskelet haline getir" i seçerek görüntüyü iskelet haline getirin.
- "Dosya" → "Farklı Kaydet" i seçerek görüntüyü kaydedin. Bir resim türü seçin (genellikle jpeg), dosya adını girin ve "Tamam" ı tıklayın.
- İskeletlenmiş görüntünün orijinal resmin üzerine bindirilerek doğruluğunu kontrol edin (Ass = "xfig"> Şekil 6).
- Hem orijinal resmi hem de iskeletlenmiş görüntüyü açarak bir kaplama oluşturun. "Görüntü" → "Yer paylaşımı" → "Resim Ekle" seçeneğini seçin. "Resim Ekle" iletişim kutusunda, "Eklenecek Görüntü" açılır menüsünden iskelet görüntüsünü seçin ve opaklığı% 30 olarak ayarlayın.
- "Dosya" → "Farklı Kaydet" i seçerek orijinal üzerine yerleştirilen iskelet görüntüsünün görüntüsünü kaydedin. Bir resim türü seçin, dosya adını girin ve "Tamam" ı tıklayın.
4. Sholl Analizinin Uygulanması
- Bir iskelet görüntüsü açın ve "İşlem" → "İkili" → "İkili Yap" seçerek görüntü ikili yapın.
- Büyütme ölçeğini ayarlamadan önce, görüntülerin çekildiği büyütme için bir mikrometre kullanarak piksel / mm sayısını ölçün.
- Ölçülen büyütme s"Analyze" (Analize Et) → Set Scale (Ölçeği Ayarla) seçeneklerini kullanarak seçiminizi yapın. Piksel / mm sayısını girin. "Bilinen Uzaklık" ve "Piksel Boy Oranı" nı her ikisine de 1'e ayarlayın. "Uzunluk Birimi" için "mm" yazın ve "Küresel" seçeneğini işaretleyin (her görüntü için aynı ölçeği korur).
- Birincil kanalın başlangıcından (analiz merkezi) glandüler epitelyumun en uzak noktasına bir çizgi çizerek Sholl analizi için bitiş yarıçapını (yarıçap çevresi) belirleyin ( Şekil 7 ).
- Çıktı noktaları arasında bir çizgi çizmek için araç çubuğundaki çizgi çizim aracını kullanın. Bir ölçüm yapmak için "M" tuşuna basın ve bir sonuç penceresi açılacağını unutmayın.
NOT: "Uzunluk" sütunundaki değer çizginin mm cinsinden uzunluğudur. Bu değer, Sholl parametrelerini ayarlarken Bitiş Yarıçapı olarak otomatik olarak girilir. Sholl eklentisi başlangıç noktasını kullanacakÇizgisinin merkezi halkaların merkezi olarak görülmesi.
- Çıktı noktaları arasında bir çizgi çizmek için araç çubuğundaki çizgi çizim aracını kullanın. Bir ölçüm yapmak için "M" tuşuna basın ve bir sonuç penceresi açılacağını unutmayın.
- Sholl Analizini Çalıştırmak.
- Analizleri "Eklentiler" "Gelişmiş Sholl Analizi;" seçeneğini seçerek çalıştırın. Bir parametre penceresi belirecektir.
- Başlama Yarıçapını "I. Kabukların Tanımı" ndan 0.00 mm'ye ayarlayın; Adım 4.2'de ölçülen çizginin uzunluğu "Sonlandırma Yarıçapı" olarak otomatik olarak girilir.
- "Radius Step Size" 'yi 0.1 mm olarak ayarlayın.
NOT: Yarıçap basamağı boyutu, çalma sayısını belirler (etkin olarak yineleme sayısı); Daha küçük bir adım boyutu halka sayısını artıracak, daha büyük bir adım boyutu halka sayısını azaltacaktır. Çok küçük bir yarıçapa gereksiz yere fazla sayıda halka gelmesine rağmen, yarıçap çok küçük ayarlanamaz. Bununla birlikte, çok fazla ayarlanabilir, bu daha az zil sesi oluşturacak ve ardından gerçek kesişim sayısını hafife alacaktır. Stanko ve ark.(2015) adım boyutunun belirlenmesi hakkında daha fazla bilgi için. - "II. Her Radius İçin Birden Çok Örnek" bölümünde "# Örnekler" i "1" ve "Bütünleştirme" yı "Ortalama" olarak ayarlayın.
- "Kapanış yarıçapı kesilmesi" ni 1 olarak ayarlayın ve "III. Tanımlayıcılar ve Eğri Bağlantı" daki "# Birincil dallar" için "başlangıç yarıçapından çıkarsama" nı kontrol edin.
NOT: "Profil ve tanımlayıcı hesapla" ve "Dayanım detaylarını göster" istenen şekilde kontrol edilebilir. - "Doğrusal Olmayan Profillerde" "Doğrusal" yı kontrol edin ve "En uygun derece" seçeneğini seçin; "En bilgilendirici" seçeneğini işaretleyin. "IV.Soll Yöntemleri" nde "Normalleştirilmiş Profiller İçin Alan" ı seçin.
- Kavsakların ısı haritasını oluşturmak için "V. Çıktı seçenekleri" nde "Kesişme Noktası Maskesi Oluşturma" yı kontrol edin (isteğe bağlı).
- Bölgeyi doğrulamak için halkalı görüntülerin önizleme penceresi oluşturmak için "Cf. Segmentation" a tıklayın.Analiz.
- Analizi çalıştırmak için "Tamam" ı tıklayın.
5. ÇÇA'nın ölçülmesi
- Epitelyal ağacın etrafındaki en kısa mesafeyi izleyerek MEA'yı ölçün ( Şekil 8 ).
- ImageJ'de, bezin iskelet görüntüsü açıkken, Çokgen aracını tıklatın. Poligonu başlatmak, bezin çevresini dolaşmak ve bir çizgi parçası eklemek için tıklamak için epitel ağacının çevresindeki bir noktayı tıklayın.
- Epitel bölgesinin tamamı engellendiğinde, çokgeni kapatmak için çift tıklayın. Bir sonuç penceresi açmak için "M" tuşuna basın; "Alan" sütunundaki değer MEA'dır.
- Glandüler epitelin lenf düğümünün ötesine geçtiği durumlarda, dallanma yoğunluğunu hesaplarken lenf nodu alanını (LNA) MEA'dan çıkarın.
- Aynı adamdaki lenf nodunu izleyerek LNA'yı ölçünEr epitel ağacı olarak ve "M" basarak.
NOT: Bu durumlarda LNA, MEA'dan çıkartılmalıdır, çünkü lenf düğümü analizin LNA içindeki kesişim noktalarını saymasını engeller. Epitel lenf düğümüne ulaşmadığında LNA sıfırdır.
- Aynı adamdaki lenf nodunu izleyerek LNA'yı ölçünEr epitel ağacı olarak ve "M" basarak.
6. Raporlama Verileri
- Çevreleyen yarıçap, MEA, N, k ve dallanma yoğunluğu için rapor değerleri.
NOT: Çevreleyen yarıçap adım 4.2'de belirlenir ve MEA adım 5.1'de belirlenir.- Bir Sholl sonuçları penceresi oluşturmak için analizi çalıştırın.
NOT: Bildirilen N toplam kesişim değeridür. Bildirilen k , Sholl gerileme katsayısının (yarı log) değeridır. Sholl analizi, glandüler epitelyumun herhangi bir ölçülen bölgesi üzerinden k değeri döndürür. Tam epitel üzerinden k için doğru bir değer elde etmek için duktal uçlar bulunmalıdır. - Değiştir değiştirE Dallanma yoğunluğunu (bu yöntemin temel bitiş noktası) hesaplamak için N için çıkış değerini kullanarak meme bezi için Sholl analizi. Dallanma yoğunluğunu N / (MEA-LNA) formülü kullanarak hesaplayın ve değeri N / mm 2 olarak kaydedin.
- Bir Sholl sonuçları penceresi oluşturmak için analizi çalıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ölçülen kapalı yarıçap, MEA, N, k için değerler ve bu protokolde analiz edilen meme bezi için hesaplanan dallanma yoğunluğu Tablo 1'de gösterilmektedir . Sholl analizi, her yarıçaptaki kesişim sayısının doğrusal ve yarı-loglu grafikler oluşturur ( Şekil 9 ) ve eğer seçilirse, kesişimlerin bir ısı haritasını oluşturur ( Şekil 10 ). Az gelişmiş bezler aynı MEA içerisinde daha az kavşak sergiler ve bu nedenle daha düşük dallanma yoğunluğuna sahiptir. İyi gelişmiş bir bez tüm glandüler epitel boyunca, özellikle distal bölgelerde düzgün bir şekilde dalmaya devam edecektir. Bu bölgelerde dallanmanın ne derecede devam ettiği dallanma karmaşıklığı olarak tanımlanabilir ve karmaşıklıktaki azalmalar çürüme oranı (veya Sholl gerileme katsayısı, k ) olarak iletilir. Çürüme oranı distal epitel sutyenindeki değişimi yansıtıyorNching ve kapalı yarıçapı ( yani, epitelin boyuna büyümesi) karşı çizilen kesişimlerin sayısının çizgisinin eğimi olarak ölçülür. Böylece, Sholl geri çekilme katsayısı log (N / S) = - k r + m'ye karşılık gelen log (N / S) ile radyal mesafeye (r) ait çizginin eğimini alarak hesaplanır; burada N Yarıçap r ve alan S'nin her halkası için kesişme sayısı (πr 2 ) ve m, kesişim noktasıdır. Eğim - k , kesişimlerin çürümesini açıkladığından, - k = 0 değeri sıfır bozunumu ve analiz merkezinden epitel kenarına düzgün dallanma anlamına gelir. Seyrek olarak gelişen bezlerde dallanma çürüğü artar; Epitelyal ağacın distal bölgesinde az kesişme noktası vardır; Ve eğim, k , arttırılır. Bu nedenle, k'nin 0'a yaklaşan değerleri daha büyük distal dallanma ( yani, dallanma karmaşıklığı) ve bir kuyu-gelişmiş meme bezi.
Şekil 1: Ventral Görünüm. Yetişkin bir dişi Sprague Dawley sıçanının ventral kısmının görüntüsü, sıçanın diseksiyon yüzeyinde nasıl sabitleneceğini ve meme çizgileri ile birlikte 12 meme bezi bulunduğunu gösterir. * 6 ve 7 bezlerinin meme uçları görünmez. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Dişi Sıçan Meme Bezi. Maruz kalan meme bezleri 4 (MG4) ve 5 (MG5), cildin MG4'ün üstündeki ve MG5'in hemen altındaki diseksiyon yüzeyine sabitler. Bezler sk'den çıkarılmalıdır MG5'ten başlayarak MG5 ve 4 tamamen çıkarılana kadar yukarı ve dorsal olarak devam eder. Emzik, bezin 4 distal bölgesinde bulunur ve bu alanı toplamak için özen gösterilmelidir. Referans için lenf nodu gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Meme Bezi Tüm montaj. Bir doğum gününde 25 kadın Sprague Dawley sıçanından toplanan bir meme bezi görüntüsü. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
.jpg "/>
Şekil 4: Gürültünün Kaldırılması. Meme bütün montaj görüntüsünün mavi renk kanalı, arka plan çıkarılır. ( A ) gürültülü örnekler gösterir. Oklar, kan damarları tarafından oluşturulan gürültüyü gösterir ve duktal uçları çevreleyen daha gölgeli bölge, arka planın çıkarılmasıyla oluşturulan bir gürültünün bir örneğidir. ( B ), gürültü çıkarıldıktan sonraki görüntüyü gösterir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: Görüntü Yeniden Yapılandırma. Eşik görüntünün silinen kısımlarının yeniden yapılandırılması. ( A ) Kırmızı oklar, eşikleme nedeniyle resmin bölümlerinin kaybolduğu bölgeleri gösterir. Görüntü yeniden oluşturmaBu bölgelerde müzakere yapılmalıdır. ( B ) Silinen bölgeleri yeniden yapılandırdıktan sonra yapılan meme görüntüsü. Görüntü yeniden yapılandırılması, orijinal görüntünün bütünlüğünü korumak için dikkatli ve az düzeyde yapılmalıdır . Bu şekli daha büyük görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: İskeletlenmiş bir Görüntünün Örtüsü. Orijinal tümüyle montaj görüntüsüne bindirilmiş iskelet görüntüsü gösteren yer paylaşımı resmi. Bu görüntü, iskelet haline getirilmiş bezin, gerçek bezin dallanmasını yüksek bir doğruluk derecesinde yansıttığını göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 7: Çemberin Radius'u. Kapsüllenen yarıçapın ölçülendiği (sarı) bir meme tüm montajının iskelet görüntüsü. Çizgi, epitel ağacının tabanında (analiz merkezi) başlamalı ve epitelin en uzak noktasına kadar uzanmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 8: Meme Epitelyal Alanı. İskelet görüntüsü, MEA'yı belirlemek için epitelin etrafında izlenen bir poligonu göstermektedir. Daha büyük bir veriyi görmek için lütfen tıklayınızBu rakamın adı.
Şekil 9: Sholl Plot Çıktısı. Her bir radyal artımda kavşak sayısının doğrusal ( A ) ve yarı-log ( B ) çizimlerinin siluik çıktısı. Panelde (A) kırmızı nokta, merkezin (geometrik merkezin) yatay eksenidür. Kırmızı çizgi 10. -90 persentil üzerinde lineer regresyon ise panel (B) 'de, mavi çizgi, verilerin tam aralığı üzerinde lineer regresyon. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 10: Kavşak Maskesi. "Create InterBölümler Maske "seçeneği seçildiğinde (adım 4.3.7), analiz, görüntünün çevreleyen yarıçapı boyunca kesişme sayısının bir ısı haritasını çıkartır Bu ısı haritası, epitel boyunca dallanma kesişme noktalarının yoğunluğunu yansıtır (kırmızı = sıcak = Yüksek yoğunluklu, mavi = soğuk = düşük yoğunluk) Tüm epitel, k = 0 olan bir görüntünün ısı haritasında aynı renge sahip olur . Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Muhafaza Yarıçapı (mm) | MEA (mm2) | N- | k | Dallanma Yoğunluğu (N / mm2) |
| 7.4 | 71.7 | 2381 | 0.73 | 33.2 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting board | NA | NA | A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable. |
| Dissecting T-Pins | Daigger | EF7419A | |
| Spray bottle with ethanol | NA | NA | 70% ethanol is suitable. |
| Curved dissecting scissors | Fine Science Tools | 14569-09 | |
| Straight dissecing scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11003-12 | |
| Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mm microscope slides | ThermoFisher Scientific | 4951PLUS-001 | Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 24 x 60 x 1 mm | Fisher scientific | 12-548-5P | |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Fisher scientific | 13-374-12 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | A9967 | |
| Ethanol absolute, ≥99.8% (GC) | Sigma-Aldrich | 24102 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Carmine alum | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| Aluminum potassium sulfate | Sigma-Aldrich | A6435 | |
| Permount mounting media | Fisher Scientific | SP15 | |
| Macroscope | Leica | Z16 APO | This is the image capturing hardware and software used in this laboratory. As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories. |
| Digital camera | Leica | DFC295 | |
| Camera software | Leica | Leica Application Suite v3.1 | |
| ImageJ software | Open source | http://imagej.net/Welcome | |
| Sholl analysis | Open source | http://imagej.net/Sholl_Analysis |
References
- Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
- Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
- Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
- Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).
- Ferreira, T. Sholl Analysis. ImageJ. , Available from: http://imagej.net/Sholl_Analysis (2012).
- Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012).
- Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
- Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
- Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5 (2011).
- Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373 (2013).
- Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
- Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
- Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).
Tags
Gelişimsel Biyoloji Sayı 125 Meme bezi Sholl analizi üreme bütün montaj toksikoloji sıçan modeli View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
