كوانتينغينغ المتفرعة الكثافة في الجرذ الغدة الثديية كله يتصاعد باستخدام طريقة تحليل شول

Summary

وقد تم تقييم تنمية الغدد الثديية في القوارض عادة باستخدام التقييمات الوصفية أو من خلال قياس الخصائص الفيزيائية الأساسية. الكثافة المتفرعة هي مؤشر على تطور الثديية التي يصعب قياسها بشكل موضوعي. يصف هذا البروتوكول طريقة موثوق بها لتقييم الكمي من الخصائص المتفرعة الغدة الثديية.

Abstract

وهناك عدد متزايد من الدراسات التي تستخدم الغدة الثديية القوارض كنقطة نهاية لتقييم السمية التنموية للتعرض الكيميائية. يتم تقييم آثار هذه التعرضات على التنمية الغدة الثديية عادة باستخدام إما القياسات الأبعاد الأساسية أو عن طريق تسجيل الخصائص المورفولوجية. ومع ذلك، فإن مجموعة واسعة من الطرق لتفسير التغيرات التنموية يمكن أن يؤدي إلى ترجمة غير متناسقة عبر المختبرات. وهناك حاجة إلى طريقة مشتركة للتقييم بحيث يمكن تشكيل تفسيرات سليمة من البيانات التي تتم مقارنتها عبر الدراسات. وتصف هذه الدراسة تطبيق طريقة تحليل شول لتحديد خصائص الغدة الثديية المتفرعة. تم تطوير طريقة شول أصلا لاستخدامها في قياس أنماط العصبية شجيري. باستخدام إيماجيج، صورة مفتوحة المصدر تحليل البرمجيات حزمة، والمكونة وضعت لهذا التحليل، والغدة الثديية المتفرعة الكثافة وتعقيد آمتم تحديد الغدة الثديية من الفئران الإناث بيريبوبيرتال. سوف الطرق المذكورة هنا تمكين استخدام تحليل شول كأداة فعالة لقياس سمة هامة للتنمية الغدة الثديية.

Introduction

الغدة الثديية المتفرعة هي السمة التي يتم تقييمها عادة كمؤشر على تنمية الغدة، ولكن من الصعب تحديد موضوعي. في عام 1953، وصف شول ¹ طريقة لقياس أربوريزاتيون شجيري العصبية في القشور البصرية والحركية للقط، وقد تم تطوير البرنامج المساعد لهذه التقنية من قبل فيريرا وآخرون ² . لأن كلا من الخلايا العصبية والغدد الثديية تظهر بنية تشبه شجرة مماثلة، تم استخدام البرنامج المساعد لتحديد كثافة الثديية المتفرعة الظهارية في الصور 2D من الغدة الثديية الجرذ بيريبوبيرتال. تم اختيار المرحلة المحيطة بالحيوية للتحليل لأن الفطام هو مرحلة حياة يتم تقييمها غالبا في المختبرات الأكاديمية ودراسات توجيه الاختبار. تحليل شول هو البرنامج المساعد توزيعها مع فيجي، وهو مفتوح المصدر حزمة معالجة الصور إيماجيج، مع الإضافات الإضافية المدرجة. البرنامج المساعد يخلق سلسلة من حلقات متحدة المركز تطويق بريديف(عادة سوما من الخلايا العصبية أو أصل القناة الرئيسية للغدة الثديية) وتمتد إلى الجزء البعيد البعيدة من الكائن (دائرة نصف قطرها مرفق). ثم تحسب عدد التقاطعات (N) التي تحدث على كل من الحلقات. ويعود البرنامج المساعد أيضا معامل الانحدار شول ( ك )، وهو قياس معدل تسوس من المتفرعة الظهارية.

باستخدام إيماجيج، يتم إنشاء صورة سكيليونيزد من الغدة الثديية كله جبل ويتم قياس المنطقة الظهارية الثديية (ميي). يتم تحليل الصورة باستخدام البرنامج المساعد تحليل شول، والقيم ل N و k ، من بين القيم الأخرى غير المستخدمة هنا، يتم إرجاعها. يتم تحديد الثديية الظهارة المتفرعة الظهارية من خلال حساب N / ميي. مدى استمرار المتفرعة في المناطق الخارجية من ظهارة غدية هو التعقيد المتفرعة وهو مؤشر على النمو الظهاري البعيدة موحدة. كما ك هو مقياس للانخفاض البعيدة في إبيثإليان المتفرعة، بل هو مقياس فعال للتعقيد المتفرعة ومؤشر موثوقة للتنمية الثديية.

يصف هذا البروتوكول طريقة بمساعدة الكمبيوتر لخلق صور الهيكل العظمي من الغدة الثديية يتصاعد كله وتقييم كميا الخصائص المتفرعة الثديية في الذكور بيريبوبيرتال والفئران الإناث. هذه الطريقة سريعة نسبيا ولا تتطلب استخدام معدات المجهر المتخصصة. يتم وصف التطوير والتحقق من هذه الطريقة في ستانكو وآخرون. (2015) ³ . ويصف هذا التقرير أيضا إعداد الفئران الثديية الغدة كله = يتصاعد. وقد وصفت إجراءات مماثلة جبل كامل الثدي في دي أسيس وآخرون. (2010) ⁴ و بلانتي وآخرون. (2011) ⁵ .

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع استخدامات الحيوان والإجراءات لهذه الدراسة من قبل نيهس مختبر رعاية الحيوان واستخدام اللجنة، وأجريت في جمعية لتقييم واعتماد مختبر مختبر رعاية الحيوان منشأة.

1. الغدد الثديية المكشوفة

1. قبل تسمية جميع الشرائح باستخدام طريقة زيلين واقية (قلم رصاص يعمل بشكل أفضل). تغطية لهم مع تصاعد الحل في نهاية للحفاظ على التسمية.
2. الموت ببطء الحيوان من قبل رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام أسلوب وافقت اللجنة.
3. بعد القتل الرحيم، ووضع الحيوان على ظهرها على لوحة تشريح ( الشكل 1 ). تمدد وتثبيت جميع الأطراف الأربعة، مع الأطراف الخلفية تشكيل V مقلوب (عقد دبابيس أو إبر قياس صغير تعمل بشكل جيد).
4. رش البطن بحرية مع الايثانول 70٪ للحفاظ على الشعر من العينة الثديية.
5. باستخدام ملقط، سحب ما يصل الجلد في البطن في خط الوسط وجعل شق صغير معمقص تشريح، والحرص على عدم ثقب البريتوني.
   1. بدءا من شق، وقطع الجلد حتى منطقة الرقبة ومن ثم بشكل أقصى إلى الطرف الأمامي. قطع إلى المنطقة الإربية ثم بعد ذلك إلى أول مشترك من الطرف الخلفي على نفس الجانب. وهذا شق عادة يفصل الغدد الثديية 5 و 6. تجنب قطع الصفاق.
   2. سحب الجلد مع لوحة الدهون الثديية المرفقة باستخدام ملقط، فصل بلطف من الصفاق باستخدام نهاية حادة من مقص تشريح. فصل بقدر ظهريا ممكن للكشف تماما عن ^ال 4 و 5 الغدد الثديية الأربية ^عشر على الجانب السفلي من الجلد. دبوس الجلد إلى مجلس تشريح ( الشكل 2 ).
   3. فهم بلطف الأنسجة الثديية للغدة ^{الموافق} 5 مع الجانب مقربة من ملقط المنحنية وتقليم ببطء الغدة بعيدا عن الجلد، والحرص على عدم شق الغدة أو الجلد.
   4. الاستمرار في تقليم،الانتقال ظهريا حتى رفعت تماما الغدد ^ال 4 و 5 ^عشر من الجلد. تأكد من إزالة المنطقة الحلمة مع بقية الغدة، وهذا بمثابة نقطة انطلاق لتحليل شول. قطع الأنسجة الثديية بعيدا عن الجسم حيث يتم إرفاقه في الغدة 4.
6. مرة واحدة يتم إزالة الغدة من الحيوان، ونشرها بالتساوي على مشحونة كهربائيا، 25 مم × 75 مم × 1 مم شريحة المجهر، مع الجانب الذي كان متاخما للجلد تواجه أسفل.
   ملاحظة: بالنسبة للغدد من الحيوانات القديمة أو المرضعة، قد تكون هناك حاجة شريحة 51 × 75 × 1 مم.
7. أثناء ارتداء القفازات، والضغط بلطف من أي فقاعات الهواء. تغطية الغدة مع فيلم البارافين البلاستيك وشريحة المجهر آخر وضغط الغدة على الانضمام إلى الشريحة.
   ملاحظة: أنبوب مخروطي 50 مل مليئة بالماء بمثابة الوزن المناسب. مقدار الوقت اللازم للانضمام إلى الشريحة يعتمد على سمك الغدة. رقيقة، بوستناتال داي (بند) 4 يجب أن تكون مضغوطة الغدد لمدة لا تقل عن 30 دقيقة، في حين سمكا، والغدد الكبار قد تتطلب ما يصل إلى 2-5 ساعة.

2. إعداد الثديية كله يتصاعد

1. إعداد حل الشبك القرم لا يقل عن 24 ساعة مقدما، لأنها تتطلب الغليان والتبريد.
   1. حل 1 غرام من الشبك القرم و 2.5 غرام من كبريتات البوتاسيوم الألومنيوم (ألك (سو ₄ ) ₂ · 12H ₂ O) في 500 مل من الماء المقطر وتغلي لمدة 20 دقيقة في قارورة 1 لتر. جلب الحجم النهائي إلى 500 مل باستخدام الماء المقطر.
   2. تصفية الحل من خلال ورقة الترشيح تحت فراغ والتبريد للتخزين.
      ملاحظة: كارمين حل الشب يمكن إعادة استخدامها ولكن ينبغي التخلص منها عندما يبدأ لون تتلاشى.
2. قبل التثبيت، قشر فيلم البارافين قبالة الغدة، والحرص على عدم سحب الغدة قبالة الشريحة. وضع الشريحة (ق) في الزجاج جرة تلطيخ الشريحة وتزج في تثبيتي (إيثان 100٪أول، الكلوروفورم، وحمض الخليك الجليدي في نسبة 6: 3: 1) لمدة 12-48 ساعة، اعتمادا على سمك الغدد.
3. صب قبالة تثبيتي ونقع الغدد في الايثانول 70٪ لمدة 15 دقيقة. تدريجيا ترطيب الغدد عن طريق صب 1/3 من محلول الإيثانول واستبدالها بالماء المقطر. نقع لمدة 5 دقائق. كرر هذه العملية ثلاث مرات.
4. بعد شطف النهائي، صب قبالة كل محلول الإيثانول / المياه واستبدالها مع 100٪ الماء المقطر. نقع الغدد لمدة 5 دقائق.
5. صب الماء المقطر وتزج الغدد في محلول الشبك القرمزي. وصمة عار الغدد لمدة 12-24 ساعة، اعتمادا على سمك.
   ملاحظة: الغدد لا يمكن أن تكون ملطخة، ولكن الوقت تلطيخ لدفعات متعددة يجب أن يكون هو نفسه، حتى أن كثافة تلطيخ هو نفسه.
6. صب قبالة محلول الشبك القرم وشطف الغدد في الماء المقطر 100٪ لمدة 30 ثانية. تدريجيا يذوى الغدد عن طريق تمرغها في الايثانول 70٪ لمدة 15 دقيقة، و 95٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة، وند الإيثانول 100٪ لمدة 20 دقيقة.
7. مسح الغدد من الدهون عن طريق تمرغ في الزيلين لمدة 12-72 ساعة، اعتمادا على سمك.
   ملاحظة: يجب أن تكون الغدد شفافة (واضحة). إذا بقيت أي مناطق مبهمة (بيضاء)، استمر تمرغ في الزيلين حتى شفافة. إذا كانت ملطخة أو غيرها من الغدد سميكة جدا ويجري ملطخة وتنظيفها، قد تحتاج إلى استبدال زيلين مرة واحدة واضحة تماما الغدد.
8. جبل الشرائح مع زيلين القائم على تصاعد المتوسطة التي بيبتينغ ما يكفي من المتوسطة لتغطية مجرد الغدة. إضافة ساترة، وضمان عدم وجود فقاعات الهواء شكل.
9. السماح للشرائح لتجف. كما يجف المتوسطة تصاعد، وسوف تتعاقد تحت ساترة، وأنه قد يكون من الضروري إضافة إضافية متزايدة المتوسطة. مرة واحدة لا حاجة إلى وسيط إضافي، والسماح للشرائح لتجف تماما. وهذا قد يستغرق 2-3 أسابيع.
10. مرة واحدة الشرائح هي جافة تماما، أي إزالة المتوسطة المتبقية يمكن إزالتها مع مسحة القطن وكمية صغيرة من الزيلين. يجب الحرص على عدم استخدامالكثير زيلين، وهذا يمكن حل وسط تصاعد وتخفيف ساترة. إذا حدث هذا وتجمع فقاعات الهواء تحت ساترة، وينبغي إزالة ساترة في زيلين وينبغي تكرار عملية التركيب.

3. إعداد كامل جبل صور للتحليل

1. التقاط الصور من يتصاعد كله ( الشكل 3 ) باستخدام المجهر أو تشريح المجهر وكاميرا رقمية مع البرامج المناسبة.
   ملاحظة: في حين أن أي التكبير الذي يلتقط ظهارة غدية بأكملها يمكن اختيار، لا بد من التقاط جميع الصور كامل جبل التي سيتم مقارنتها مع بعضها البعض في نفس التكبير.
2. تحميل برنامج إيماجيج (أو برنامج فيجي) ⁶ .
3. فتح الثدي كامل صورة جبل في إيماجيج عن طريق النقر على "ملف" → "فتح". حدد أداة فريهاند وتتبع حول ظهارة غدية. حدد "تعديل" & #8594؛ "مسح خارج".
   1. إزالة العقد الليمفاوية عن طريق تتبع حول العقدة واستخدام أداة فريهاند و "تحرير" → "قص".
4. قم بفصل قنوات الألوان عن طريق تحديد "إيماج" ← "كولور" ← "سبليت تشانلز". حدد القناة بأفضل تباين، وعادة ما تكون القناة الزرقاء.
   ملاحظة: تتكون صورة رغب من كومة من المكونات الحمراء والأخضر والأزرق لتلك الصورة. يعمل هذا الإجراء على فصل هذه المكونات إلى ثلاث صور بتدرج الرمادي 8 بت.
5. اطرح الخلفية عن طريق تحديد "عملية" → "طرح الخلفية". اختر المعلمات المطلوبة ثم انقر فوق "معاينة" لمعاينة التغييرات.
   ملاحظة: "سوبتراكت باكغروند" يزيل الخلفيات السلسة والمستمرة. بالإضافة إلى ذلك، "عملية" → "مرشحات" → "أونشارب قناع" يمكن استخدامها لخلق التباين.
6. اختيار واحد من ال e الطرق التالية لإزالة الضوضاء تلقائيا: قم بإزالة أو إزالة القيم المتطرفة.
   ملاحظة: إيماجيج يقدم طريقة ثالثة لإزالة الضوضاء التلقائي: إزالة نانز. ومع ذلك، لا يتم تطبيق الأمر إزالة نانز لأنه يستخدم الصور 32 بت، والطريقة الحالية يستخدم 8 بت الصور.
   1. قم بإزالة الضجيج باستخدام الأمر ديسبكل عن طريق اختيار "بروسيس" ← "نويز" ← "ديزبيكل".
      ملاحظة: هذا يعادل إضافة مرشح وسيط، الذي يحل محل كل بكسل مع القيمة المتوسطة في حي 3 × 3.
   2. قم بإزالة الضجيج باستخدام أمر إزالة القيم المتطرفة عن طريق اختيار "بروسيس" ← "نويز" ← "ريموف أوتليرس".
      ملاحظة: تستبدل هذه العملية البكسل بمتوسط ​​وحدات البكسل في المناطق المحيطة المباشرة إذا كانت تنحرف عن الوسيط بأكثر من قيمة معينة (العتبة).
7. إزالة أي ضجيج متبقي يدويا (لاس = "زفيغ"> الشكل 4).
   1. فتح نسخة من الصورة الأصلية واستخدام هذا كدليل لما هو وما لا ضوضاء. انقر على زر السهم المزدوج الأحمر في أقصى يسار شريط الأدوات. حدد أدوات الرسم. ستظهر أزرار أداة الرسم الآن في شريط الأدوات.
   2. انقر فوق أداة ممحاة. اضبط قطر الممحاة بالنقر بزر الماوس األيمن فوق زر أداة ممحاة. اضغط على زر الماوس الأيسر لمحو الضوضاء.
      ملاحظة: يمكن التراجع عن جلسة واحدة فقط للمحو. مرة واحدة يتم تحرير زر الماوس الأيسر ونقر مرة أخرى، لا يمكن التراجع عن محو السابقة.
8. ضبط عتبة عن طريق اختيار "صورة" → "ضبط" → "عتبة". حرك المتزلجون لضبط الحد الأدنى (المنزلق العلوي) والحد الأقصى (المنزلق السفلي) القيم العتبة حتى يتم تحقيق تصوير مناسب للغدة.
   ملاحظة: تعيين شرائح قيمة العتبة صور تدرج الرمادي إلى ميزات الفائدة والخلفية.
   1. انقر على تطبيق. إذا لزم الأمر، إزالة الضوضاء إضافية في هذه المرحلة باتباع الخطوات 3.6.1 و 3.6.2.
9. إعادة بناء أجزاء من ظهارة غدية التي تمت إزالتها بواسطة العتبة وإزالة الضوضاء ( الشكل 5 ).
   1. إجراء إعادة بناء الصورة بعناية وعلى أساس الحد الأدنى للحفاظ على سلامة الصورة الأصلية. الرجوع إلى الصورة الأصلية للرجوع إلى ما هو وما هو ليس ظهارة.
   2. انقر فوق أداة سبراي كان (على شريط الأدوات باستخدام أدوات الرسم). ضبط قطر الرش ومعدل عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على زر أداة رذاذ يمكن. ملء بعناية في عداد المفقودين أقسام الغدة عن طريق النقر أو الضغط باستمرار على زر الماوس الأيسر.
10. إنشاء صورة سكيليونيزد من الغدة لإجراء تحليل شول. تأكد من أن الصورة عتبة ثنائي عن طريق اختيار "عملية" → "ثنائي" → "جعل ب inary ".
    1. إذا كانت الصورة بيضاء على خلفية سوداء، حدد "عملية" → "ثنائي" → "خيارات" وإلغاء "خلفية سوداء". سكيليونيز الصورة عن طريق اختيار "عملية" → "ثنائي" → "سكيليتونيز".
       مالحظة: يزيل هذا بشكل متكرر البكسالت من حواف الصورة الثنائية حتى يتم تخفيضها إلى شكل على شكل بكسل واحد.
    2. تمدد الصورة مرة واحدة عن طريق اختيار "عملية" → "ثنائي" → "تمدد".
       ملاحظة: هذا يملأ الفجوات التي أنشأتها العتبة و سكيليتونيزينغ عن طريق إضافة بكسل إلى حواف الصورة الثنائية.
11. احفظ الصورة بتحديد "ملف" ← "حفظ باسم". حدد نوع صورة (عادة جبيغ)، وأدخل اسم الملف، وانقر على "موافق".
12. التحقق من دقة الصورة الهيكلية من خلال تراكب صورة سكيليتونيزد على الصورة الأصلية (أس = "زفيغ"> الشكل 6).
    1. إنشاء تراكب عن طريق فتح كل من الصورة الأصلية والصورة سكيليتونيزد. حدد "صورة" → "تراكب" → "إضافة صورة". في مربع الحوار "إضافة صورة"، حدد صورة الهيكل العظمي من القائمة المنسدلة "إضافة إلى" ثم عين التعتيم بنسبة 30٪.
    2. حفظ صورة صورة الهيكل العظمي مضافين على الأصل عن طريق تحديد "ملف" → "حفظ باسم". حدد نوع صورة، وأدخل اسم الملف، وانقر على "موافق".

4. إجراء تحليل شول

1. فتح صورة هيكل عظمي وجعل الصورة الثنائية عن طريق اختيار "عملية" → "ثنائي" → "جعل ثنائي."
   1. قبل تعيين مقياس التكبير، وقياس عدد بكسل / مم باستخدام ميكرومتر للتكبير الذي تم التقاط الصور.
   2. تعيين التكبير المقاسة sمن خلال تحديد "تحليل" → "تعيين مقياس". أدخل عدد وحدات البكسل / مم. تعيين "المسافة المعروفة" و "نسبة بكسل الجانب"، على حد سواء ل 1. أدخل "مم" ل "وحدة الطول" وتحقق "العالمية" (يحافظ على نفس المقياس لكل صورة).
2. تحديد نصف قطرها النهاية (ضم دائرة نصف قطرها) لتحليل شول عن طريق رسم خط من بداية القناة الأولية (مركز التحليل) إلى النقطة الأكثر البعيدة من ظهارة غدية ( الشكل 7 ).
   1. استخدم أداة رسم الخط في شريط الأدوات لرسم خط بين نقاط الاهتمام. اضغط على المفتاح "M" لإجراء قياس ولاحظ أنه سيتم فتح نافذة النتائج.
      ملاحظة: القيمة في عمود "الطول" هي طول السطر بالميليمتر. سيتم إدخال هذه القيمة تلقائيا كنقطة النهاية عند إعداد معلمات شول. سوف يستخدم البرنامج المساعد شول نقطة البدايةمن الخط كمركز حلقات مركزية.
3. تشغيل تحليل شول.
   1. تشغيل التحليل عن طريق اختيار "الإضافات" "تحليل شول المتقدم؛" ستظهر نافذة معلمة.
   2. تعيين نصف قطرها البداية في "I. تعريف قذائف" إلى 0.00 ملم. سيتم إدخال طول الخط المقاس في الخطوة 4.2 تلقائيا ك "نصف قطر النهاية".
   3. تعيين "راديوس الخطوة الحجم" إلى 0.1 ملم.
      ملاحظة: يحدد حجم خطوة نصف قطرها عدد الحلقات (على نحو فعال عدد التكرارات)؛ فإن حجم الخطوة أصغر زيادة عدد من الحلقات، في حين أن حجم خطوة أكبر سوف يقلل من عدد من الحلقات. لا يمكن تعيين دائرة نصف قطرها صغيرة جدا، على الرغم من أن دائرة نصف قطرها صغيرة مفرطة سوف يؤدي إلى عدد كبير لا داعي له من الحلقات. ومع ذلك، فإنه يمكن تعيين كبيرة جدا، والتي سوف تخلق حلقات أقل وبالتالي نقلل من العدد الحقيقي للتقاطعات. راجع ستانكو إت آل.(2015) لمزيد من المعلومات حول تحديد حجم الخطوة.
   4. قم بتعيين "# سامبلز" إلى 1 و "إنتغراشيون" إلى "مين" في "إي عينات متعددة لكل نصف قطر".
   5. تعيين "قطع دائرة نصف قطرها إرفاق" إلى 1 وتحقق "استنتاج من دائرة نصف قطرها البداية" ل "# الفروع الأساسية" في "إي الواصفات ومنحنى المناسب".
      ملاحظة: "تناسب الشخصية وحساب الواصفات" و "إظهار تفاصيل المناسب" يمكن التحقق كما تريد.
   6. تحقق "الخطي" وحدد "أفضل درجة المناسب" في "التشكيلات دون تطبيع"؛ تحقق "معظم المعلومات." حدد "منطقة لمحات عادية" في "طرق شول الرابع."
   7. تحقق من "إنشاء التقاطعات قناع" في "V. خيارات الإخراج" لإنشاء خريطة الحرارة من التقاطعات (اختياري).
   8. انقر على "التقسيم إلى شرائح" لإنشاء نافذة معاينة للصورة باستخدام حلقات لتأكيد المنطقةمن التحليل.
4. انقر فوق "موافق" لتشغيل التحليل.

5. قياس ميي

1. قياس ميي عن طريق تتبع أقصر مسافة حول شجرة الظهارية ( الشكل 8 ).
   1. في إيماجيج مع صورة الهيكل العظمي للغدة مفتوحة، انقر فوق أداة المضلع. انقر على نقطة على محيط شجرة الظهارية لبدء المضلع، التحرك في محيط الغدة، وانقر لإضافة جزء خط.
   2. عندما تم التحايل على المنطقة الظهارية بأكملها، انقر نقرا مزدوجا فوق لإغلاق المضلع. اضغط على المفتاح "M" لفتح نافذة النتائج؛ القيمة في عمود "المنطقة" هي ميي.
2. في الحالات التي تمتد فيها ظهارة غدية خارج العقدة الليمفاوية، طرح منطقة العقدة الليمفاوية (لنا) من ميي عند حساب كثافة المتفرعة.
   1. قياس لنا عن طريق تتبع العقدة الليمفاوية في نفس مانإيه مثل شجرة الظهارية والضغط على "M."
      ملاحظة: يجب طرح لنا من ميي في هذه الحالات لأن العقدة الليمفاوية يمنع التحليل من عد التقاطعات داخل لنا. عندما لم تصل الظهارة العقدة الليمفاوية، لنا هو صفر.

6. الإبلاغ عن البيانات

1. قيم التقرير لنصف قطرها المرفق، ميي، N، k ، وكثافة المتفرعة.
   ملاحظة: يتم تحديد نصف القطر المرفق في الخطوة 4.2 ويتم تحديد ميي في الخطوة 5.1.
   1. تشغيل التحليل لإنشاء نافذة النتائج شول.
      ملاحظة: N المبلغ عنها هو قيمة لتداخل المجموع. و k المبلغ هو قيمة معامل الانحدار شول (شبه لوغ). تحليل شول سيعود قيمة ل k على أي منطقة قياس من ظهارة غدية. للحصول على قيمة دقيقة ل k على ظهارة كاملة، يجب أن تكون نهايات الأقنية موجودة.
   2. تعديل ثه تحليل شول للغدة الثديية باستخدام قيمة الانتاج ل N لحساب الكثافة المتفرعة (نقطة النهاية الأساسية لهذه الطريقة). احسب الكثافة المتفرعة باستخدام الصيغة N / (ميي-لنا) وأبلغ عن القيمة N / مم ² .

Representative Results

يتم الإبلاغ عن القيم لنصف قطرها المغلقة المغلقة، ميي، N، K ، والكثافة المتفرعة المحسوبة للغدة الثديية تحليلها في هذا البروتوكول في الجدول 1 . تحليل شول يولد المؤامرات الخطية وشبه لوغ من عدد من التقاطعات في كل دائرة نصف قطرها ( الشكل 9 )، وإذا تم تحديدها، خريطة الحرارة من التقاطعات ( الشكل 10 ). وتظهر الغدد الأقل تطورا تقاطعات أقل داخل نفس الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف وبالتالي يكون لها كثافة متفرعة أقل. وسوف تستمر الغدة المتطورة لفرع موحد في جميع أنحاء ظهارة غدية بأكملها، وخاصة في المناطق البعيدة. ويمكن وصف مدى استمرار المتفرعة في هذه المناطق بالتعقيد المتفرع والنقصان في التعقيد يتم نقلها على أنها معدل من الاضمحلال (أو معامل الانحدار شول، ك ). معدل الاضمحلال يعكس التغيير في حمالة الصدر الظهارية البعيدةنشينغ ويقاس على منحدر خط عدد من التقاطعات تآمر ضد دائرة نصف قطرها المغلقة ( أي النمو الطولي للظهارة). وهكذا، يحسب معامل الانحدار شول عن طريق أخذ منحدر خط مؤامرة السجل (N / S) مقابل المسافة الشعاعية (r)، حيث لوغ (N / S) = - k r + m، عدد التقاطعات لكل حلقة من نصف القطر r والمنطقة S (πr ² )، و m هي الاعتراض. ولأن المنحدر - k يصف تسوس التقاطعات، فإن قيمة - k = 0 تشير إلى تسوس الصفر والتفرع الموحد من مركز التحليل إلى حافة الظهارة. في الغدد المتطورة قليلا، يتزايد تسوس المتفرعة. هناك تقاطعات أقل في المنطقة البعيدة من شجرة الظهارية. ويتم زيادة المنحدر k . لذلك، قيم k تقترب 0 هي دلالة على أكبر المتفرعة البعيدة ( أي تعقيد التعقيد) وبئر-تطور الغدة الثديية.

الشكل 1: عرض بطني. صورة للجزء البطني من أنثى الكبار سبراغو داولي الجرذ، وتوضيح كيفية تأمين الفئران على سطح تشريح وموقع الغدد الثديية 12، مع الحلمات محاطة بدائرة. * الحلمات من الغدد 6 و 7 غير مرئية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الإناث الجرذ الثديية الغدة. صورة من الغدد الثديية المكشوفة 4 (MG4) و 5 (MG5)، مع الجلد مثبتة على سطح تشريح فوق MG4 وأقل من MG5. يجب إزالة الغدد من سك في بداية مع MG5 والاستمرار حتى وظهري حتى MG5 و 4 تتم إزالتها تماما. الحلمة في المنطقة البعيدة من الغدة 4، وينبغي أن تمارس الرعاية لجمع هذه المنطقة. يشار إلى العقدة الليمفاوية كمرجع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: الغدة الثديية كله جبل. صورة كاملة جبل الغدة الثديية التي تم جمعها من يوم ما بعد الولادة 25 أنثى سبراغ داولي الفئران. شريط مقياس = 1 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

.jpg "/>
الشكل 4: إزالة الضوضاء. قناة اللون الأزرق من صورة الثدي كله جبل، مع طرح الخلفية. ( A ) أمثلة مع الضوضاء. تشير الأسهم إلى الضوضاء الناتجة عن الأوعية الدموية، والمنطقة المظللة بشكل أكبر المحيطة بنهايات الأقنية هي مثال على الضوضاء الناتجة عن طرح الخلفية. ( B ) الصورة بعد إزالة الضوضاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: إعادة إعمار الصورة. إعادة بناء أجزاء محو من الصورة عتبة. ( A ) تشير الأسهم الحمراء إلى المناطق التي فقدت أجزاء من الصورة بسبب العتبة. صورة ريكونست وينبغي إجراء الروك في هذه المناطق. ( B ) الصورة الثديية بعد إعادة بناء المناطق المحذوفة. يجب أن تتم إعادة إعمار الصورة بعناية وعلى أساس الحد الأدنى وذلك للحفاظ على سلامة الصورة الأصلية الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تراكب صورة سكيليونيزد. تراكب صورة تظهر صورة هيكلية مضافين على الصورة الأصلية كامل جبل. توضح هذه الصورة أن الغدة الهيكلية تعكس المتفرعة من الغدة الفعلية مع درجة عالية من الدقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

s = "jove_content" فو: كيب-together.within-بادج = "1">
الشكل 7: نصف القطر المرفق. صورة سكيليتونيزد من الثدي كله جبل تظهر حيث يتم قياس دائرة نصف قطرها أرفق (الأصفر). وينبغي أن يبدأ الخط في قاعدة شجرة الظهارية (مركز التحليل) وتمتد إلى النقطة الأكثر البعيدة من ظهارة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: منطقة الظهارية الثديية. صورة سكيليتونيزد تظهر مضلع تتبع حول شجرة الظهارية لتحديد ميي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبرسيون من هذا الرقم.

الشكل 9: شول بلوت أوتبوت. إنتاج شول من الخطية ( A ) وشبه لوغ ( B ) المؤامرات من عدد من التقاطعات في كل زيادة شعاعي. النقطة الحمراء في لوحة (A) هو أبسيسا من سنترويد (مركز هندسي). في لوحة (B)، والخط الأزرق هو الانحدار الخطي على مجموعة كاملة من البيانات، في حين أن الخط الأحمر هو الانحدار الخطي على مدى ^عشر المئوي ^ال 10 -90. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 10: قناع التقاطعات. عندما "إنشاء إنترالأقسام "يتم تحديد الخيار" قناع "(الخطوة 4.3.7)، فإن التحليل إخراج خريطة الحرارة لعدد من التقاطعات عبر دائرة نصف قطرها ضميمة للصورة، وتعكس هذه الخريطة الحرارة كثافة التقاطعات المتفرعة في جميع أنحاء الظهارة (أحمر = حار = عالية الكثافة؛ الأزرق = البرد = منخفض الكثافة)، وظهارة بأكملها سيكون نفس اللون في خريطة الحرارة للصورة حيث K = 0. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

</ الجدول>

الجدول 1: معلمات تحليل شول. القيم هي البيانات المبلغ عنها لتحليل شول. يتم قياس نصف القطر المرفق (الخطوة 4.2) و ميي (الخطوة 5.1)، و N و K هي نتائج تحليل شول ويتم إرجاعها في نافذة نتائج تحليل شول (الخطوة 6.1)، ويتم حساب الكثافة المتفرعة باستخدام الصيغة N / ميي-لنا) (الخطوة 6.1.2).

Discussion

من الولادة حتى سن البلوغ، نمو الغدة الثديية هو قياس ألوميتريك. بعد سن البلوغ، الغدة الثديية تتطور من خلال واسعة المتفرعة الأقنية واستطالة، والتي تستمر حتى تحت ظهارة الثديية يحتل كامل لوحة الدهون. الخصائص المتفرعة هي جانب مهم من التنمية الغدة الثديية، والقدرة على تحديد موضوعي هذه الخصائص يمكن أن تكون مفيدة للغاية لتقييم التنمية الثديية العادية وتحديد التنمية الشاذة بعد التعرض للحياة في وقت مبكر إلى السموم الثديية.

وسجل الخصائص المورفولوجية، وقياس القياسات الأبعاد الأساسية، وعد الهياكل الثديية هي الطرق النموذجية لتقييم التنمية الغدة الثديية. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب ليست حساسة بشكل خاص بسبب التباين الكبير في حجم وشكل الغدد الثديية القوارض والتفسير التنموي قد يكون من الصعب على مقيم عديمي الخبرة. وعلاوة على ذلك، وإمكانات لالتحيز موجود في الدراسات التي لا أعمى بشكل صحيح. توفر طريقة تحليل شول بروتوكول كفاءة لقياس بدقة الثديية الظهارية المتفرعة الكثافة والتفرع التعقيد، وخصائص المورفولوجية منفصلة للتنمية الغدة الثديية، والتي يمكن بسهولة مقارنة عبر الدراسات والمختبرات.

هناك خطوات حاسمة داخل عدة أقسام من هذا البروتوكول. الأول والأهم يتعلق حالة الغدة الثديية كله جبل. وتعتمد دقة هذه الطريقة على الغدة الثديية التي يتم جمعها تماما سليمة، مع عدم وجود عيوب، ثابتة بشكل صحيح وملطخة، ويظهر أي أكسدة الغدة أو تلون كبير من وسط تصاعد. إذا كانت الغدة ممزقة أو مطوية، لا يمكن الحصول على قياس دقيق للكثافة المتفرعة. إذا لم تكن نهايات الأقنية موجودة، فإن قيمة k لن تكون ممثلة للغدة بأكملها. سوف تكون العتبة صعبة في الغددالتي لم يتم إصلاحها بشكل كامل بسبب عدم وجود تباين تلطيخ في ظهارة الأقنية. وأخيرا، إذا كان الأكسدة أو تلون موجودة، وهذه العيوب يمكن أن تمنع التحليل من قياس التقاطعات في المنطقة المصابة.

عندما يتم إعداد مناسبة كلها يتصاعد، فإن الخطوة الحرجة التالية التقاط الصور في نفس التكبير. ومن الممارسات الشائعة التقاط الصور الرقمية بأعلى دقة ممكنة. ومع ذلك، لتحليل شول، فمن المهم أن يتم التقاط جميع الصور في نفس التكبير. كما هو موضح في ستانكو وآخرون. (2015) ³ ، تم اكتشاف التحذير حيث صور الغدد الصغيرة التي تم التقاطها في التكبير عالية أظهرت كثافة المتفرعة أكبر من الصور من الغدد أكبر القبض عليها في التكبير أقل، على الرغم من أنها ظهرت بصريا لتكون أقل تطورا. افترضنا أن التكبير العالي أدى إلى مزيد من التفاصيل، والتي انتقلت إلى tانه صورة سكيليونيزد وأسفرت عن N أعلى، والتي أكثر من تمثيل الكثافة المتفرعة من الغدد الصغيرة. يتم تخفيف هذه المسألة من خلال التقاط جميع الصور في نفس التكبير.

في حين أن أساس تحليل دقيق يقع داخل كامل جبل، فإن أكبر إمكانية للتغيرات المؤثرة على المستخدم في بيانات التقاطع تقع ضمن خطوات لإزالة الضوضاء. جميع الصور تحتوي على ضوضاء، إلى حد ما، بسبب كثافة تلطيخ، الكيانات الفسيولوجية غير ذات الصلة (على سبيل المثال، الأوعية الدموية)، والتحف من العتبة. يجب معالجة كل صورة بشكل مستقل بسبب الاختلافات في كمية الضوضاء بين الصور. يجب الحرص على عدم إزالة القليل جدا أو الكثير من الضوضاء، وهذا يمكن أن تحرف عدد من التقاطعات، وبالتالي، والكثافة المتفرعة. ومع ذلك، لم يتم فحص مدى تأثير الضوضاء على التفسير. يجب على المستخدم أن يقرر مدى دقة أن يكون مع إزالة الضوضاء وينبغي أيضا ممارسة كونسيزتينس للحفاظ على سلامة الصور. ويوصى بشدة أن يكون المستخدم أعمى للعلاج عند إجراء إزالة الضوضاء، وهذا سوف يقلل من احتمال التحيز. ويرد وصف إزالة الضوضاء بالتفصيل دليل المستخدم إيماجيج ⁷ . في هذا الإجراء، تتم إزالة الضجيج بشكل أساسي من الصورة الخلفية المطروحة. بالإضافة إلى ذلك، قد عملية إزالة العتبة نفسها إزالة أجزاء من الغدة. سيتم إعادة بناء أجزاء من الغدة حيث تمت إزالة عدد قليل من وحدات البكسل تلقائيا عندما يتم توسيع الصورة الهيكلية. ومع ذلك، قد تتطلب الثغرات الواسعة إعادة البناء اليدوي. يجب أن يقرر المستخدم ما إذا كان وإلى أي مدى لإعادة بناء هذه القطاعات، والحفاظ مرة أخرى على سلامة الصور الأصلية.

على الرغم من أن هذا ليس حرجا، فمن المهم للحفاظ على تحديثات البرامج، كما يتم تحديث برنامج إيماجيج بشكل متكرر. تستند الطرق الموضحة هنا إلى الإصدار 1.48v. فيجي و شول أيتم تحديث البرنامج المساعد نليسيس أيضا بانتظام، ويستند البروتوكول الموصوفة هنا على v3.4.1. التغييرات التي تم إجراؤها في الإصدارات الأحدث من كل من إيماجيج و شول أناليسيس المساعد يمكن أن تؤثر على هذه الأساليب. إيماجيج يتحقق تلقائيا للحصول على التحديثات، ولكن يجب إجراء تحديثات ل فيجي بانتظام، وينبغي معالجة التغييرات بين الإصدارات الحالية وتلك المستخدمة هنا حسب الحاجة. يتم تعريف جميع المعلمات في العناوين الفرعية على صفحة ويب شول أناليسيس ⁶ . وتستند إعدادات المعلمة ضمن هذا الإجراء على الصور التي تم التقاطها من الغدة الثديية كلها يتصاعد التي تم إنشاؤها في مختبرنا وليست مطلقة. يتنوع الإعداد الكامل من مختبر إلى مختبر، ويمكن تعديل هذه المعلمات وفقا لذلك لتحسين الصور والمخرجات.

الغدة الثديية كلها جبل المستخدمة في هذه الدراسة كانت من الإناث سبراغ داولي الفئران في الحزب الوطني الديمقراطي 25، وتم تطبيق الطريقة بشكل مناسب ودون قيود. في الفئران، وكثافة الثديية الظهارية المؤتمر الوطني العراقييعيد مع تقدم العمر إلى نقطة حيث يمنع عتبة الصورة مع دقة عالية بما فيه الكفاية لتوليد صورة سكيليونيزد دقيقة من الغدة. ولذلك، ونحن حاليا لا ننصح باستخدام هذه الطريقة على الغدد من الفئران أقدم من PND40. على الرغم من أن سلالة من الفئران وقد أشير هنا، فإنه لا صلة لها بالموضوع، حيث أن المؤلفين ليسوا على علم حاليا من أي سمات الثديية سلالة محددة من شأنها أن تمنع استخدام هذه الطريقة. وعلاوة على ذلك، في حين أن الطريقة الموصوفة داخل أجريت باستخدام الفئران الإناث، ويمكن أيضا أن تطبق على الغدد الثديية من الفئران الذكور. كما تم استخدام هذا التطبيق بشكل فعال مع يتصاعد كله من الفئران (ديردري تاكر، والاتصالات الشخصية)، وينبغي أن تكون مناسبة للفئران في أي عمر، والغدد الثديية في الفئران لا تنمو كثيفة مثل تلك الموجودة في الفئران. ومع ذلك، هناك نوعان من القيود مع استخدام هذا التطبيق في الفئران: 1) قد يكون هناك عدد قليل جدا من تقاطعات المتفرعة في الفئران الأصغر للكشف عن اختلافات كبيرة و 2) هذا الأسلوب كانور تطبق على الفئران الذكور، كما أنها لا تظهر ظهارة الثديية. وبغض النظر عن ذلك، فإن هذه الطريقة الآلية هي أسرع، غير منحازة، وأقل كثافة في استخدام اليد العاملة من حساب تقاطعات التقاطعات المتفرعة يدويا.

فمن الممكن أن المحققين قد ترغب في الاستفادة من الغدة الثديية لتقنيات تجريبية أخرى، مثل استئصال الهياكل الشاذة أو المناعية (إهك). على الرغم من تاكر وآخرون. (2016) وصفت طريقة لإعداد قسم الهيماتوكسيلين-يوزين الملون من الماوس الغدة الثديية كله جبل، ⁸ نحن عادة النظر في إنشاء كامل جبل ليكون عملية محطة ولا يعرفون من أساليب لاستخدام كامل- مثبتة الغدة الثديية لفحوصات حساسة إضافية، مثل المقايسات إهك أو تونيل. حيث مطلوب المقايسات الحساسة باستخدام الأنسجة الغدة الثديية بالتزامن مع يتصاعد كله، فمن المستحسن استخدام الغدد الثديية المقابل.

الغدة الثديية تواصل to تكون النقطة المحورية في عدد متزايد من الدراسات، ومع ذلك توجد اختلافات عبر المختبرات في كل من إعداد كامل جبل ^{9 ، 10 ، 11 ، 12} والتقييمات التنموية ^{13 ، 14 ، 15} . تعديل تحليل شول وصفها هنا يوفر طريقة موحدة للقياس الكمي للكثافة المتفرعة، وهي سمة هامة للتنمية الغدة الثديية، في الغدة الثديية القوارض. هذه الطريقة يمكن تطبيقها على الثديية يتصاعد كامل من الذكور أو الإناث القوارض، وعلى الرغم من الموصى بها حاليا لاستخدامها في وقت مبكر فقط بعد الولادة إلى الغدد بيريبوبتال من الفئران، ويمكن تطبيقها على الغدد الثديية من الفئران من جميع الأعمار. التطبيق هو مناسبة خاصة للغدد الثديية التي تم جمعها من القوارض بيريبوبيرتال وهذه الفترة هو الموصى بهانقطة النهاية لإعداد جبل كامل الثديية في الدراسات التوجيهية اختبار. ويجري حاليا تحسين الاستفادة من هذه الطريقة لاستخدامها في الغدد الثديية أكثر كثافة من الفئران الكبار.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

ويود المؤلفون أن يعترفوا بالدكتور مايكل إيسترلينغ (النظم الاجتماعية والعلمية، دورهام، نك) لمساعدته في التحقق من صحة هذه الطريقة والدكتور تياغو فيريرا (جامعة ماكغيل، مونتريال، كيبيك، كندا) المساعدة مع تطبيق شول.

Materials

ضم دائرة نصف قطرها (مم)	ميي (mm2)	N	ك	المتفرعة الكثافة (n / mm2)
7.4	71.7	2381	0.73	33.2

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting board	NA	NA	A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable.
Dissecting T-Pins	Daigger	EF7419A
Spray bottle with ethanol	NA	NA	70% ethanol is suitable.
Curved dissecting scissors	Fine Science Tools	14569-09
Straight dissecing scissors	Fine Science Tools	14568-09
Curved forceps	Fine Science Tools	11003-12
Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mm microscope slides	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001	Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4.
Fisherfinest Premium Cover Glass 24 x 60 x 1 mm	Fisher scientific	12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film	Fisher scientific	13-374-12
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	A9967
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC)	Sigma-Aldrich	24102
Xylene	Sigma-Aldrich	214736
Carmine alum	Sigma-Aldrich	C1022
Aluminum potassium sulfate	Sigma-Aldrich	A6435
Permount mounting media	Fisher Scientific	SP15
Macroscope	Leica	Z16 APO	This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.  As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.
Digital camera	Leica	DFC295
Camera software	Leica	Leica Application Suite v3.1
ImageJ software	Open source	http://imagej.net/Welcome
Sholl analysis	Open source	http://imagej.net/Sholl_Analysis