Summary
Automatiserede systemer og protokoller for den rutinemæssige forberedelse af et stort antal skærme og nanoliter krystallisation dråber til vapor diffusion forsøg beskrives og diskuteres.
Abstract
Når høj kvalitet krystaller er fremstillet, diffract x-stråler, kan krystalstruktur løses på nær atomic opløsning. Betingelser til at krystallisere proteiner, DNAs, RNA'er og deres komplekser kan dog ikke være forudsagt. Ansætte en bred vifte af betingelserne er en måde at øge udbyttet af kvalitet diffraktion krystaller. To fuldt automatiserede systemer er blevet udviklet på den MRC laboratorium for Molekylærbiologi (Cambridge, England, MRC-LMB) at lette krystallisering screening mod 1.920 oprindelige betingelser ved vapor diffusion i nanoliter dråber. Semi-automatiske protokoller har også udviklet til at optimere betingelser ved at ændre koncentrationen af reagenser, pH-værdien, eller ved at indføre tilsætningsstoffer, der potentielt forbedre egenskaberne af de resulterende krystaller. Alle de tilhørende protokoller bliver beskrevet i detaljer og kort drøftet. Taget sammen, aktiverer de praktisk og meget effektiv makromolekylære krystallisering i en multi-user facilitet, og giver brugerne kontrol over vigtige parametre for deres eksperimenter.
Introduction
Røntgenkrystallografi er i vid udstrækning anvendes til yderligere fremme vores forståelse af biologiske og sygdom mekanismer på det atomare niveau og efterfølgende hjælpe rationel tilgange til drug discovery1. For dette, renset og koncentreret (2-50 mg/mL) makromolekylære prøver af proteiner, DNA, RNA, andre ligander og deres komplekser er trialed for deres tilbøjelighed til at danne bestilte tre-dimensionelle lattices gennem krystallisering2,3 ,4. Når høj kvalitet krystaller er fremstillet, diffract x-stråler, kan krystalstruktur løses på nær atomic opløsning5,6. Afgørende, betingelser at krystallisere en roman prøve kan ikke forudsiges og udbyttet af høj kvalitet krystaller er normalt meget lavt. En underliggende årsag er, at mange prøver af interesse har udfordrende biokemiske egenskaber, som gør dem ustabile på tilsvarende tidsskalaen for krystallisering (typisk et par dage). Endelig, processen er forværret af den tid, det tager at producere prøver og prøve varianter og optimere deres rensning og krystallisation7,8.
Betingelsen krystallisering er en løsning med en fældningsmiddel, der reducerer prøve opløselighed, og ofte også indeholder buffere og tilsætningsstoffer. Hundredvis af sådanne reagenser er velegnet til at ændre parametrene for krystallisering eksperimenter, som de har lav tilbøjelighed til at forstyrre prøve integritet (såsom protein eller nukleinsyre udfoldning). Mens testning millioner af kombinationer af krystallisering reagenser ikke er mulig, er test flere til mange screening kits - formuleret med forskellige strategier9,10 - muligt med miniaturized forsøg og automatiseret protokoller. I dette perspektiv er den mest medgørlige teknik sandsynligvis vapor diffusion med 100-200 nL dråber sidder på et lille godt over et reservoir, der indeholder betingelsen krystallisering (25-250 µL), gennemført i specialiserede krystallisering plader11 , 12. protein prøve og tilstand kombineres ofte i forholdet 1:1 for en samlet maengde paa 200 nL når du opretter slipværktøjer i øvre-brønde. Robot nanoliter protein krystallisering kan gennemføres med alternative teknikker og plader som manglende olie batch13 og Lipidic Cubic fase14 (den nyeste ene at blive anvendt specifikt til trans-membran proteiner, der er meget dårligt opløselige i vand).
Krystallisering facilitet på MRC-LMB blev startet i begyndelsen af 2000 ' erne og en tidlig Resumé af vores automatiserede protokoller blev præsenteret i 200515. En historisk Introduktion til protein krystallisering blev præsenteret og også en oversigt over fordelene ved robot nanoliter tilgang (derefter en ny metode til rutinemæssig eksperimenter). Siden makromolekylære krystallisering er hovedsagelig en stokastiske proces med meget lidt eller ingen nyttige forhåndsoplysninger, ansætte en bred vifte af (egnet) begyndelsesbetingelser øge udbyttet af kvalitet diffraktion krystaller16. Desuden er en ofte overset fordel af et stort indledende skærm at reducere behovet for optimering af prøver og krystaller i mange tilfælde. Selvfølgelig kan man stadig nødt til at fortsætte med optimering af nogle oprindelige betingelser senere. Typisk, koncentrationen af reagenser og pH er derefter systematisk undersøgt. Flere reagenser kan også indføres i den optimerede betingelse(r) yderligere ændre parametrene for krystallisering. Sikkert, man bør forsøge krystallisering med en prøve frisklavede, dermed de tilhørende protokoller skal være enkle og tilgængelige helst.
Her, to fuldt automatiseret systemer designet på MRC-LMB (systemer 1 og 2) og de tilhørende protokoller er fuldt beskrevet. Den vigtigste anvendelse af disse to systemer er indledende screening af vapor diffusion siddende drop krystallisering plader. System 1 integrerer en flydende handleren, en automatiseret karrusel til stock plader, en inkjetprinter for plade mærkning og en selvklæbende plade sealer. På system 1, er 72 96-brønd plader fyldt med kommercielt tilgængelige screening kits (80 µL af betingelsen overføres til reservoir fra en start volumen på 10 mL i reagensglas), mærket og forseglet. Pladerne opbevares derefter i en 10 ° C incubator, hvor de er tilgængelige for brugerne når som helst (som indledende skærme kaldet 'LMB plader').
System 2 integrerer en flydende handleren, en nanoliter dispenser og en selvklæbende plade sealer. På systemet 2, sidder dråber (100-1.000 nL) for dampe diffusion eksperimenter er produceret ved at kombinere betingelser og prøven i øvre-wells af 20 48 eller 96 brønde plader fyldt med betingelser. Dette betyder 1.920 indledende screening betingelser er trialed, når du bruger 20 LMB plader på systemet 2.
Robotter bruges også individuelt for optimering af udvalgte forhold, og de tilsvarende halvautomatiske protokoller er beskrevet. 4-hjørne metoden17 er ansat rutinemæssigt at producere optimering skærme. Tilsvarende protokollen først kræver manuel udarbejdelse af 4 løsninger ("A, B, C og D'). To lineære gradueringer af koncentrationer (for to vigtigste krystallisering agenter) er derefter automatisk genereret direkte til reservoirer for en krystallisering plade. For dette dispenserer en sprøjte-baseret flydende handler 4 hjørne løsninger på forskellige nøgletal.
For at optimere yderligere en betingelse, kan man ansætte tilsætningsstof skærme, der potentielt forbedre egenskaberne for resulterende krystaller18. To tilgange er tilgængelige for tilsætningsstoffet screening: en protokol, begyndende med tilsætningsstoffer hældes reservoirer for krystallisering plader før du konfigurerer dråber (protokol 1) og en anden protokol, hvor tilsætningsstoffet skærmen er udleveret direkte på dråber (protokol 2).
Andre nyttige udviklinger, der blev indledt på MRC-LMB til lette automatiseret makromolekylære krystallisering, er også præsenteret. Det væsentlige, krystallisering plader og tilknyttede enheder såsom en stabelbar samfund af Biomolekylær Screening (SBS) låg der minimerer fordampning af betingelser, når du bruger system 2.
For korthed antages det, at brugerne er fortrolige med de grundlæggende funktioner og vedligeholdelse af nanoliter dispenser, inkjetprinter og selvklæbende plade sealer. Medmindre andet er angivet, plader på dækket af robotter er placeret sådan, at de godt A1 ("A1-hjørne') er mod tilbage til venstre i en plade luftfartsselskab.
Protocol
1. to automatiserede fuldt systemer (indledende screening)
-
System 1: forberedelse af 72 96-brønd krystallisering plader fyldt med screening kits (LMB plader)
- Inden du udfører proceduren, sikre, at systemets robotter er initialiseret og deres kontrollerende software er åben. Tænde chiller tube-køling luftfartsselskabets ca 30 minutter før main-programmet startes.
- Placer en test plade på motoriseret SBS bærer af plade sealer. Køre plade sealer og kontrollere, at filmen bliver anvendt ordentligt. Gentag denne test to gange mere for at kontrollere, at den plade sealer er klar.
- Tilføj derefter 20 L ionbyttet vand til den største beholder med flydende handleren. Afbryde kobling skær fra den lille beholder (20% ethanol skylning løsning) og forbinde indsætter til den primære beholder.
- Angiv den relevante skærmnavn (tabel 1) på inkjet printer touchscreen. Derefter åbne og lukke karrusel døren for at udløse karrusel rotation. Åbn døren, når den første stak præsenterer sig selv.
- Fuldt indlæse den første stak med 22 krystallisering plader, hver med kolonne 1 vender ud. Fuldt indlæse de næste to stakke på samme måde.
- Indlæse de resterende 6 plader i de højeste stillinger i den fjerde stak. Luk karrusel døren.
- Kontroller, at visningen chiller angiver 14 ° C. Forsigtigt og gentagne gange invertere de valgte screening kits i 1 minut. Åbn derefter den flydende handleren frontpanel.
- Åbne rør og placere dem i afkøling luftfartsselskabet ifølge systemets standardopsætning 96-brønd (A1, A2, osv.). Efter markedsføring hvert rør i flyselskabet, placere dens låg på en bakke i den samme 96-godt layout.
- Cross-check røret positioner og sikre, at alle rør er niveau og bosatte sig i luftfartsselskabet. Luk frontpanelet.
- I vinduet 'Start' af flydende handleren software Vælg 'Run vedligeholdelse' og Åbn programmet rødmen. Kør programmet til at skylle 20% ethanol fra systemet og at vaske ydersiderne af de flydende-dispensering tips.
- Når rødmen er fuldført, skal du klikke på 'Annuller' for at vende tilbage til 'Start'. Vælg 'Kør en eksisterende proces' og klik 'Start dit valg'. Åbn programmet 'MRC kit udlevering'. Udfyld '18' for 'Tilfælde' i konfigurationen raster og køre programmet.
- Overvåge systemet, som de første fire plader er mærket, fyldt og plomberet.
- Når alle 72 plader har udarbejdet og lagt tilbage i karrusellen, skifte kobling skær fra den primære beholder til den lille beholder. Kør programmet 'Start up flush' (Se trin 1.1.10).
- Slukke chiller og kassér tomt screening kit rør. Fjern forsigtigt de 72 villige plader fra karrusellen. Kassér forkert udfyldt eller dårligt-forseglet plader. Gemme klar-til-brug plader på 10 ° C.
-
System 2: Opsætning af krystallisering dråber (100 nL protein + 100 nL betingelse) fra en enkelt prøve i 20 LMB plader
- Først, sikre, at systemets robotter er på, nanoliter dispenser er initialiseret med sin software åben, og den flydende handleren metode manager er åben. Slå microtube-køling Flyselskabet ca 15 minutter før main-programmet startes.
- Placer en test plade på motoriseret SBS bærer af plade sealer. Køre plade sealer og kontrollere, at pladen er forseglet korrekt. Test af plade sealer tre gange.
- Kør derefter nanoliter dispenser til at sætte 100-nL dråber af test-opløsningen i en test plade. Kontroller under et mikroskop, dråberne er indstillet korrekt. Luk nanoliter dispenser software og fjern strip-indehaveren blok fra dæk.
- Indsæt dernæst i den specialdesignede plade holder (Se Repræsentant resultater: krystallisering enheder udviklet på LMB) LMB pladen med den højeste relative mængde flygtige reagenser i dens betingelser (tabel 1). Fjern den selvklæbende film fra pladen.
- Åbn frontpanelet for flydende handleren og tætnet pladen anbringes på dæk, på bagsiden af den første glidende carrier (glidende luftfartsselskaber kan trækkes ud for lethed af adgang).
- Dække pladen med en SBS aluminium låg. Bilægge låget mod den bageste venstre hjørne af luftfartsselskabet ved at anvende blid pres på det modsatte hjørne af låget.
- Fjerne forseglingen, indlæse i de glidende luftfartsselskaber og dække de resterende 19 plader på samme måde arbejder fra mest at mindst flygtige betingelser. Når microtube-køling carrier er ved 4 ° C, som er angivet med et grønt lys, skal du fjerne omslaget.
- Afbrød låget af en microtube, der indeholder (mindst) 440 µL af protein prøve (tabel 2). Sikre, at prøven har ingen skum ovenfor menisk, da det vil forstyrre den flydende detektionssystem. Glasset anbringes i Position 1 af microtube-køling Flyselskabet.
- Placer en PCR-plade på flydende handler dæk foran plade bevæger adapter luftfartsselskab. Luk frontpanelet.
- Efter indlæsning af dæk, sikre at nanoliter dispenser dæk fremgår af strip-indehaveren blok og at luftfartsselskaber på bagsiden 50 µL tip stakke er klart af aluminium SBS låg.
- Den flydende handler 'Metode Management' grænseflade, Vælg 'Setup plader'. Overvåge initialisering af begge systemer og udfylde de køre parametre. Følg retningslinjerne for den metode Management interface (prompter, tal og et tip-management system hjælpe med forberedelse).
- Dobbelttjek, at alle nødvendige komponenter er klar, og derefter starte processen.
- Overvåge systemet nanoliter dispenser indstiller dråberne i den første plade og plade sealer efterfølgende sæler pladen.
- Når alle 20 plader har været forberedt med krystallisering dråber og automatisk tilbage til de glidende luftfartsselskaber, Åbn frontpanelet og forsigtigt fjerne pladerne. Kontrollere, at pladerne korrekt forseglet før gemme dem for krystallisering.
- Rengøre SBS låg med en 20% ethanol løsning inden stabling dem på den venstre side af flydende handleren til opbevaring. Kassér PCR-plade og microtube.
- Slå microtube-køling transportøren og tørre væk kondensation. Forlade et papir håndklæde på toppen af den køligere overflade til at absorbere yderligere kondens. Derefter, sæt bagcoveret på carrier og luk frontpanelet.
2. optimering af betingelser
-
Sprøjte-baseret flydende handleren: producerer to lineære gradueringer af koncentrationer i reservoirer for en krystallisering plade (4-hjørne metoden).
- Først, sikre at flydende handleren er på og initialiseres med sine open software.
- På 'GRADUERINGEN' fanen: Åbn programmet kræves, Vælg krystallisering plade type og det endelige rumfang i reservoirer (tabel 3). Den avancerede indstilling til «max shot vol» bør sænkes fra 6.000 til 3.000, når du bruger opløsninger indeholdende [isopropanol] > 10% v/v og [MPD] > 20% v / v.
- Forberede sprøjter. Placere et stempel i hver sprøjte (spidse ender ned) og Indsæt på bagsiden af sprøjter ind i udpegede rillerne nedenunder robot hoved. Twist en sprøjte med uret for at låse den i position (programmet vil begynde kun med alle de krævede sprøjter knyttet korrekt).
- Forberede trug. Fjerne rustfrit stål ramme og indsætte trug. De 4 positioner på venstre svarer til de 4 hjørner A, B, C, D. kontakten til 'SET UP' fane, der viser mængderne af løsninger kræves i hver sprøjte (på tabel 3, 0,5 mL dødvolumen blev tilføjet til diskenhederne vises). Hæld hjørne løsninger i deres respektive trug og placere rammen tilbage på dækket (rammen holder i position med 2 små magneter placeret foran på dækket). En alternativ måde at gå videre med dette trin er at hælde løsningerne i trug, når de allerede er placeret på dæk.
- Krystallisering pladen anbringes på den motoriserede SBS luftfartsselskab.
- Klik på 'ASPIRÉR' og vente på dette trin udfyldes (når stemplerne standsede på deres vej op).
- Skift til fanen 'Kør' og køre programmet.
- Efter afslutningen af programmet, gå tilbage til fanen Konfigurer, og klik på 'Fjern': systemet renser sprøjter fra sidesten løsninger, og derefter løfter stemplerne hele vejen op. 'Rense' kan anmodes om i stedet for 'Fjern'; Dette vil efterlade stemplerne på den nederste position, klar til Opsug mere løsninger med de samme sprøjter.
- Fjerne sprøjter ved at dreje dem mod uret.
- Kassér sprøjter og lavpunkter i den passende placering (eller skylle dem med deioniseret vand og derefter 20% v/v ethanol løsning for genbrug).
- Forsegle pladen og læg den på mikrotiterplade mixer til 3 min ved 1000 rpm, eller 10 min, når meget tyktflydende løsninger blandes. Pladen er klar til opsætning af krystallisering dråber på nanoliter dispenser.
-
Tilsætningsstof screening protokol 1 (oprettelse af krystallisering dråber i en 96-brønd krystallisering tallerken fyldt med tilsætningsstoffet skærm)
- Først, forberede tilstand med indledende koncentrationer af reagenser steg med 10% (min. vol. 15 mL når du overfører betingelsen fra en beholder på den additive skærm med flydende handleren).
- Sikre, at de flydende handler er klar til at betjene. Åbn programmet 'Tilføj skærm til tilsætningsstoffer' for en enkelt plade (Angiv volumen i reservoirer: '72 µL'). Beder, tal og et tip-management system (12 x 1.000 µL tips kræves) hjælpe med at sikre robotten er klar til at fungere efter valgene.
- Hente tilsætningsstof skærmen fra-20 ° C inkubator og fjerne dens aluminium seal straks (brug plade-indehaveren), så pladen anbringes på dækket af den flydende handleren. Programmet fungerer efter et portræt layout (pladen placeres med A1-hjørne placeret foran til venstre i luftfartsselskabet). Også placere også container fyldt med betingelsen. Kør programmet.
- Når reservoirer for pladen har været fyldt, placere den på mikrotiterplade shaker og køre programmet. Skyl beholderen for tilstand med deioniseret vand og 20% ethanol til genbrug.
- Oprette droplets på nanoliter dispenser. For det første markante krystallisering plade (brug plade-indehaveren). Derefter sted pladen og 8-godt protein strip i den første position af strip-indehaveren blok. Fanen 'Setup' på den kontrollerende software viser de faktiske holdninger af hver komponent på dækket. Belastning hver godt af strip med protein prøve drop størrelse kræves (tabel 4). Køre programmet at forberede droplets.
- Efter afslutningen af programmet, fjerne pladen fra dæk og forsegle det straks (bruge plade sealer, 3-tommer bredt selvklæbende tape). Kassér strip i den passende placering.
- Vurdere størrelsen, form, og centrering af dråber under mikroskop før opbevaring.
-
Tilsætningsstof screening protokol 2 (oprettelse af krystallisering dråber i en 96-brønd krystallisering plade med en genbrugelige tilsætningsstof skærm)
- Først, forberede det additive skærm: forlade den tilsvarende frosne 96-brønd celle kultur plade til at tø op ved stuetemperatur i 40 min. Derefter centrifugeres tilsætningsstof skærmen ved 1.000 x g i 2 min.
- Forberede tilstand (min. vol. 15 mL når du overfører betingelsen fra en beholder på den additive skærm med flydende handleren).
- Fyld reservoirer for en 96-brønd krystallisering plade med betingelsen. På væske-handleren, fortsætte på samme måde som protokol 1, trin 2.2.2, men Angiv "80 µL" for mængden i reservoirer.
- Oprette droplets på nanoliter dispenser med 3 komponenter på dækket (den plade der indeholder tilsætningsstoffet skærmen, sammen med krystallisering pladen og 8-godt protein-striben i den første position af strip-indehaveren blok, tabel 4).
- Forsegle celle kultur pladen som indeholder skærm med en aluminium ark og læg den tilbage i inkubatoren-20 ° C.
- Vurdere størrelsen, form, og centrering af dråber under mikroskop før opbevaring.
Representative Results
1. system 1 og LMB plader
Figur 1A viser system 1 baseret på en flydende handler opererer med en væske-system (deioniseret vand). Væske-systemet består af en beholder, en pumpe, slanger, 8 sprøjter udstyret med ventiler og 8 faste tips. Indstillingerne for flydende klasse var optimeret til at aspirat/give afkald på en bred vifte af løsninger og multi-dispensere på 4 plader (multi-dispensere kræver en relativt store overskud af indsugning volumen). En 22 L vandbeholder og en mindre beholder (5 L) med 20% v/v ethanol er gemt nedenunder system at fodre væske-system. Hver beholder er udstyret med to kobling skær. En insert (farvet blå) feeds system med væske, den anden (red) er en flow-tilbage til reducere overtryk. Efter brug forhindrer skylning med vand og derefter 20% v/v ethanol løsning mikrobiel vækst. En kølemaskine (også placeret nedenunder systemet) er tilsluttet en specialbygget tube-køling luftfartsselskab. System 1 er 2050 mm bred, herunder karrusel, 760 mm dyb og 88 mm høj. En yderligere 550 mm kræves i front for den arbejdsbord, der holder styreenheden af inkjet-printer og selvklæbende plade sealer. Ekstra plads kræves også ved siden af systemet for den kontrollerende PC. Program til at producere 72 fyldt plader (dvs. 18 runder af 4 plader) tager 3 timer og 50 min.
Figur 1B er et nærbillede af hoveddækket, der er udstyret med 8 faste tips (figur 1 c) monteret på en automatiserede pipettering arm, en anden arm med en gripper, en spids håndvask station, 2 x 4-holdning luftfartsselskaber for SBS plader og rør-køling transportør. De vigtigste program behandler 4 plader på et tidspunkt, der er taget automatisk fra karrusellen og placeret på dækket, hvor de er fyldt med krystallisering betingelser (80 µL i reservoirer, figur 1 d). Flydende niveauer er automatisk registreret som tips er ledende. Mens den flydende handleren dispenserer betingelser i et sæt af plader, er et andet sæt af tomme plader taget fra karrusellen, mærket og placeret på hoveddækket. En lille specialbygget indehaveren og vinduet i den bageste panel af flydende handleren var forpligtet til at placere printeren hoved og sin sensor bag på hoveddækket. 8 tips er skyllet og vaskes med vand fra de vigtigste container efter hver udlevering trin, der består af 4 delprøver i de tilsvarende kolonner i reservoirer. Efter 4 plader har været fyldt, er de automatisk forseglet og placeret tilbage i deres oprindelige position i karrusel. Plade sealer er udløst af en specifik driver (kaldet den kontrollerende software). Sealer bruger en rulle af 3-tommer bred tape, der er anvendt på en tallerken med ruller under mekanisk pres. Efter afslutningen af programmet, fyldt pladerne fjernes manuelt fra karrusel stakke og gemt i en 10 ° C inkubator beliggende i havnefaciliteten.
Figur 1 : Fylde reservoirerne med indledende screening kits. (A) oversigt over den fuldt automatiseret system 1. Karrusellen er en automatiseret enhed med plade stakke og det har til huse i et godt lavet af klar akryl plader på højre side hoveddækket. (B) hoveddækket af flydende handleren i drift med (en) den tube-køling carrier (forbundet til en isnende enhed nedenunder, ikke vist), (b) hurtigt håndvask station (tilsluttet til dræning, ikke vist), (c) den pipettering arm fylde 8 reservoirer for en 96-brønd krystallisering plade, (d) grebets arm at bringe en fyldt tallerken på (e) den motoriserede SBS carrier plade sealer. På bagsiden dækket er (f) trykning hovedet af inkjet-printer tilsluttet (g) inkjet styreenheden nedenunder sealer. (C) en mærket plade (navnet på skærmen) og produktionsdatoen bliver fyldt med krystallisering betingelser af 8 ledende fast tips af Teflon-belagt rustfrit stål. (D) tværsnit af en forseglet krystallisering godt. Reservoiret indeholder 80 µL af krystallisering tilstand (mens øverst godt er tom). Reservoir og øvre-og dybde specifikationer er i millimeter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1 viser de forskellige formuleringer for kommercielt tilgængelige screening kits i reagensglas. Kits bruges til at fylde reservoirerne 96-brønd krystallisering plader (LMB01-LMB22) på en regelmæssig basis med system 1.
| Plade navn | Kit navn | leverandør | butik nummer | rør | grundlæggende beskrivelse | ||
| LMB01 | Crystal raster 1 | Hampton forskning | HR2-110 | 48 | Sparsomme Matrix (pH 4.6-8.5) | ||
| Crystal raster 2 | Hampton forskning | HR2-112 | 48 | Stokastiske prøveudtagning (pH 4.6-9,0) | |||
| LMB02 | Guiden 1 | Rigaku | 1009530 | 48 | Stokastiske prøveudtagning (pH 4.5-10.5) | ||
| Guiden 2 | Rigaku | 1009531 | 48 | Stokastiske prøveudtagning (pH 4.5-10.5) | |||
| LMB03 | Gitter skærmen ammoniumsulfat | Hampton forskning | HR2-211 | 24 | Gitter skærmen, [AmS] = 0,8-3,2 M og buffere pH 4.0-9,0 | ||
| Gitter skærmen PIND/LiCl | Hampton forskning | HR2-217 | 24 | Gitter skærmen, [PLØK 6000] = 0-30 %w/v, koncentreret LiCl = 1,0 M og buffere pH 4.0-9,0 | |||
| Quick Screen | Hampton forskning | HR2-221 | 24 | Gitter skærmen, [NaKPO4] = 0,8-1,8 M ved pH 5,0-8.2 | |||
| Gitter skærmen natriumchlorid | Hampton forskning | HR2-219 | 24 | Gitter skærmen, [NaCl] = 1,0-4.0 M og buffere pH 4.0-9,0 | |||
| LMB04 | Gitter skærmen PLØK 6000 | Hampton forskning | HR2-213 | 24 | Gitter skærmen, [PLØK 6000] = 5-30 %w/v og buffere pH 4.0-9,0 | ||
| Gitter skærmen MPD | Hampton forskning | HR2-215 | 24 | Gitter skærmen [MPD] = 10-65 %w/v og buffere pH 4.0-9,0 | |||
| MemFac | Hampton forskning | HR2-114 | 48 | Sparsomme Matrix for Membranproteiner (pH 4.6-8.5) | |||
| LMB05 | PIND-Ion | Hampton forskning | HR2-126 | 48 | Gitter skærmen, [PLØK 3350] = 20 %w/v og forskellige salte på 0,2 M (ingen buffere) | ||
| Natrix | Hampton forskning | HR2-116 | 48 | Ufuldstændig Fakultet (pH 5.6-8.5) | |||
| LMB06 | Crystal raster Lite | Hampton forskning | HR2-128 | 48 | Crystal-skærm 1 med halvdelen af de oprindelige fældningsmiddel koncentrationer | ||
| Brugerdefinerede Lite skærm | Molekylær dimensioner | Nielsen | 48 | Yderligere betingelser med lave fældningsmiddel koncentrationer | |||
| LMB07 | Guiden Cryo 1 | Rigaku | 1009536 | 48 | Stokastiske prøveudtagning med betingelser cryoprotected ved hjælp af lav MW pløkker (pH 4,5-9,4) | ||
| Guiden Cryo 2 | Rigaku | 1009537 | 48 | Stokastiske prøveudtagning med betingelser cryoprotected ved hjælp af lav MW pløkker (pH 4.5-10.1) | |||
| LMB08 | JBS1 | JenaBioScience | CS - 101L | 24 | Ufuldstændig Fakultet baseret på forskellige pløkker (pH 4.6-9,0) | ||
| JBS2 | JenaBioScience | CS - 102L | 24 | Ufuldstændig Fakultet baseret på PLØK 4000 (pH 4.6-8.5) | |||
| JBS3 | JenaBioScience | CS - 103L | 24 | Ufuldstændig Fakultet baseret på PLØK 4000 (pH 4.6-8.5) | |||
| JBS4 | JenaBioScience | CS - 104L | 24 | Ufuldstændig Fakultet baseret på mellemlang MW pløkker (pH 6,5-8,5) | |||
| LMB09 | JBS5 | JenaBioScience | CS - 105L | 24 | Ufuldstændig Fakultet baseret på tunge MW pløkker (pH 6,5-9,5) | ||
| JBS6 | JenaBioScience | CS - 106L | 24 | Ufuldstændig Fakultet baseret på AmS (pH 4.6-8.5) | |||
| JBS7 | JenaBioScience | CS - 107L | 24 | Ufuldstændig Fakultet baseret på MPD (pH 4.6-8.5) | |||
| JBS8 | JenaBioScience | CS - 108L | 24 | Ufuldstændig Fakultet baseret på MPD og ethanol (pH 4.6-8.5) | |||
| LMB10 | JBS9 | JenaBioScience | CS - 109L | 24 | Ufuldstændig Fakultet baseret på fælles salte og 2-propanol (pH 4.6-8.5) | ||
| JBS10 | JenaBioScience | CS - 110L | 24 | Ufuldstændig Fakultet baseret på fælles salte (pH 4.6-8.5) | |||
| Klar strategi skærm 1 pH 4.5 | Molekylær dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Gitter skærmen med forskellige pinde | |||
| Klar strategi skærm 1 pH 5,5 | Molekylær dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Gitter skærmen med forskellige pinde | |||
| LMB11 | Klar strategi skærm 1 pH 6,5 | Molekylær dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Gitter skærmen med forskellige pinde | ||
| Klar strategi skærm 1 pH 7,5 | Molekylær dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Gitter skærmen med forskellige pinde | |||
| Klar strategi skærm 1 pH 8,5 | Molekylær dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Gitter skærmen med forskellige pinde | |||
| Klar strategi skærm 2 pH 4.5 | Molekylær dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Gitter skærmen med forskellige pinde | |||
| LMB12 | Klar strategi skærm 2 pH 5,5 | Molekylær dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Gitter skærmen med forskellige pinde | ||
| Klar strategi skærm 2 pH 6,5 | Molekylær dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Gitter skærmen med forskellige pinde | |||
| Klar strategi skærm 2 pH 7,5 | Molekylær dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Gitter skærmen med forskellige pinde | |||
| Klar strategi skærm 2 pH 8,5 | Molekylær dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Gitter skærmen med forskellige pinde | |||
| LMB13 | Indeks | Hampton forskning | HR2-144 | 96 | Små sparsomme matrix og gitter skærme (pH 3,0-9,0) | ||
| LMB14 | SaltRX 1 | Hampton forskning | HR2-107 | 48 | Gitter skærmen herunder 22 unikke salte versus salt og pH-værdi (4.1-9,0) | ||
| SaltRX 2 | Hampton forskning | HR2-109 | 48 | Gitter skærmen herunder 22 unikke salte versus salt og pH-værdi (4.1-9,0) | |||
| LMB15 | MemStart | Molekylær dimensioner | MD1-21 | 48 | Sparsomme matrix for Membranproteiner (pH 4.0-10,0) | ||
| MemSys | Molekylær dimensioner | MD1-25 | 48 | Gitter skærmen på Membranproteiner (for det meste pløkker, pH 3,5-9,5) | |||
| LMB16 | JCSG + | Qiagen | 130720 | 96 | Sparsomme Matrix (pH 4.0-10,0) | ||
| LMB17 | MORPHEUS skærm | Molekylær dimensioner | MD1-46 | 96 | Gitter skærmen herunder blandinger af tilsætningsstoffer og cryoprotected betingelser (pH 6,5-8,5) | ||
| LMB18 | Pi minimal skærm | JenaBioScience | CS-127 | 96 | Ufuldstændig Fakultet (pH 4.0-9,5) | ||
| LMB19 | Pi-PIND skærm | JenaBioScience | CS-128 | 96 | Ufuldstændig Fakultet på Membranproteiner (pH-værdi 4.8-8,8) | ||
| LMB20 | MORPHEUS II skærm | Molekylær dimensioner | MD1-91 | 96 | Gitter skærmen herunder blandinger af tilsætningsstoffer (tunge atomer) og cryoprotected betingelser (pH 6,5-8,5) | ||
| LMB21 | LMB krystallisering skærm | Molekylær dimensioner | MD1-98 | 96 | Sparsomme matrix herunder betingelser udvalgt fra LMB publikationer | ||
| LMB22 | MORPHEUS III skærm | Molekylær dimensioner | Nielsen | 96 | Gitter skærmen herunder blandinger af tilsætningsstoffer (drug forbindelser) og cryoprotected betingelser (pH 6,5-8,5) | ||
Tabel 1: formuleringer af kits fundet i LMB plader. Hver kommercielle screening kit består af 24/48/96 betingelser i første omgang i reagensglas. LMB plader lagerføres i 10 ° C væksthuse placeret i havnefaciliteten, hvor de er tilgængelige for brugerne når som helst.
2. system 2 og krav for at oprette slipværktøjer
Figur 2A viser system 2 baseret på en flydende handleren19 opererer med positiv fortrængning og engangs tips. De disponible tips leveres i stabelbare stativer egnet til automatiserede håndtering. En 3-position dæk nanoliter dispenser20 blev integreret i højre side af systemet. Aspirat/give afkald på nanoliter dispenser opererer også med positiv fortrængning bruge engangs microsyringes (leveret i store spoler). Som en stand-alone robot bruges en flytbar strip-indehaveren blok til at indlæse protein stikprøveudvælgelsen. For de fuldt automatiseret proces erstatter en 384-godt PCR plade strip-indehaveren. En lignende selvklæbende plade sealer til system 1 blev integreret i venstre side. Sealer og nanoliter dispenser stå på specialbyggede, rejst arbejdsborde i rækkefølge for de vigtigste gripper at nå plade bærere af disse to integrerede robotter (et vindue skulle skæres i både sidepaneler af flydende handleren for gripper at få adgang uden for hoveddækket). Hovedprogrammet kræver specifikke drivere til at udløse nanoliter udlevering programmer og sealer i rette tid. System 2 er 2,850 mm bred, 800 mm dyb og 800 mm høj. Ekstra plads er nødvendig ved siden af robot for visningen af den kontrollerende PC. To skraldespande er placeret nedenunder system for tips og microsyringes kasseres under processen (den kontrollerende PC er også gemt nedenunder). Et vigtigt kendetegn for system 2 er den overordnede layout, som bevarer nem adgang til de tre robotter, så de kan bruges individuelt for de optimering protokoller er beskrevet tidligere, eller andre protokoller er beskrevet andetsteds som krystallisering membran proteiner i lipidic mesophases21 og tilfældige microseed matrix screening22.
Figur 2B er et nærbillede af de dæk, der er udstyret med en enkelt robot arm. Armen integrerer 12 uafhængige pipettering sonder og de vigtigste gripper. Holdninger af sonderne kan styres individuelt i én retning for at få adgang til forskellige steder langs aksen mellem sonder eller endda enkelt rør. Sonderne kan afhente enten engangs tips (1-12) eller et par af plade-bevæger adaptere. To sæt af 4 stakke indeholdende 50 µL engangs tips indlæses i første omgang. Flydende niveauer er automatisk registreret som tips er ledende. De plade bevæger adaptere er designet med 2 skarpe pins på indersiden, der danner en valgfri gripper når det er nødvendigt. På batteridækket er placeret en 24-position microtube køling transportør for prøven, selv om kun 1-2 positioner bruges her. Derudover er der en transportør for PCR-plade og også 2 opbevaring luftfartsselskaber for stabelbar, specialbyggede SBS låg (figur 2 c). Endelig er der 4 glidende luftfartsselskaber, hver med 5 steder for krystallisering plader (4 x 5 = 20 plader).
Figur 2 : Oprettelse af droplets til vapor diffusion eksperimenter. (A) oversigt over den fuldt automatiseret system 2. (B) hoveddækket af flydende handleren i drift med (en) opbevaring luftfartsselskaber i stakke af SBS låg, (b) den stabelbare tips, (c) afkøling-carrier med en prøve i microtube, (d) carrier for 2 plade-bevægelse adaptere, (e) PCR-plade til overførsel af protein til nanoliter håndtering robot, (f) 9 forseglet plader, der er blevet placeret tilbage i deres oprindelige positioner, (g) den valgfri gripper at fjerne SBS låget af de 10th pladen om at blive transporteret på dæk af flydende handleren (h) de næste 10 plader skal forberedes med SBS låg på toppen, (jeg) den vigtigste gripper, som bruges til at transportere PCR og krystallisering pladerne, (j) vigtigste automatiseret arm integrere 12 pipettering sonder (2 bliver brugt til at fungere som valgfri gripper) og de vigtigste gripper og (k) dækket af nanoliter dispenser. (C) In-house custom SBS låg lavet af aluminium. Lågene integrere en gummiplade for at undgå fordampning af betingelser og to små huller at være præcist hentet op af den valgfri gripper. (D) tværsnit af en forseglet krystallisering godt hvor reservoiret er fyldt med en betingelse og øvre-brønden indeholder et slipværktøj sammensat fra både protein prøven og tilstand. Fordi fældningsmiddel i slipværktøjet er mindre koncentreret end i stand, vand koncentrationer af alle komponenter i drop stige gennem tab i løbet af processen af ækvilibrering ved vapor diffusion (meget skematisk repræsenteret af en pil). (E) lys micrographs af 100 nL og (F) 200 nL dråber produceret af nanoliter dispenser med en test-opløsningen (20% v/v polyethylenglycol 400, 0,001% w/v Safranin som røde farvestof). Størrelse og form af dråberne kan variere ud fra chemicophysical egenskaber af betingelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
De vigtigste program starter med den valgfri gripper at fjerne SBS låget fra den første krystallisering plade. Når låget blev overført til den tilsvarende opbevaring carrier, er krystallisering plade transporteret til dækket af nanoliter dispenser. Derefter overfører pipettering armen beløbet af prøven kræves for at oprette droplets fra den normalt kølet microtube til den første kolonne af PCR-plade. Efterfølgende, den vigtigste gripper flytter PCR-plade på dæk af nanoliter dispenser, der vil forberede dråber følgende valgmuligheder valgt af brugeren fra starten (fx. Dråbestørrelse). For dette, protein stikprøven er først hældes de øverste-brønde (ved hjælp af et enkelt sæt af 8 microsyringes og multi-udlevering), derefter krystallisering betingelserne udleveres på protein dråber (hver række nu kræver 8 nye microsyringes til at undgå krydskontaminering). Efter afslutningen af programmet for at oprette droplets, det vigtigste gripper transporterer den tilsvarende plade til plade sealer, så placerer PCR-plade tilbage i dens oprindelige position (mere protein vil blive udleveret i den næste kolonne af PCR-plade til den følgende plade ). Endelig, den forseglede krystallisering plade er flyttet tilbage til sin oprindelige position på dækket: Vapor diffusion eksperimenter er allerede begyndt på denne plade (figur 2D). Denne cyklus gentages afhængig af antallet af plader. Når det er nødvendigt, fjerner valgfri gribepunkterne en tom tip rack tillader pipettering armen til at få adgang til flere tips. Programmet tager 2 timer og 20 min og 440 µL af prøven at forberede enkelt dråber i 20 plader ved hjælp af 100 nL prøve + 100 nL tilstand (figur 2E og 2F).
Når du bruger nanoliter dispenser som stand-alone robot for to ekstra plader (se protokollen, trin 1.2.3), hele sættet af indledende screening plader fås i 10 ° C inkubator kan sættes op (22 LMB plader x 96 betingelser = 2,112 betingelser).
Tabel 2 viser kravene til hovedprogrammet ifølge brugervalgene på systemet 2.
| Plader | Drop størrelse (nL) | Stikprøveudvælgelsen | Tip krav | Varighed | |||
| Antallet | Type | Vol. 1 (µL) | Vol. 2 (µL) | 50 µL tips | Microsyringes | ||
| 10 | 96-brønd | 100 | 240 | 0 | 80 | 1040 | 1 h 12 min |
| 20 | 96-brønd | 100 | 440 | 0 | 160 | 2080 | 2 h 20 min |
| 10 | 96-brønd | 100 | 240 | 240 | 160 | 2080 | 1 h 45 min |
| 20 | 96-brønd | 100 | 440 | 440 | 320 | 4160 | 3 t 05 min |
| 10 | 48-godt | 1000 | 624 | 0 | 80 | 560 | 1 h 10 min |
| 20 | 48-godt | 1000 | 1208 | 0 | 160 | 1120 | 2 h 16 min |
Tabel 2: eksempler på hovedprogrammet indstillinger tilgængelige på 2-system til at konfigurere krystallisering droplets. Den nødvendige mængde af protein prøve, tips og microsyringes varierer efter program. Mængder af prøven ' vol. 1' (drop 1) og "vol. 2' (drop 2) beregnes som følger: (8 tips x kræves volumen pr. brønd af PCR plade + 4 µL tabt volumen) x antallet af krystallisering plader + 40 µL dødvolumen i microtube. Den nødvendige volumen pr. brønd af PCR plade for 100 nL dråber i 96-brønd krystallisering plade er 2 µL mens 6.8 µL kræves for 1.000 nL dråber i en 48-godt plade (dødvolumen i pladens huller PCR: 0,8 µL). En ekstra volumen af prøven er taget i betragtning ('tabt volumen') på grund af fordampning fra microtube og andre tab (f.eks. prøve stikning på tips). F.eks. til 20 MRC plader, 100 nL, 1 dråbe protokol, volumen af prøven kræves er: (8 x 2 + 4) x 20 + 40 = 440 µL (dvs., svarende til 22 µL pr. plade). Otte engangs 50 µL tips er påkrævet for hver plade, og hver prøve. For eksempel, 10 plader, 2-henlægge protokol, antallet af tips kræves er 8 x 10 x 2 = 160 tips. Antallet af microsyringes beregnes som følger: (8 + antal betingelser pr. plade) x antal prøver x antal plader. For 10 x 48-godt plader, er antallet af flydende handleren tips kræves f.eks: (8 + 48) x 1 x 10 = 560 tips.
3. formulering, forberedelse og håndtering af de 4-hjørne løsninger
Begge formuleringer af de 4 hjørne løsninger ("A, B, C og D') og den tilsvarende optimering skærmen (figur 3A) er automatisk genereret af et Excel-regneark. Der er forskellige regneark for forskellige antal betingelser — hovedsagelig 24, 48 og 96 betingelser — og også regneark til at udarbejde to forskellige optimering skærme i en enkelt plade. En typisk forbereder et sæt af 4 x 10 mL hjørne løsninger i reagensglas fra som 2-3 optimering skærme kan være forberedt, afhængigt af antallet og omfanget af nødvendige betingelser. Løsningerne er hældt i trug hvorfra de er indsugning af en sprøjte-baseret flydende handleren og senere hældes direkte plader (figur 3B). De to lineære gradueringer af koncentrationer skyldes blanding A, B, C og D på systematisk varierende forhold (figur 3 c).
Figur 3: 4-hjørne metoden til at forberede optimering skærme. (A) repræsentation af de to forløb af fusioner på tværs af en 96-brønd plade layout. (B) den sprøjte-baseret flydende handleren klar til at forberede en skærm med 4 sprøjter indsat i hovedet af robotten. En krystallisering pladen sidder i motoriseret SBS transportøren og 4 starter løsninger (A, B, C og D) har allerede blevet udleveret til deres respektive trug (løsningerne har været farvet rød kun til demonstration). (C) nøgletal løsninger A, B, C og D på tværs af 96 reservoirer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 3 viser kravene til de programmer, der er tilgængelige for brugere på sprøjte-baseret flydende-handleren.
| Plade type | Lol betingelser | Vol. i plade (reservoirer, µL) | Vol. i trug (mL) | Varighed |
| 96-brønd | 48 | 80 | 1,6 | 2 min. 5 sek |
| 96-brønd | 96 | 80 | 2.5 | 3 min 50 sek |
| 96-brønd | 2 x 48 | 80 | 1,6 | 2 min 50 sek |
| 48-godt | 24 | 200 | 1.8 | 2 min 25 sek |
| 48-godt | 48 | 200 | 3 | 4 min 20 sek |
Tabel 3: programmer tilgængelige på sprøjte-baseret flydende handleren for at forberede optimering skærme efter 4-hjørne metoden. 96-brønd pladen kan bruges til at forberede 96 eller 48 betingelse optimering skærm (når to 48-betingelse skærme tilberedes samtidigt, robotten skal være udstyret med 8 sprøjter og 8 trug). Andre programmer aktiverer brugen af 48-godt plader. De anførte mængder i trug omfatter de nødvendige dødvolumen (0,5 mL).
4. tilsætningsstoffet screening
Figur 4 viser de skridt til at udføre et tilsætningsstof screening starter enten med 96 tilsætningsstof løsninger allerede i reservoirer for krystallisering plade (protokol 1) eller i wells af lav-profil celle kultur plade anvendes som en genbrugelige tilsætningsstof skærm ( protokol 2). Tabel 4 viser de programmer til rådighed på nanoliter dispenser ifølge de to typer af protokoller.
Figur 4: de to typer af protokoller for tilsætningsstoffet screening. 96-additiv skærme gemmes ved-20 ° C. Efter protokol 1, additiv skærmen er tilføjet i første omgang at reservoirer for krystallisering plader (og ideelt fyldt på denne måde). En flydende handleren eller multipipette bruges til at give afkald på betingelsen til de reservoirer, der indeholder tilsætningsstoffet løsninger (volumen af tilsætningsstoffet skærmen repræsenterer 10% af det endelige rumfang i reservoirer: 8 µL til 80 µL endelige rumfang). Efter blanding betingelser på en mikrotiterplade mixer (ikke vist), bruges mikrosprøjte-baserede nanoliter dispenser til at oprette droplets (tabel 4). Efter protokol 2, additiv skærmen er tilføjet først senere under opsætningen af krystallisering dråber. Denne gang nanoliter dispenser er ansat til at forberede dråber med en ekstra komponent på sine dæk (den genbrugelige celle kultur plade der indeholder tilsætningsstoffet skærmen). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Protokol | Drop størrelse (nL) | Strip type | Prøven vol. (µL) | Lol af microsyringes | Varighed | ||||
| Type | Kilde af tilsætningsstoffer | Protein | Betingelse | Tilsætningsstof | I hver brønd (strip) | I alt | |||
| 1 | 96-brønd krystallisering plade | 100 | 100 | 0 | 2 ΜL | 2 | 16 | 104 | 2 min |
| 1 | 96-brønd krystallisering plade | 200 | 200 | 0 | 5 ΜL | 3.8 | 31 | 104 | 2min 10 sek |
| 2 | 96-brønd celle kultur plade | 200 | 200 | 100 | 5 ΜL | 3.8 | 31 | 200 | 3min 45 sek |
| 2 | 96-brønd celle kultur plade | 500 | 500 | 100 | 5 ΜL | 7.4 | 60 | 200 | 4min 15 sek |
Tabel 4: programmer tilgængelige på mikrosprøjte-baserede nanoliter dispenser til tilsætningsstoffet screening. Prøve i hver brønd i 8-godt strip krævede mængde beregnes som følger: dødvolumen + 12 x drop størrelse. Der er 2 typer af strimler (2 µL og 5 µL). De døde bind er 0,8 µL til 2 µL brøndene (som kan faktisk indeholde 3,2 µL max.) og 1,4 µL til 5 µL brøndene (7,5 µL max.). Den samlede mængde af protein påkrævet: 8 x volumen i godt af the strip (runde-up værdi). Døde er de V-formede huller i 96-brønd celle kultur pladen 2,5 µL. Det nødvendige antal microsyringes varierer alt efter det valgte program (8 + 96 = 104; eller 8 + 2 x 96 = 200).
På grund af fortynding af betingelsen med tilsætningsstoffet under protokol 1 skal betingelsen være forberedt på et forholdsmæssigt højere koncentration end i første omgang. Stigningen i endelige koncentrationer opnås lettest ved at reducere den endelige tilsætning af vand til den beregnede endelige rumfang. Efter dette provenuet man simpelthen med den normale sæt op af dråber, der bland tilstand og prøve (fx, 100 nL protein + 100 nL betingelse allerede blandet med tilsætningsstoffer). Protokol 2 (f.eks., 200 nL protein + 200 nL tilstand + 100 nL tilsætningsstof) letter screening på forskellige koncentrationer af tilsætningsstoffer ved simpelthen at variere mængden af tilsætningsstoffet skærm tilføjet. Protokol 2 indebærer mere eller mindre fortynding af dråber (som kan ændre krystallisering).
Flydende handleren fra system 2 kan bruges til Aspirér nok betingelse i 12 tips og dispensere 8 delprøver i reservoirer for en 96-brønd plade (Se protokollen, trin 2.2.2), selvom dette skridt kan selvfølgelig gøres manuelt med en multikanalpipette ( Figur 4). Flere plader kan fyldes på et tidspunkt med den samme betingelse, når du bruger flydende handleren (til at teste forskellige tilsætningsstof skærme senere). Ved udarbejdelsen af 2 plader, udfylde reagens beholder med mindst 23 mL. Ved udarbejdelsen af 3 plader, udfylde reagens beholder med mindst 31 mL.
5. krystallisering plader og tilknyttede enheder
Design af både MRC mødet-drop vapor diffusion krystallisering plader (96-godt 2-drop og 48-godt 1-dråbe, figur 5A og figur 5B) indeholder egenskaber, der giver pålidelig og effektiv automatiseret krystallisering eksperimenter, med især kugleform af øvre-brønde og en let V-form af reservoirer, som letter præcise udlevering og også centrifugering når centrering af dråberne er påkrævet. Desuden har øvre-wells en linse effekt for optimal belysning under et stereomikroskop (polymeren er UV overførbare til påvisning af UV-absorberende eller fluorescerende krystaller23).
En brugerdefineret segl (figur 5 c) giver mulighed for opsætning af hængende drop krystallisering eksperimenter inden for begge typer af plader ved hjælp af en nanoliter dispenser (protokoller ikke vist). Endelig, begge MRC plader har samme ydre dimensioner og rand. Randen passer ind i rillerne i vores specialbyggede plade holder (fig. 5 d), som bruges til manuelt placere/fjerne forsegling tape uden sprøjt væsker.
Figur 5: The MRC krystallisering plader og tilknyttede enheder udviklet på LMB. (A) A1-hjørne af 96-brønd plade. Reservoiret (aflange) er på venstre side af krystallisering godt, de to kugleformede øvre-brønde til højre. Dimensioner er i millimeter. (B) A1-hjørne af 48-godt plade. Reservoiret er på højre side af brønden (1 stort øvre-godt kun). (C) MRC hængende drop segl. (D) In-house custom plade holder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
6. protein krystaller
Figur 6 viser eksempler på nyttige krystaller opnået med vores automatiserede protokoller.
Figur 6: lys micrographs af dråber indeholdende krystaller opnået efter de automatiserede protokoller. (A, B) Krystaller fra indledende skærm af OmpF og PRT i plader forberedt med 2 fuldt automatiserede systemer (Se protokollen afsnit 1.1 og 1.2, betingelser: LMB07 godt A4 og LMB20 godt D12, henholdsvis, størrelsen af droplets er 100 nL protein + 100 nL tilstand, arbejde med Andrzej Szewczak, LMB)24. (C, D) Bar domæne krystaller før og efter optimering af oprindelige betingelser med metoden 4-hjørne (trin 2.1, LMB02 B6, 1.000 nL + 1000 nL, upubliceret arbejde af Leonardo Almeida-Souza, LMB). (E, F) Tunge kæde af menneskelige dynein 1 N-terminale domæne krystaller før og efter optimering af de oprindelige betingelser med metoden 4-hjørne (LMB20 E6, 200 nL + 200 nL, derefter 500 nL + 500 nL, upubliceret arbejde af Edgar Morales-Rios, LMB). (G, H) Supplere faktor D krystaller, før og efter optimering af betingelsen med tilsætningsstoffet screening (trin 2.2, indledende betingelse fra in-house custom skærmen, 200 nL + 200 nL, additiv D6 fra skærmbilledet 96-stand tilsætningsstoffer upubliceret arbejde af Matthias Bauer, LMB). (Jeg, J) Virale kuvert glycoprotein25 krystaller før og efter optimering af betingelsen med tilsætningsstoffet screening (trin 2.3, LMB20 A2, 150 nL + 150 nL, derefter 200 nL + 200nL + 100 nL tilsætningsstof E5 fra skærmbilledet 96-stand tilsætningsstoffer upubliceret arbejde af mia Modis, University of Cambridge, England). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
1 - udarbejdelse og anvendelse af indledende skærme gemt i plader
Screening kits skal blandes før der hældes plader, fordi lys nedbør eller fase adskillelse opstår i nogle rør under opbevaring. Når en skærm er sammensat af to kits (2 x 48 rør), er den første rør af andet kit placeret i beliggenhed E1 afkøling luftfartsselskabets. Når en skærm består af 4 kits (4 x 24 rør), den første rør af andet kit er placeret i beliggenhed C1, den første rør af den tredje kit er placeret i placering E1 og den første rør af den fjerde kit er placeret i placering G1. Samtidigt med at indlagde rør i deres afkøling carrier, er låg placeret på en bakke efter standard 96-brønd landskab layoutet. Da godt tal er angivet oven på lågene af fabrikanter, muliggør dette krydscheck hvis alle rør er blevet placeret i den rigtige rækkefølge. Dette hjælper også til at erstatte de korrekte låg på rørene, når du udfylder en reduceret antallet af plader.
Vi gemmer fyldt pladerne ved 10 ° C, et kompromis for at undgå frysning og oplagring ved 4 ° C, der kan medføre forringelse af betingelser og problemer med forsegling. Pladerne er gemt i op til flere måneder med normalt ingen mærkbar kondens på indersiden af sæl. Dette er mindre sandt for LMB05, LMB06, LMB09 og LMB10 plader som disse indeholde betingelser med relativt høje koncentrationer af flygtige reagenser (tabel 1). Lille mængde af kondens på den indvendige side af seglet reducerer forsegling effektivitet og kan medføre krydskontaminering mellem wells mens unsealing pladerne. For at hjælpe med at forhindre kondens under indledende afkøling, kan plader først overført fra karrusel i en isoleret picnic køligere, der er lagret i et koldt rum, 4 ° C natten over. Den meget langsom afkøling minimerer udviklingen af temperatur forløb inden for de lukket wells og dermed reducerer kondens samlede15. Desuden, når pladerne er gemt i 10 ° C inkubator, er en in-house custom SBS polystyren låget placeret på plade øverst i hver stak (ikke vist).
Hele sættet af vores fyldt plader kan bruges som en stor første skærm mod en roman, vandopløselige, protein prøve. Alternativt, færre plader kan vælges til at matche specifikke krav. For eksempel, LMB15 og LMB19 er skærme formuleret specielt til membranen protein prøver26,27, eller LMB20 er en skærm, formuleret med heavy-atomer til at lette den eksperimentelle udfasning af diffraktion data28 (Se også : Formulering af MORPHEUS protein krystallisering skærme).
2. opsætning af krystallisering dråber
Når du bruger systemet 2, skal screening kits med betydelige mængder af flygtige reagenser behandles først. Dette undgår man kondens dannes på gummi af SBS låg, der indvirker på låget håndtering og plade forsegling. En SBS låget har lidt af clearance når øverst på en plade, som derfor skal de justeres i første omgang (Se protokollen, trin 1.2.6). Protein døde diskenheder i wells af PCR-plade er relativt generøse (0,8 µL, Se forklaringen i tabel 2). Bemærk, at lige så generøs døde diskenheder er ansat ved brug af nanoliter dispenser individuelt med protein i 8-brønds strips (tabel 4). Mindre døde diskenheder kan arbejde, men nogle prøver overholder tips, kalibrering af en robot kan blive lidt unøjagtig, rummet kan være varmere end sædvanligt, osv. Alle føre til prøven tab dækket af de generøse døde diskenheder for at konsolidere tilgangen.
Seneste udvikling aktiveret yderligere miniaturisering af eksperimenter og dermed volumen af prøven kræves for screening krystallisering betingelser kan reduceres væsentligt ved at integrere den tilsvarende teknologi29,30 . Nogle aspekter af yderligere miniaturisering skal dog nøje overvejelse, såsom fordampning af droplets31 og manipulation af microcrystals32.
Endelig, centrifugering af pladen (2.000 omdr. / min., 1 min.) kunne integreres som en rutinemæssig sidste trin, når du konfigurerer krystallisering dråber (i sfæriske øvre-wells). En mere ensartet størrelse og form af dråber som følge af centrifugering kan reducere reproducerbarhed spørgsmål33,34. Sikkert, centreret dråber vil lette den senere vurdering af eksperimenter ved hjælp af et mikroskop, som de krævede brændvidde vil være den samme på tværs af hele pladen.
3. fordelene ved metoden 4-hjørne
Den mest markante fordel ved 4-hjørne metoden er dets enkelhed, hvilket minimerer fejl og letter ligetil automatiseret protokoller. For eksempel, placeret 4 hjørne løsninger altid på dækket af en flydende handler efter det samme layout. Også, alle programmer er baseret på faste nøgletal mellem løsninger (figur 3 c).
Manuel forberedelse af de 4 hjørne løsninger foretrækkes til automatiserede håndtering af løsninger i høje koncentrationer, som kan være meget tyktflydende. Relativt hurtige og præcise aspiration/udlevering er derefter muligt på de fleste typer af flydende handlere med mindstekrav til optimering af flydende klasser. Ikke desto mindre kan nogle hjørne løsninger stadig være for tyktflydende for en robot, der opererer med en væske-system til at fungere effektivt. Det er derfor, vi har valgt en flydende handler opererer med positive forskydning (figur 3B).
Ud over de 2 lineære gradueringer af koncentrationer, kan en tredje komponent (dvs., et sæt af buffere/tilsætningsstoffer) testes på en konstant koncentration på en praktisk måde. For dette, er en relativt stor mængde af et grundlæggende sæt af hjørne løsninger på en passende højere koncentration, undtagen komponenten skal varieres, forberedt først. Derefter stamopløsninger herunder denne komponent er tilføjet til at justere de endelige koncentrationer. For eksempel, er 50 mL af et sæt af 4 hjørne løsninger forberedt på 10% højere koncentrationer end i første omgang. Dette sæt er så delt i 5 mindre undersæt af 4. Endelig, 10% i mængden af forskellige buffer pH løsninger er tilføjet til hver delmængde.
4. formater og typer af tilsætningsstoffet skærme
Skærmene er normalt opbevares ved-20 ° C (figur 4), da de ikke bruges regelmæssigt og indeholder flygtige/ustabile forbindelser. Brug af en frossen tilsætningsstof skærm lagret i en dyb brønd blok (1 mL i wells) skal planlægges tidligt, fordi det vil tage 12-24 hr for alle de tilsætningsstoffer løsninger at tø helt ved stuetemperatur. Også et væld af brugere dele samme tilsætningsstof skærmen, potentielt forårsager problemer med krydskontaminering. Endelig, højden af dyb brønd blokke gør dem uegnede til de fleste nanoliter dispensere. Som en praktisk løsning til at omgå disse problemer, skal skærmen overføres fra dyb brønd blokken til lav-profil plader (figur 4).
Tilsætningsstof skærme, som omfatter en bred vifte af enkelt reagenser (med enkelt koncentrationer) har historisk set været meget populære35,36. Men andre typer af tilsætningsstoffet skærme er blevet udviklet, integrerer blandinger af tilsætningsstoffer37 eller en reduceret antallet af enkelt tilsætningsstoffer fundet ved forskellige koncentrationer38. Endelig, en supplerende tilgang er at undersøge effekten af tilsætningsstoffer på prøver før krystallisering39,40.
5. flere overvejelser
God praksis: De fleste skærme indeholder skadelige eller endda giftige stoffer og dermed tilstrækkelig personlig beskyttelse skal være ansat under protokollerne. Lige, bevægelige dele af robotter kan føre til skader, især når de forsøger at manuelt blande mens et program kører (selv om de fleste af robotterne har nødstop-knappen/system). På grund af de tekniske kompleksitet involveret, regelmæssig kontrol af robotter, skærme og programmer med tidligere karakteriseret testprøver, der er vigtige for vedvarende høje niveauer af reproducerbarhed.
Produktion: Som en indikation, mellem 4.000 til 8.000 LMB er plader produceret årligt med 1-system (og efterfølgende ansat af brugere for indledende screening). Det er ikke tilpasset de bestand en stor mængde af fyldt plader på 10 ° C, når den forventede omsætning er meget lavere, som efter 4-5 måneder, nogle betingelser vil begynde at blive forværret og fordampe. Forskellige tilgange til automatisering protokoller er blevet gennemført for små til medium størrelse laboratorier41.
Lagring og vurdering af eksperimenter: Efter udarbejdelsen af dråber, er pladerne gemt på vibrationsminimeret hylder i et værelse på 4 eller 18 ° C med stramt kontrolleret temperatur (+/-0,5 ° C maksimal afvigelse). Eksperimenter er vurderet ved hjælp af koldt lys kilde mikroskoper. Forskellige automatiske Billeddannende systemer er kommercielt tilgængelige, men man bør nøje overveje alle aspekter: vil den hastighed, der kræves til at scanne en plade være tilstrækkeligt for høj produktivitet? Påvirker objekter end krystaller med autofokus? Bliver den resulterende kvalitet af billeder nok til at stedet meget små krystaller (især omkring kanten af dråberne)? 42 , 43 , 44
Sammenligning af krystallisering betingelser: Efter omhyggelige undersøgelser om karakteren af de i første omgang fremstillede krystaller, kan man analysere tendenser og ligheder på tværs af betingelser ved hjælp af LMB skærmen database eller C6 Webværktøj45.
Disclosures
Vi hermed tilstand en modstridende kommercielle interesser, da LifeArc commercializes følgende: 96 - og 48-brønden MRC plader, MRC hængende drop sæl, MORPHEUS, Pi, ÅNGSTRØM og LMB krystallisering skærme.
Acknowledgments
MRC-LMB krystallisering facilitet er venligt støttet af medicinsk forskning Rådet (UK). Vi vil gerne takke medlemmerne af LMB for deres støtte: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den Ent og Pat Edwards (strukturelle undersøgelser), Steve Scotcher og de øvrige medlemmer af den mekaniske værksted, Neil Grant og Jo Westmoreland (visuelle hjælpemidler), Paul Hart og Tom Pratt (IT). Vi vil også gerne takke Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart og Heather Ringrose (Hamilton robotteknologi, UK), Paul Thaw, Robert Lewis og Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Schweiz), George Stephens og Donald Ogg (Alphabiotech, UK), Neil Williams (Markem Imaje, UK) og Graham Harris (The Cleveland Agency) for teknisk hjælp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Robots | |||
| Freedom EVO® | Tecan | n/a | Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0. |
| Microlab® STAR™ | Hamilton | n/a | Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE™ technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface. |
| Mosquito® | TTP Labtech | n/a | Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422. |
| Dragonfly® | TTP Labtech | n/a | Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196. |
| Adhesive plate sealer | Brandel | n/a | Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot). |
| Inkjet printer 9232 | Markem-Imaje | n/a | Integrated to System 1. Touchscreen interface. |
| Crystallization screens | |||
| Crystal Screen™ 1 | Hampton Research | HR2-110 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01 |
| Crystal Screen 2™ | Hampton Research | HR2-112 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01 |
| Wizard™ Classic 1 | Rigaku | 1009530 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02 |
| Wizard™ Classic 2 | Rigaku | 1009531 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02 |
| Grid Screen™ Ammonium Sulfate | Hampton Research | HR2-211 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ PEG/LiCl | Hampton Research | HR2-217 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Quick Screen™ | Hampton Research | HR2-221 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ Sodium Chloride | Hampton Research | HR2-219 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ PEG 6000 | Hampton Research | HR2-213 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| Grid Screen™ MPD | Hampton Research | HR2-215 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| MemFac™ | Hampton Research | HR2-114 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| PEG/Ion™ | Hampton Research | HR2-126 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05 |
| Natrix™ | Hampton Research | HR2-116 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05 |
| Crystal Screen Lite™ | Hampton Research | HR2-128 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06 |
| Custom Lite screen | Molecular Dimensions Ltd | n/a | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06 |
| Wizard™ Cryo 1 | Rigaku | 1009536 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07 |
| Wizard™ Cryo 2 | Rigaku | 1009537 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07 |
| JBS1 | JenaBioScience | CS-101L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS2 | JenaBioScience | CS-102L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS3 | JenaBioScience | CS-103L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS4 | JenaBioScience | CS-104L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS5 | JenaBioScience | CS-105L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS6 | JenaBioScience | CS-106L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS7 | JenaBioScience | CS-107L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS8 | JenaBioScience | CS-108L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS9 | JenaBioScience | CS-109L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| JBS10 | JenaBioScience | CS-110L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 6.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 7.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 8.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Index™ | Hampton Research | HR2-144 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13 |
| SaltRX™ 1 | Hampton Research | HR2-107 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14 |
| SaltRX™ 2 | Hampton Research | HR2-109 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14 |
| MemStar™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-21 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15 |
| MemSys™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-25 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15 |
| JCSG-plus™ Suite | Qiagen | 130720 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16 |
| MORPHEUS® screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17 |
| Pi minimal screen | JenaBioScience | CS-127 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18 |
| Pi-PEG screen | JenaBioScience | CS-128 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19 |
| MORPHEUS® II screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-91 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20 |
| LMB crystallization screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-98 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21 |
| Additive screens | |||
| HT additive screen | Hampton Research | HR2-138 | Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well). |
| MORPHEUS® additive screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-93-500 | Frozen in 96-well deepwell block (500 µL per well). |
| ANGSTROM additive screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-100 | Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well). |
| MORPHEUS® additive screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-93 | Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped wells (100 µL per well). |
| ANGSTROM additive screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-100-FX | Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped well (100 µL per well). |
| HIPPOCRATES additive screen | Molecular Dimensions Ltd | n/a | 48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS® III). |
| Other consumables | |||
| 96-well MRC 2-drop plate | Swissci | MRC 96T-UVP | Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80 µL. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible. |
| 48-well MRC 1-drop plate ('MAXI plate') | Swissci | MMX01-UVP | Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200 µL. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 µL. UV transmissible. |
| MRC hanging drop seal | Swissci | n/a | Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible. |
| Adhesive sealing tape | Hampton Research | HR4-50 | 3-inch wide Duck® HD Clear™ for sealer and manual sealing. |
| Adhesive aluminium sheet | Beckman Coulter | 538619 | Used to reseal additive screens. |
| Ink cartridge | Markem-Imaje | 9651 | System 1 (inkjet printer). |
| Solvent cartridge | Markem-Imaje | 8652 | System 1 (inkjet printer). |
| 50 µL tips | Hamilton | 235947 | System 2 (STAR™ liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE™ tips in disposable stacks. |
| Reagent container | Hamilton | 194052 | Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols. |
| PCR plate | Thermo Scientific™ | AB-2150 | System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito®). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells. |
| microsyringes | TTP Labtech | 4150-03020 | Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito® nanoliter dispenser (9mm spacing). |
| strip-holder block | TTP Labtech | 3019-05013 | SSB device for the Mosquito® strips, aka '4-way Reagent Holder'. |
| 2 µL 8-well strip | TTP Labtech | 4150-03110 | Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 µL. |
| 5 µL 8-well strip | TTP Labtech | 4150-03100 | Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 µL. |
| 5 mL syringes | TTP Labtech | 4150-07100 | Syringe body and piston for the Dragonfly® liquid handler. Pack of 100. |
| Troughs/Reservoirs | TTP Labtech | 4150-07103 | Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly®. Pack of 50. |
| Orbital microplate shaker | CamLab Limited | n/a | Variomag® for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm). |
| Microplate mixer | TTP Labtech | 3121-01015 | MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins. |
References
- Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Principles, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
- McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
- Bergfors, T. M. Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
- Dessau, M. A., Modis, Y. Protein Crystallization for X-ray Crystallography. J. Vis. Exp. (47), e2285 (2011).
- Crick, F. H. C. X-Ray Diffraction of Protein Crystals. Methods Enzymol. 4, 127-146 (1957).
- Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281, 3995-4009 (2014).
- Chruszcz, M., Wlodawer, A., Minor, W. Determination of Protein Structures-A Series of Fortunate Events. Biophys. J. 95, 1-9 (2008).
- Manjasetty, B. A., Büssow, K., Panjikar, S., Turnbull, A. P. Current methods in structural proteomics and its applications in biological sciences. 3 Biotech. 2, 89-113 (2012).
- Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J. Biol. Chem. 254, 12219-12223 (1979).
- Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J. Appl. Cryst. 23, 409-411 (1991).
- Stevens, R. C. High-throughput protein crystallization. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 558-563 (2000).
- Berry, I. M., Dym, O., Esnouf, R. M., Harlos, K., Meged, R., Perrakis, A., Sussman, J. L., Walter, T. S., Wilson, J., Messerschmidt, A. SPINE high-throughput crystallization, crystal imaging and recognition techniques: current state, performance analysis, new technologies and future aspects. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1137-1149 (2006).
- Luft, J. R., Collins, R. J., Fehrman, N. A., Lauricella, A. M., Veatch, C. K., DeTitta, G. T. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. J. Struct. Biol. 142, 170-179 (2003).
- Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. S. Membrane protein structure determination-the next generation. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 78-87 (2014).
- Stock, D., Perisic, O., Löwe, J. Robotic nanoliter protein crystallisation at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Prog. Biophys. Mol. Biol. 88, 311-327 (2005).
- Gorrec, F. The current approach to initial crystallization screening of proteins is under-sampled. J. Appl. Cryst. 46, 795-797 (2013).
- Hennessy, D. N., Narayanan, B., Rosenberg, J. M. Automatic implementation of precise grid screens: the four-corners method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1001-1003 (2009).
- Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
- DiLorenzo, M. E., Timoney, C. F., Felder, R. A. Technological Advancements in Liquid Handling Robotics. JALA. 6, 36-40 (2001).
- Jenkins, J., Cook, M. Mosquito: An Accurate Nanoliter Dispensing Technology. JALA. 9, 257-261 (2004).
- Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. (67), e4000 (2012).
- Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (78), e50548 (2013).
- Dierks, K., Meyer, A., Oberthür, D., Rapp, G., Einspahr, H., Betzel, C. Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wavelengths longer than 300 nm. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 66, 478-484 (2010).
- Szewczak, A. Structural studies of the bacterial MreBCD complex. , University of Cambridge, UK. (2016).
- Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., Modis, Y. Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion. J. Virol. 83, 4338-4344 (2009).
- Gorrec, F., Palmer, C. M., Lebon, G., Warne, T. Pi sampling: a methodical and flexible approach to initial macromolecular crystallization screening. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67, 463-470 (2011).
- Parker, J. L., Newstead, S. Current trends in α-helical membrane protein crystallization: An update. Protein Sci. 21, 1358-1365 (2012).
- Gorrec, F. The MORPHEUS II protein crystallization screen. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 71, 831-837 (2015).
- Yin, X., et al. Hitting the target: fragment screening with acoustic in situ co-crystallization of proteins plus fragment libraries on pin-mounted data-collection micromeshes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 70, 1177-1189 (2014).
- Wu, P., Noland, C., Ultsch, M., Edwards, B., Harris, D., Mayer, R., Harris, S. F. Developments in the Implementation of Acoustic Droplet Ejection for Protein Crystallography. JALA. 21, 97-106 (2015).
- Zipper, L. E., et al. A simple technique to reduce evaporation of crystallization droplets by using plate lids with apertures for adding liquids. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 70, 1707-1713 (2014).
- Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. Microcrystal manipulation with laser tweezers. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1297-1302 (2013).
- Newman, J. Initial Evaluations of the Reproducibility of Vapor-Diffusion Crystallization. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 826-832 (2007).
- Reis, N. M., Chirgadze, D. Y., Blundell, T. L., Mackley, M. R. The effect of protein-precipitant interfaces and applied shear on the nucleation and growth of lysozyme crystal. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1127-1139 (2009).
- McPherson, A., Koszelak., S., Axelrod, H., Day, J., Robinson, L., McGrath, M., Williams, R., Cascio, D. The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins. J. Crystal Growth. 76 (3), 547-553 (1986).
- Sauter, C., Ng, J. D., Lorber, B., Keith, G., Brion, P., Hosseini, M. W., Lehn, J. -M., Giegé, R. Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids. J. Crystal Growth. 196, 365-376 (1999).
- McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules. J. Struct. Biol. 156, 387-406 (2006).
- Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov. Today. 21, 819-825 (2016).
- Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).
- Chari, A., et al. ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space. Nat. Methods. 12, 859-865 (2015).
- Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., Sussman, J. L., Stuart, D. I., Perrakis, A. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 1426-1431 (2005).
- Wilson, J. Automated Evaluation of Crystallisation Experiments. Cryst. Rev. 10, 73-84 (2004).
- Snell, E. H., et al. Establishing a training set through the visual analysis of crystallization trials. Part I: ∼150 000 images. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 1123-1130 (2008).
- Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
- Newman, J., Fazio, V., Lawson, B., Peat, T. The C6 Web Tool: A Resource for the Rational Selection of Crystallization Conditions. Cryst. Growth & Des. 13, 12219-12223 (2010).
