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Developmental Biology

Sholl 분석법을 이용한 유방 내 유선 마운트의 분지 밀도 정량화

doi: 10.3791/55789 Published: July 12, 2017

Summary

설치류의 유선 선생 발달은 일반적으로 기술적 평가를 사용하거나 기본적인 신체적 속성을 측정하여 평가되었습니다. 분지 밀도는 객관적으로 정량화하기 어려운 유방 발달의 지표입니다. 이 프로토콜은 유선의 분기 특성의 정량 평가를위한 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다.

Abstract

점점 더 많은 수의 연구가 설치류 유선을 화학 물질 노출의 발달 독성을 평가하기위한 종점으로 이용하고있다. 이러한 노출이 유선 분화에 미치는 영향은 일반적으로 기본 치수 측정을 사용하거나 형태 학적 특성을 채점하여 평가됩니다. 그러나 발달 변화를 해석하는 광범위한 방법은 실험실 간 일관성없는 번역을 초래할 수 있습니다. 연구를 통해 비교되는 데이터로부터 적절한 해석이 형성 될 수 있도록 일반적인 평가 방법이 필요합니다. 본 연구는 유선의 분지 특성을 정량화하기위한 Sholl 분석 방법의 적용을 기술한다. Sholl 방법은 원래 신경 돌기 패턴을 정량화하는데 사용하기 위해 개발되었습니다. 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어 패키지 인 ImageJ와이 분석을 위해 개발 된 플러그인을 사용하여 유선 분지 밀도와 am혈관 주위 암컷 쥐의 유선이 결정되었다. 여기에 설명 된 방법은 유선 개발의 중요한 특성을 정량화하기위한 효과적인 도구로 Sholl 분석의 사용을 가능하게합니다.

Introduction

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유선 분지는 일반적으로 분비선 발달의 지표로 평가되는 특성이지만 객관적으로 정량화하기는 어렵습니다. 1953 년에 Sholl 1 은 고양이의 시각 및 운동 피질에서 신경 연결 돌기 arborization을 측정하는 방법을 설명했으며,이 기술을위한 플러그인은 Ferriera 2에 의해 개발되었습니다. 뉴런과 유선 모두 유사한 나무와 유사한 구조를 나타 내기 때문에,이 플러그인은 혈관 주위 쥐 유선의 2D 이미지에서 유방 상피 분지 밀도를 정량화하기 위해 사용되었습니다. 생후기가 학업 실험실 및 시험 가이드 라인 연구에서 종종 평가되는 생활 단계이기 때문에 주변기 단계는 분석을 위해 선택되었습니다. Sholl 분석은 추가 플러그인이 포함 된 오픈 소스 이미지 처리 패키지 인 ImageJ 인 FIJI와 함께 배포되는 플러그인입니다. 플러그인은 predef를 둘러싼 일련의 동심원 반지름을 만듭니다.ined center (전형적으로는 신경 세포의 soma 또는 유선의 1 차관의 기원)과 물체의 distal-most 부분 (enclosing radius)으로 확장된다. 그런 다음 각 링에서 발생하는 교차 수 (N)를 계산합니다. 플러그인은 Sholl 회귀 계수 ( k )를 반환하는데, 이는 상피 분지의 붕괴 속도를 측정합니다.

ImageJ를 사용하여 유선 전체 이미지의 골격화 된 이미지가 생성되고 유방 상피 영역 (MEA)이 측정됩니다. Sholl 분석 플러그인을 사용하여 이미지를 분석하고 여기서 사용하지 않은 다른 값 중 N 및 k 값이 반환됩니다. 유방 상피 분화 밀도는 N / MEA를 계산하여 결정됩니다. 선 상피의 바깥 쪽 영역에서 분지가 계속되는 정도는 분기 복잡성이며 균일 한 원위 상피 성장의 지표입니다. k 는 epith에서 원위부 감소의 척도이므로그것은 분지 복잡성과 유방 발달의 확실한 지표의 효과적인 척도이다.

이 프로토콜은 유선 전체 마운트의 골격화 이미지를 생성하고 peripubertal 남성과 여성의 쥐의 유방 분기 특성을 정량적으로 평가하기위한 컴퓨터 보조 방법을 설명합니다. 이 방법은 상대적으로 빠르며 전문화 된 현미경 장비를 사용할 필요가 없습니다. 이 방법의 개발 및 검증은 Stanko et al. (2015) 3 . 이 보고서는 또한 쥐 유선 전체 = 마운트의 준비를 설명합니다. 유사한 유방 전체 마운트 절차가 Assis et al. (2010) 4 및 Plante et al. (2011) 5 .

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Protocol

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이 연구를위한 모든 동물의 사용과 절차는 NIEHS 실험 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 얻었으며 실험 동물 관리 인증 기관의 평가 및 인정 협회에서 실시되었다.

1. 유방 유선 분만

  1. 크실렌 방지 방법을 사용하여 모든 슬라이드를 미리 레이블을 붙이십시오 (연필이 가장 잘 작동 함). 레이블을 보존하려면 끝에 마운트 솔루션으로 덮으십시오.
  2. 기관 동물 보호 및 사용위원회가 승인 한 방법으로 동물을 안락사하십시오.
  3. 안락사가 끝난 후 해부 보드 ( 그림 1 )에 동물을 등뒤로 올려 놓습니다. 뒤 팔다리가 거꾸로 된 V (지주 핀 또는 작은 게이지 바늘이 잘 작동 함)로 4 개의 모든 팔다리를 늘리고 핀으로 고정하십시오.
  4. 유방 샘플에서 머리카락을 없애기 위해 70 % 에탄올로 복부를 충분히 스프레이하십시오.
  5. 집게를 사용하여 정중선에서 복부 피부를 당기고 작은 절개를 만듭니다.해부 가위, 복막을 뚫지 않도록 조심하십시오.
    1. 절개에서 시작하여 피부를 목 부위까지 잘라 낸 다음 앞쪽 다리까지 멀리 잘라냅니다. 사타구니 부분까지 잘라 낸 다음, 같은 쪽의 뒷다리의 첫 번째 관절을 원위치로 잘라냅니다. 이 절개는 보통 유선 5와 6을 분리합니다. 복막 절단을 피하십시오.
    2. 붙어있는 유방 지방 패드로 포머를 사용하여 피부를 당겨 가위 해부의 뭉툭한 끝 부분을 사용하여 복막에서 부드럽게 분리합니다. 등쪽까지 가능한 한 완전히 피부 아래쪽에 사타구니 젖샘 번째 4 번째 및 5를 노출 별개; 해부 보드에 피부를 고정시킵니다 ( 그림 2 ).
    3. 완만 한 구부러진 포셉의 측면과 다섯 번째 동맥의 유방 조직을 부드럽게 파악하고 서서히 피부에서 멀리 그라운드 또는 피부를 흠집하지 않도록 조심해라.
    4. 계속 트림,4 번째와 5 번째의 동맥이 완전하게 피부로부터 해제 될 때까지 이동 등쪽. Sholl 분석을위한 시작점 역할을하므로 젖꼭지 부분이 나머지 부분과 함께 제거되었는지 확인하십시오. 글 랜드에서 부착 된 몸에서 유방 조직을 잘라냅니다 4.
  6. 일단 동물에서 동맥이 제거되면, 정전기로 충전 된 25 mm x 75 mm x 1 mm 현미경 슬라이드에 골격을 아래로 향하게 한 옆면에 골고루 바릅니다.
    참고 : 나이가 많은 동물이나 수유중인 동물의 땀샘의 경우 51 x 75 x 1 mm 슬라이드가 필요할 수 있습니다.
  7. 장갑을 끼고 공기 방울을 조심스럽게 짜내십시오. 글 랜드를 플라스틱 파라핀 필름과 다른 현미경 슬라이드로 감싸고 글 랜드를 압축하여 슬라이드에 부착시킵니다.
    참고 : 물이 채워진 50 mL 원뿔형 튜브가 적절한 무게 역할을합니다. 슬라이드에 부착하는 데 필요한 시간은 글 랜드의 두께에 따라 다릅니다. 얇은 포스트 나투약 일 (PND) 4 개의 땀샘은 최소 30 분 동안 압축되어야하며, 더 두꺼운 성인 땀샘은 2 ~ 5 시간 정도가 필요할 수 있습니다.

2. 유방 전체 마운트 준비

  1. 끓는 물과 냉장을 필요로하기 때문에 적어도 24 시간 전에 카루 민 알럼 용액을 준비하십시오.
    1. 카르 민 산삼 1g과 알루미늄 황산 칼륨 (AlK (SO 4 ) 2 · 12H 2 O) 2.5g을 증류수 500mL에 녹이고 1L 플라스크에서 20 분간 끓인다. 증류수를 사용하여 최종 부피를 500 mL로 가져옵니다.
    2. 진공 상태에서 여과지를 통해 용액을 여과하고 보관을 위해 냉장 보관하십시오.
      참고 : Carmine 명반 용액은 재사용 할 수 있지만 색상이 흐려지기 시작하면 폐기해야합니다.
  2. 고정하기 전에 슬라이드에서 글 랜드를 당기지 않도록주의하면서 파라핀 필름을 글 랜드에서 떼어냅니다. 유리 슬라이드 얼룩 항아리에 슬라이드를 놓고 정착액 (100 % ethanol, chloroform 및 glacial acetic acid를 6 : 3 : 1의 비율로 혼합하여 12-48 시간 동안 땀샘의 두께에 따라 달라집니다.
  3. 정착액을 붓고 70 % 에탄올에 15 분 동안 땀샘을 담그십시오. 에탄올 용액의 1/3을 붓고 증류수로 교체하여 점차적으로 땀샘을 재수 화하십시오. 5 분간 담그십시오. 이 과정을 세 번 반복하십시오.
  4. 최종 헹굼 후 모든 에탄올 / 물 용액을 털어 내고 100 % 증류수로 교체하십시오. 5 분 동안 땀샘을 담그십시오.
  5. 증류수를 부어 카밀린 명반 용액에 땀샘을 담그십시오. 두께에 따라 땀샘을 12-24 시간 동안 얼룩지게하십시오.
    참고 : 땀샘은 과도한 염색을 할 ​​수 없지만 염색 강도가 동일하도록 여러 뱃치의 염색 시간이 동일해야합니다.
  6. 카민 용액을 붓고 100 % 증류수로 30 초간 씻어 낸다. 점차적으로 15 분 동안 70 % 에탄올, 95 분 에탄올에 15 분간 담가서 땀샘을 탈수시킵니다.20 분 동안 100 % 에탄올.
  7. 두께에 따라 12-72 시간 동안 자일 렌에 담궈 지방 땀샘을 제거합니다.
    참고 : 땀샘은 반투명 (투명)해야합니다. 불투명 한 (희끄무레 한) 부분이 남아 있으면 반투명 할 때까지 크실렌에 계속 담그십시오. 수유 또는 그렇지 않으면 매우 두꺼운 땀샘이 얼룩지고 지워지면 땀샘을 완전히 지우기 위해 크실렌을 한 번 교체해야 할 수도 있습니다.
  8. 글 랜드를 막을 수있는 충분한 배지를 pipetting하여 자일 렌 기반 장착 매체로 슬라이드를 마운트하십시오. 커버 슬립을 추가하여 공기 방울이 생기지 않도록하십시오.
  9. 슬라이드를 건조시킵니다. 장착 매체가 마르면 커버 슬립 아래에서 수축되므로 추가 장착 매체를 추가해야 할 수 있습니다. 추가 매체가 필요하지 않으면 슬라이드를 완전히 말리십시오. 2-3 주가 소요될 수 있습니다.
  10. 슬라이드가 완전히 건조되면 면봉과 소량의 크실렌으로 잔여 매질을 제거 할 수 있습니다. 사용하지 않도록주의하십시오.너무 많은 자일 렌, 이것은 장착 매체를 분해하고 coverslip을 느슨하게 수 있습니다. 이런 일이 발생하고 공기 방울이 coverslip 아래에 수집되면, coverslip는 자일 렌으로 제거되어야하고 장착 과정을 반복해야합니다.

3. 분석을 위해 전체 마운트 이미지 준비

  1. 거시경 또는 해부 현미경과 적절한 소프트웨어를 사용하여 디지털 카메라를 사용하여 전체 마운트 ( 그림 3 )의 이미지를 캡처하십시오.
    참고 : 전체 선 상피를 캡처하는 모든 배율을 선택할 수 있지만 동일한 배율로 서로 비교할 모든 전체 탑재 이미지를 캡처하는 것이 중요합니다.
  2. ImageJ 소프트웨어 (또는 FIJI 소프트웨어) 다운로드 6 .
  3. "파일"→ "열기"를 클릭하여 ImageJ에서 유방 전체 마운트 이미지를 엽니 다. 자유 선 도구를 선택하고 선 상피 주위를 추적하십시오. "편집"& #8594; "바깥 쪽."
    1. 노드 주위를 추적하고 자유형 도구를 사용하여 "편집"→ "잘라 내기"를 통해 림프절을 제거합니다.
  4. "이미지"→ "색상"→ "분할 채널"을 선택하여 색상 채널을 분리하십시오. 콘트라스트가 가장 좋은 채널 (일반적으로 파란색 채널)을 선택하십시오.
    참고 : RGB 이미지는 해당 이미지의 빨강, 녹색 및 파랑 구성 요소 스택으로 구성됩니다. 이 작업은 이러한 구성 요소를 세 개의 8 비트 회색조 이미지로 분리합니다.
  5. "처리"→ "배경 빼기"를 선택하여 배경을 뺍니다. 원하는 매개 변수를 선택한 다음 "미리보기"를 클릭하여 변경 사항을 미리 봅니다.
    참고 : "배경 빼기"는 매끄럽고 연속적인 배경을 제거합니다. 또한 "프로세스"→ "필터"→ "언샵 마스크"를 사용하여 대비를 만들 수 있습니다.
  6. th 중 하나를 선택하십시오. e 자동으로 노이즈를 제거하는 방법 : 이상 치를 제거하거나 제거합니다.
    참고 : ImageJ는 자동 노이즈 제거의 세 번째 방법 인 NaN을 제거합니다. 그러나 NaNs 제거 명령은 32 비트 이미지를 사용하고 현재 메서드는 8 비트 이미지를 사용하기 때문에 적용 할 수 없습니다.
    1. "Process"→ "Noise"→ "Despeckle"을 선택하여 despeckle 명령을 사용하여 노이즈를 제거하십시오.
      참고 : 이는 중간 픽셀을 추가하는 것과 동일합니다.이 필터는 각 픽셀을 3x3 근처의 중간 값으로 대체합니다.
    2. "프로세스"→ "노이즈"→ "아웃 라이어 제거"를 선택하여 아웃 라이어 제거 명령을 사용하여 노이즈를 제거하십시오.
      참고 :이 프로세스는 특정 값 (임계 값) 이상으로 중앙값에서 벗어나는 경우 인접한 픽셀의 중앙값으로 픽셀을 대체합니다.
  7. 남은 잡음을 수동으로 제거하십시오 (lass = "xfig"> 그림 4).
    1. 원본 이미지의 사본을 열고 이것을 잡음이 아닌 무엇을위한 가이드로 사용하십시오. 툴바의 오른쪽 끝에있는 이중 빨간색 화살표 버튼을 클릭하십시오. 그리기 도구를 선택하십시오. 그리기 도구 버튼이 도구 모음에 나타납니다.
    2. 지우개 도구를 클릭하십시오. 지우개 도구 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 지우개 직경을 조정하십시오. 노이즈를 지우려면 마우스 왼쪽 버튼을 누르고 계십시오.
      참고 : 지우기 세션은 한 번만 취소 할 수 있습니다. 마우스 왼쪽 버튼을 놓고 다시 클릭하면 이전 지우기를 실행 취소 할 수 없습니다.
  8. "이미지"→ "조정"→ "임계 값"을 선택하여 임계 값을 조정하십시오. 글 랜드의 적절한 묘사가 이루어질 때까지 슬라이더를 움직여 최소 (상단 슬라이더) 및 최대 (하단 슬라이더) 임계 값을 조정하십시오.
    참고 : 임계 값을 설정하면 회색조 이미지가 관심 대상 및 배경으로 나뉩니다.
    1. 적용을 클릭하십시오. 필요한 경우이 단계에서 3.6.1 및 3.6.2 단계를 따라 추가 노이즈를 제거하십시오.
  9. thresholding과 잡음 제거에 의해 제거 된 선 상피의 부분을 재구성하십시오 ( 그림 5 ).
    1. 원본 이미지의 무결성을 유지하기 위해 신중하고 최소한의 기준으로 이미지 재구성을 실시하십시오. 상피가 무엇이고 무엇이 아닌지에 관해서는 원본 이미지를 참조하십시오.
    2. Spray Can 도구 (도면 도구가있는 도구 모음에 있음)를 클릭하십시오. 스프레이 캔 도구 버튼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 스프레이 직경과 속도를 조정하십시오. 왼쪽 마우스 버튼을 클릭하거나 누른 채로 누락 된 절편을 조심스럽게 채우십시오.
  10. Sholl Analysis를 수행하기 위해 글 랜드의 골격 이미지를 만듭니다. "프로세스"→ "이진"→ "B를 선택하여 임계화된 이미지가 바이너리인지 확인하십시오 inary. "
    1. 이미지가 검은 색 바탕에 흰색이면 "처리"→ "이진"→ "옵션"을 선택하고 "검정색 배경"을 선택 취소하십시오. "Process"→ "Binary"→ "Skeletonize"를 선택하여 이미지를 골격으로 만듭니다.
      참고 : 이것은 단일 픽셀 너비 모양으로 축소 될 때까지 이진 이미지의 가장자리에서 픽셀을 반복적으로 제거합니다.
    2. "Process"→ "Binary"→ "Dilate"를 선택하여 이미지를 한 번 확대합니다.
      참고 : 이것은 이진 이미지의 가장자리에 픽셀을 추가하여 임계 값 및 골격화로 인해 생성 된 틈을 채 웁니다.
  11. "파일"→ "다른 이름으로 저장"을 선택하여 이미지를 저장하십시오. 이미지 유형 (보통 jpeg)을 선택하고 파일 이름을 입력 한 다음 "확인"을 클릭하십시오.
  12. 골격화 된 이미지를 원래 이미지 위에 겹쳐서 골격 이미지의 정확성을 확인하십시오 (ass = "xfig"> 그림 6).
    1. 원본 이미지와 골격화 된 이미지를 모두 열어 오버레이를 만듭니다. "이미지"→ "오버레이"→ "이미지 추가"를 선택하십시오. "이미지 추가"대화 상자의 "추가 할 이미지"드롭 다운 메뉴에서 골격 이미지를 선택하고 불투명도를 30 %로 설정하십시오.
    2. "파일"→ "다른 이름으로 저장"을 선택하여 원본 이미지 위에 중첩 된 뼈대 이미지의 이미지를 저장하십시오. 이미지 유형을 선택하고 파일 이름을 입력 한 다음 "확인"을 클릭하십시오.

4. Sholl 분석 수행

  1. 골격 이미지를 열고 "Process"→ "Binary"→ "Make Binary"를 선택하여 이미지 바이너리를 만듭니다.
    1. 확대 배율을 설정하기 전에 이미지를 캡처 한 배율의 마이크로 미터를 사용하여 픽셀 수 / mm를 측정합니다.
    2. 측정 된 배율을 설정하십시오."Analyze"→ "Set Scale"을 선택하여 울리십시오. 픽셀 수 / mm를 입력하십시오. "Known Distance"및 "Pixel Aspect Ratio"를 모두 1로 설정하십시오. "Unit of Length"에 "mm"을 입력하고 "Global"(각 이미지에 대해 동일한 배율을 유지)을 선택하십시오.
  2. 일차 관 (분석 중심)의 시작부터 선 상피의 가장 먼 지점 ( 그림 7 )까지 선을 그어 Sholl 분석을위한 끝 반경 (동봉 반지름)을 결정합니다.
    1. 도구 모음의 선 그리기 도구를 사용하여 관심있는 지점 사이에 선을 그립니다. "M"키를 눌러 측정을하고 결과 창이 열립니다.
      참고 : "길이"열의 값은 선의 길이 (mm)입니다. 이 값은 Sholl 매개 변수를 설정할 때 Ending Radius로 자동 입력됩니다. Sholl 플러그인은 시작 지점을 사용합니다.중심 고리의 중심으로 선의.
  3. Sholl 분석 실행.
    1. "플러그인", "고급 Sholl 분석"을 선택하여 분석을 실행하십시오. 매개 변수 창이 나타납니다.
    2. "I. 쉘의 정의"에서 시작 반지름을 0.00 mm로 설정하십시오. 4.2 단계에서 측정 된 선의 길이가 자동으로 "엔딩 반경"으로 입력됩니다.
    3. "Radius Step Size"를 0.1mm로 설정하십시오.
      참고 : 반경 스텝 크기는 링 수를 결정합니다 (사실상 반복 횟수). 스텝 사이즈가 작 으면 링 수가 증가하고 스텝 사이즈가 클수록 링 수가 감소합니다. 반경이 지나치게 작 으면 반지 수가 불필요하게 많아 지지만 반경을 너무 작게 설정할 수 없습니다. 그러나 너무 크게 설정하면 고리 수가 줄어들고 결과적으로 실제 교차로 수가 과소 평가됩니다. Stanko et al.(2015)를 참조하십시오.
    4. "II. 다중 샘플 / 반경"에서 "# 샘플"을 1로 설정하고 "통합"을 "평균"으로 설정하십시오.
    5. "III. 기술자 및 곡선 피팅"의 "기본 분기"에 대해 "둘러싸인 반지름 컷오프"를 1로 설정하고 "시작 반지름에서 추론"을 선택하십시오.
      참고 : "프로파일 맞춤 및 계산 기술자"및 "피팅 세부 정보 표시"는 원하는대로 확인할 수 있습니다.
    6. "선형화"를 선택하고 "정규화가없는 프로파일"에서 "최고 적합도"를 선택하십시오. "가장 유익한 정보"를 확인하십시오. "IV. Sholl Methods"에서 "Normalized Profiles"영역을 선택하십시오.
    7. "V. 출력 옵션"에서 "교차점 마스크 만들기"를 선택하여 교차점의 히트 맵을 만듭니다 (선택 사항).
    8. "Cf. Segmentation"을 클릭하여 링의 이미지 미리보기 창을 생성하여 영역을 확인하십시오.분석.
  4. "확인"을 클릭하여 분석을 실행하십시오.

5. MEA 측정

  1. 상피 트리 주변의 최단 거리를 추적하여 MEA를 측정합니다 ( 그림 8 ).
    1. 글 랜드의 뼈대 이미지가 열린 ImageJ에서 Polygon 도구를 클릭합니다. 상피 트리의 주변에있는 점을 클릭하여 다각형을 시작하고 글 랜드 경계를 따라 이동 한 다음 클릭하여 선분을 추가합니다.
    2. 전체 상피 부위가 우회되었을 때 더블 클릭하여 다각형을 닫습니다. "M"키를 눌러 결과 창을 엽니 다. "영역"열의 값은 MEA입니다.
  2. 선 상피가 림프절 이상으로 확장 된 경우 분지 밀도를 계산할 때 MEA에서 림프절 면적 (LNA)을 뺍니다.
    1. 같은 mann에서 림프절을 추적하여 LNA를 측정er을 상피 나무로 삼고 "M."을 누르면됩니다.
      참고 : 림프절이 LNA 내의 교차점 수를 계산하지 못하게하기 때문에 MEA에서 LNA를 빼야합니다. 상피가 림프절에 도달하지 않았 으면 LNA는 0입니다.

6.보고 데이터

  1. 둘러싸는 반경, MEA, N, k 및 분기 밀도에 대한 값을보고합니다.
    참고 : 둘러싸는 반경은 단계 4.2에서 결정되고 MEA는 단계 5.1에서 결정됩니다.
    1. 분석을 실행하여 Sholl 결과 창을 생성하십시오.
      참고 :보고 된 N은 합계 inters의 값입니다. 보고 된 k 는 Sholl 회귀 계수 (semi-log)의 값입니다. Sholl 분석은 선 상피의 어떤 측정 된 영역보다 k에 대한 값을 반환합니다. 전체 상피에 대해 k에 대한 정확한 값을 얻으려면 관 말단이 존재해야합니다.
    2. 수정하기e 분기 밀도를 계산하기 위해 N에 대한 출력 값을 사용하여 유선에 대한 Sholl 분석 (이 방법의 기본 종점). N / (MEA-LNA) 공식을 사용하여 분지 밀도를 계산하고 그 값을 N / mm 2로보고하십시오 .

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Representative Results

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이 프로토콜에서 분석 된 유선에 대해 측정 된 밀폐 반경, MEA, N, k 및 계산 된 분기 밀도 값을 표 1 에보고합니다. Sholl 분석은 각각의 반경 (도 9)의 교점의 수의 선형 및 세미 - 로그 플롯을 생성하고, 선택된 경우, 교차점의 히트 맵 (도 10). 덜 발달 된 땀샘은 동일한 MEA 내에서 더 적은 교차점을 나타내므로 더 낮은 분기 밀도를 보입니다. 잘 발달 된 샘은 전체 선 상피, 특히 원위부에 균일하게 분지를 계속할 것입니다. 이 영역에서 분기가 계속되는 정도는 분기 복잡성 및 복잡성 감소가 붕괴 속도 (또는 Sholl 회귀 계수, k )로 전달되는 것으로 설명 할 수 있습니다. 붕괴 속도는 말초 상피 브래지어의 변화를 반영합니다nching)하고 둘러싸는 반경 ( 즉, 상피의 종 방향 성장)에 대해 그려진 교차점 수의 선의 기울기로 측정됩니다. 따라서, Sholl 회귀 계수는 log (N / S) = -k r + m이고, 여기서 N은 방사형 거리 (r)에 대한 log (N / S) 대 플롯의 선의 기울기를 취함으로써 계산된다. 반지름 r과 면적 S (πr 2 )의 각 반지름에 대한 교차 수이며, m은 절편입니다. 기울기 -k 는 교차점의 붕괴를 나타 내기 때문에 -k = 0의 값은 분석 중심에서 상피 가장자리까지의 제로 붕괴 및 균일 한 분기를 나타냅니다. 드문 드문 분비샘에서 분지 붕괴가 증가합니다. 상피 조직의 원위부에있는 교차점이 거의 없다. 기울기 k 가 증가한다. 따라서 0에 가까워지는 k의 값은 더 큰 말초 분지 ( 즉, 분기 복잡성)와 우물개발 된 유선.

그림 1
그림 1 : Ventral View. 해부 표면에 젖꼭지와 12 유방 땀 샘의 위치를 ​​보호하는 방법을 보여주는 성인 여성 Sprague Dawley 쥐의 복부 부분의 이미지가 동그라미. * 땀샘 6과 7의 젖꼭지는 보이지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 암컷 유선. 노출 된 유방 腺 4 (MG4) 및 5 (MG5)의 삽화, 피부가 MG4 위 및 MG5 바로 밑의 해부 표면에 고정됨. 땀샘은 sk에서 제거해야합니다. 처음에는 MG5로, MG5와 4가 완전히 제거 될 때까지 위로 및 등쪽으로 계속됩니다. 젖꼭지는 글 랜드 4의 원위부에 있으며,이 부위를 수집하기 위해주의를 기울여야합니다. 림프절은 참고로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 유선 전체 마운트. 출생 후의 날 25 명의 여성 Sprague Dawley 쥐에서 채취 한 유선의 전체 - 마운트 이미지. 눈금 막대 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4 : 소음 제거. 백그라운드가 제거 된 유방 전체 마운트 이미지의 파란색 색상 채널입니다. ( A )는 노이즈가있는 예제를 보여줍니다. 화살표는 혈관에 의해 생성되는 노이즈를 나타내며, 덕트 말단을 둘러싸는 더 많이 음영 처리 된 영역은 배경을 뺀 노이즈의 예입니다. ( B )는 노이즈가 제거 된 후의 이미지를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 이미지 재구성. 임계 값 이미지의 지워진 부분을 재구성합니다. ( A ) 빨간색 화살표는 임계 값으로 인해 이미지의 일부가 손실 된 영역을 나타냅니다. 이미지 재구성이 지역에서 경매가 수행되어야한다. ( B ) 삭제 된 지역을 재구성 한 후의 유방 이미지. 이미지 재구성은 원본 이미지의 무결성을 유지할 수 있도록 신중하게 그리고 최소한으로 수행되어야합니다 .이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 6
그림 6 : 해킹 된 이미지의 오버레이. 원본 전체 마운트 이미지 위에 중첩 된 골격 이미지를 보여주는 오버레이 이미지. 이 그림은 골격 화 된 샘이 실제 샘의 분기를 정확하게 반영한다는 것을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 7 : 반경을 둘러싸는 그림. 둘러싸는 반경을 측정하는 유방 전체 마운트의 골격화 된 이미지 (노란색). 선은 상피 나무 (분석의 중심)의 바닥에서 시작하여 상피의 가장 먼 지점까지 확장되어야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8
그림 8 : 유방 상피 부위. MEA를 결정하기 위해 상피 트리 주위에 추적되는 다각형을 보여주는 골격화 된 이미지. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.이 그림의

그림 9
그림 9 : Sholl 플롯 출력. 각 방사형 증분에서 교차 수의 선형 ( A ) 및 반자동 ( B ) 플롯의 출력을 Sholl합니다. 패널 (A)의 빨간색 점은 중심 (횡 방향 중심)의 횡좌표입니다. 적색 라인의 10 번째 -90 번째 백분위 수 이상의 선형 회귀되는 동안 패널 (B)에서, 청색 라인은, 데이터의 전체 범위에 걸쳐 선형 회귀이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10
그림 10 : 교차 마스크. "인터를 만들 때단면 마스크 (Section Mask) "옵션을 선택하면 (4.3.7 단계), 분석은 이미지의 둘러싸는 반경을 가로 지르는 교차 수의 히트 맵을 출력합니다.이 히트 맵은 상피 전체의 분기 교차점의 밀도를 나타냅니다 (빨간색 = 고밀도, 청색 = 차가운 = 저농도) 전체 상피는 k = 0 인 이미지의 열지도에서 같은 색 이됩니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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표 1 : Sholl 분석 매개 변수. 값은 Sholl 분석에 대해보고 된 데이터입니다. Enclosing Radius (단계 4.2)와 MEA (단계 5.1)는 측정 값이고, N과 k 는 Sholl 분석 결과이며 Sholl 분석 결과 창 (단계 6.1)에 반환되며 Branching Density는 N / ( MEA-LNA) (단계 6.1.2).

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Discussion

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출생부터 사춘기까지 유선의 성장은 알로 메트릭입니다. 사춘기 후, 유선은 광범위한 지방 분지 및 신장을 통해 발생하며 유방 상피가 전체 지방 패드를 차지할 때까지 계속됩니다. 분지 특성은 유선 개발의 중요한 측면이며, 이러한 특성을 객관적으로 정량화하는 능력은 정상적인 유방 발달을 평가하고 유방 내 독성 물질에 일생 초기 노출 후 비정상적인 발달을 확인하는 데 매우 유용 할 수 있습니다.

형태 학적 특징을 채점하고, 기본 치수 측정을 정량화하며, 유방 조직을 계수하는 것은 유선 개발을 평가하는 전형적인 방법입니다. 그러나 이러한 방법은 설치류 유선의 크기와 모양이 상당히 다양하기 때문에 특별히 민감하지 않으며 경험이없는 평가자에게는 발달 해석이 어려울 수 있습니다. 또한,편견은 제대로 눈이 멀지 않은 연구에 존재합니다. Sholl 분석 방법은 유방 상피 분지 밀도와 분지 복잡성, 유선 분비의 개별 형태 학적 특성을 정확하게 정량화하기위한 효율적인 프로토콜을 제공하며 연구 및 실험실에서 쉽게 비교할 수 있습니다.

이 프로토콜의 여러 섹션에는 중요한 단계가 있습니다. 가장 중요한 것은 유선 전체 마운트 상태와 관련이 있습니다. 이 방법의 정확성은 완전히 손상되지 않고 적절하게 고정되고 염색되며 유선의 산화 나 장착 매체의 현저한 변색을 입증하는 유선에 의존합니다. 글 랜드가 찢어 지거나 접혀지면 정확한 밀도 측정치를 얻을 수 없습니다. 관 말단이 존재하지 않으면, k 의 값은 전체 분비선을 대표하지 않을 것이다. 땀샘은 땀샘에서 어려울 것입니다.관 상피의 얼룩 대조의 부족으로 인해 완전히 고정되지 않았다. 그리고 마지막으로, 산화 또는 변색이 있다면, 이러한 흠은 영향을받는 영역에서 교차점을 측정하는 분석을 방해 할 수 있습니다.

적합한 전체 마운트가 준비되면 다음 중요한 단계는 동일한 배율로 이미지를 캡처하는 것입니다. 가능한 가장 높은 해상도로 디지털 이미지를 캡처하는 것이 일반적입니다. 그러나 Sholl 분석의 경우 모든 이미지를 동일한 배율로 캡처하는 것이 더 중요합니다. Stanko et al. (2015) 3 에서는 고배율에서 포착 된 작은 땀샘의 이미지가 시각적으로 덜 발달 된 것처럼 보였음에도 불구하고 낮은 배율로 포착 된 큰 땀샘의 이미지보다 더 큰 분지 밀도를 나타내는 경고가 발견되었습니다. 우리는 더 높은 배율이 더 세밀한 결과를 가져 왔다고 가정했다.그는 이미지를 골격화하여 더 작은 땀샘의 분지 밀도를 과장 한 N을 높였다. 이 문제는 모든 이미지를 동일한 배율로 캡처하여 완화됩니다.

정확한 분석의 기초는 전체 마운트 내에 있지만 사용자가 영향을 미치는 교차 데이터의 변경 가능성은 노이즈 제거 단계에 있습니다. 모든 이미지에는 염색 강도, 관련성이없는 생리 학적 개체 ( 예 : 혈관) 및 임계 값의 인공물로 인해 어느 정도 노이즈가 포함됩니다. 각 이미지는 이미지 사이의 노이즈 양의 변화 때문에 독립적으로 처리되어야합니다. 너무 작거나 너무 많은 소음을 제거하지 않도록주의해야합니다. 이렇게하면 교차로 수와 결과적으로 분기 밀도가 왜곡 될 수 있습니다. 그러나, 소음이 해석에 영향을 미치는 정도는 조사되지 않았다. 사용자는 노이즈 제거와 함께 얼마나 세심한 지 결정해야하며 consis를 연습해야합니다.이미지의 무결성을 유지해야합니다. 잡음 제거를 수행 할 때 사용자는 치료에 눈 멀게하는 것이 좋습니다. 이렇게하면 편향 가능성을 최소화 할 수 있습니다. 노이즈 제거에 대한 자세한 내용은 ImageJ 사용 설명서 7을 참조하십시오. 이 절차에서 노이즈는 주로 배경 빼기 이미지에서 제거됩니다. 또한, thresholding 프로세스 자체가 동맥의 세그먼트를 제거 할 수 있습니다. 일부 픽셀 만 제거 된 동맥 부분은 골격 이미지가 확장되면 자동으로 재구성됩니다. 그러나 확장 된 격차는 수동으로 재구성해야 할 수도 있습니다. 사용자는 원본 이미지의 무결성을 유지하면서 이러한 세그먼트를 재구성할지 여부와 그 범위를 결정해야합니다.

중요한 것은 아니지만 ImageJ 소프트웨어가 자주 업데이트되므로 소프트웨어 업데이트를 유지하는 것이 중요합니다. 여기에 설명 된 방법은 1.48v 버전을 기반으로합니다. 피지와 숄은nalysis plugin도 정기적으로 업데이트되며 여기에 설명 된 프로토콜은 v3.4.1을 기반으로합니다. ImageJ 및 Sholl Analysis 플러그인의 이후 버전에서 변경된 사항은 이러한 방법에 영향을 미칠 수 있습니다. ImageJ는 업데이트를 자동으로 확인하지만 FIJI에 대한 업데이트는 정기적으로 수행되어야하며 현재 버전과 여기에서 사용 된 변경 사항은 필요에 따라 수정해야합니다. 모든 매개 변수는 Sholl Analysis 웹 페이지 6의 소제목에 정의되어 있습니다. 이 절차의 매개 변수 설정은 우리 실험실에서 만든 유선 전체 마운트에서 캡처 한 이미지를 기반으로하며 절대적인 것은 아닙니다. 전체 장착 준비는 실험실마다 다르며 이미지 및 출력을 최적화하기 위해 이러한 매개 변수가 조정될 수 있습니다.

이 연구에서 사용 된 유선 전체 마운트는 PND 25에서 암컷 Sprague Dawley 쥐에게서 유래되었으며,이 방법은 제한없이 적절히 적용되었다. 쥐에서는 유방 상피 밀도가 inc은 선의 정확한 골격화 된 이미지를 생성 할 수있을만큼 충분히 높은 해상도로 이미지를 임계 화하지 못하도록하는 나이까지 퇴색합니다. 따라서 현재 PND40보다 오래된 쥐의 땀샘에서는이 방법을 사용하지 않는 것이 좋습니다. 쥐의 변형이 여기에 표시되었지만, 저자는이 방법의 사용을 방해 할 수있는 특정의 유선 특유의 유방 특성에 대해 현재 알지 못하기 때문에 무관하다. 또한, 상기 기술 된 방법은 암컷 래트를 사용하여 수행되었지만, 수컷 래트의 유선에도 적용될 수있다. 이 응용 프로그램은 또한 마우스의 전체 마운트 (Deirdre Tucker, 개인 통신)와 효과적으로 사용되었으며 쥐의 유선은 쥐와 같이 밀도가 높아지지 않기 때문에 모든 연령의 마우스에 적합해야합니다. 그러나 마우스에서이 응용 프로그램을 사용하는 데는 두 가지 한계가 있습니다. 1) 어린 마우스에서 분기점이 너무 적어 심각한 차이를 감지하지 못할 수 있으며 2)이 방법을 사용할 수 없습니다그들은 유방 상피를 나타내지 않기 때문에 수컷 쥐에게 적용됩니다. 그럼에도 불구하고이 자동화 된 방법은 분기 교차점을 수동으로 계산하는 것보다 빠르고 편향적이며 노동 집약적입니다.

연구자들은 유방암을 비정상적인 구조를 제거하거나 면역 조직 화학 검사 (IHC)와 같은 다른 실험 기술에 활용하고자 할 수 있습니다. Tucker et al. (2016)은 마우스 유선 전체 마운트에서 hematoxylin-eosin으로 염색 된 절편을 만드는 방법을 기술했다 .8 우리는 일반적으로 whole-mount를 터미널 프로세스로 만드는 것을 고려하고 있으며, IHC 또는 TUNEL 분석과 같은 추가의 민감한 분석을위한 유선을 장착했습니다. 유선 조직을 사용하는 민감한 검사가 전체 마운트와 함께 요구되는 경우에는 반대쪽 유방 땀샘을 사용하는 것이 좋습니다.

유선이 계속된다.o 점점 더 많은 연구에서 초점이되지만 실험실 간 차이점은 전체 설치 준비 9 , 10 , 11 , 12 와 발달 평가 13 , 14 , 15에 있습니다. 여기에 설명 된 Sholl 분석의 수정은 설치류 유선에서 유선 분화의 중요한 특징 인 분지 밀도의 객관적인 정량화를위한 ​​표준화 된 방법을 제공합니다. 이 방법은 수컷 또는 암컷 설치류의 유방 전체 마운트에 적용 할 수 있으며, 현재 출산 전과 ​​출산 전과 ​​쥐에서 혈관 주위 샘에서만 사용하도록 권장되고 있지만 모든 연령대의 생쥐에서 유방 땀샘에 적용 할 수 있습니다. 이 응용 프로그램은이 기간이 권장되는 것처럼 주변 혈관 설치 동물에서 채취 한 유선 땀샘에 특히 적합합니다.테스트 가이드 라인 연구에서 포유류 전체 마운트 준비를위한 엔드 포인트. 성숙한 쥐의 더 조밀 한 유선에 사용을위한이 방법의 최적화는 현재 고려되고있다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

저자는이 방법과 Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Canada) 박사의 지속적인 도움을 받아 Dr. Michael Easterling (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC)을 인정하고 싶습니다. Sholl 응용 프로그램에 대한 지원.

Materials

밀폐 반경 (mm) MEA (mm2) 케이 분지 밀도 (N / mm2)
7.4 71.7 2381 0.73 33.2
Name Company Catalog Number Comments
Dissecting board NA NA A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable.
Dissecting T-Pins Daigger EF7419A
Spray bottle with ethanol NA NA 70% ethanol is suitable.
Curved dissecting scissors Fine Science Tools 14569-09
Straight dissecing scissors Fine Science Tools 14568-09
Curved forceps Fine Science Tools 11003-12
Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mm microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001 Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. 
Fisherfinest Premium Cover Glass 24 x 60 x 1 mm Fisher scientific 12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Fisher scientific 13-374-12
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich A9967
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC)  Sigma-Aldrich 24102
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Carmine alum  Sigma-Aldrich C1022
Aluminum potassium sulfate  Sigma-Aldrich A6435
Permount mounting media Fisher Scientific SP15
Macroscope Leica Z16 APO  This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.  As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.
Digital camera Leica DFC295
Camera software Leica Leica Application Suite v3.1 
ImageJ software Open source http://imagej.net/Welcome
Sholl analysis  Open source http://imagej.net/Sholl_Analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87, (4), 387-406 (1953).
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  7. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012).
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Sholl 분석법을 이용한 유방 내 유선 마운트의 분지 밀도 정량화
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Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method. J. Vis. Exp. (125), e55789, doi:10.3791/55789 (2017).More

Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method. J. Vis. Exp. (125), e55789, doi:10.3791/55789 (2017).

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