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Biochemistry

आणविक जीवविज्ञान की MRC प्रयोगशाला में Macromolecular क्रिस्टलीकरण के लिए स्वचालित प्रोटोकॉल

Published: January 24, 2018 doi: 10.3791/55790
Automatic Translation
1, 1
1Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council

Summary

स्वचालित प्रणालियों और स्क्रीन और वाष्प प्रसार प्रयोगों के लिए nanoliter क्रिस्टलीय बूंदों की एक बड़ी संख्या की दिनचर्या तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल वर्णित है और चर्चा की ।

Abstract

जब उच्च गुणवत्ता क्रिस्टल प्राप्त कर रहे है कि diffract एक्स रे, क्रिस्टल संरचना के पास परमाणु संकल्प पर हल किया जा सकता है । शर्तों प्रोटीन, DNAs, RNAs, और उनके परिसरों सघन करने के लिए लेकिन भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है । शर्तों की एक व्यापक विविधता को रोजगार एक तरह से गुणवत्ता विवर्तन क्रिस्टल की उपज को बढ़ाने के लिए है । दो पूरी तरह से स्वचालित प्रणाली आणविक जीवविज्ञान की MRC प्रयोगशाला में विकसित किया गया है (कैंब्रिज, इंग्लैंड, MRC-LMB) कि nanoliter बूंदों में वाष्प प्रसार द्वारा १,९२० प्रारंभिक स्थितियों के खिलाफ क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग की सुविधा । अर्द्ध स्वचालित प्रोटोकॉल भी पुनर्अभिकर्ताओं की सांद्रता, पीएच, या additives है कि संभावित परिणामस्वरूप क्रिस्टल के गुणों को बढ़ाने के द्वारा शुरू करने की स्थिति को अनुकूलित करने के लिए विकसित किया गया है । सभी संबंधित प्रोटोकॉल विस्तार से वर्णित किया जाएगा और संक्षेप में चर्चा की । एक साथ ले लिया, वे एक बहु प्रयोक्ता सुविधा में सुविधाजनक और अत्यधिक कुशल macromolecular क्रिस्टलीकरण सक्षम है, जबकि उनके प्रयोगों के प्रमुख मापदंडों पर उपयोगकर्ताओं को नियंत्रण दे रही है ।

Introduction

एक्स-रे क्रि बड़े पैमाने पर आगे के लिए परमाणु स्तर पर जैविक और रोग तंत्र की हमारी समझ अग्रिम लागू किया जाता है और बाद में दवा खोज के लिए तर्कसंगत दृष्टिकोण की सहायता1। इस के लिए, शुद्ध और ध्यान केंद्रित (2-50 मिलीग्राम/प्रोटीन, डीएनए, आरएनए, अंय लाइगैंडों के macromolecular नमूने, और उनके परिसरों के लिए उनकी प्रवृत्ति के लिए परीक्षण कर रहे है क्रिस्टलीकरण के माध्यम से तीन आयामी जाली का आदेश दिया2,3 ,4. जब उच्च गुणवत्ता क्रिस्टल प्राप्त कर रहे है कि diffract एक्स-रे, क्रिस्टल संरचना के पास परमाणु संकल्प5पर हल किया जा सकता है,6। महत्वपूर्ण, शर्तों एक उपंयास नमूने सघन करने की भविष्यवाणी नहीं की जा सकती है और उच्च गुणवत्ता क्रिस्टल की उपज आमतौर पर बहुत कम है । एक अंतर्निहित कारण यह है कि ब्याज के कई नमूनों जैव रासायनिक गुणों को चुनौती है, जो उन्हें क्रिस्टलीकरण के लिए इसी टाइमस्केल पर अस्थिर कर (आमतौर पर कुछ दिनों). अंत में, प्रक्रिया नमूनों और नमूना वेरिएंट का उत्पादन करने के लिए आवश्यक समय से जटिल है, और उनकी शुद्धि और क्रिस्टलीकरण7,8का अनुकूलन करने के लिए.

एक क्रिस्टलीकरण शर्त नमूना घुलनशीलता कम कर देता है एक precipitant के साथ एक समाधान है, और शर्तों अक्सर भी बफ़र्स और additives होते हैं । ऐसे एजेंट के सैकड़ों के रूप में वे नमूना अखंडता के साथ हस्तक्षेप करने के लिए कम प्रवृत्ति है के रूप में क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के मापदंडों में परिवर्तन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं (जैसे प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड खुलासा). जबकि क्रिस्टलीय रिएजेंट के संयोजन के लाखों परीक्षण व्यवहार्य नहीं है, कई स्क्रीनिंग किट के लिए कई परीक्षण-विभिंन रणनीतियों9,10 के साथ तैयार-लघुकृत परीक्षणों और स्वचालित प्रोटोकॉल के साथ संभव है । इस परिप्रेक्ष्य में, सबसे नवागत तकनीक शायद 100-200 nL बूंदों के साथ वाष्प प्रसार है एक छोटे से ऊपर क्रिस्टलीकरण हालत (25-250 µ एल) युक्त जलाशय पर बैठे, विशेष क्रिस्टलीकरण प्लेटों में लागू11 , 12. प्रोटीन नमूना और हालत अक्सर २०० nL की कुल मात्रा के लिए एक 1:1 अनुपात में संयुक्त जब ऊपरी कुओं में बूंदों की स्थापना कर रहे हैं । रोबोट nanoliter प्रोटीन क्रिस्टलीकरण वैकल्पिक तकनीक और प्लेटों के साथ इस तरह के तहत तेल बैच13 और लिपिड घन चरण14 (नवीनतम एक ट्रांस-झिल्ली प्रोटीन है कि विशेष रूप से लागू किया जा रहा है के रूप में लागू किया जा सकता है बहुत खराब पानी में घुलनशील).

MRC-LMB में क्रिस्टलीकरण सुविधा जल्दी- 2000 में शुरू किया गया था और हमारे स्वचालित प्रोटोकॉल का एक प्रारंभिक सारांश २००५15में प्रस्तुत किया गया था । प्रोटीन क्रिस्टलीकरण के लिए एक ऐतिहासिक परिचय प्रस्तुत किया और भी रोबोट nanoliter दृष्टिकोण के लाभों की एक रूपरेखा (तब नियमित प्रयोग करने के लिए एक उपंयास दृष्टिकोण) था । चूंकि macromolecular क्रिस्टलीकरण मूलतः बहुत कम या कोई उपयोगी पूर्व जानकारी के साथ एक stochastic प्रक्रिया है, (उपयुक्त) प्रारंभिक स्थितियों की एक व्यापक विविधता को रोजगार गुणवत्ता विवर्तन क्रिस्टल की उपज16वृद्धि हुई है । इसके अलावा, एक बड़े प्रारंभिक स्क्रीन के एक अक्सर अनदेखी लाभ के लिए काफी कई मामलों में नमूनों और क्रिस्टल के अनुकूलन के लिए की आवश्यकता को कम है । बेशक, एक अभी भी बाद में कुछ प्रारंभिक स्थितियों के अनुकूलन के साथ आगे बढ़ने की जरूरत हो सकती है । आमतौर पर, पुनर्अभिकर्ताओं की एकाग्रता और पीएच तो व्यवस्थित रूप से जांच की जाती है । अधिक एजेंट भी अनुकूलित हालत (ओं) में आगे क्रिस्टलीकरण के मापदंडों में परिवर्तन करने के लिए पेश किया जा सकता है । निश्चित रूप से, एक एक नमूना हौसले से तैयार है, इसलिए इसी प्रोटोकॉल सीधा और किसी भी समय उपलब्ध होना चाहिए के साथ क्रिस्टलीकरण का प्रयास करना चाहिए ।

यहां, दो पूरी तरह से स्वचालित MRC-LMB (सिस्टम 1 और 2) और इसी प्रोटोकॉल पर डिजाइन सिस्टम पूरी तरह से वर्णित हैं । इन दो प्रणालियों के मुख्य आवेदन बैठे छोड़ क्रिस्टलीकरण प्लेटों में भाप प्रसार द्वारा प्रारंभिक स्क्रीनिंग है । 1 सिस्टम एक तरल हेंडलर, स्टॉक प्लेटों, प्लेट लेबलिंग और एक चिपकने वाला प्लेट मुहर के लिए एक inkjet प्रिंटर के लिए एक स्वचालित हिंडोला एकीकृत करता है । 1 सिस्टम पर, ७२ ९६-अच्छी तरह से प्लेटें व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्क्रीनिंग किट के साथ भर रहे है (८० µ एल परीक्षण ट्यूबों में 10 मिलीलीटर की एक प्रारंभिक मात्रा से जलाशय को हस्तांतरित), लेबल और सील । प्लेटें तो एक 10 डिग्री सेल्सियस मशीन में संग्रहीत कर रहे हैं, जहां वे उपयोगकर्ताओं के लिए किसी भी समय उपलब्ध है (आरंभिक स्क्रीन ' LMB प्लेट्स ' कहा जाता है) ।

2 प्रणाली एक तरल हेंडलर, एक nanoliter मशीन, और एक चिपकने वाला प्लेट मुहर को एकीकृत करता है । प्रणाली 2 पर, भाप प्रसार प्रयोगों के लिए बैठे बूंदों (100-1000 nL) के संयोजन शर्तों और २० ४८ के ऊपरी कुओं में नमूना द्वारा उत्पादित कर रहे हैं-या ९६-अच्छी तरह से पूर्व शर्तों के साथ भरा प्लेटें । यह १,९२० प्रारंभिक स्क्रीनिंग की स्थिति का मतलब है जब प्रणाली 2 पर 20 LMB प्लेटों का उपयोग कर परीक्षण कर रहे हैं ।

रोबोट भी व्यक्तिगत रूप से चयनित शर्तों के अनुकूलन के लिए उपयोग किया जाता है, और इसी अर्द्ध स्वचालित प्रोटोकॉल भी वर्णित हैं । 4-कोने विधि17 नियमित रूप से कार्यरत है अनुकूलन स्क्रीन का उत्पादन । इसी प्रोटोकॉल पहले 4 समाधान (' ए, बी, सी, और डी ') के मैनुअल तैयारी की आवश्यकता है । सांद्रता के दो रैखिक ढाल (दो मुख्य क्रिस्टलीकरण एजेंटों के लिए) तो स्वचालित रूप से एक क्रिस्टलीकरण प्लेट के जलाशयों में सीधे उत्पंन कर रहे हैं । इसके लिए, एक सिरिंज-आधारित तरल हेंडलर विभिंन अनुपात में 4 कोने समाधान तिरस्कृत ।

आगे एक शर्त को अनुकूलित करने के लिए, एक additive स्क्रीन है कि संभावित क्रिस्टल18के परिणामस्वरूप के गुणों को बढ़ाने को रोजगार कर सकते हैं । दो दृष्टिकोण additive स्क्रीनिंग के लिए उपलब्ध हैं: एक प्रोटोकॉल की स्थापना से पहले क्रिस्टलीकरण प्लेटों के जलाशयों में तिरस्कृत additives के साथ शुरू (प्रोटोकॉल 1) और अंय प्रोटोकॉल जहां additive स्क्रीन तिरस्कृत है सीधे बूंदों (प्रोटोकॉल 2) पर ।

MRC-LMB में स्वचालित macromolecular क्रिस्टलीकरण की सुविधा के लिए शुरू किए गए अंय उपयोगी घटनाक्रम भी प्रस्तुत किए गए हैं । अनिवार्य रूप से, क्रिस्टलीकरण प्लेटें और इस तरह के एक stacked सोसायटी के रूप में जुड़े उपकरणों के रूप में (SBS) ढक्कन है कि शर्तों के वाष्पीकरण को कम करता है जब सिस्टम 2 का उपयोग कर ।

लाघव के लिए, यह माना जाता है कि उपयोगकर्ताओं को बुनियादी कार्यों और nanoliter मशीन, inkjet प्रिंटर, और चिपकने वाला प्लेट मुहर के रखरखाव के साथ परिचित हैं । जब तक अंयथा कहा, रोबोटों के डेक पर प्लेटों ऐसे तैनात है कि अच्छी तरह a1 (' a1-कॉर्नर ') वापस एक थाली वाहक के बाएं कोने की ओर है ।

Protocol

1. दो पूरी तरह से स्वचालित प्रणालियों (प्रारंभिक स्क्रीनिंग)

  1. 1 सिस्टम: ७२ ९६ की तैयारी-स्क्रीनिंग किट (LMB प्लेट्स) से भरी अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेट्स
    1. प्रक्रिया करने से पहले, सुनिश्चित करें कि सिस्टम के रोबोटों शुरू कर रहे है और उनके नियंत्रण सॉफ्टवेयर खुला है । ट्यूब की मिर्च पर बारी-शीतलक वाहक के बारे में 30 मिनट पहले मुख्य कार्यक्रम शुरू कर दिया जाएगा ।
    2. प्लेट मुहर के मोटर चालित SBS वाहक पर एक परीक्षण प्लेट रखें । थाली मुहर भागो और जांच है कि फिल्म ठीक से लागू किया जाता है । इस परीक्षण दोहराएं और दो बार सत्यापित करें कि प्लेट मुहर के लिए तैयार है ।
    3. फिर, तरल हैंडलर के मुख्य कंटेनर के लिए पानी की 20 एल जोड़ें । छोटे कंटेनर से युग्मन आवेषण डिस्कनेक्ट (20% इथेनॉल धोने समाधान) और मुख्य कंटेनर के लिए आवेषण कनेक्ट.
    4. inkjet प्रिंटर टचस्क्रीन पर उपयुक्त स्क्रीन नाम (तालिका 1) दर्ज करें । फिर, कैरोसल रोटेशन को ट्रिगर करने के लिए कैरोसल डोर खोलें और बंद करें । दरवाजा खोलो जब पहला ढेर खुद को प्रस्तुत करता है ।
    5. पूरी तरह से 22 क्रिस्टलीकरण प्लेटों के साथ पहली ढेर लोड, कॉलम 1 के साथ प्रत्येक बाहर का सामना करना पड़ । पूरी तरह से अगले दो ढेर उसी तरह लोड ।
    6. चौथे स्टैक के उच्चतम पदों में शेष 6 प्लेटों को लोड करना । फिर, हिंडोला दरवाजा बंद करो ।
    7. पुष्टि करें कि सर्द प्रदर्शन 14 ° c इंगित करता है । धीरे और बार 1 मिनट के लिए चयनित स्क्रीनिंग किट पलटना । उसके बाद, तरल हैंडलर के सामने पैनल खोलें ।
    8. ट्यूबों खोलें और उन्हें ठंडा वाहक में मानक ९६ के अनुसार जगह-अच्छी तरह से लेआउट (A1, A2, आदि). वाहक में प्रत्येक ट्यूब रखने पर, एक ही ९६ में एक ट्रे पर अपने ढक्कन जगह-अच्छी तरह से लेआउट ।
    9. क्रॉस-ट्यूब पदों की जांच करें और सुनिश्चित करें कि सभी ट्यूबों स्तर और वाहक में बसे हैं । उसके बाद, सामने पैनल बंद करें ।
    10. तरल हैंडलर सॉफ्टवेयर की ' स्टार्टअप ' विंडो में, ' रन रखरखाव ' का चयन करें और फ्लशिंग प्रोग्राम खोलें । कार्यक्रम चलाने के लिए प्रणाली से 20% इथेनॉल फ्लश और तरल-वितरण युक्तियों के अंदर की ओर धोने ।
    11. फ्लशिंग पूर्ण होने पर, ' स्टार्टअप ' पर वापस जाने के लिए ' रद्द करें ' क्लिक करे । ' किसी मौजूदा प्रक्रिया को चलाएं ' चुनें और ' अपना चयन प्रारंभ करें ' क्लिक करे । ' MRC किट औषधालय ' कार्यक्रम खोलें. विंयास स्क्रीन में ' उदाहरणों ' के लिए ' 18 ' में भरें और कार्यक्रम चलाते हैं ।
    12. पहले चार प्लेटों के रूप में प्रणाली की निगरानी, लेबल भरा है, और बंद कर दिया ।
    13. एक बार सभी ७२ प्लेट्स तैयार किया गया है और हिंडोला में वापस रखा, छोटे कंटेनर के लिए मुख्य कंटेनर से युग्मन आवेषण स्विच । भागो ' स्टार्ट अप फ्लश ' कार्यक्रम (चरण 1.1.10 देखें) ।
    14. मिर्च बंद कर दें और खाली स्क्रीनिंग किट ट्यूबों छोड़ें । ध्यान से हिंडोला से ७२ तैयार प्लेटों को हटा दें । गलत तरीके से भरे या खराब सील प्लेटें छोड़ें । 10 डिग्री सेल्सियस पर तैयार करने के लिए उपयोग प्लेटों की दुकान ।
  2. प्रणाली 2:20 LMB प्लेटों में एक एकल नमूना से क्रिस्टलीकरण बूंदों (१०० nL प्रोटीन + १०० nL शर्त) की स्थापना
    1. सबसे पहले, सुनिश्चित करें कि सिस्टम रोबोटों पर हैं, nanoliter मशीन अपने सॉफ्टवेयर के साथ शुरू खुला है, और तरल हेंडलर विधि प्रबंधक खुला है । microtube-कूलिंग वाहक को चालू करने के बारे में 15 मिनट पहले मुख्य प्रोग्राम प्रारंभ किया जाएगा ।
    2. प्लेट मुहर के मोटर चालित SBS वाहक पर एक परीक्षण प्लेट रखें । थाली मुहर भागो और सत्यापित करें कि प्लेट ठीक से बंद है । टेस्ट प्लेट मुहर तीन बार ।
    3. फिर, एक परीक्षण प्लेट में परीक्षण समाधान की १००-nL बूंदें सेट करने के लिए nanoliter मशीन चलाते हैं । एक खुर्दबीन कि बूंदों सही ढंग से सेट कर रहे है के तहत जांच करें । nanoliter मशीन सॉफ्टवेयर बंद करो और डेक से पट्टी धारक ब्लॉक हटा दें ।
    4. इसके बाद, कस्टम-डिजाइन प्लेट धारक में डालें ( प्रतिनिधि परिणामदेखें: LMB में विकसित क्रिस्टलीकरण उपकरणों) अपनी स्थितियों (तालिका 1) में अस्थिर रिएजेंट की सबसे अधिक सापेक्ष मात्रा के साथ LMB प्लेट. प्लेट से चिपकने वाली फिल्म निकालें ।
    5. तरल हेंडलर सामने पैनल खोलें और डेक पर सील प्लेट जगह, पहली फिसलने वाहक के पीछे (फिसलने वाहक का उपयोग आसानी के लिए बाहर निकाला जा सकता है) ।
    6. एक एसबीएस एल्यूमीनियम ढक्कन के साथ प्लेट को कवर । ढक्कन के विपरीत कोने के लिए कोमल दबाव लागू करने से वाहक के पीछे बाएं कोने की ओर ढक्कन बसा ।
    7. सील, फिसलने वाहक में लोड, और एक ही रास्ते में शेष 19 प्लेटों को कवर, सबसे अधिक से कम अस्थिर शर्तों से काम कर रहे । एक बार microtube-शीतलक वाहक 4 ° c पर है, के रूप में एक हरे रंग की रोशनी से संकेत, इसके कवर को हटा दें ।
    8. एक microtube के ढक्कन से युक्त कट (कम) ४४० µ एल प्रोटीन का नमूना (तालिका 2) । सुनिश्चित करें कि नमूना meniscus के ऊपर कोई फोम है, के रूप में यह तरल का पता लगाने प्रणाली के साथ हस्तक्षेप करेगा । microtube-कूलिंग वाहक की स्थिति 1 में ट्यूब रखें ।
    9. प्लेट चलती अनुकूलक वाहक के सामने तरल हेंडलर डेक पर एक पीसीआर प्लेट रखें । उसके बाद, सामने पैनल बंद करें ।
    10. डेक लदान के बाद, सुनिश्चित करें कि nanoliter मशीन डेक पट्टी के स्पष्ट है धारक ब्लॉक और है कि वाहक ५०-µ एल टिप के ढेर के पीछे एल्यूमीनियम एसबीएस ढक्कन के स्पष्ट हैं ।
    11. तरल हैंडलर ' विधि प्रबंधन ' इंटरफ़ेस में, ' सेटअप ' प्लेट का चयन करें । दोनों प्रणालियों के आरंभ की निगरानी और भागो पैरामीटर में भरें । विधि प्रबंधन इंटरफ़ेस (संकेतों, आंकड़े और तैयारी के साथ एक टिप-प्रबंधन प्रणाली मदद) के दिशानिर्देशों का पालन करें ।
    12. डबल-जांच करें कि सभी आवश्यक घटक तैयार हैं, और फिर प्रक्रिया प्रारंभ करें ।
    13. प्रणाली की निगरानी के रूप में nanoliter मशीन पहली थाली में बूंदें सेट और प्लेट मुहर बाद में प्लेट जवानों ।
    14. एक बार सभी 20 प्लेटों क्रिस्टलीय बूंदों के साथ तैयार किया गया है और स्वचालित रूप से फिसलने वाहक को लौट, सामने पैनल खुला और धीरे प्लेटों को हटा दें । जांच करें कि प्लेटें सही ढंग से उंहें क्रिस्टलीकरण के लिए भंडारण से पहले सील कर रहे हैं ।
    15. भंडारण के लिए तरल हेंडलर के बाएं हाथ की ओर उंहें स्टैक करने से पहले एक 20% इथेनॉल समाधान के साथ SBS पलकों साफ । पीसीआर प्लेट और microtube को त्यागें ।
    16. microtube-शीतलक वाहक बंद करें और दूर संघनित्र पोंछ । कूलर की सतह के शीर्ष पर एक कागज तौलिया छोड़ आगे संघनित्र अवशोषित । फिर, वाहक आवरण को प्रतिस्थापित करें और सामने पैनल को बंद करें ।

2. शर्तों का अनुकूलन

  1. सिरिंज आधारित तरल हैंडलर: एक सघन प्लेट के जलाशयों में सांद्रता के दो रैखिक ढाल का निर्माण (4-कोने विधि).
    1. पहले, सुनिश्चित करें कि तरल हैंडलर चालू है और उसके सॉफ़्टवेयर के साथ प्रारंभ खुला है ।
    2. ' ढाल ' टैब पर: आवश्यक प्रोग्राम खोलें, क्रिस्टलीकरण प्लेट प्रकार और जलाशयों में अंतिम मात्रा (तालिका 3) का चयन करें । [isopropanol] > 10% v/v और [MPD] > 20% v/शामिल समाधान का उपयोग करते समय अधिकतम शॉट खंड ' के लिए उंनत सेटिंग को ६,००० से ३,००० तक कम किया जाना चाहिए ।
    3. सीरिंज तैयार कर लें । प्रत्येक सिरिंज में एक पिस्टन प्लेस (कहा जाता है नीचे) और रोबोट सिर के नीचे नामित खांचे में सिरिंजों के पीछे डालें. स्थिति में इसे बंद करने के लिए एक सिरिंज दक्षिणावर्त ट्विस्ट (कार्यक्रम सही ढंग से संलग्न सभी आवश्यक सीरिंज के साथ ही शुरू कर देंगे).
    4. गर्त को तैयार करते हैं । स्टेनलेस स्टील फ्रेम निकालें और गर्त डालें । वाम पर 4 पदों के लिए 4 कोनों A, B, C, D. Switch ' सेट अप ' टैब जो प्रत्येक सिरिंज में आवश्यक समाधानों की मात्रा प्रदर्शित करता है ( तालिका 3पर, ०.५ एमएल मृत मात्रा प्रदर्शित संस्करणों में जोड़ा गया है) । उनके संबंधित गर्त में कोने समाधान डालो और फ्रेम डेक पर वापस जगह (फ्रेम 2 छोटे डेक के सामने स्थित मैग्नेट के साथ स्थिति में रखती है) । इस कदम के साथ आगे बढ़ने के लिए एक वैकल्पिक तरीका है गर्त में समाधान डाल जब वे पहले से ही डेक पर रखा जाता है ।
    5. मोटर चालित SBS वाहक पर क्रिस्टलीकरण प्लेट रखें ।
    6. ' महाप्राण ' पर क्लिक करें और इस कदम के लिए इंतजार पूरा हो (जब पिस्टन अपने रास्ते पर बंद कर दिया) ।
    7. ' run ' टैब पर स्विच करें और प्रोग्राम चलाएं ।
    8. कार्यक्रम के पूरा होने पर, सेट अप टैब पर वापस जाएँ और ' निकालें ' पर क्लिक करें: सिस्टम बचे हुए समाधानों से सीरिंज को मिटा देता है, और फिर पिस्टन को सभी तरह से ऊपर उठाता है । ' पर्ज करें ' के बजाय ' निकालें ' का अनुरोध किया जा सकता है; इससे पिस्ते को नीचे की पोजिशन पर छोड़ देंगे, उसी सीरिंज के साथ ज्यादा सॉल्यूशन महाप्राण के लिए तैयार हैं.
    9. सीरिंज को anticlockwise घुमाकर निकाल लें ।
    10. उचित बिन में सिरिंज और गर्त त्यागें (या उन्हें पानी के साथ कुल्ला और फिर 20% v/वी इथेनॉल समाधान पुन: उपयोग के लिए) ।
    11. प्लेट सील और यह १,००० rpm, या 10 मिनट में 3 मिनट के लिए microplate मिक्सर पर जगह जब अत्यधिक चिपचिपा समाधान मिलाया जा रहा है । प्लेट nanoliter मशीन पर क्रिस्टलीकरण बूंदों की स्थापना के लिए तैयार है ।
  2. additive स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल 1 (एक ९६-अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेट additive स्क्रीन के साथ पूर्व भर में क्रिस्टलीकरण बूंदों की स्थापना)
    1. सबसे पहले, एजेंट के प्रारंभिक सांद्रता के साथ हालत तैयार 10% (min. vol. 15 मिलीलीटर जब तरल हेंडलर के साथ additive स्क्रीन पर एक कंटेनर से हालत स्थानांतरित) की वृद्धि हुई ।
    2. सुनिश्चित करें कि तरल हैंडलर संचालित करने के लिए तैयार है । एक ही थाली के लिए ' additives के लिए स्क्रीन जोड़ें ' कार्यक्रम खोलें (जलाशयों में मात्रा दर्ज करें: ' ७२ µ l ') । संकेत, आंकड़े और एक टिप प्रबंधन प्रणाली (12 x १,००० µ l आवश्यक सुझाव) रोबोट के चयन के अनुसार संचालित करने के लिए तैयार है सुनिश्चित करने के साथ मदद ।
    3. -20 डिग्री सेल्सियस मशीन से additive स्क्रीन पुनः प्राप्त करने और उसके एल्यूमीनियम सील तुरंत हटाने (प्लेट धारक का उपयोग करें), तो तरल हेंडलर के डेक पर थाली जगह है । कार्यक्रम एक चित्र लेआउट के अनुसार चल रही है (थाली के सामने-वाहक के बाएं में स्थित A1-कोने के साथ रखा गया है) । इसके अलावा शर्त से भरे कंटेनर भी प्लेस । प्रोग्राम चलाएं ।
    4. एक बार थाली के जलाशयों भर गया है, यह microplate शेखर पर जगह और कार्यक्रम चलाते हैं । कुल्ला पानी और पुनः प्रयोग के लिए 20% इथेनॉल के साथ हालत के कंटेनर ।
    5. nanoliter मशीन पर बूंदों को सेट करें। सबसे पहले, क्रिस्टलीकरण प्लेट सील (प्लेट धारक का उपयोग करें) । फिर, प्लेट और 8 अच्छी तरह से प्रोटीन पट्टी की पहली स्थिति में पट्टी धारक ब्लॉक जगह है । नियंत्रण सॉफ्टवेयर पर ' सेटअप ' टैब डेक पर प्रत्येक घटक के वास्तविक पदों को प्रदर्शित करताहै । आवश्यक ड्रॉप आकार के अनुसार प्रोटीन के नमूने के साथ पट्टी के प्रत्येक अच्छी तरह से लोड (तालिका 4) । बूंदें तैयार करने के लिए प्रोग्राम चलाएं.
    6. कार्यक्रम के पूरा होने पर, डेक से प्लेट हटाने और इसे तुरंत सील (प्लेट मुहर, 3 इंच चौड़ा चिपकने वाला टेप का उपयोग करें) । उपयुक्त बिन में पट्टी छोड़ें ।
    7. भंडारण से पहले माइक्रोस्कोप के तहत बूंदों के आकार, आकार, और केंद्र का आकलन करें ।
  3. Additive स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल 2 (एक ९६-अच्छी तरह से एक पुनः प्रयोज्य additive स्क्रीन के साथ क्रिस्टलीकरण प्लेट में क्रिस्टलीकरण बूंदों की स्थापना)
    1. सबसे पहले, additive स्क्रीन तैयार: ४० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इसी जमे हुए ९६-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट गल छोड़ दें । फिर, 2 मिनट के लिए १,००० x g पर additive स्क्रीन केंद्रापसारक ।
    2. हालत (ंयूनतम vol. 15 मिलीलीटर तैयार जब तरल हेंडलर के साथ additive स्क्रीन पर एक कंटेनर से हालत स्थानांतरित) ।
    3. हालत के साथ एक ९६-अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेट के जलाशयों भरें । तरल हेंडलर पर, प्रोटोकॉल 1, चरण -8 के रूप में उसी तरह आगे बढ़ना है, लेकिन जलाशयों में मात्रा के लिए ' ८० µ एल ' दर्ज करें ।
    4. डेक पर 3 घटकों के साथ nanoliter मशीन पर बूंदें सेट (additive स्क्रीन युक्त प्लेट, क्रिस्टलीकरण प्लेट और पट्टी के पहले स्थान में 8 अच्छी तरह से प्रोटीन पट्टी के साथ-धारक ब्लॉक, तालिका 4) ।
    5. सेल संस्कृति एक एल्यूमीनियम शीट के साथ स्क्रीन युक्त प्लेट सील और यह जगह वापस-20 डिग्री सेल्सियस मशीन में ।
    6. भंडारण से पहले माइक्रोस्कोप के तहत बूंदों के आकार, आकार, और केंद्र का आकलन करें ।

Representative Results

1. सिस्टम 1 और LMB प्लेट्स

चित्र 1a एक लिक्विड-सिस्टम (deionised water) के साथ ऑपरेटिंग एक लिक्विड हैंडलर के आधार पर सिस्टम 1 दिखाता है । तरल प्रणाली एक कंटेनर, एक पंप, टयूबिंग, 8 वाल्व और 8 तय सुझावों से सुसज्जित सीरिंज शामिल हैं । तरल वर्ग सेटिंग्स महाप्राण करने के लिए अनुकूलित/4 प्लेटों में समाधान और बहु-वितरण की एक व्यापक विविधता वितरण (बहु वितरण aspirated मात्रा के एक अपेक्षाकृत बड़े अतिरिक्त की आवश्यकता है) । एक 22 एल पानी कंटेनर और एक छोटे कंटेनर (5 एल) के साथ 20% v/इथेनॉल प्रणाली के नीचे जमा करने के लिए तरल प्रणाली फ़ीड कर रहे हैं । प्रत्येक कंटेनर दो युग्मन आवेषण के साथ सुसज्जित है । एक डालने (नीले रंग) तरल के साथ प्रणाली फ़ीड, एक दूसरे (लाल) एक प्रवाह वापस अतिरिक्त दबाव को कम करने के लिए है । उपयोग के बाद, पानी के साथ निस्तब्धता और फिर 20% v/v इथेनॉल समाधान माइक्रोबियल विकास रोकता है । एक ठंडा इकाई (भी प्रणाली के नीचे स्थित) एक कस्टम निर्मित ट्यूब शीतलन वाहक से जुड़ा है । 1 सिस्टम २०५० मिमी चौड़ा है, जिसमें कैरोसल, ७६० mm डीप और ८८ mm उच्च है । एक अतिरिक्त ५५० mm worktable कि inkjet प्रिंटर और चिपकने वाला प्लेट मुहर के नियंत्रण इकाई रखती है के लिए सामने की आवश्यकता है । अतिरिक्त स्थान भी नियंत्रण पीसी के लिए प्रणाली के बगल में की जरूरत है । ७२ पूर्व प्लेटों का उत्पादन करने के लिए कार्यक्रम (यानी 4 प्लेटों के 18 राउंड) 3 एच और ५० मिनट लगते हैं ।

चित्रा 1b एक बंद मुख्य डेक है कि 8 तय सुझावों (चित्रा 1C) एक स्वचालित pipetting बांह पर घुड़सवार के साथ सुसज्जित है के ऊपर है, एक मनोरंजक के साथ एक दूसरे हाथ, एक टिप वॉश स्टेशन, 2 एक्स 4-SBS प्लेटों के लिए स्थिति वाहक और ट्यूब कूलिंग वाहक । मुख्य कार्यक्रम एक समय है कि बाहर स्वचालित रूप से हिंडोला से लिया जाता है और डेक जहां वे क्रिस्टलीकरण शर्तों (जलाशयों में ८० µ एल, चित्र 1 डी) से भर रहे है पर रखा पर 4 प्लेट प्रक्रियाओं । युक्तियां प्रवाहकीय हैं के रूप में तरल स्तर स्वचालित रूप से पाए जाते हैं । जबकि तरल हेंडलर प्लेटों का एक सेट में शर्तों तिरस्कृत, खाली प्लेटों का एक और सेट बाहर हिंडोला से लिया जाता है, लेबल और मुख्य डेक पर रखा । एक छोटे से कस्टम निर्मित धारक और तरल हेंडलर के रियर पैनल में खिड़की के लिए मुख्य डेक के पीछे प्रिंटर सिर और उसके संवेदक की स्थिति की आवश्यकता थी । 8 युक्तियां फ्लश और प्रत्येक वितरण कदम है कि जलाशयों के इसी कॉलम में 4 aliquots के होते है के बाद मुख्य कंटेनर से पानी से धोया जाता है । के बाद 4 प्लेटें भर गया है, वे स्वचालित रूप से सील कर रहे है और हिंडोला में अपनी मूल स्थिति में वापस रखा । प्लेट मुहर एक विशिष्ट चालक द्वारा ट्रिगर किया जाता है (नियंत्रण सॉफ्टवेयर द्वारा कहा जाता है). मुहर 3 के एक रोल इंच चौड़ा चिपकने वाला टेप है जो यांत्रिक दबाव के तहत रोलर्स के साथ एक थाली के लिए लागू किया जाता है का उपयोग करता है । कार्यक्रम के पूरा होने पर, पहले से भरी हुई प्लेटें कैरोसल स्टैक से मैन्युअल रूप से निकाल दी जाती हैं और सुविधा के भीतर स्थित 10 डिग्री सेल्सियस में संग्रहित होती हैं ।

Figure 1
चित्र 1 : जलाशयों को प्रारंभिक स्क्रीनिंग किट के साथ भरना । (A) पूरी तरह से स्वचालित सिस्टम 1 का ओवरव्यू । हिंडोला प्लेट ढेर के साथ एक अलग स्वचालित इकाई है और यह एक अच्छी तरह से सही हाथ की ओर मुख्य डेक पर स्पष्ट एक्रिलिक शीट्स के बने में स्थित है । (ख) के साथ आपरेशन में तरल हेंडलर के मुख्य डेक (एक) ट्यूब शीतलक वाहक (नीचे एक द्रुतशीतन इकाई से जुड़ा है, नहीं दिखाया गया है), (ख) फास्ट वॉश स्टेशन (जल निकासी के लिए जुड़ा हुआ है, नहीं दिखाया गया है), (ग) pipetting बांह एक ९६-अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेट के 8 जलाशयों भरना, (घ) पर एक भरी हुई प्लेट लाने के मनोरंजक हाथ (ई) प्लेट मुहर के मोटर चालित एसबीएस वाहक । डेक के पीछे में (च) inkjet प्रिंटर के मुद्रण सिर (जी) मुहर के नीचे inkjet नियंत्रण इकाई से जुड़ा है । (ग) एक लेबल प्लेट (स्क्रीन और उत्पादन की तारीख का नाम) Polytetrafluoroethylene लेपित स्टेनलेस स्टील के बने 8 प्रवाहकीय तय सुझावों द्वारा क्रिस्टलीकरण शर्तों से भरा जा रहा है । (घ) एक मुहरबंद क्रिस्टलीकरण की धारा को अच्छी तरह से पार करना । जलाशय क्रिस्टलीकरण हालत के ८० µ एल शामिल है (जबकि ऊपरी अच्छी तरह से खाली है) । जलाशय और उच्च अच्छी तरह से गहराई निर्दिष्टीकरण मिलीमीटर में कर रहे हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तालिका 1 परीक्षण ट्यूबों में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्क्रीनिंग किट के लिए विभिंन योगों को दिखाता है । किट 1 प्रणाली के साथ एक नियमित आधार पर ९६-अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेटों (LMB01-LMB22) के जलाशयों को भरने के लिए उपयोग किया जाता है ।

प्लेट का नाम किट का नाम आपूर्तिकर्ता कैटलॉग संख्या ट्यूब मूल वर्णन
LMB01 क्रिस्टल स्क्रीन 1 Hampton अनुसंधान HR2-110 ४८ विरल मैट्रिक्स (पीएच 4.6-8.5)
क्रिस्टल स्क्रीन 2 Hampton अनुसंधान HR2-112 ४८ Stochastic नमूना (पीएच 4.6-9.0)
LMB02 विज़ार्ड 1 Rigaku १००९५३० ४८ Stochastic नमूना (पीएच 4.5-10.5)
विज़ार्ड 2 Rigaku १००९५३१ ४८ Stochastic नमूना (पीएच 4.5-10.5)
LMB03 ग्रिड स्क्रीन अमोनियम सल्फेट Hampton अनुसंधान HR2-211 24 ग्रिड स्क्रीन, [एंस] = 0.8-3.2 M और बफ़र्स पीएच 4.0-9.0
ग्रिड स्क्रीन खूंटी/LiCl Hampton अनुसंधान HR2-217 24 ग्रिड स्क्रीन, [खूंटी ६०००] = 0-30% w/v, LiCl = १.० मीटर और बफ़र्स पीएच 4.0-9.0
त्वरित स्क्रीन Hampton अनुसंधान HR2-221 24 ग्रिड स्क्रीन, [NaKPO4] = 0.8-1.8 एम पीएच 5.0-8.2 पर
ग्रिड स्क्रीन सोडियम क्लोराइड Hampton अनुसंधान HR2-219 24 ग्रिड स्क्रीन, [NaCl] = 1.0-4.0 M और बफ़र्स पीएच 4.0-9.0
LMB04 ग्रिड स्क्रीन खूंटी ६००० Hampton अनुसंधान HR2-213 24 ग्रिड स्क्रीन, [खूंटी ६०००] = 5-30% w/v और बफ़र्स पीएच 4.0-9.0
ग्रिड स्क्रीन MPD Hampton अनुसंधान HR2-215 24 ग्रिड स्क्रीन [MPD] = 10-65% w/v और बफ़र्स पीएच 4.0-9.0
MemFac Hampton अनुसंधान HR2-114 ४८ झिल्ली प्रोटीन के लिए विरल मैट्रिक्स (पीएच 4.6-8.5)
LMB05 खूंटी-आयन Hampton अनुसंधान HR2-126 ४८ ग्रिड स्क्रीन, [खूंटी ३३५०] = 20% डब्ल्यू/वी और विभिन्न लवण ०.२ मीटर (कोई बफ़र्स)
Natrix Hampton अनुसंधान HR2-116 ४८ अपूर्ण कारक (pH 5.6-8.5)
LMB06 क्रिस्टल स्क्रीन लाइट Hampton अनुसंधान HR2-128 ४८ क्रिस्टल स्क्रीन 1 मूल precipitant सांद्रता के एक आधे के साथ
कस्टम लाइट स्क्रीन आण्विक आयाम n/a ४८ कम precipitant सांद्रता के साथ अतिरिक्त शर्तें
LMB07 जादूगर क्रायो 1 Rigaku १००९५३६ ४८ कम मेगावाट खूंटे का उपयोग cryoprotected शर्तों के साथ Stochastic नमूना (पीएच 4.5-9.4)
जादूगर क्रायो 2 Rigaku १००९५३७ ४८ Stochastic नमूना के साथ शर्तों cryoprotected का उपयोग कम मेगावाट खूंटे (पीएच 4.5-10.1)
LMB08 JBS1 JenaBioScience सीएस-101L 24 अपूर्ण विभिन्न खूंटे पर आधारित कारक (पीएच 4.6-9.0)
JBS2 JenaBioScience सीएस-102L 24 अधूरा कारक खूंटी पर आधारित ४००० (पीएच 4.6-8.5)
JBS3 JenaBioScience सीएस-103L 24 अधूरा कारक खूंटी पर आधारित ४००० (पीएच 4.6-8.5)
JBS4 JenaBioScience सीएस-104L 24 अपूर्ण मध्यम मेगावाट खूंटे पर आधारित कारक (पीएच 6.5-8.5)
LMB09 JBS5 JenaBioScience सीएस-105L 24 अपूर्ण भारी मेगावाट खूंटे पर आधारित कारक (pH 6.5-9.5)
JBS6 JenaBioScience सीएस-106L 24 अपूर्ण कारक एंस पर आधारित (पीएच 4.6-8.5)
JBS7 JenaBioScience सीएस-107L 24 अपूर्ण MPD पर आधारित कारक (पीएच 4.6-8.5)
JBS8 JenaBioScience सीएस-108L 24 अपूर्ण MPD और इथेनॉल पर आधारित कारक (पीएच 4.6-8.5)
LMB10 JBS9 JenaBioScience सीएस-109L 24 अपूर्ण आम लवण और 2-propanol (पीएच 4.6-8.5) के आधार पर कारक
JBS10 JenaBioScience सीएस-110L 24 अपूर्ण आम लवण पर आधारित कारक (पीएच 4.6-8.5)
स्पष्ट रणनीति स्क्रीन 1 पीएच ४.५ आण्विक आयाम MD1-16LMB 24 विभिन्न खूंटे के साथ ग्रिड स्क्रीन
स्पष्ट रणनीति स्क्रीन 1 पीएच ५.५ आण्विक आयाम MD1-16LMB 24 विभिन्न खूंटे के साथ ग्रिड स्क्रीन
LMB11 स्पष्ट रणनीति स्क्रीन 1 पीएच ६.५ आण्विक आयाम MD1-16LMB 24 विभिन्न खूंटे के साथ ग्रिड स्क्रीन
स्पष्ट रणनीति स्क्रीन 1 पीएच ७.५ आण्विक आयाम MD1-16LMB 24 विभिन्न खूंटे के साथ ग्रिड स्क्रीन
स्पष्ट रणनीति स्क्रीन 1 पीएच ८.५ आण्विक आयाम MD1-16LMB 24 विभिन्न खूंटे के साथ ग्रिड स्क्रीन
स्पष्ट रणनीति स्क्रीन 2 पीएच ४.५ आण्विक आयाम MD1-16LMB 24 विभिन्न खूंटे के साथ ग्रिड स्क्रीन
LMB12 स्पष्ट रणनीति स्क्रीन 2 पीएच ५.५ आण्विक आयाम MD1-16LMB 24 विभिन्न खूंटे के साथ ग्रिड स्क्रीन
स्पष्ट रणनीति स्क्रीन 2 पीएच ६.५ आण्विक आयाम MD1-16LMB 24 विभिन्न खूंटे के साथ ग्रिड स्क्रीन
स्पष्ट रणनीति स्क्रीन 2 पीएच ७.५ आण्विक आयाम MD1-16LMB 24 विभिन्न खूंटे के साथ ग्रिड स्क्रीन
स्पष्ट रणनीति स्क्रीन 2 पीएच ८.५ आण्विक आयाम MD1-16LMB 24 विभिन्न खूंटे के साथ ग्रिड स्क्रीन
LMB13 सूचकांक Hampton अनुसंधान HR2-144 ९६ छोटे विरल मैट्रिक्स और ग्रिड स्क्रीन (पीएच 3.0-9.0)
LMB14 SaltRX १ Hampton अनुसंधान HR2-107 ४८ नमक एकाग्रता और पीएच बनाम 22 अद्वितीय लवण सहित ग्रिड स्क्रीन (4.1-9.0)
SaltRX २ Hampton अनुसंधान HR2-109 ४८ नमक एकाग्रता और पीएच बनाम 22 अद्वितीय लवण सहित ग्रिड स्क्रीन (4.1-9.0)
LMB15 MemStart आण्विक आयाम MD1-21 ४८ झिल्ली प्रोटीन के लिए विरल मैट्रिक्स (पीएच 4.0-10.0)
MemSys आण्विक आयाम MD1-25 ४८ झिल्ली प्रोटीन के लिए ग्रिड स्क्रीन (ज्यादातर खूंटे, पीएच 3.5-9.5)
LMB16 JCSG + Qiagen १३०७२० ९६ विरल मैट्रिक्स (पीएच 4.0-10.0)
LMB17 MORPHEUS स्क्रीन आण्विक आयाम MD1-46 ९६ additives और cryoprotected शर्तों के घोला जा सकता है सहित ग्रिड स्क्रीन (पीएच 6.5-8.5)
LMB18 Pi न्यूनतम स्क्रीन JenaBioScience सीएस-१२७ ९६ अपूर्ण कारक (पीएच 4.0-9.5)
LMB19 पीआई-खूंटी स्क्रीन JenaBioScience सीएस-१२८ ९६ झिल्ली प्रोटीन के लिए अपूर्ण कारक (पीएच 4.8-8.8)
LMB20 MORPHEUS द्वितीय स्क्रीन आण्विक आयाम MD1-91 ९६ additives (भारी परमाणु) और cryoprotected शर्तों (पीएच 6.5-8.5) के घोला जा सकता है सहित ग्रिड स्क्रीन
LMB21 LMB क्रिस्टलीकरण स्क्रीन आण्विक आयाम MD1-98 ९६ LMB प्रकाशनों से चयनित शर्तों सहित विरल मैट्रिक्स
LMB22 MORPHEUS III स्क्रीन आण्विक आयाम n/a ९६ additives (दवा यौगिकों) और cryoprotected शर्तों (पीएच 6.5-8.5) के घोला जा सकता है सहित ग्रिड स्क्रीन

तालिका 1: LMB प्लेटों में पाया किट के योगों। प्रत्येक वाणिज्यिक जांच किट 24/48/96 शर्तों के होते है शुरू में परीक्षण ट्यूबों । LMB प्लेटें 10 डिग्री सेल्सियस की सुविधा है जहां वे किसी भी समय उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध है के भीतर स्थित मशीन में रखता है ।

2. बूंदों की स्थापना के लिए सिस्टम 2 और आवश्यकताएं

चित्र 2a सकारात्मक विस्थापन और प्रयोज्य सुझावों के साथ एक तरल हैंडलर19 ऑपरेटिंग के आधार पर सिस्टम 2 से पता चलता है । डिस्पोजेबल सुझावों स्वचालित हैंडलिंग के लिए उपयुक्त स्टैक करने योग्य रैक में आपूर्ति कर रहे हैं । एक 3-स्थिति डेक nanoliter मशीन20 प्रणाली के दाहिने हाथ की ओर एकीकृत किया गया था । महाप्राण/nanoliter मशीन पर वितरण भी सकारात्मक प्रयोज्य microsyringes का उपयोग विस्थापन के साथ संचालित (बड़े स्पूल में आपूर्ति की) । एक स्टैंड-अलोन रोबोट के रूप में, एक हटाने योग्य पट्टी-धारक ब्लॉक प्रोटीन नमूना (ओं) लोड करने के लिए प्रयोग किया जाता है । पूरी तरह से स्वचालित प्रक्रिया के लिए, एक ३८४-खैर पीसीआर प्लेट पट्टी धारक की जगह । 1 प्रणाली के लिए एक समान चिपकने वाला प्लेट मुहर बाएं हाथ की ओर एकीकृत किया गया था । मुहर और nanoliter मशीन कस्टम पर खड़े-निर्मित, मुख्य मनोरंजक के लिए आदेश में worktables उठाया इन दो एकीकृत रोबोटों के प्लेट वाहक तक पहुंचने के लिए (एक खिड़की के लिए तरल हेंडलर के दोनों पक्ष पैनलों में मनोरंजक के लिए बाहर का उपयोग हासिल करने के लिए किया जाना था मुख्य डेक) । मुख्य कार्यक्रम विशिष्ट ड्राइवरों nanoliter वितरण कार्यक्रमों और नियत समय में मुहर को ट्रिगर करने के लिए कॉल करता है । सिस्टम 2 २,८५० मिमी चौड़ा, ८०० मिमी गहरा और ८०० मिमी उच्च है । अतिरिक्त अंतरिक्ष नियंत्रण पीसी के प्रदर्शन के लिए रोबोट के बगल में की जरूरत है । दो अपशिष्ट डिब्बे युक्तियां और प्रक्रिया के दौरान खारिज कर दिया microsyringes के लिए प्रणाली के नीचे स्थित है (नियंत्रण पीसी भी नीचे संग्रहित है) । प्रणाली 2 की एक महत्वपूर्ण विशेषता समग्र लेआउट है, जो तीन रोबोटों के लिए आसान पहुंच बनाए रखता है ताकि वे व्यक्तिगत रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है अनुकूलन प्रोटोकॉल पहले वर्णित है, या अंय ऐसे क्रिस्टलीकरण के रूप में कहीं वर्णित प्रोटोकॉल झिल्ली प्रोटीन की लिपिड mesophases21 और यादृच्छिक microseed मैट्रिक्स स्क्रीनिंग22में ।

चित्रा बी एक बंद डेक है कि एक रोबोट हाथ से सुसज्जित है के ऊपर है । एआरएम 12 स्वतंत्र pipetting जांच और मुख्य मनोरंजक एकीकृत करता है । जांच की स्थिति व्यक्तिगत रूप से एक दिशा में नियंत्रित किया जा सकता है ताकि जांच या भी एकल ट्यूबों के बीच धुरी के साथ विभिंन स्थानों का उपयोग करने के लिए । जांच या तो प्रयोज्य युक्तियां (1-12) या थाली की एक जोड़ी-जा एडेप्टर ले सकते हैं । 4 टैक् स के दो सेट जिनमें ५० µ l डिस्पोजेबल टिप् स शुरू में भरी हुई हैं । युक्तियां प्रवाहकीय हैं के रूप में तरल स्तर स्वचालित रूप से पाए जाते हैं । प्लेट चलती एडाप्टर के अंदर पर 2 तेज पिन के साथ तैयार कर रहे हैं कि जब जरूरत एक वैकल्पिक मनोरंजक फार्म. मुख्य डेक पर एक नमूना के लिए 24-स्थिति microtube शीतलक वाहक स्थित है, हालांकि केवल 1-2 पदों यहां उपयोग किया जाता है । इसके अलावा, वहां पीसीआर प्लेट के लिए एक वाहक है और भी 2 भंडारण वाहक स्टैक करने के लिए, कस्टम-निर्मित एसबीएस ढक्कन (चित्रा 2c) । अंत में, वहां 4 फिसलने वाहक हैं, क्रिस्टलीकरण प्लेटों के लिए 5 स्थानों के साथ प्रत्येक (4 x 5 = 20 प्लेटें) ।

Figure 2
चित्र 2 : वाष्प प्रसार प्रयोगों के लिए बूंदों की स्थापना । (A) पूर्णत: स्वचालित सिस्टम 2 का ओवरव्यू. (ख) के साथ आपरेशन में तरल हेंडलर के मुख्य डेक (एक) SBS ढक्कन के ढेर के लिए भंडारण वाहक, (ख) stacked युक्तियां, (ग) microtube में एक नमूना के साथ शीतलक वाहक, (घ) 2 प्लेट के लिए वाहक-चलती एडेप्टर्स, (e) प्रोटीन को nanoliter हैंडलिंग रोबोट में स्थानांतरित करने के लिए पीसीआर प्लेट, (f) 9 सीलबंद प्लेटें जिन्हें उनके आरंभिक पदों में वापस रखा गया है, (g) 10th के एसबीएस लिड को हटाकर वैकल्पिक मनोरंजक प्लेट के बारे में तरल हेंडलर के डेक पर ले जाया जाएगा, (h) शीर्ष पर SBS पलकों के साथ तैयार की जाने वाली अगली 10 प्लेट्स, (i) मुख्य मनोरंजक जो पीसीआर और क्रिस्टलीकरण प्लेटों के परिवहन के लिए उपयोग किया जाता है, (j) मुख्य स्वचालित 12 pipetting जांच (2 वैकल्पिक मनोरंजक के रूप में संचालित करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है) और मुख्य मनोरंजक, और (k) nanoliter मशीन के डेक को एकीकृत एआरएम । (ग) में घर कस्टम SBS एल्यूमीनियम का बना ढक्कन । ढक्कन शर्तों और दो छोटे छेद के वाष्पीकरण से बचने के लिए एक रबर शीट को एकीकृत सही वैकल्पिक मनोरंजक द्वारा उठाया जा करने के लिए । (घ) एक सील क्रिस्टलीकरण की धारा पार अच्छी तरह से जहां जलाशय एक शर्त से भर जाता है और ऊपरी-अच्छी तरह से एक छोटी बूंद दोनों प्रोटीन नमूने और हालत से बना होता है । क्योंकि छोटी बूंद में precipitant कम हालत में से ध्यान केंद्रित है, भाप प्रसार द्वारा equilibration की प्रक्रिया के दौरान पानी के नुकसान के माध्यम से छोड़ वृद्धि में सभी घटकों की सांद्रता (बहुत योजनाबद्ध एक तीर से प्रतिनिधित्व) । (E) १०० nL की हल्की माइक्रोग्राफ और (F) २०० nL बूंदों का परीक्षण समाधान के साथ nanoliter मशीन द्वारा उत्पादित (20% v/v पॉलीथीन ग्लाइकोल ४००, ०.००१% w/वी Safranin रेड डाई के रूप में) । बूंदों का आकार और आकार शर्त के chemicophysical गुणों के अनुसार भिन्न हो सकते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

मुख्य कार्यक्रम वैकल्पिक मनोरंजक पहले क्रिस्टलीकरण प्लेट से एसबीएस ढक्कन हटाने के साथ शुरू होता है । ढक्कन इसी भंडारण वाहक को हस्तांतरित किया गया था के बाद, क्रिस्टलीकरण प्लेट nanoliter मशीन के डेक करने के लिए ले जाया जाता है. फिर pipetting एआरएम पीसीआर प्लेट के पहले कॉलम के लिए सामान्य रूप से ठंडा microtube से बूंदों की स्थापना के लिए आवश्यक नमूना की राशि स्थानान्तरण । इसके बाद मुख्य मनोरंजक पीसीआर प्लेट को nanoliter मशीन के डेक पर ले जाता है जो प्रारंभ में उपयोगकर्ता द्वारा चुने गए विकल्पों के बाद की बूंदों को तैयार करेगी (उदाहरणछोटी बूंद आकार) । इसके लिए, प्रोटीन का नमूना पहले ऊपरी-कुओं में तिरस्कृत किया जाता है (8 microsyringes और बहु औषधालय का एक सेट का उपयोग कर), तो क्रिस्टलीकरण शर्तों प्रोटीन बूंदों पर तिरस्कृत कर रहे हैं (प्रत्येक पंक्ति अब से बचने के लिए 8 नए microsyringes की आवश्यकता है पार संदूषण) । बूंदों की स्थापना के लिए कार्यक्रम के पूरा होने पर, मुख्य मनोरंजक थाली मुहर के लिए इसी थाली परिवहन, तो पीसीआर प्लेट अपनी मूल स्थिति में वापस स्थानों (अधिक प्रोटीन निंनलिखित प्लेट के लिए पीसीआर प्लेट के अगले कॉलम में तिरस्कृत किया जाएगा ). अंत में, सील क्रिस्टलीकरण प्लेट डेक पर अपनी मूल स्थिति में वापस ले जाया जाता है: वाष्प प्रसार प्रयोगों पहले से ही इस थाली (चित्रा 2d) में शुरू कर दिया है । यह चक्र प्लेटों की संख्या के अनुसार दोहराया जाता है । जब जरूरत है, वैकल्पिक मनोरंजक एक खाली टिप pipetting हाथ और अधिक युक्तियों का उपयोग करने की अनुमति रैक निकालता है । इस कार्यक्रम में 2 hr और 20 min और ४४० µ l को 20 प्लेट्स में सिंगल बूंदें तैयार करने के लिए १०० nL sample + १०० nL कंडीशन (figure 2E and 2F) का उपयोग करते हुए लेता है ।

जब nanoliter मशीन का उपयोग कर के रूप में अकेले खड़े दो अतिरिक्त प्लेटों के लिए रोबोट (देखें प्रोटोकॉल, चरण 1.2.3), प्रारंभिक स्क्रीनिंग प्लेटों के पूरे सेट में उपलब्ध 10 डिग्री सेल्सियस मशीन सेट किया जा सकता (22 LMB प्लेट्स x ९६ शर्तें = २,११२ शर्तें).

तालिका 2 सिस्टम 2 पर उपयोगकर्ता चयनों के अनुसार मुख्य प्रोग्राम की आवश्यकताएं दिखाता है ।

प्लेट ड्रॉप आकार (nL) नमूना (s) टिप आवश्यकताएं अवधि
संख्या प्रकार Vol .1 (µ l) Vol .2 (µ l) ५० µ l सुझाव Microsyringes
10 ९६-अच्छी तरह से १०० २४० 0 ८० १०४० 1 ज 12 मिनट
20 ९६-अच्छी तरह से १०० ४४० 0 १६० २०८० 2 ज 20 मिनट
10 ९६-अच्छी तरह से १०० २४० २४० १६० २०८० 1 ज ४५ मिनट
20 ९६-अच्छी तरह से १०० ४४० ४४० ३२० ४१६० 3 ज 05 मिनट
10 ४८-अच्छी तरह से १००० ६२४ 0 ८० ५६० 1 ज 10 मिनट
20 ४८-अच्छी तरह से १००० १२०८ 0 १६० ११२० 2 ज 16 मिनट

तालिका 2: मुख्य प्रोग्राम विकल्पों के उदाहरण सिस्टम 2 पर उपलब्ध क्रिस्टलीकरण बूंदों की स्थापना के लिए. प्रोटीन का नमूना, सुझावों और microsyringes की आवश्यक मात्रा कार्यक्रम के अनुसार बदलती हैं । नमूना ' vol की मात्रा । 1 ' (ड्रॉप 1) और ' vol .2 ' (ड्रॉप 2) का पालन के रूप में गणना कर रहे हैं: (8 युक्तियां एक्स पीसीआर प्लेट की अच्छी तरह से प्रति आवश्यक मात्रा + 4 µ l खो मात्रा) x क्रिस्टलीकरण प्लेटों की संख्या + ४० µ l microtube में मृत मात्रा । ९६ में १०० nL बूंदों के लिए पीसीआर प्लेट के प्रति कुआं आवश्यक मात्रा-अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेट 2 µ l जबकि ६.८ µ एल एक ४८-अच्छी तरह से प्लेट में १,००० nL बूंदों के लिए आवश्यक है (पीसीआर प्लेट के कुओं में मृत मात्रा: ०.८ µ एल) । नमूना की एक अतिरिक्त मात्रा (' खोया मात्रा ') microtube और अन्य नुकसान से वाष्पीकरण के कारण (उदाहरण के लिए सुझावों पर चिपके हुए) ध्यान में रखा जाता है. उदाहरण के लिए, 20 MRC प्लेट्स, १०० nL, 1 ड्रॉप प्रोटोकॉल के लिए, आवश्यक नमूना की मात्रा है: (8 x 2 + 4) x 20 + ४० = ४४० µ l (यानी, 22 µ l प्रति प्लेट के बराबर). आठ डिस्पोजेबल ५० µ एल सुझावों प्रत्येक थाली और प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक हैं । उदाहरण के लिए, 10 प्लेट्स, 2-ड्रॉप प्रोटोकॉल के लिए, आवश्यक सुझावों की संख्या 8 x 10 x 2 = १६० युक्तियाँ है । microsyringes की संख्या का पालन के रूप में गणना की है: (8 + प्लेट प्रति शर्तों की संख्या) एक्स नंबर प्लेट्स के नमूनों की संख्या x. उदाहरण के लिए, के लिए 10 x ४८-well प्लेट्स, तरल हैंडलर आवश्यक युक्तियों की संख्या है: (8 + ४८) x 1 x 10 = ५६० युक्तियां ।

3. तैयार करने, तैयारी और 4-कोने समाधान की हैंडलिंग

4 कॉर्नर समाधान के दोनों योगों (' ए, बी, सी और डी ') और इसी अनुकूलन स्क्रीन (चित्र 3) स्वचालित रूप से एक एक्सेल स्प्रेडशीटद्वारा उत्पंन कर रहे हैं । वहां शर्तों के विभिंन संख्याओं के लिए विभिंन स्प्रेडशीट-अनिवार्य रूप से 24, ४८, और ९६ की स्थिति और भी स्प्रेडशीट के लिए एक ही थाली में दो अलग अनुकूलन स्क्रीन तैयार कर रहे हैं । एक आम तौर पर परीक्षण ट्यूबों में 4 x 10 मिलीलीटर कॉर्नर समाधान का एक सेट तैयार करता है जिसमें से 2-3 अनुकूलन स्क्रीन तैयार किया जा सकता है, संख्या और आवश्यक शर्तों की मात्रा पर निरभर है । समाधान गर्त में डाल रहे है जिसमें से वे एक सिरिंज आधारित तरल हेंडलर द्वारा aspirated और बाद में सीधे प्लेटों में तिरस्कृत (चित्र बी) । सांद्रता के दो रेखीय ग्रेडिएंट का परिणाम व्यवस्थित रूप से भिंन अनुपातों (चित्र 3सी) में मिश्रण A, B, C और D से होता है.

Figure 3
चित्र 3: अनुकूलन स्क्रीन तैयार करने के लिए 4-कोने की विधि. (a) एक ९६-well प्लेट लेआउट में सांद्रता के दो ग्रेडिएंट का प्रतिनिधित्व । (ख) सिरिंज आधारित तरल हैंडलर रोबोट के सिर में डाली गई 4 सीरिंज के साथ एक स्क्रीन तैयार करने के लिए तैयार है । एक क्रिस्टलीकरण प्लेट मोटर चालित एसबीएस वाहक में बैठता है और 4 शुरू समाधान (ए, बी, सी, और डी) पहले से ही उनके संबंधित गर्त में तिरस्कृत किया गया है (समाधान प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए लाल रंग का हो गया है केवल) । (c) समाधान A, B, c, और D के ९६ जलाशयों के पार अनुपात । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तालिका 3 सिरिंज-आधारित लिक्विड-हैंडलर पर उपयोगकर्ताओं के लिए उपलब्ध प्रोग्रांस के लिए आवश्यकताओं को दिखाता है ।

प्लेट प्रकार नहीं. की स्थिति Vol. in थाली (जलाशयों, µ l) Vol. गर्त में (एमएल) अवधि
९६-अच्छी तरह से ४८ ८० १.६ 2 मिनट 5 सेकंड
९६-अच्छी तरह से ९६ ८० २.५ 3 मिनट ५० सेकंड
९६-अच्छी तरह से 2 x ४८ ८० १.६ 2 मिनट ५० सेकंड
४८-अच्छी तरह से 24 २०० १.८ 2 मिनट 25 सेकंड
४८-अच्छी तरह से ४८ २०० 3 4 मिनट 20 सेकंड

तालिका 3: प्रोग्राम 4-कोने विधि के अनुसार अनुकूलन स्क्रीन तैयार करने के लिए सिरिंज आधारित तरल हैंडलर पर उपलब्ध. ९६-well प्लेट ९६-या ४८-स्थिति अनुकूलन स्क्रीन तैयार करने के लिए उपयोग किया जा सकता (जब २ ४८-शर्त स्क्रीन एक साथ तैयार कर रहे हैं, रोबोट 8 सिरिंज और 8 गर्त के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए). अंय कार्यक्रमों ४८-अच्छी तरह से प्लेटों के उपयोग को सक्षम करें । गर्त में सूचीबद्ध खंड आवश्यक मृत मात्रा (०.५ एमएल) शामिल हैं ।

4. Additive स्क्रीनिंग

चित्रा 4 एक additive के साथ या तो शुरू करने के लिए कदम से पता चलता है ९६ additive समाधान पहले से ही क्रिस्टलीकरण प्लेट (प्रोटोकॉल 1) के जलाशयों में या एक कम प्रोफ़ाइल सेल संस्कृति एक फिर से प्रयोज्य additive स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया थाली के कुओं में ( प्रोटोकॉल 2) । तालिका 4 प्रोटोकॉल के दो प्रकारों के अनुसार nanoliter मशीन पर उपलब्ध प्रोग्रांस को सूचीबद्ध करता है ।

Figure 4
चित्रा 4: दो प्रकार के प्रोटोकॉल के लिए additive स्क्रीनिंग. ९६-additive स्क्रीन पर संग्रहित कर रहे है-20 ° c । प्रोटोकॉल 1 के बाद, additive स्क्रीन क्रिस्टलीकरण प्लेटों के जलाशयों के लिए शुरू में जोड़ा जाता है (और आदर्श इस तरह से शेयर) । एक तरल हेंडलर या multipipette additive समाधान (additive स्क्रीन की मात्रा जलाशयों में अंतिम मात्रा का 10% का प्रतिनिधित्व करता है) से युक्त जलाशयों में हालत को बांटने के लिए प्रयोग किया जाता है: 8 µ एल के लिए ८० µ एल अंतिम मात्रा) । एक microplate मिक्सर (नहीं दिखाया गया है) पर शर्तों को मिलाने के बाद, microsyringe-आधारित nanoliter मशीन (तालिका 4) बूंदों को सेट करने के लिए उपयोग किया जाता है । प्रोटोकॉल 2 के बाद, केवल बाद में क्रिस्टलीय बूंदों को सेट करते समय additive स्क्रीन जोड़ा जाता है । इस बार nanoliter मशीन अपने डेक पर एक अतिरिक्त घटक के साथ बूंदें तैयार करने के लिए कार्यरत है (फिर से प्रयोग करने योग्य कोशिका संस्कृति additive स्क्रीन युक्त प्लेट) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्रोटोकॉल ड्रॉप आकार (nL) स्ट्रिप प्रकार नमूना vol. (µ l) नहीं. microsyringes के अवधि
प्रकार additives के स्रोत प्रोटीन हालत additive प्रत्येक वेल (स्ट्रिप) कुल
1 ९६-अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेट १०० १०० 0 2 µ l 2 16 १०४ 2 min
1 ९६-अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेट २०० २०० 0 5 µ l ३.८ 31 १०४ 2min 10 सेकंड
2 ९६-खैर सेल संस्कृति प्लेट २०० २०० १०० 5 µ l ३.८ 31 २०० 3min ४५ sec
2 ९६-खैर सेल संस्कृति प्लेट ५०० ५०० १०० 5 µ l ७.४ ६० २०० 4min 15 सेकंड

तालिका 4: प्रोग्राम microsyringe-आधारित nanoliter मशीन पर additive स्क्रीनिंग के लिए उपलब्ध है । 8-अच्छी तरह पट्टी के प्रत्येक कुआं में नमूना की आवश्यक मात्रा निंनानुसार गणना की है: मृत मात्रा + 12 एक्स ड्रॉप आकार । स्ट्रिप्स के 2 प्रकार (2 µ एल और 5 µ एल) कर रहे हैं । मृत मात्रा 2 µ l कुओं के लिए ०.८ µ एल हैं (जो वास्तव में ३.२ µ एल मैक्स.) और १.४ µ एल के लिए 5 µ एल वेल्स (७.५ µ एल मैक्स.) शामिल कर सकते हैं. आवश्यक प्रोटीन की कुल मात्रा है: 8 पट्टी के कुआं में x मात्रा (गोल-अप मूल्य) । ९६-वेल सेल कल्चरल प्लेट के वी-आकार के कुओं की डेड मात्रा २.५ µ एल है. microsyringes की अपेक्षित संख्या चयनित प्रोग्राम के अनुसार भिंन होती है (8 + ९६ = १०४; या 8 + 2 x ९६ = २००) ।

प्रोटोकॉल के दौरान additive के साथ शर्त के कमजोर पड़ने के कारण 1, हालत शुरू में से एक आनुपातिक उच्च एकाग्रता पर तैयार होने की जरूरत है । अंतिम सांद्रता में वृद्धि सबसे आसानी से परिकलित अंतिम मात्रा के लिए पानी के अंतिम अतिरिक्त को कम करने के द्वारा प्राप्त की है । इस के बाद, एक बस बूंदों कि हालत और नमूना मिश्रण (उदा, १०० nL प्रोटीन + १०० nL शर्त पहले से ही additives के साथ मिश्रित) के सामांय सेट के साथ आय । प्रोटोकॉल 2 (उदा., २०० nL प्रोटीन + २०० nL हालत + १०० nL additive) additives के विभिंन सांद्रता पर स्क्रीनिंग की सुविधा बस additive स्क्रीन की मात्रा अलग से जोड़ा । प्रोटोकॉल 2 बूंदों के अधिक या कम कमजोर पड़ने का तात्पर्य (जो क्रिस्टलीकरण बदल सकता है) ।

2 प्रणाली से तरल हेंडलर 12 सुझावों में पर्याप्त हालत महाप्राण और एक ९६ के जलाशयों में 8 aliquots-अच्छी तरह से थाली तिरस्कृत इस्तेमाल किया जा सकता है ( प्रोटोकॉलदेखें, चरण -8), हालांकि इस कदम को पाठ्यक्रम के एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ मैंयुअल रूप से किया जा सकता है ( चित्रा 4) । कई प्लेटें तरल हैंडलर का उपयोग करते समय एक ही शर्त के साथ एक बार में भरा जा सकता है (बाद में विभिंन additive स्क्रीन का परीक्षण करने के लिए) । 2 प्लेट्स तैयार करते समय, कम से 23 मिलीलीटर के साथ रिएजेंट कंटेनर भरें । 3 प्लेट्स तैयार करते समय, कम से 31 मिलीलीटर के साथ रिएजेंट कंटेनर भरें ।

5. क्रिस्टलीकरण प्लेटों और जुड़े उपकरणों

दोनों MRC बैठे-ड्रॉप वाष्प प्रसार क्रिस्टलीकरण प्लेटों (९६-अच्छी तरह से 2-ड्रॉप और ४८-अच्छी तरह से 1-ड्रॉप, आंकड़ा 5 ए और चित्रा 5B) के डिजाइन विशेषताओं है कि विश्वसनीय और कुशल स्वचालित क्रिस्टलीकरण प्रयोगों को सक्षम प्रदान करता है, के साथ विशेष रूप से ऊपरी कुओं के गोलाकार आकार और जलाशयों जो सटीक वितरण और भी केंद्रापसारक की सुविधा के एक मामूली वी आकार जब बूंदों के केंद्र की आवश्यकता है । इसके अलावा, ऊपरी कुओं एक stereomicroscope के तहत इष्टतम रोशनी के लिए एक लेंस प्रभाव है (बहुलक यूवी का पता लगाने के लिए यूवी संक्रामक है अवशोषित या फ्लोरोसेंट क्रिस्टल23) ।

एक कस्टम सील (चित्रा 5C) एक nanoliter मशीन का उपयोग करते हुए प्लेटों के दोनों प्रकार के भीतर हैंगिंग ड्रॉप क्रिस्टलीकरण प्रयोगों को स्थापित करने में सक्षम बनाता है (प्रोटोकॉल नहीं दिखाया गया है). अंत में, दोनों MRC प्लेट एक ही बाहरी आयामों और रिम है । रिम हमारे कस्टम निर्मित प्लेट धारक (चित्रा 5d) के खांचे में फिट बैठता है, जो मैंयुअल रूप से रखने के लिए प्रयोग किया जाता है/

Figure 5
चित्रा 5: MRC क्रिस्टलीकरण प्लेट और LMB में विकसित संबंधित उपकरणों । (एक) ९६-खैर थाली के A1-कोने । जलाशय (आयताकार) में क्रिस्टलीकरण अच्छी तरह से बाईं ओर है, ठीक है पर दो गोलाकार ऊपरी-कुओं । आयाम मिलीमीटर में हैं । (ख) ४८-खैर प्लेट के A1-कॉर्नर । जलाशय ठीक (1 बड़े ऊपरी-अच्छी तरह से केवल) के दाहिने हाथ की ओर है । (C) MRC हैंगिंग ड्रॉप सील । (D) घर में कस्टम प्लेट धारक । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

6. प्रोटीन क्रिस्टल

चित्रा 6 हमारे स्वचालित प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त उपयोगी क्रिस्टल के उदाहरण से पता चलता है.

Figure 6
चित्रा 6: क्रिस्टल युक्त बूंदों के प्रकाश माइक्रोग्राफ स्वचालित प्रोटोकॉल का पालन प्राप्त किया । (A, B) 2 पूरी तरह से स्वचालित प्रणालियों के साथ तैयार प्लेटों में OmpF और MreB के प्रारंभिक स्क्रीन से क्रिस्टल ( प्रोटोकॉल वर्गों १.१ और १.२, शर्तों: LMB07 अच्छी तरह से A4 और LMB20 अच्छी तरह से D12, क्रमशः, बूंदों का आकार है १०० nL प्रोटीन + १०० nL हालत, का काम Andrzej Szewczak, LMB)24. (ग, घ) 4-कोने विधि (चरण २.१, LMB02 B6, १,००० nL + १,००० nL, लियोनार्डो Almeida-Souza, LMB) के अप्रकाशित कार्य के साथ प्रारंभिक स्थितियों का अनुकूलन करने से पहले और बाद में बार डोमेन क्रिस्टल । (ङ, च) मानव dynein 1 एन टर्मिनल डोमेन क्रिस्टल के भारी श्रृंखला से पहले और 4 के साथ प्रारंभिक स्थितियों के अनुकूलन के बाद कोने विधि (LMB20 E6, २०० nL + २०० nL, तो ५०० nL + ५०० nL, एडगर नैतिकता के अप्रकाशित कार्य-Ríos, LMB) । (छ, ज) पूरक के पहले और additive स्क्रीनिंग के साथ हालत के अनुकूलन के बाद D क्रिस्टल (चरण २.२, घर में कस्टम स्क्रीन से प्रारंभिक स्थिति, २०० nL + २०० nL, ९६ से additive D6-शर्त additive स्क्रीन, मथायस Bauer के अप्रकाशित कार्य, LMB) । (I, J) वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन से पहले और additive स्क्रीनिंग के साथ हालत के अनुकूलन के बाद25 क्रिस्टल (चरण २.३, LMB20 A2, १५० nL + १५० nL, फिर २०० nL + 200nL + १०० nL additive E5 से ९६-शर्त additive स्क्रीन, Yorgo के अप्रकाशित कार्य मोदी, यूनिवर्सिटी ऑफ कैंब्रिज, यूके) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

1-तैयारी और प्लेटों में संग्रहीत प्रारंभिक स्क्रीन का उपयोग

स्क्रीनिंग किट प्लेटों में तिरस्कृत किया जा रहा है, क्योंकि प्रकाश वर्षण या चरण जुदाई भंडारण के दौरान कुछ ट्यूबों में होता है पहले मिलाया जाना चाहिए । जब एक स्क्रीन दो किट (2 x ४८ ट्यूबों) से बना है, दूसरी किट की पहली ट्यूब में ठंडा वाहक के स्थान E1 में रखा गया है । जब एक स्क्रीन 4 किट (4 x 24 ट्यूबों) से बना है, दूसरी किट की पहली ट्यूब स्थान C1 में रखा गया है, तीसरी किट की पहली ट्यूब स्थान E1 में रखा गया है और चौथी किट की पहली ट्यूब स्थान G1 में रखा गया है । जबकि उनके शीतलक वाहक में ट्यूबों डालने, ढक्कन मानक ९६-अच्छी तरह से परिदृश्य लेआउट निंनलिखित एक ट्रे पर रखा जाता है । चूंकि अच्छी संख्या निर्माताओं द्वारा पलकों के शीर्ष पर संकेत कर रहे हैं, इस पार की जांच सक्षम बनाता है अगर सभी ट्यूबों सही क्रम में रखा गया है । यह भी ट्यूबों पर सही ढक्कन की जगह जब प्लेटों की एक कम संख्या भरने में मदद करता है ।

हम 10 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व भर प्लेटों की दुकान, ठंड से बचने के लिए एक समझौता और 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण कि शर्तों और सीलिंग के साथ मुद्दों की गिरावट का कारण हो सकता है । प्लेटें के लिए कई महीनों के लिए जमा हो जाती है के साथ आम तौर पर सील के भीतरी चेहरे पर कोई नजर नहीं संघनित्र । यह LMB05, LMB06, LMB09 और LMB10 प्लेटों के लिए कम सच है क्योंकि इनमें अस्थिर रिएजेंटों की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता (तालिका 1) के साथ स्थितियां होती हैं । मुहर के भीतर की ओर संघनित्र की छोटी राशि सील दक्षता को कम कर देता है और प्लेटों को अनसील करते हुए कुओं के बीच क्रॉस-दूषण पैदा कर सकता है । प्रारंभिक कूलिंग के दौरान रोक लगाने के साथ मदद करने के लिए, प्लेटें पहले हिंडोला से एक अछूता पिकनिक कूलर जो एक 4 ° c ठंड कमरे में रात भर में संग्रहित है में स्थानांतरित किया जा सकता है । बहुत धीमी गति से ठंडा करने के लिए सील कुओं के भीतर तापमान ढाल के विकास को कम करता है और इसलिए कुल मिलाकर15संघनित्र कम कर देता है । इसके अलावा, एक बार प्लेटें 10 डिग्री सेल्सियस मशीन में जमा हो जाती हैं, एक घर में कस्टम SBS polystyrene ढक्कन प्रत्येक स्टैक के शीर्ष पर प्लेट पर रखा जाता है (नहीं दिखाया गया है) ।

हमारे पूर्व के पूरे सेट प्लेटें एक उपंयास, पानी में घुलनशील, प्रोटीन नमूना के खिलाफ एक बड़े प्रारंभिक स्क्रीन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, कम प्लेट विशिष्ट आवश्यकताओं से मेल करने के लिए चुना जा सकता है । उदाहरण के लिए, LMB15 और LMB19 झिल्ली प्रोटीन नमूनों के लिए विशेष रूप से तैयार की स्क्रीन है26,27, या LMB20 एक भारी परमाणुओं के साथ तैयार स्क्रीन है विवर्तन डेटा28 के प्रयोगात्मक चरणबद्ध की सुविधा (यह भी देखें : MORPHEUS प्रोटीन क्रिस्टलीकरण स्क्रीन के निर्माण) ।

2. क्रिस्टलीकरण बूंदों की स्थापना

जब सिस्टम 2 का उपयोग कर, अस्थिर एजेंट की महत्वपूर्ण मात्रा के साथ स्क्रीनिंग किट पहले संसाधित किया जाना चाहिए । यह, जो ढक्कन हैंडलिंग और प्लेट सील को प्रभावित कर सकता है SBS पलकों के रबर पर बनाने के संघनित्र से बचा जाता है । एक SBS ढक्कन निकासी का एक सा है जब एक थाली है, जो क्यों वे शुरू में गठबंधन की जरूरत है के शीर्ष पर है ( प्रोटोकॉलदेखें, चरण 1.2.6) । पीसीआर प्लेट के कुओं में प्रोटीन डेड वॉल्यूम अपेक्षाकृत उदार (०.८ µ एल, देखें तालिका 2की कथा) । ध्यान दें कि समान रूप से उदार मृत मात्रा में 8-well स्ट्रिप्स (तालिका 4) में प्रोटीन के साथ व्यक्तिगत रूप से nanoliter मशीन का उपयोग करते समय कार्यरत हैं । छोटे मृत संस्करणों काम कर सकते हैं, हालांकि कुछ नमूनों सुझावों का पालन, एक रोबोट के अंशांकन थोड़ा गलत हो सकता है, कमरे में सामान्य से अधिक गर्म हो सकता है, आदि सभी का नेतृत्व करने के लिए दृष्टिकोण को मजबूत करने के क्रम में उदार मृत मात्रा से आच्छादित नमूना नुकसान ।

हाल के घटनाक्रम और प्रयोगों के miniaturization आगे सक्षम और इसलिए जांच क्रिस्टलीकरण शर्तों के लिए आवश्यक नमूना की मात्रा काफी इसी तकनीक को एकीकृत करने के द्वारा कम किया जा सकता है29,30 . हालांकि, आगे miniaturization के कुछ पहलुओं को सावधान विचार की जरूरत है, जैसे बूंदों के वाष्पीकरण31 और microcrystals३२के हेरफेर ।

अंत में, प्लेट के केंद्रापसारक (२,००० rpm, 1 मिनट) एक नियमित अंतिम चरण के रूप में एकीकृत किया जा सकता है जब तक क्रिस्टलीकरण बूंदों (गोलाकार ऊपरी कुओं में) की स्थापना । एक अधिक सुसंगत आकार और केंद्रापसारक से जिसके परिणामस्वरूप बूंदों के आकार reproducibility मुद्दों को कम कर सकते है३३,३४। निश्चित रूप से, केंद्रित बूंदें आवश्यक फोकल लंबाई के रूप में एक खुर्दबीन का उपयोग कर के बाद के आकलन में आसानी होगी पूरी थाली भर में इसी तरह की जाएगी ।

3.4-कोने विधि के लाभ

4-कोने विधि का सबसे महत्वपूर्ण लाभ अपनी सादगी है, जो त्रुटियों को कम करता है और सरल स्वचालित प्रोटोकॉल की सुविधा है । उदाहरण के लिए, 4 कोने समाधान हमेशा एक ही लेआउट के बाद एक तरल हेंडलर के डेक पर रखा जाएगा । साथ ही, सभी प्रोग्राम समाधानों के बीच निश्चित अनुपात (चित्र 3 c) पर आधारित होते हैं ।
4 कोने समाधान के मैनुअल तैयारी उच्च सांद्रता जो अत्यधिक चिपचिपा हो सकता है पर समाधान के स्वचालित हैंडलिंग के लिए पसंद किया जाता है । अपेक्षाकृत तेजी से और सही आकांक्षा/वितरण तरल वर्गों के अनुकूलन के लिए ंयूनतम आवश्यकताओं के साथ तरल संचालकों के अधिकांश प्रकार पर तो संभव है । फिर भी, कुछ कोने समाधान एक तरल प्रणाली के साथ काम करने के लिए कुशलतापूर्वक काम रोबोट के लिए अभी भी चिपचिपा हो सकता है । यही कारण है कि हम एक तरल हेंडलर सकारात्मक विस्थापन (चित्र बी) के साथ ऑपरेटिंग के लिए चुना है ।

सांद्रता के 2 रैखिक ढाल के अलावा, एक तिहाई घटक (यानी, बफ़र्स/additives का एक सेट) एक सुविधाजनक तरीके से एक निरंतर एकाग्रता पर परीक्षण किया जा सकता है । इसके लिए, एक उपयुक्त उच्च एकाग्रता में कोने समाधान के एक कोर सेट की एक अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में, घटक को छोड़कर, पहले तैयार किया जाता है । फिर, इस घटक सहित स्टॉक समाधान अंतिम सांद्रता समायोजित करने के लिए जोड़ा जाता है । उदाहरण के लिए, 4 कोने समाधान का एक सेट की ५० मिलीलीटर शुरू से 10% अधिक सांद्रता पर तैयार कर रहे हैं । इस कोर सेट तो 4 के 5 छोटे सबसेट में विभाजित है । अंत में, अलग बफर की मात्रा में 10%-पीएच समाधान प्रत्येक सबसेट के लिए जोड़ा जाता है ।

4. स्वरूपों और additive स्क्रीन के प्रकार

स्क्रीन सामान्य रूप से-20 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 4) में संग्रहीत कर रहे हैं क्योंकि वे नियमित रूप से इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं और अस्थिर/अस्थिर यौगिकों होते हैं । एक जमे हुए additive स्क्रीन का उपयोग एक गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक (कुओं में 1 मिलीलीटर) में संग्रहीत जल्दी योजना बनाई जानी चाहिए क्योंकि यह सभी additive समाधान के लिए 12-24 hr ले जाएगा पूरी तरह से कमरे के तापमान पर गल । इसके अलावा, उपयोगकर्ताओं की एक भीड़ एक ही additive स्क्रीन साझा, संभवतः पार के साथ समस्याओं के कारण संदूषण । अंत में, गहरी अच्छी तरह से ब्लॉकों की ऊंचाई उंहें सबसे nanoliter मशीन के लिए अनुपयुक्त बनाता है । इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए एक सुविधाजनक समाधान के रूप में, स्क्रीन डीप वेल ब्लॉक से कम प्रोफ़ाइल प्लेट (चित्रा 4) के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए ।

ऐतिहासिक रूप से, additive स्क्रीन जो एकल पुनर्अभिकर्ताओं की एक व्यापक विविधता (एकल सांद्रता के साथ शामिल हैं) बहुत लोकप्रिय है३५,३६। हालांकि, additive स्क्रीन के अंय प्रकार विकसित किया गया है कि एकीकृत३७ additives के घोला जा सकता है या एक कम संख्या में एक additives के विभिंन सांद्रता३८पर पाया । अंत में, एक पूरक दृष्टिकोण के नमूनों पर additives के प्रभाव की जांच करने से पहले क्रिस्टलीकरण३९,४०।

5. अधिक विचार

अच्छा अभ्यास: अधिकांश स्क्रीन हानिकारक या भी विषाक्त पदार्थ होते है और इसलिए पर्याप्त व्यक्तिगत सुरक्षा प्रोटोकॉल के दौरान कार्यरत होना चाहिए । समान रूप से, रोबोट के भागों चलती चोटों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, खासकर जब एक कार्यक्रम चल रहा है जब मैंयुअल रूप से हस्तक्षेप करने की कोशिश कर (हालांकि रोबोट के अधिकांश आपातकालीन बंद करें बटन/ तकनीकी जटिलताओं शामिल की वजह से, रोबोट, स्क्रीन और पहले से ही परीक्षण नमूनों के साथ कार्यक्रमों की नियमित जांच reproducibility के उच्च स्तर पर निरंतर के लिए महत्वपूर्ण हैं ।

प्रवाह: एक संकेत के रूप में, ४,००० के बीच ८,००० LMB प्लेट वार्षिक 1 प्रणाली के साथ उत्पादित कर रहे हैं (और बाद में प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए उपयोगकर्ताओं द्वारा नियोजित). यह 10 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व भर प्लेटों की एक बड़ी राशि स्टॉक करने के लिए अनुकूलित नहीं है जब अपेक्षित कारोबार बहुत कम है, के रूप में 4-5 महीने के बाद, कुछ शर्तों को खराब और लुप्त हो जाना शुरू कर देंगे । छोटे-से मध्यम आकार की प्रयोगशालाओं के लिए स्वचालन प्रोटोकॉल के लिए विभिन्न दृष्टिकोण को लागू किया गया है४१.

भंडारण और प्रयोगों का आकलन: बूंदें तैयार करने के बाद, प्लेटें कम कंपन अलमारियों पर एक कमरे में 4 या 18 डिग्री सेल्सियस पर कसकर नियंत्रित तापमान के साथ जमा हो जाती है (+/-०.५ ° c अधिकतम विचलन) । प्रयोग ठंडे प्रकाश स्रोत सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर मूल्यांकन कर रहे हैं । विभिंन स्वचालित इमेजिंग प्रणालियों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, लेकिन एक सावधानी से सभी पहलुओं पर विचार करना चाहिए: गति एक थाली स्कैन करने के लिए आवश्यक उच्च प्रवाह के लिए पर्याप्त होगा? क्रिस्टल के अलावा अंय वस्तुओं होगा फोकस के साथ हस्तक्षेप? छवियों के परिणामस्वरूप गुणवत्ता (विशेष रूप से बूंदों के किनारे के आसपास) बहुत छोटे क्रिस्टल हाजिर करने के लिए पर्याप्त होगा? ४२ , ४३ , ४४

क्रिस्टलीकरण शर्तों की तुलना: शुरू में क्रिस्टल प्राप्त की प्रकृति के बारे में सावधान जांच के बाद, एक प्रवृत्तियों और LMB स्क्रीन डेटाबेस या सी 6 वेब उपकरण४५का उपयोग कर शर्तों भर में समानता का विश्लेषण कर सकते हैं ।

Disclosures

हम इसके द्वारा एक परस्पर विरोधी वाणिज्यिक हित राज्य LifeArc निंनलिखित मदों के व्यावसायियों: ९६-और ४८-अच्छी तरह से MRC प्लेटें, MRC हैंगिंग ड्रॉप सील, MORPHEUS, Pi, ANGSTROM और LMB क्रिस्टलीकरण स्क्रीन ।

Acknowledgments

MRC-LMB क्रिस्टलीकरण सुविधा कृपया चिकित्सा अनुसंधान परिषद (यूके) द्वारा समर्थित है । हम उनके समर्थन के लिए LMB के सदस्यों को धंयवाद: ओल्गा Perisic (PNAC), टोनी वार्न, Fusinita वान मांद ईएनटी और पैट एडवर्ड्स (संरचनात्मक अध्ययन), स्टीव स्कॉच और यांत्रिक कार्यशाला के अंय सदस्यों, नील अनुदान और जो Westmoreland (दृश्य एड्स), पॉल हार्ट और टॉम प्रैट (IT) । हम भी स्टीव इलियट (Tecan, ब्रिटेन), मिशेल स्टुअर्ट और हीथ Ringrose (हैमिल्टन रोबोटिक्स, ब्रिटेन), पॉल गल, रॉबर्ट लुईस और Joby Jenkins (टीटीपी Labtech, ब्रिटेन), पॉल Reardon (Swissci एजी, स्विट्जरलैंड), जॉर्ज स्टीफंस और डोनाल्ड Ogg (Alphabiotech, के लिए धंयवाद देना चाहूंगा ब्रिटेन), नील विलियंस (Markem Imaje, ब्रिटेन) और ग्राहम हैरिस (क्लीवलैंड एजेंसी) तकनीकी मदद के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Robots
Freedom EVO® Tecan n/a Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0. 
Microlab® STAR™ Hamilton n/a Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE™ technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.
Mosquito® TTP Labtech n/a Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422. 
Dragonfly® TTP Labtech n/a Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196. 
Adhesive plate sealer Brandel n/a Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).
Inkjet printer 9232 Markem-Imaje n/a Integrated to System 1. Touchscreen interface.
Crystallization screens
Crystal Screen™ 1 Hampton Research HR2-110 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Crystal Screen 2™ Hampton Research HR2-112 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Wizard™ Classic 1 Rigaku 1009530 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Wizard™ Classic 2 Rigaku 1009531 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Grid Screen™ Ammonium Sulfate Hampton Research HR2-211 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG/LiCl Hampton Research HR2-217 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Quick Screen™ Hampton Research HR2-221 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ Sodium Chloride Hampton Research HR2-219 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG 6000 Hampton Research HR2-213 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
Grid Screen™ MPD Hampton Research HR2-215 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
MemFac™ Hampton Research HR2-114 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
PEG/Ion™ Hampton Research HR2-126 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Natrix™ Hampton Research HR2-116 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Crystal Screen Lite™ Hampton Research HR2-128 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Custom Lite screen Molecular Dimensions Ltd n/a Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Wizard™ Cryo 1 Rigaku 1009536 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
Wizard™ Cryo 2 Rigaku 1009537 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
JBS1 JenaBioScience CS-101L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS2 JenaBioScience CS-102L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS3 JenaBioScience CS-103L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS4 JenaBioScience CS-104L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS5 JenaBioScience CS-105L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS6 JenaBioScience CS-106L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS7 JenaBioScience CS-107L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS8 JenaBioScience CS-108L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS9 JenaBioScience CS-109L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
JBS10 JenaBioScience CS-110L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 6.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 7.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 8.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Index™ Hampton Research HR2-144 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13
SaltRX™ 1 Hampton Research HR2-107 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14
SaltRX™ 2 Hampton Research HR2-109 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14
MemStar™ Molecular Dimensions Ltd MD1-21 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15
MemSys™ Molecular Dimensions Ltd MD1-25 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15
JCSG-plus™ Suite Qiagen 130720 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16
MORPHEUS® screen Molecular Dimensions Ltd MD1-46 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17
Pi minimal screen JenaBioScience CS-127 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18
Pi-PEG screen JenaBioScience CS-128 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19
MORPHEUS® II screen Molecular Dimensions Ltd MD1-91 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20
LMB crystallization screen™ Molecular Dimensions Ltd MD1-98 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21
Additive screens
HT additive screen Hampton Research HR2-138 Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).
MORPHEUS® additive screen Molecular Dimensions Ltd MD1-93-500 Frozen in 96-well deepwell block (500 µL per well).
ANGSTROM additive screen™  Molecular Dimensions Ltd MD1-100 Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).
MORPHEUS® additive screen Molecular Dimensions Ltd MD1-93 Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped wells (100 µL per well).
ANGSTROM additive screen™  Molecular Dimensions Ltd MD1-100-FX Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped well (100 µL per well).
HIPPOCRATES additive screen Molecular Dimensions Ltd n/a 48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS® III).
Other consumables
96-well MRC 2-drop plate Swissci MRC 96T-UVP Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80  µL. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.
48-well MRC 1-drop plate  ('MAXI plate') Swissci MMX01-UVP  Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200  µL. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 µL. UV transmissible.
MRC hanging drop seal Swissci n/a Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.
Adhesive sealing tape Hampton Research HR4-50 3-inch wide Duck® HD Clear™ for sealer and manual sealing.
Adhesive aluminium sheet Beckman Coulter 538619 Used to reseal additive screens.
Ink cartridge Markem-Imaje 9651 System 1 (inkjet printer).
Solvent cartridge Markem-Imaje 8652 System 1 (inkjet printer).
50 µL tips  Hamilton 235947 System 2 (STAR™ liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE™ tips in disposable stacks.
Reagent container Hamilton 194052 Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols. 
PCR plate Thermo Scientific™ AB-2150 System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito®). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.
microsyringes TTP Labtech 4150-03020 Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito® nanoliter dispenser (9mm spacing).
strip-holder block TTP Labtech 3019-05013 SSB device for the Mosquito® strips, aka '4-way Reagent Holder'.
2 µL 8-well strip TTP Labtech 4150-03110 Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 µL.
5 µL 8-well strip TTP Labtech 4150-03100 Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 µL.
5 mL syringes TTP Labtech 4150-07100 Syringe body and piston for the Dragonfly® liquid handler. Pack of 100.
Troughs/Reservoirs TTP Labtech 4150-07103 Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly®. Pack of 50.
Orbital microplate shaker CamLab Limited n/a Variomag® for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).
Microplate mixer TTP Labtech 3121-01015 MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.

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References

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जैव रसायन अंक १३१ एक्स-रे क्रि प्रोटीन क्रिस्टलीकरण उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग पूरी तरह से स्वचालित प्रणाली nanoliter बूंदें वाष्प प्रसार प्रारंभिक स्क्रीन nanoliter मशीन तरल हैंडलर क्रिस्टल अनुकूलन 4-कोने विधि additive स्क्रीनिंग
आणविक जीवविज्ञान की MRC प्रयोगशाला में Macromolecular क्रिस्टलीकरण के लिए स्वचालित प्रोटोकॉल
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Gorrec, F., Löwe, J. Automated… More

Gorrec, F., Löwe, J. Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology. J. Vis. Exp. (131), e55790, doi:10.3791/55790 (2018).

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