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Developmental Biology

Quantifizierung der Verzweigungsdichte in Ratten-Mamma-Gland-Vollkonserven unter Verwendung der Sholl-Analysemethode

doi: 10.3791/55789 Published: July 12, 2017

Summary

Die Brustdrüsenentwicklung im Nagetier wurde typischerweise mit deskriptiven Beurteilungen oder durch Messung von physikalischen Grundattributen ausgewertet. Die Verzweigungsdichte ist ein Indikator für die Entwicklung von Mamma, der objektiv schwer zu quantifizieren ist. Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode für die quantitative Beurteilung der Mamma-Drüsen-Verzweigungseigenschaften.

Abstract

Eine zunehmende Anzahl von Studien nutzt die Nagetier-Brustdrüse als Endpunkt für die Beurteilung der Entwicklungstoxizität einer chemischen Exposition. Die Effekte, die diese Expositionen auf die Entwicklung von Brustdrüsen haben, werden typischerweise unter Verwendung von entweder grundlegenden Dimensionsmessungen oder durch Auswertung von morphologischen Merkmalen ausgewertet. Die breite Palette von Methoden zur Interpretation von Entwicklungsänderungen könnte jedoch zu inkonsistenten Übersetzungen in Laboratorien führen. Eine gängige Bewertungsmethode ist erforderlich, damit aus den Daten, die über Studien hinweg verglichen werden, richtige Interpretationen entstehen können. Die vorliegende Studie beschreibt die Anwendung der Sholl-Analyse-Methode zur Quantifizierung der Mamma-Drüsen-Verzweigungseigenschaften. Die Sholl-Methode wurde ursprünglich für die Verwendung bei der Quantifizierung von neuronalen dendritischen Mustern entwickelt. Durch die Verwendung von ImageJ, einem Open-Source-Bildanalyse-Softwarepaket und einem für diese Analyse entwickelten Plugin, der Verzweigungsdichte der Brustdrüse und der Komplexität von amAmmary Drüse aus einer peripubertären weiblichen Ratte wurden bestimmt. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen die Verwendung der Sholl-Analyse als wirksames Instrument zur Quantifizierung eines wichtigen Merkmals der Brustdrüsenentwicklung.

Introduction

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Die Brustdrüsenverzweigung ist ein charakteristisches Merkmal, das allgemein als Indikator der Drüsenentwicklung beurteilt wird, aber es ist schwer objektiv zu quantifizieren. Im Jahr 1953 beschrieb Sholl 1 eine Methode zur Messung der neuronalen dendritischen Arborisierung in den visuellen und motorischen Kortizes der Katze, und ein Plugin für diese Technik wurde von Ferriera et al 2 entwickelt . Da sowohl Neuronen als auch Brustdrüsen eine ähnliche baumartige Struktur aufweisen, wurde das Plugin zur Quantifizierung von Mamma-Epithel-Verzweigungsdichten in 2D-Bildern der peripubertären Ratten-Brustdrüse verwendet. Die peripubertäre Bühne wurde für die Analyse ausgewählt, weil die Entwöhnung eine Lebensphase ist, die oft in akademischen Laboratorien und Testrichtlinien untersucht wird. Die Sholl-Analyse ist ein Plugin, das mit FIJI verteilt wird, welches das Open-Source-Bildverarbeitungspaket ImageJ ist, mit zusätzlichen Plugins. Das Plugin schafft eine Reihe von konzentrischen Ringen, die ein Predef umkreisen(Typischerweise das Soma eines Neurons oder der Ursprung des Primärkanals einer Milchdrüse) und erstreckt sich bis zum distalsten Teil des Objekts (der umschließende Radius). Es zählt dann die Anzahl der Kreuzungen (N), die auf jedem der Ringe auftreten. Das Plugin gibt auch einen Sholl-Regressionskoeffizienten ( k ) zurück, der eine Messung der Rate des Zerfalls der Epithelverzweigung ist.

Mit ImageJ wird ein skelettiertes Bild einer Brustdrüsen-Ganzmasse erstellt und der Mamma-Epithelbereich (MEA) gemessen. Das Bild wird mit dem Sholl-Analyse-Plugin analysiert und Werte für N und k , unter anderen hier nicht genutzten Werten, werden zurückgegeben. Die Mamma-Epithel-Verzweigungsdichte wird durch Berechnung von N / MEA bestimmt. Das Ausmaß, in dem die Verzweigung in den äußeren Regionen des Drüsenepithels fortdauert, ist die Verzweigungskomplexität und ist ein Indikator für ein gleichmäßiges distales Epithelwachstum. Da k ein Maß für die distale Abnahme des Epiths istEliale Verzweigung, ist es ein wirksames Maß für die Verzweigungskomplexität und ein zuverlässiger Indikator für die Entwicklung von Mamma.

Dieses Protokoll beschreibt eine computergestützte Methode zur Erzeugung von skelettierten Bildern von Brustdrüsen-Vollkästen und quantitativen Auswerten von Mamma-Verzweigungseigenschaften bei peripubertalen männlichen und weiblichen Ratten. Diese Methode ist relativ schnell und erfordert nicht die Verwendung von spezialisierten Mikroskopie Ausrüstung. Entwicklung und Validierung dieser Methode sind in Stanko et al. (2015) 3 Dieser Bericht beschreibt auch die Vorbereitung der Ratten-Brustdrüsen-Ganzheit. Ähnliche Mamma-Vollmontageverfahren wurden in de Assis et al. Beschrieben . (2010) 4 und Plante et al. (2011) 5 .

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Protocol

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Alle Tiernutzungen und -verfahren für diese Studie wurden vom NIEHS Laboratory Animal Care and Use Committee genehmigt und in einer Assoziation zur Bewertung und Akkreditierung von Laboratoriums-Tierpflege-akkreditierten Einrichtungen durchgeführt.

1. Getreide Mamma Drüsen

  1. Vor-Etikett alle Folien mit einer Xylol-Beweis-Methode (Bleistift funktioniert am besten). Decken Sie sie mit Montage-Lösung am Ende, um das Etikett zu bewahren.
  2. Euthanisieren Sie das Tier durch eine Institutional Animal Care und Use Committee-genehmigte Methode.
  3. Nach der Euthanasie legen Sie das Tier auf den Rücken auf eine Sektionstafel ( Abbildung 1 ). Strecken und stecken Sie alle vier Gliedmaßen, wobei die hinteren Gliedmaßen ein umgekehrtes V bilden (Haltebolzen oder kleine Nadeln arbeiten gut).
  4. Sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol groß, um das Haar aus der Milchprobe herauszuhalten.
  5. Mit Pinzette, ziehen Sie die Bauchhaut an der Mittellinie und machen einen kleinen Schnitt mitSezieren Schere, wobei darauf achten, nicht zu punktieren das Peritoneum.
    1. Beginnend an der Inzision, schneide die Haut bis zum Halsbereich und dann distal zum vorderen Glied. Auf den Leistenbereich und dann distal zum ersten Gelenk des hinteren Gliedes auf derselben Seite abschneiden; Dieser Einschnitt trennt gewöhnlich die Milchdrüsen 5 und 6. Vermeiden Sie das Schneiden des Bauchfells.
    2. Ziehen Sie die Haut mit dem angehängten Brustfett-Pad mit Pinzette zurück und trennen Sie es vorsichtig vom Peritoneum mit dem stumpfen Ende der Sezierschere. Trennt so weit nach dorsal wie möglich vollständig den 4. und 5. inguinalen Brustdrüsen auf der Unterseite der Haut zu; Stecken Sie die Haut auf die Sektionsplatte ( Abbildung 2 ).
    3. Das Brustgewebe der 5.e Verschraubung mit der abgerundeten Seite des gebogenen Pinzette vorsichtig und langsam greift die Drüse von der Haut schneiden, darauf achten , daß nicht zu nick die Drüse oder die Haut.
    4. Weiter zu schneiden,Bewegen vom Rücken her , bis die 4. und 5. Drüsen vollständig von der Haut abgehoben wurden. Sicherstellen, dass der Nippelbereich mit dem Rest der Drüse entfernt wird, da dies als Ausgangspunkt für die Sholl-Analyse dient. Schneide das Mammagewebe vom Körper weg, wo es an der Drüse 4 befestigt ist.
  6. Sobald die Drüse aus dem Tier entfernt ist, verteilen sie es gleichmäßig auf eine elektrostatisch aufgeladene, 25 mm x 75 mm x 1 mm mikroskopische Folie, wobei die Seite der Haut nach unten zeigt.
    HINWEIS: Für Drüsen von älteren oder stillenden Tieren kann eine 51 x 75 x 1 mm Folie erforderlich sein.
  7. Beim Tragen von Handschuhen, drückt sanft alle Luftblasen aus. Decken Sie die Drüse mit einem Plastik-Paraffin-Film und einem anderen Mikroskop-Objektträger und komprimieren Sie die Drüse, um es an der Folie zu haften.
    HINWEIS: Ein 50 ml konisches Rohr, das mit Wasser gefüllt ist, dient als geeignetes Gewicht. Die Zeitspanne, die erforderlich ist, um an der Folie zu hängen, hängt von der Dicke der Drüse ab. Dünn, postnaTal Tag (PND) 4 Drüsen sollten für mindestens 30 min komprimiert werden, während dickere, erwachsene Drüsen können so viel wie 2-5 h erfordern.

2. Vorbereitung Mammary Whole-Mounts

  1. Bereiten Sie die Karma-Alaun-Lösung mindestens 24 Stunden im Voraus vor, da sie Kochen und Kühlen erfordert.
    1. 1 g Karma-Alaun und 2,5 g Aluminiumkaliumsulfat (AlK (SO 4 ) 2 · 12H 2 O) in 500 ml destilliertem Wasser auflösen und 20 min in einem 1-L-Kolben kochen lassen. Bringen Sie das Endvolumen auf 500 ml mit destilliertem Wasser.
    2. Filtriere die Lösung durch Filterpapier unter Vakuum und kälte für die Lagerung.
      HINWEIS: Karmin-Alaun-Lösung kann wiederverwendet werden, sollte aber verworfen werden, wenn die Farbe zu verblassen beginnt.
  2. Vor der Fixierung, schälen Sie den Paraffin-Film aus der Drüse, wobei darauf achten, die Drüse nicht von der Rutsche zu ziehen. Legen Sie die Folie (n) in ein Glas-Gleitfärbe-Glas und tauchen Sie in Fixiermittel (100% EthanOl, Chloroform und Eisessig im Verhältnis 6: 3: 1) für 12-48 h, abhängig von der Dicke der Drüsen.
  3. Gießen Sie das Fixiermittel und tränken Sie die Drüsen in 70% Ethanol für 15 min. Allmählich rehydrieren die Drüsen durch Ausgießen von 1/3 der Ethanol-Lösung und ersetzt sie mit destilliertem Wasser. 5 Minuten einweichen. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.
  4. Nach dem letzten Spülen die gesamte Ethanol / Wasser-Lösung ausgießen und mit 100% destilliertem Wasser ersetzen. Tauchen Sie die Drüsen für 5 min.
  5. Gießen Sie das destillierte Wasser ab und tauchen Sie die Drüsen in die Karmin-Alaun-Lösung ein. Färben Sie die Drüsen für 12-24 h, abhängig von der Dicke.
    HINWEIS: Die Drüsen können nicht überfärbt werden, aber die Färbezeit für mehrere Chargen sollte gleich sein, so dass die Färbeintensität gleich ist.
  6. Die Karmin-Alaun-Lösung abgießen und die Drüsen in 100% destilliertem Wasser für 30 s ausspülen. Allmählich dehydrieren die Drüsen durch Einweichen in 70% Ethanol für 15 min, 95% Ethanol für 15 min, a100% Ethanol für 20 min.
  7. Löschen Sie die Drüsen des Fettes, indem Sie sie in Xylol für 12-72 h eintauchen, abhängig von der Dicke.
    HINWEIS: Die Drüsen sollten lichtdurchlässig sein (klar). Wenn irgendwelche undurchsichtigen (weißlichen) Bereiche bleiben, weiter in Xylol einweichen, bis lichtdurchlässig. Wenn laktierende oder sonst sehr dicke Drüsen gebeizt und gereinigt werden, muss das Xylol möglicherweise einmal ersetzt werden, um die Drüsen vollständig zu löschen.
  8. Montieren Sie die Folien mit einem Xylol-basierten Montagemedium, indem Sie genug Medium pipettieren, um die Drüse zu bedecken. Fügen Sie ein Deckglas hinzu, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen entstehen.
  9. Lassen Sie die Objektträger trocknen. Wenn das Montagemedium trocknet, wird es sich unter dem Deckglas verteilen, und es kann notwendig sein, zusätzliches Montagemedium hinzuzufügen. Sobald kein zusätzliches Medium erforderlich ist, lassen Sie die Objektträger vollständig trocknen. Dies kann 2-3 Wochen dauern.
  10. Sobald die Objektträger vollständig trocken sind, kann jedes restliche Montagemedium mit einem Wattestäbchen und einer kleinen Menge an Xylol entfernt werden. Sei vorsichtig, nicht zu benutzenZu viel Xylol, da dies das Montagemedium auflösen und das Deckglas lösen kann. Wenn dies geschieht und Luftblasen unter dem Deckglas sammeln, sollte das Deckglas in Xylol entfernt werden und der Montagevorgang sollte wiederholt werden.

3. Vorbereiten von Vollbild-Bildern für die Analyse

  1. Erfassen Sie Bilder von Vollmontage ( Abbildung 3 ) mit einem Makroskop oder Seziermikroskop und einer Digitalkamera mit der entsprechenden Software.
    ANMERKUNG: Während jede Vergrößerung, die das gesamte Drüsenepithel einfängt, ausgewählt werden kann, ist es unerlässlich, alle Vollbilder zu erfassen, die bei gleicher Vergrößerung miteinander verglichen werden.
  2. Download ImageJ Software (oder FIJI Software) 6 .
  3. Öffnen Sie das Mamma-Vollbild-Bild in ImageJ, indem Sie auf "Datei" → "Öffnen" klicken. Wählen Sie das Freihand-Werkzeug und verfolgen Sie das Drüsenepithel. Wählen Sie "Bearbeiten" & #8594; "Klar draußen."
    1. Entfernen Sie die Lymphknoten, indem Sie den Knoten verfolgen und das Freehand-Werkzeug und "Bearbeiten" → "Ausschneiden" verwenden.
  4. Trennen Sie die Farbkanäle, indem Sie "Bild" → "Farbe" → "Split Channels" auswählen. Wählen Sie den Kanal mit dem besten Kontrast, in der Regel den blauen Kanal.
    HINWEIS: Ein RGB-Bild besteht aus einem Stapel der roten, grünen und blauen Komponenten dieses Bildes. Diese Aktion trennt diese Komponenten in drei 8-Bit-Graustufenbilder.
  5. Subtrahieren Sie den Hintergrund, indem Sie "Prozess" → "Subtrahieren Hintergrund" wählen. Wählen Sie die gewünschten Parameter und klicken Sie dann auf "Vorschau", um die Änderungen zu sehen.
    HINWEIS: "Subtrahieren von Hintergrund" entfernt glatte, durchgehende Hintergründe. Zusätzlich kann "Process" → "Filters" → "Unsharp Mask" verwendet werden, um Kontrast zu erzeugen.
  6. Wähle eine von th Nachfolgenden Methoden zum automatischen Entfernen von Rauschen: entkehren oder Ausreißer entfernen.
    HINWEIS: ImageJ bietet eine dritte Methode zur automatischen Geräuschentfernung: NaNs entfernen. Der Befehl NaNs entfernen ist jedoch nicht anwendbar, da er 32-Bit-Bilder verwendet und die aktuelle Methode 8-Bit-Bilder verwendet.
    1. Entfernen Sie das Rauschen mit dem Befehl despeckle, indem Sie "Process" → "Noise" → "Despeckle" wählen.
      HINWEIS: Dies ist gleichbedeutend mit dem Hinzufügen eines Medianfilters, der jedes Pixel mit dem Medianwert in seiner 3 × 3 Nachbarschaft ersetzt.
    2. Entfernen Sie das Rauschen mit dem Befehl "Ausreißer entfernen", indem Sie "Prozess" → "Rauschen" → "Ausreißer entfernen" auswählen.
      HINWEIS: Dieser Vorgang ersetzt ein Pixel mit dem Median der Pixel in der unmittelbaren Umgebung, wenn er vom Median um mehr als einen bestimmten Wert (die Schwelle) abweicht.
  7. Restliches Rauschen manuell entfernen (Lass = "xfig"> Abbildung 4).
    1. Öffnen Sie eine Kopie des Originalbildes und verwenden Sie diese als Leitfaden für was ist und was nicht Lärm ist. Klicken Sie auf die Doppel-Pfeil-Schaltfläche ganz rechts in der Symbolleiste. Wählen Sie die Zeichnungswerkzeuge aus. Die Schaltflächen zum Zeichnen werden nun in der Symbolleiste angezeigt.
    2. Klicken Sie auf das Radiergummi. Passen Sie den Radiergummordurchmesser an, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche Radiergummi klicken. Halten Sie die linke Maustaste gedrückt, um Rauschen zu löschen.
      HINWEIS: Nur eine Session des Löschens kann rückgängig gemacht werden. Sobald die linke Maustaste losgelassen und erneut geklickt wird, kann die vorherige Löschung nicht rückgängig gemacht werden.
  8. Passen Sie den Schwellenwert an, indem Sie "Bild" → "Anpassen" → "Schwellenwert" wählen. Bewegen Sie die Schieberegler, um die minimalen (oberen Schieberegler) und den maximalen (unteren Schieberegler) Schwellenwerte einzustellen, bis eine ausreichende Darstellung der Drüse erreicht ist.
    HINWEIS: Einstellen der Schwellenwertsegmente Graustufenbilder in interessante Merkmale und Hintergrund.
    1. Klicken Sie auf Übernehmen. Gegebenenfalls zusätzliche Geräusche an dieser Stelle durch die Schritte 3.6.1 und 3.6.2 entfernen.
  9. Rekonstruieren Sie die Teile des Drüsenepithels, die durch Schwellenwertbildung und Rauschentfernung entfernt wurden ( Abbildung 5 ).
    1. Führen Sie die Bildrekonstruktion sorgfältig und auf einer minimalen Basis durch, um die Integrität des Originalbildes aufrechtzuerhalten. Verweisen Sie auf das Originalbild für eine Referenz, was ist und was ist nicht Epithel.
    2. Klicken Sie auf das Spray Can Tool (auf der Symbolleiste mit den Drawing Tools). Stellen Sie den Sprühdurchmesser und die Geschwindigkeit ein, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Schaltfläche "Spray Can" klicken. Füllen Sie sorgfältig fehlende Abschnitte der Drüse, indem Sie auf die linke Maustaste klicken oder gedrückt halten.
  10. Erstellen Sie ein skelettiertes Bild der Drüse für die Durchführung der Sholl-Analyse. Stellen Sie sicher, dass das Schwellenwert binär ist, indem Sie "Prozess" → "Binär" → "Machen B" wählen Inary. "
    1. Wenn das Bild auf einem schwarzen Hintergrund weiß ist, wählen Sie "Prozess" → "Binär" → "Optionen" und deaktivieren Sie "Schwarzer Hintergrund". Skeletonize das Bild durch Auswahl von "Process" → "Binary" → "Skeletonize".
      HINWEIS: Das entfernt immer wieder Pixel von den Kanten des Binärbildes, bis es auf eine einpixelige Form reduziert wird.
    2. Dilate das Bild einmal durch Auswahl von "Process" → "Binary" → "Dilate".
      HINWEIS: Dies füllt Lücken aus, die durch Schwellenwert und Skelettierung erzeugt werden, indem Pixel zu den Kanten des Binärbildes hinzugefügt werden.
  11. Speichern Sie das Bild, indem Sie "Datei" → "Speichern unter" wählen. Wählen Sie einen Bildtyp (typischerweise jpeg), geben Sie den Dateinamen ein und klicken Sie auf "OK".
  12. Überprüfen Sie die Genauigkeit des skelettierten Bildes, indem Sie das skelettierte Bild auf das Originalbild überlagern (Ass = "xfig"> Abbildung 6).
    1. Erstellen Sie ein Overlay, indem Sie sowohl das Originalbild als auch das skelettierte Bild öffnen. Wählen Sie "Bild" → "Overlay" → "Bild hinzufügen". Wählen Sie im Dialogfeld "Bild hinzufügen" das Skelettbild aus dem Dropdown-Menü "Bild zu Hinzufügen" und legen Sie die Deckkraft auf 30% fest.
    2. Speichern Sie das Bild des Skeletts, das auf das Original überlagert ist, indem Sie "Datei" → "Speichern unter" auswählen. Wählen Sie einen Bildtyp aus, geben Sie den Dateinamen ein und klicken Sie auf "OK".

4. Durchführung der Sholl-Analyse

  1. Öffnen Sie ein Skelettbild und machen Sie das Bild binär, indem Sie "Prozess" → "Binär" → "Binär machen" wählen.
    1. Bevor Sie die Vergrößerungsskala einstellen, messen Sie die Anzahl der Pixel / mm mit einem Mikrometer für die Vergrößerung, bei der die Bilder aufgenommen wurden.
    2. Stellen Sie die gemessene Vergrößerung s einCale durch Auswahl von "Analysieren" → "Skala einstellen". Geben Sie die Anzahl der Pixel / mm ein. Setzen Sie den "Bekannten Abstand" und das "Pixel-Seitenverhältnis" beide auf 1. Geben Sie "mm" für die "Einheit der Länge" ein und überprüfen Sie "Globale" (behält die gleiche Skala für jedes Bild).
  2. Bestimmen Sie den Endradius (umschließender Radius) für die Sholl-Analyse, indem Sie eine Linie vom Beginn des Primärkanals (Zentrum der Analyse) bis zum distalen Punkt des Drüsenepithels zeichnen ( Abbildung 7 ).
    1. Verwenden Sie das Linienzeichnungswerkzeug in der Symbolleiste, um eine Linie zwischen den interessanten Punkten zu zeichnen. Drücken Sie die Taste "M", um eine Messung durchzuführen, und beachten Sie, dass sich ein Ergebnisfenster öffnet.
      HINWEIS: Der Wert in der Spalte "Länge" ist die Länge der Linie in mm. Dieser Wert wird bei der Einstellung der Sholl-Parameter automatisch als Endradius eingegeben. Das Sholl-Plugin wird den Ausgangspunkt nutzenDer Linie als Zentrum der zentrischen Ringe.
  3. Laufen der Sholl-Analyse.
    1. Führen Sie die Analyse durch Auswahl von "Plugins" "Advanced Sholl Analysis;" Erscheint ein Parameterfenster.
    2. Setzen Sie den Startradius in "I. Definition der Shells" auf 0.00 mm; Wird die in Schritt 4.2 gemessene Länge der Linie automatisch als "Endradius" eingegeben.
    3. Stellen Sie die "Radius Step Size" auf 0,1 mm ein.
      HINWEIS: Die Radiusschrittgröße bestimmt die Anzahl der Ringe (effektiv die Anzahl der Iterationen); Eine kleinere Schrittweite erhöht die Anzahl der Ringe, während eine größere Schrittweite die Anzahl der Ringe verringert. Der Radius kann nicht zu klein eingestellt werden, obwohl ein übermäßig kleiner Radius zu einer unnötig großen Anzahl von Ringen führt. Allerdings kann es zu groß eingestellt werden, was weniger Ringe erzeugt und anschließend die wahre Anzahl von Kreuzungen unterschätzen wird. Siehe Stanko et al.(2015) für weitere Informationen zur Bestimmung der Schrittweite.
    4. Setzen Sie die "# Samples" auf 1 und die "Integration" auf "Mean" in "II. Multiple Samples pro Radius".
    5. Setzen Sie den "Enclosing Radius Cutoff" auf 1 und prüfen Sie "Ableiten von Startradius" für die "# Primary Branches" in "III. Deskriptoren und Curve Fitting".
      HINWEIS: "Profil anpassen und Deskriptoren berechnen" und "Passende Details anzeigen" können wie gewünscht überprüft werden.
    6. Überprüfen Sie "Linear" und wählen Sie "Best fit grad" in "Profile ohne Normalisierung". Check "Am meisten informativ." Wählen Sie "Bereich für normalisierte Profile" in "IV. Sholl-Methoden".
    7. Überprüfen Sie "Erstellen Sie Kreuzungsmaske" in "V. Ausgabeoptionen", um eine Wärmekarte der Kreuzungen (optional) zu erstellen.
    8. Klicken Sie auf "Cf. Segmentation", um ein Vorschaufenster des Bildes mit Ringen zu erzeugen, um den Bereich zu bestätigenDer Analyse
  4. Klicken Sie auf "OK", um die Analyse auszuführen.

5. Messung der MEA

  1. Messen Sie die MEA, indem Sie den kürzesten Abstand um den Epithelbaum verfolgen ( Abbildung 8 ).
    1. In ImageJ mit dem Skelettbild der Drüse offen, klicken Sie auf das Polygon-Werkzeug. Klicken Sie auf einen Punkt auf dem Umkreis des Epithelbaums, um das Polygon zu beginnen, um den Umfang der Drüse zu bewegen, und klicken Sie, um ein Liniensegment hinzuzufügen.
    2. Wenn der gesamte Epithelbereich umgangen wurde, doppelklicken Sie, um das Polygon zu schließen. Drücken Sie die Taste "M", um ein Ergebnisfenster zu öffnen. Der Wert in der Spalte "Bereich" ist die MEA.
  2. In Fällen, in denen sich das Drüsenepithel über den Lymphknoten hinaus erstreckt, subtrahieren Sie den Lymphknotenbereich (LNA) von der MEA bei der Berechnung der Verzweigungsdichte.
    1. Messen Sie die LNA, indem Sie den Lymphknoten im selben Mann verfolgenEr als der Epithelbaum und drückt "M."
      HINWEIS: Die LNA muss in diesen Fällen von der MEA subtrahiert werden, da der Lymphknoten die Analyse daran hindert, Überschneidungen innerhalb der LNA zu zählen. Wenn das Epithel den Lymphknoten nicht erreicht hat, ist die LNA Null.

6. Berichtsdaten

  1. Reportwerte für den umschließenden Radius, MEA, N, k und Verzweigungsdichte.
    HINWEIS: Der umschließende Radius wird in Schritt 4.2 bestimmt und die MEA wird in Schritt 5.1 ermittelt.
    1. Führen Sie die Analyse aus, um ein Sholl-Ergebnisfenster zu generieren.
      HINWEIS: Das gemeldete N ist der Wert für die Summenintervalle. Der angegebene k ist der Wert für den Sholl-Regressionskoeffizienten (Semi-Log). Die Sholl-Analyse liefert einen Wert für k über jede gemessene Region des Drüsenepithels. Um einen genauen Wert für k über das volle Epithel zu erhalten, müssen die duktalen Enden vorhanden sein.
    2. Ändern Sie thE Sholl-Analyse für die Brustdrüse unter Verwendung des Ausgangswertes für N zur Berechnung der Verzweigungsdichte (der grundsätzliche Endpunkt dieser Methode). Berechnen Sie die Verzweigungsdichte mit der Formel N / (MEA-LNA) und melden Sie den Wert als N / mm 2 an .

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Representative Results

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Die in diesem Protokoll analysierten Werte für den gemessenen eingeschlossenen Radius, MEA, N, k und die berechnete Verzweigungsdichte für die Brustdrüse sind in Tabelle 1 angegeben . Die Sholl-Analyse erzeugt lineare und halb-log-Plots der Anzahl der Kreuzungen bei jedem Radius ( Abbildung 9 ) und, falls ausgewählt, eine Wärmekarte der Kreuzungen ( Abbildung 10 ). Weniger entwickelte Drüsen weisen weniger Schnittpunkte innerhalb derselben MEA auf und haben daher eine geringere Verzweigungsdichte. Eine gut entwickelte Drüse wird auch im ganzen Drüsenepithel, insbesondere in den distalen Gebieten, gleichmäßig verzweigen. Das Ausmaß, in dem die Verzweigung in diesen Bereichen fortgesetzt wird, kann als Verzweigungskomplexität beschrieben werden, und Abnahmen in der Komplexität werden als Zerfallsrate (oder Sholl-Regressionskoeffizient, k ) übertragen. Die Rate des Zerfalls spiegelt die Veränderung des distalen Epithelbügels widerNching und wird gemessen als die Steigung der Linie der Anzahl der Kreuzungen, die gegen den umschließenden Radius ( dh das Längswachstum des Epithels) aufgetragen sind. Somit wird der Sholl-Regressionskoeffizient berechnet, indem man die Steigung der Linie des Plots von log (N / S) gegenüber dem radialen Abstand (r) annimmt, wobei log (N / S) = - k r + m ist, wobei N ist Die Anzahl der Kreuzungen für jeden Ring des Radius r und der Fläche S (πr 2 ) und m der Zwischenpunkt. Da die Steigung - k den Zerfall der Kreuzungen beschreibt, würde ein Wert von - k = 0 Null Zerfall und gleichmäßige Verzweigung vom Zentrum der Analyse bis zum Rand des Epithels anzeigen. In spärlich entwickelten Drüsen wird der Verzweigungsverfall erhöht; Es gibt weniger Kreuzungen im distalen Bereich des Epithelbaums; Und die Steigung, k , wird erhöht. Daher sind die Werte von k, die sich nennen, eine größere distale Verzweigung ( dh Verzweigungskomplexität) und eine VertiefungEntwickelte Milchdrüse.

Abbildung 1
Abbildung 1: Ventralansicht. Bild des ventralen Teils einer erwachsenen weiblichen Sprague Dawley Ratte, die veranschaulicht, wie man die Ratte auf der Sezierfläche und die Lage der 12 Milchdrüsen sichern kann, wobei die Nippel umkreisten. * Die Brustwarzen der Drüsen 6 und 7 sind nicht sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Weibliche Ratten-Brustdrüse. Abbildung der exponierten Milchdrüsen 4 (MG4) und 5 (MG5), wobei die Haut auf die Sezierfläche oberhalb von MG4 und knapp unterhalb von MG5 fixiert ist. Die Drüsen sollten aus dem Sk entfernt werden Beginnend mit MG5 und weiter oben und dorsal bis MG5 und 4 vollständig entfernt sind. Die Brustwarze befindet sich im distalen Bereich der Drüse 4, und es sollte darauf geachtet werden, diesen Bereich zu sammeln. Der Lymphknoten ist als Referenz angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Mamma-Gland-Ganzes. Ein ganzes Bild einer Brustdrüse, die von einem postnatalen Tag gesammelt wurde 25 weibliche Sprague Dawley Ratte. Maßstab = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4: Entfernung von Rauschen Der blaue Farbkanal eines Mamma-Vollbild-Bildes, mit dem Hintergrund subtrahiert. ( A ) zeigt Beispiele mit Lärm. Die Pfeile zeigen Rauschen an, die durch Blutgefäße erzeugt werden, und der stärker schattierte Bereich, der die duktalen Enden umgibt, ist ein Beispiel für Lärm, das durch Subtrahieren des Hintergrundes erzeugt wird. ( B ) veranschaulicht das Bild, nachdem das Rauschen entfernt worden ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5: Bildrekonstruktion. Rekonstruktion der gelöschten Teile des Schwellenbildes. ( A ) Die roten Pfeile zeigen Bereiche an, in denen Teile des Bildes aufgrund von Schwellenwerten verloren gingen. BildrekonstruktionIn diesen Regionen sollte die Ruktion durchgeführt werden. ( B ) Mammabild nach Rekonstruktion der gelöschten Regionen. Bild Rekonstruktion sollte sorgfältig und auf einer minimalen Basis durchgeführt werden, um die Integrität des Originalbildes zu erhalten Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6
Abbildung 6: Überlagerung eines Skelettbildes. Overlay-Bild mit einem skelettierten Bild überlagert auf das Original-Vollbild-Bild. Dieses Bild zeigt, dass die skelettierte Drüse die Verzweigung der eigentlichen Drüse mit einem hohen Maß an Genauigkeit widerspiegelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


Abbildung 7: Umschaltradius. Skelettiertes Bild eines Mamma-Ganzes, das zeigt, wo der umschließende Radius gemessen wird (gelb). Die Linie sollte an der Basis des Epithelbaums (Zentrum der Analyse) beginnen und sich bis zum distalen Punkt des Epithels erstrecken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8
Abbildung 8: Mamma-Epithelgebiet. Skelettiertes Bild, das ein Polygon zeigt, das um den Epithelbaum herum verfolgt wird, um die MEA zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehenDieser Figur.

Abbildung 9
Abbildung 9: Sholl-Plot-Ausgabe. Sholl-Ausgabe von linearen ( A ) und semi-log ( B ) Diagrammen der Anzahl der Kreuzungen bei jedem radialen Inkrement. Der rote Punkt in der Tafel (A) ist die Abszisse des Schwerpunkts (geometrisches Zentrum). In Tafel (B) wird die blaue Linie die lineare Regression über den gesamten Bereich der Daten, während die rote Linie die lineare Regression über den 10 th -90 th Percentile ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 10
Abbildung 10: Kreuzungsmaske. Wenn das "Create InterAbschnitte Maske "gewählt (Schritt 4.3.7), gibt die Analyse eine Wärmekarte der Anzahl der Kreuzungen über den umschließenden Radius des Bildes aus. Diese Wärmekarte reflektiert die Dichte der Verzweigungskreuzungen im gesamten Epithel (rot = heiß = Hohe Dichte, blau = kalt = niedrige Dichte) Das gesamte Epithel wäre die gleiche Farbe in einer Wärmekarte eines Bildes mit k = 0. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Tabelle 1: Sholl-Analyseparameter Die Werte sind die gemeldeten Daten für die Sholl-Analyse. Der Umleitungsradius (Schritt 4.2) und MEA (Schritt 5.1) sind Messwerte, N und k sind Sholl-Analyseergebnisse und werden im Sholl-Analyse-Ergebnisfenster zurückgegeben (Schritt 6.1) und die Verzweigungsdichte wird nach der Formel N / ( MEA-LNA) (Schritt 6.1.2).

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Discussion

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Von der Geburt bis zur Pubertät ist das Brustdrüsenwachstum allometrisch. Nach der Pubertät entwickelt sich die Brustdrüse durch umfangreiche duktale Verzweigung und Dehnung, die sich fortsetzen, bis das Mammaepithel das gesamte Fettkissen einnimmt. Verzweigungscharakteristiken sind ein wichtiger Aspekt der Entwicklung von Brustdrüsen, und die Fähigkeit, diese Eigenschaften objektiv zu quantifizieren, kann sehr nützlich sein, um die normale Entwicklung der Mamma zu beurteilen und eine abnormale Entwicklung nach frühzeitiger Exposition gegenüber Mamma-Toxiziden zu identifizieren.

Die Auswertung von morphologischen Merkmalen, die Quantifizierung grundlegender Dimensionsmessungen und das Zählen von Bruststrukturen sind typische Methoden zur Bewertung der Entwicklung von Brustdrüsen. Allerdings sind diese Methoden nicht besonders empfindlich aufgrund der erheblichen Variation in der Größe und Form der Nagetier-Brustdrüsen und Entwicklungs-Interpretation kann für einen unerfahrenen Evaluator schwierig sein. Darüber hinaus ist das Potenzial fürBias besteht in Studien, die nicht richtig geblendet sind. Die Sholl-Analyse-Methode bietet ein effizientes Protokoll zur genauen Quantifizierung der Mamma-Epithel-Verzweigungsdichte und der Verzweigungskomplexität, diskrete morphologische Merkmale der Brustdrüsenentwicklung, die leicht über Studien und Laboratorien verglichen werden können.

Es gibt kritische Schritte in mehreren Abschnitten dieses Protokolls. Die erste und wichtigste bezieht sich auf den Zustand der Brustdrüse ganz-mount. Die Genauigkeit dieser Methode beruht auf einer Milchdrüse, die vollständig intakt gesammelt wird, ohne Defekte, richtig fixiert und gefärbt, und zeigt keine Oxidation der Drüse oder eine signifikante Verfärbung des Montagemediums. Wenn die Drüse zerrissen oder gefaltet ist, kann ein genaues Maß der Verzweigungsdichte nicht erhalten werden. Wenn die duktalen Enden nicht vorhanden sind, wird der Wert für k nicht repräsentativ für die gesamte Drüse sein. Thresholding wird in Drüsen schwierig seinDie aufgrund des fehlenden Färbekontrastes im duktalen Epithel nicht vollständig fixiert wurden. Und schließlich, wenn Oxidation oder Verfärbung vorhanden ist, könnten diese Makel die Analyse daran hindern, Kreuzungen im betroffenen Bereich zu messen.

Wenn geeignete Vollbefestigungen vorbereitet wurden, wird der nächste kritische Schritt die Bilder bei gleicher Vergrößerung erfassen. Es ist üblich, digitale Bilder mit der höchsten Auflösung zu erfassen. Für die Sholl-Analyse ist es jedoch wichtiger, dass alle Bilder bei gleicher Vergrößerung erfasst werden. Wie in Stanko et al. (2015) 3 wurde eine Einschränkung entdeckt, bei der Bilder von kleineren Drüsen, die bei hoher Vergrößerung eingefangen wurden, größere Verzweigungsdichten aufwiesen als Bilder von größeren Drüsen, die bei einer geringeren Vergrßerung eingefangen wurden, obwohl sie visuell weniger entwickelt waren. Wir vermuteten, dass die höhere Vergrößerung näher geführt wurde, die in t übergingEr skeletonisiertes Bild und führte zu einem höheren N, das die Verzweigungsdichte der kleineren Drüsen überreagierte. Dieses Problem wird durch die Erfassung aller Bilder bei der gleichen Vergrößerung gemildert.

Während die Basis einer genauen Analyse innerhalb des gesamten Mount liegt, liegt das größte Potential für benutzerdefinierte Änderungen der Schnittdaten in den Schritten zur Rauschentfernung. Alle Bilder enthalten Rauschen in gewissem Maße durch Färbeintensität, nicht relevante physiologische Einheiten ( zB Blutgefäße) und Artefakte der Schwellwertbildung. Jedes Bild muss unabhängig voneinander aufgrund von Variationen in der Menge an Rauschen zwischen Bildern adressiert werden. Es ist darauf zu achten, dass nicht zu wenig oder zu viel Lärm entfernt wird, da dies die Anzahl der Schnittpunkte und damit die Verzweigungsdichte verschieben kann. Das Ausmaß, in dem Lärm die Interpretation beeinflusst, wurde jedoch nicht untersucht. Der Benutzer sollte entscheiden, wie sorgfältig mit Rauschunterbrechung zu sein und sollte auch Konsis ausübenUm die Integrität der Bilder aufrechtzuerhalten. Es wird dringend empfohlen, dass der Benutzer zur Behandlung bei der Rauschentfernung geblendet wird, da dadurch das Potenzial für Bias minimiert wird. Rauschentfernung wird im Detail beschrieben die ImageJ Benutzerhandbuch 7. In dieser Prozedur wird das Rauschen primär aus dem Hintergrund-subtrahierten Bild entfernt. Zusätzlich kann der Schwellenwert selbst die Segmente der Drüse entfernen. Teile der Drüse, in denen nur wenige Pixel entfernt wurden, werden automatisch rekonstruiert, wenn das skelettierte Bild erweitert wird. Allerdings können expansive Lücken eine manuelle Rekonstruktion erfordern. Der Benutzer sollte entscheiden, ob und inwieweit diese Segmente rekonstruiert werden, um die Integrität der Originalbilder wieder aufrechtzuerhalten.

Obwohl dies nicht kritisch ist, ist es wichtig, Software-Updates zu pflegen, da die ImageJ-Software häufig aktualisiert wird. Die hier beschriebenen Methoden basieren auf Version 1.48v. FIJI und die Sholl aNalyse-Plugin werden ebenfalls regelmäßig aktualisiert und das hier beschriebene Protokoll basiert auf v3.4.1. Änderungen, die in späteren Versionen von ImageJ und dem Sholl Analysis Plugin vorgenommen wurden, können diese Methoden beeinflussen. ImageJ prüft automatisch auf Updates, aber Updates für FIJI sollten regelmäßig durchgeführt werden, und Änderungen zwischen den aktuellen Versionen und den hier verwendeten Personen sollten nach Bedarf adressiert werden. Alle Parameter sind in den Unterpositionen auf der Sholl Analysis Webseite 6 definiert . Die Parametereinstellungen in dieser Prozedur basieren auf Bildern, die aus in unserem Laboratorium entstandenen Brustdrüsen-Ganzkästen aufgenommen wurden und nicht absolut sind. Die gesamte Montagevorbereitung variiert von Labor zu Labor, und diese Parameter können entsprechend angepasst werden, um Bilder und Ausgabe zu optimieren.

Die in dieser Studie genutzte Brustdrüsen-Vollmontage war von einer weiblichen Sprague-Dawley-Ratte bei PND 25, und die Methode wurde angemessen und ohne Einschränkungen angewendet. Bei Ratten ist die Mamma-Epitheldichte incWiederholungen mit dem Alter zu einem Punkt, wo es verhindert, dass das Schwellenwert des Bildes mit einer ausreichend hohen Auflösung, um ein genaues skelettiertes Bild der Drüse zu erzeugen. Daher empfehlen wir derzeit nicht, diese Methode auf Drüsen von Ratten älter als PND40 zu verwenden. Obwohl der Stamm der Ratte hier angegeben wurde, ist es irrelevant, da den Autoren derzeit keine strichsspezifischen Mamma-Merkmale bekannt sind, die die Anwendung dieser Methode verhindern würden. Darüber hinaus, während das beschriebene Verfahren unter Verwendung einer weiblichen Ratte durchgeführt wurde, könnte es auch auf die Brustdrüsen von männlichen Ratten angewendet werden. Diese Anwendung wurde auch effektiv mit ganzen Mounts von Mäusen verwendet (Deirdre Tucker, persönliche Kommunikation) und sollte für Mäuse jeden Alters geeignet sein, da Brustdrüsen bei Mäusen nicht so dicht wie bei Ratten wachsen. Allerdings gibt es zwei Einschränkungen bei der Anwendung dieser Anwendung bei Mäusen: 1) kann es zu wenig Verzweigungskreuzungen bei jüngeren Mäusen geben, um signifikante Unterschiede zu erkennen und 2) diese Methode cannoT auf männliche Mäuse angewendet werden, da sie kein Mammaepithel aufweisen. Unabhängig davon ist diese automatisierte Methode schneller, unvoreingenommener und viel weniger arbeitsintensiv als das Zählen von Verzweigungskreuzungen manuell.

Es ist möglich, dass die Ermittler die Milchdrüse für andere experimentelle Techniken nutzen können, wie z. B. ansteigende anormale Strukturen oder für die Immunhistochemie (IHC). Obwohl Tucker et al. (2016) haben ein Verfahren zur Herstellung eines Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Abschnitts aus einer Maus-Brustdrüsen-Vollmontage beschrieben 8, die wir in der Regel in Erwägung ziehen, ein Ganzes zu einem terminalen Prozess zu schaffen und keine Methoden zur Verwendung eines Ganzkörpers zu kennen, Montierte Brustdrüse für zusätzliche empfindliche Assays, wie IHC- oder TUNEL-Assays. Wenn empfindliche Assays mit Hilfe von Brustdrüsengewebe in Verbindung mit Vollbehältern erforderlich sind, empfiehlt es sich, die kontralateralen Brustdrüsen zu verwenden.

Die Milchdrüse geht weiterO der Schwerpunkt in einer wachsenden Zahl von Studien, doch Unterschiede zwischen den Laboratorien bestehen sowohl in der Gesamtmontage Vorbereitung 9 , 10 , 11 , 12 und Entwicklungs-Assessments 13 , 14 , 15 . Die hier beschriebene Modifikation der Sholl-Analyse stellt eine standardisierte Methode zur objektiven Quantifizierung der Verzweigungsdichte, ein wichtiges Merkmal der Brustdrüsenentwicklung, in der Nagetier-Brustdrüse dar. Diese Methode kann auf Mamma-Voll-Reittiere von männlichen oder weiblichen Nagetieren angewendet werden, und obwohl derzeit für den Einsatz in nur frühen postnatalen bis peripubertären Drüsen von Ratten empfohlen, kann es auf Brustdrüsen von Mäusen aller Altersgruppen angewendet werden. Die Anwendung eignet sich besonders für Milchdrüsen, die aus peripubertären Nagetieren gesammelt werden, da diese Zeitspanne empfohlen wirdEndpunkt für Mamma Vollständige Vorbereitung in Testrichtlinien Studien. Die Optimierung dieser Methode zur Verwendung in den dichteren Brustdrüsen von erwachsenen Ratten wird derzeit in Betracht gezogen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Dr. Michael Easterling (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) für seine Unterstützung bei der Validierung dieser Methode und Dr. Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Kanada) für seine kontinuierliche ansprechen Unterstützung bei der Sholl-Anmeldung.

Materials

Umschaltradius (mm) MEA (mm2) N K Verzweigungsdichte (N / mm2)
7.4 71,7 2381 0,73 33.2
Name Company Catalog Number Comments
Dissecting board NA NA A piece of styrofoam roughly 10"x12" is suitable.
Dissecting T-Pins Daigger EF7419A
Spray bottle with ethanol NA NA 70% ethanol is suitable.
Curved dissecting scissors Fine Science Tools 14569-09
Straight dissecing scissors Fine Science Tools 14568-09
Curved forceps Fine Science Tools 11003-12
Superfrost Plus 24 x 75 x 1 mm microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001 Thermo Scientific Superfrost Plus & Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. 
Fisherfinest Premium Cover Glass 24 x 60 x 1 mm Fisher scientific 12-548-5P
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film Fisher scientific 13-374-12
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich A9967
Ethanol absolute, ≥99.8% (GC)  Sigma-Aldrich 24102
Xylene Sigma-Aldrich 214736
Carmine alum  Sigma-Aldrich C1022
Aluminum potassium sulfate  Sigma-Aldrich A6435
Permount mounting media Fisher Scientific SP15
Macroscope Leica Z16 APO  This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.  As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.
Digital camera Leica DFC295
Camera software Leica Leica Application Suite v3.1 
ImageJ software Open source http://imagej.net/Welcome
Sholl analysis  Open source http://imagej.net/Sholl_Analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Quantifizierung der Verzweigungsdichte in Ratten-Mamma-Gland-Vollkonserven unter Verwendung der Sholl-Analysemethode
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Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method. J. Vis. Exp. (125), e55789, doi:10.3791/55789 (2017).More

Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method. J. Vis. Exp. (125), e55789, doi:10.3791/55789 (2017).

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