Summary
Automatiserade system och protokoll för rutinmässig beredning av ett stort antal skärmar och nliter kristallisering droppar för ånga diffusion experiment beskrivs och diskuteras.
Abstract
När hög kvalitet kristaller erhålls som gravering röntgen, kan kristallstrukturen lösas på nära atomär upplösning. Villkoren för att kristallisera proteiner, DNAs, RNAs och deras komplex kan dock inte vara förutspådde. Anställa en bred mängd villkor är ett sätt att öka avkastningen av kvalitet diffraktion kristaller. Två helt automatiserade system har utvecklats på den MRC laboratorium för molekylärbiologi (Cambridge, England, MRC-LMB) som underlättar kristalliseringen screening mot 1.920 initialt villkorar av vapor diffusion i nliter droppar. Halvautomatisk protokoll har också utvecklats för att optimera villkor genom att ändra koncentrationerna av reagenser, pH, eller genom att införa tillsatser som potentiellt ökar egenskaper av de resulterande kristallerna. Alla motsvarande protokoll kommer att beskrivas i detalj och diskuterade kort. Sammantaget möjliggör de bekväm och mycket effektiv makromolekylära kristallisering i en fleranvändar-anläggning, samtidigt som den ger användarna kontroll över viktiga parametrar av sina experiment.
Introduction
Röntgenkristallografi är omfattande tillämpas att vidareutveckla vår förståelse av mekanismerna för biologiska och sjukdom på atomär nivå och därefter hjälpa rationellt förhållningssätt till drug discovery1. För detta, renat och koncentrerad (2-50 mg/mL) makromolekylära prover av protein, DNA, RNA, andra ligander och deras komplex är trialed för deras benägenhet att bilda beställde tredimensionellt galler genom kristallisering2,3 ,4. När hög kvalitet kristaller erhålls som gravering röntgen, kan kristallstrukturen lösas på nära atomär upplösning5,6. Är avgörande förutsättningar för att kristallisera roman prov kan inte förutsägas och utbytet av hög kvalitet kristaller är oftast mycket låg. En underliggande orsak är att många prover av intresse har utmanande biokemiska egenskaper, som gör dem instabila på motsvarande tidsskalan för kristallisering (vanligtvis några dagar). Slutligen, processen förvärras av den tid som krävs för att producera prov och prov varianter, och för att optimera deras rening och kristallisering7,8.
En kristallisering skick är en lösning med en fällningsmedel som minskar provets löslighet och villkor innehåller ofta även buffertar och tillsatser. Hundratals sådana reagenser är väl lämpade för att ändra parametrarna för kristallisering experimenten eftersom de har låg benägenhet att störa prov integritet (t.ex. protein eller nukleinsyra utspelar sig). Även testning miljontals kombinationer av kristallisering reagenser inte är genomförbart, är testa flera till många screening kit - formulerad med olika strategier9,10 - möjligt med miniaturized prövningar och automatiserade protokoll. I detta perspektiv är mest mottaglig tekniken förmodligen ånga diffusion med 100-200 nL droppar sitter på en liten väl över en reservoar som innehåller villkoret kristallisering (25-250 µL), genomförs i specialiserade kristallisering plattor11 , 12. protein provet och skick kombineras ofta i förhållandet 1:1 för en total volym på 200 nL när du ställer in droppar i övre-brunnarna. Robotic nliter protein kristallisation kan genomföras med alternativa tekniker och tallrikar som under olja batch13 och Lipidic Cubic fas14 (senast en tillämpas specifikt till trans-membranproteiner som är Mycket dåligt lösligt i vatten).
Kristallisering anläggningen i MRC-LMB startades i början av 2000 talet och en tidig Sammanfattning av vår automatiserade protokoll presenterades 200515. En historisk introduktion till protein kristallisering presenterades och också en översikt av fördelarna med robotic nliter närma sig (då en ny metod för rutinmässig experiment). Sedan makromolekylära kristallisering är i huvudsak en stokastisk process med mycket liten eller ingen användbar förhandsinformation, anställa en bred mängd (lämplig) initialt villkorar öka avkastningen av kvalitet diffraktion kristaller16. Förutom, en ofta förbisedd fördel av en stor inledande skärm är att avsevärt minska behovet för optimering av prover och kristaller i många fall. Naturligtvis kan man fortfarande behöver fortsätta med optimering av vissa ursprungliga villkoren senare. Vanligtvis undersöks systematiskt då koncentrationen av reagenser och pH. Mer reagenser kan också införas i den optimerade villkoren att ytterligare ändra parametrarna för kristallisering. Visst, en bör försök kristallisering med ett urval nylagade, därav de motsvarande protokoll måste vara enkel och tillgänglig som helst.
Här två helautomatiska system som utformats på MRC-LMB (system 1 och 2) och de motsvarande protokoll beskrivs fullt. Den huvudsakliga tillämpningen av dessa två system är initial screening av vapor diffusion i sitter droppe kristallisering plattor. System 1 integrerar en flytande hanterare, en automatiserad karusell till lager plattor, en bläckstråleskrivare för plattan märkning och en vidhäftande plattan sealer. På systemet 1, 72 96 brunnar fylls med kommersiellt tillgängliga screening Kit (80 µL av villkorar överfört till reservoaren från en start volym av 10 mL provrör), märkt och förseglade. Pläterar lagras sedan i en 10 ° C inkubator där de är tillgängliga för användare när som helst (som inledande skärmar kallas 'LMB plåtar').
System 2 integrerar en flytande hanterare, en nliter dispenser och en vidhäftande plattan sealer. På systemet 2, sitter droppar (100-1000 nL) för ånga diffusion experiment produceras genom att kombinera villkor och provet i övre-brunnarna av 20 48 eller 96-brunnar förfylld med villkor. Detta innebär 1.920 inledande screening villkor trialed när du använder 20 LMB plattor på systemet 2.
Robotar används också individuellt för optimering av valda villkor och motsvarande halvautomatisk protokollen beskrivs också. Den 4-hörn metod17 används rutinmässigt att producera optimering skärmar. Motsvarande protokollet först kräver manuell beredning av 4 lösningar ('A, B, C, och D'). Två linjära övertoningar koncentrationer (för två huvudsakliga kristallisering agenter) genereras sedan automatiskt direkt i reservoarerna kristallisering platta. För detta doserar en spruta-baserade flytande hanterare 4 hörn lösningar på olika nyckeltal.
För att ytterligare optimera ett tillstånd, kan man använda tillsatsen skärmar som potentiellt ökar egenskaper resulterande kristaller18. Det finns två metoder för additiv screening: ett protokoll som börjar med tillsatser dispenseras i behållarna i kristallisering tallrikar innan du ställer in droppar (protokoll 1) och ett annat protokoll där skärmen additiv dispenserats direkt på droppar (protokoll 2).
Annan användbar utveckling som inleddes vid MRC-LMB att underlätta automatiserade makromolekylära kristallisering, presenteras också. I huvudsak minimerar kristallisering tallrikar och tillhörande enheter såsom en stapelbar samhället av Biomolecular Screening (SBS) lock som avdunstning av villkor vid användning av systemet 2.
För korthetens förutsätts det att användare är bekanta med grundläggande funktioner och skötsel av nliter fördelaren, bläckstråleskrivare och vidhäftande plattan sealer. Om inte annat anges, plattor på däck på robotarna är placerade så att väl A1 ('A1-hörnet') är mot baksidan vänstra hörnet av en tallrik-bärare.
Protocol
1. två helautomatiserade system (initial screening)
-
System 1: förberedelse av 72 96 brunnar kristallisering tallrikar fyllda med screening Kit (LMB pläterar)
- Innan du utför proceduren, säkerställa att systemets robotar initieras och deras kontrollerande mjukvaran är öppen. Slå på kylaren tube-kylning transportörens ca 30 minuter innan huvudprogrammet kommer att startas.
- Placera en test platta på motordrivna SBS bärare av plattan sealer. Kör plattan sealer och kontrollera att filmen tillämpas korrekt. Upprepa detta två gånger fler test för att kontrollera att plattan sealer är klar.
- Lägg sedan till 20 L avjoniserat vatten till huvudsakliga behållaren av flytande hanteraren. Koppla bort koppling skär små behållare (20% etanol sköljning lösning) och Anslut skären till huvudsakliga behållaren.
- Ange lämpliga skärmnamn (tabell 1) på bläckstråle skrivare pekskärmen. Sedan, öppna och stänga dörren carousel för att utlösa carousel rotation. Öppna dörren när den första stacken presenterar sig själv.
- Fullt Fyll på första bunten med 22 kristallisering pläterar, var och en med kolumn 1 vänd ut. Ladda fullt de nästa två högarna på samma sätt.
- Ladda de återstående 6 plattorna i de högsta positionerna i fjärde stapeln. Stäng sedan carousel dörren.
- Kontrollera att kylmaskin displayen visar 14 ° C. Försiktigt och upprepade gånger Invertera markerade screening satserna i 1 minut. Öppna frontpanelen på flytande hanteraren.
- Öppna rören och placera dem i den svalkande hållaren enligt 96 brunnar standardlayouten (A1, A2, etc.). Vid placering varje rör i flygbolaget, placera locket på en bricka i samma 96 brunnar layout.
- Dubbelkontrollera röret positioner och se till att alla rör är nivå och bosatte sig i transportören. Stäng sedan frontpanelen.
- I fönstret 'Start' av programvaran flytande handler, Välj 'Kör underhåll' och öppna programmet rodnad. Kör programmet att spola 20% etanol från systemet och att tvätta utsidorna av vätska-dispensering tips.
- När spolning är klar, klicka på 'Avbryt' om du vill återgå till 'Start'. Välj 'Kör en befintlig process' och klicka på 'Starta ditt val'. Öppna programmet 'MRC kit dispensering'. Fyll i '18' för 'Instanser' i konfigurationen skärm och kör programmet.
- Övervaka systemet som de fyra första plattorna är märkt, fylld och förseglade.
- När alla 72 plattor har beretts och sättas tillbaka i karusellen, byta koppling skär från den huvudsakliga behållaren till små behållaren. Kör programmet 'Start flush' (se steg 1.1.10).
- Stäng av kylmaskinen och kassera tomt screening kit rör. Ta försiktigt bort 72 förberedda plåtarna från karusellen. Kassera felaktigt-fyllda eller dåligt tillslutna plattor. Lagra färdiga att använda plattorna vid 10 ° C.
-
System 2: Konfigurera kristallisering droppar (100 nL protein + 100 nL tillstånd) från ett prov i 20 LMB plattor
- Först, se till att systemets robotar är på nliter dispensern initieras med dess öppen programvara och den flytande hanterares metod manager är öppen. Slå på mikrorör-kylning flygbolaget ca 15 minuter innan huvudprogrammet kommer att startas.
- Placera en test platta på motordrivna SBS bärare av plattan sealer. Kör plattan sealer och verifierar att plattan försluts ordentligt. Testa den platta sealer tre gånger.
- Kör sedan den nliter dispensern för att ställa in 100-nL droppar av provlösningen i en test-plattan. Kolla under ett Mikroskop att dropparna är korrekt. Stäng nliter dispenser programvaran och ta bort remshållaren blocket från däck.
- Nästa, infoga i specialdesignade plåt hållaren (se Representativa resultat: kristallisering enheter utvecklas på LMB) LMB plattan med den högsta relativa mängden flyktiga reagenser i dess villkor (tabell 1). Ta bort den självhäftande filmen från plattan.
- Öppna panelen flytande handler och placera oförseglade plattan på däck, på baksidan av den första skjutbara transportören (glidande bärare kan dras ut för att underlätta åtkomst).
- Täck plåten med en SBS aluminium lock. Kvitta locket mot bakre vänstra hörnet av bäraren genom att tillämpa mild tryck till det motsatta hörnet av locket.
- Unseal, Fyll i de skjutbara bärarna och täcka de återstående 19 plattorna på samma sätt, arbeta från mest till minst volatila förhållanden. När mikrorör-kylning flygbolaget är vid 4 ° C, som indikeras av ett grönt ljus, ta bort omslaget.
- Skär av locket på ett mikrorör med (minst) 440 µL av protein prov (tabell 2). Se till att provet har ingen skum ovan menisken, eftersom detta kommer att störa upptäckande av flytande. Placera röret i Position 1 i mikrorör-kylning transportören.
- Placera en PCR-plattan på flytande handler däck framför plattan-flytta kortet transportören. Stäng sedan frontpanelen.
- Efter lastning däck, se till att nliter dispenser däck framgår av remshållaren blocket och att transportörerna på baksidan 50-µL tip stackarna är fri från aluminium SBS locken.
- I flytande handler ' metod ' administrationsgränssnittet, Välj 'Setup plåtar'. Övervaka initieringen av båda systemen och fyller i parametrarna för kör. Följ riktlinjerna i metoden administrationsgränssnittet (uppmaningarna, siffror och ett tip-ledningssystem som hjälper till med förberedelser).
- Dubbelkolla att alla nödvändiga komponenter är redo, och sedan starta processen.
- Övervaka systemet som nliter dispensern ställer in dropparna i den första plattan och plattan sealer förseglar därefter plattan.
- När alla 20 plattor har beretts med kristallisering droppar och automatiskt tillbaka till skjutbara bärarna, öppna frontpanelen och ta försiktigt bort plattorna. Kontrollera att plattorna förseglas korrekt innan du förvarar dem för kristallisering.
- Ren SBS locken med en 20% etanol lösning innan stapla dem på vänster sida av flytande hanteraren för lagring. Kassera PCR-plattan och mikroröret.
- Stäng av mikrorör-kylning transportören och torka bort kondensen. Lämna en pappershandduk ovanpå den kalla ytan att absorbera ytterligare kondens. Sedan ersätta transportören locket och Stäng frontpanelen.
2. optimering av villkor
-
Spruta-baserade flytande handler: producerar två linjära övertoningar av koncentrationer i reservoarerna kristallisering platta (4-hörn-metoden).
- Först, se till att flytande hanteraren är på och initierats med dess öppen programvara.
- På 'Lutning' fliken: öppna programmet krävs, Välj kristallisering platta typen och den avslutande volymen i behållarna (tabell 3). Den avancerade inställningen för 'max sköt vol' bör sänkas från 6000 till 3000 när du använder lösningar som innehåller [isopropanol] > 10% v/v och MPD] > 20% v / v.
- Förbereda sprutorna. Placera en kolv i varje spruta (spetsiga ändar ner) och sätt på baksidan av sprutor i utsedda spåren under chefen robot. Vrida en spruta medurs för att låsa det på plats (programmet startar endast med alla nödvändiga sprutorna korrekt ansluten).
- Förbereda Dalarna. Ta bort ramen rostfritt stål och infoga Dalarna. 4 positioner till vänster motsvarar 4 hörn A, B, C, D. Växla till 'Ställa upp' flik som visar volymerna av lösningar som krävs i varje spruta (på tabell 3, 0,5 mL dödvolym lades till de volymer som visas). Häll i hörnet lösningar i sina respektive rännor och placera ramen tillbaka på däcket (ramen håller i position med 2 små magneter som ligger på framsidan av däcket). Ett alternativt sätt att gå vidare med det här steget är att hälla lösningarna i Dalarna när de släpps redan på däck.
- Placera kristallisering plattan på motordrivna SBS bärare.
- Klicka 'ASPIRERA' och vänta för det här steget ska slutföras (när kolvarna stoppats på väg upp).
- Växla till fliken 'Springa' och kör programmet.
- Vid slutförandet av programmet, gå tillbaka till fliken Inst. och klicka på 'Ta bort': systemet utrensningar sprutorna från överblivna lösningar och sedan lyfter kolvarna hela vägen upp. 'Rensa' kan begäras i stället för 'Ta bort'; Detta lämnar kolvarna vid bottenläget, redo att aspirera mer lösningar med samma sprutorna.
- Ta bort sprutor genom att vrida dem moturs.
- Kassera sprutor och dalar i lämpliga bin (eller skölj dem med avjoniserat vatten och sedan 20% v/v etanol lösning för återanvändning).
- Försegla plattan och placera den på mikroplattan mixern för 3 min vid 1000 rpm eller 10 min när högviskösa lösningar blandas. Plattan är redo för att ställa in kristallisering vattendroppar på nliter dispensern.
-
Tillsatsen screening protokoll 1 (Konfigurera kristallisering droppar i en 96 brunnar kristallisering tallrik förfylld med additiv skärmen)
- Först förbereda villkoret med inledande koncentrationer av reagenser ökade med 10% (min. vol. 15 mL när du överför villkora från en behållare på additiv skärmen med flytande handler).
- Se till att flytande hundföraren är driftklar. Öppna programmet 'Lägg till skärm till tillsatser' för en enda skylt (ange volym i reservoarer: '72 µL'). Meddelanden, siffror och en tip-management system (12 x 1000 µL tips krävs) hjälp med att se roboten är redo att fungera enligt val.
- Hämta additiv skärmen från-20 ° C inkubatorn och bort dess aluminium förseglar omedelbart (Använd hållaren plattan), sedan placera plattan på däcket på den flytande hanteraren. Programmet fungerar enligt en stående layout (skylten är placerad med A1-hörnet ligger i den främre vänstern delen av transportören). Också placera också behållaren fylld med villkoret. Kör programmet.
- När behållarna i plattan har fyllts, placera den på mikroplattan shaker och köra programmet. Skölj behållaren på skick med avjoniserat vatten och 20% etanol för återanvändning.
- Ställa in droppar på nliter dispensern. Först unseal kristallisering plattan (Använd hållaren plattan). Och placera sedan plattan och proteinet 8-väl remsa i första positionen i remshållaren blocket. Fliken 'Setup' på kontrollerande programvara visar den faktiska placeringen av varje komponent på däck. Fyll varje brunn av remsan med protein prov enligt den droppe storlek som krävs (tabell 4). Kör programmet att förbereda droppar.
- Vid slutförandet av programmet, avlägsna plattan från däck och försegla den omedelbart (använda plattan sealer, 3-tums bred tejp). Kassera remsan i den lämpliga bin.
- Bedöma storleken, form och centrering av droppar under mikroskopet före lagring.
-
Tillsatsen screening protokoll 2 (Konfigurera kristallisering droppar i en 96 brunnar kristallisering tallrik med en re-usable additiv skärm)
- Först förbereda additiv skärmen: lämna motsvarande frysta 96 brunnar cell kultur plattan Tina i rumstemperatur i 40 min. Sedan Centrifugera additiv skärmen vid 1 000 x g i 2 min.
- Förbereda villkoret (min. vol. 15 mL när du överför villkora från en behållare på additiv skärmen med flytande handler).
- Fyll behållarna 96 brunnar kristallisering platta med villkoret. På vätska-hanteraren, fortsätt på samma sätt som protokoll 1, steg 2.2.2, men ange '80 µL' för volymen i reservoarer.
- Ställa in droppar på nliter dispensern med 3 komponenter på däck (plattan som innehåller tillsatsen skärmen, tillsammans med kristallisering plattan och 8-väl protein remsan i första positionen i remshållaren blocket, tabell 4).
- Försegla cell kultur plattan som innehåller skärmen med en aluminiumplåt och placera den tillbaka i-20 ° C inkubatorn.
- Bedöma storleken, form och centrering av droppar under mikroskopet före lagring.
Representative Results
1. system 1 och LMB plattor
Figur 1A visar systemet 1 baserat på en flytande hanterare med ett flytande-system (avjoniserat vatten). Vätska-systemet består av en behållare, en pump, slang, 8 sprutor utrustade med ventiler och 8 fasta tips. De flytande klassinställningar var optimerad för att aspirera/avstå från ett brett utbud av lösningar och multi-fördela i 4 tallrikar (multi-dosera kräver en relativt stora överskott av aspirerade volym). En 22 L vattenbehållare och en mindre behållare (5 L) med 20% v/v etanol lagras under systemet att mata vätska-systemet. Varje behållare är utrustad med två koppling skär. En Infoga (blåfärgad) feeds systemet med vätska, den andra (röd) är en flödet tillbaka till minska övertryck. Efter användning förhindrar spola med vatten och sedan 20% v/v etanol lösning mikrobiell tillväxt. Kylaggregat (som också finns under systemet) är ansluten till en specialbyggd tub-kylning bärare. System 1 är 2050 mm bred, inklusive karusell, 760 mm djupa och 88 mm hög. En ytterligare 550 mm krävs i fronten för den arbetsbord som håller styrenheten bläckstråleskrivare och vidhäftande plattan sealer. Ytterligare utrymme behövs också bredvid systemet för kontrollerande PC. Programmet att producera 72 förfylld plattor (dvs 18 omgångar i 4 tallrikar) tar 3 h och 50 min.
Figur 1B är en närbild på huvuddäck som är utrustad med 8 fasta tips (figur 1 c) monterad på en automatiserad pipettering arm, en andra arm med en gripper, en tip tvätt station, 2 x 4-position bärare för SBS plåtar och tube-kylning transportören. Huvudprogrammet bearbetar 4 tallrikar på en gång som tas automatiskt från karusellen och placeras på däck där de är fyllda med kristallisering villkor (80 µL i reservoarer, figur 1 d). Flytande nivåer identifieras automatiskt som tips är ledande. Medan den flytande handler doserar villkor i tallrikar, en annan uppsättning tomma tallrikar tas från karusellen, märkt och placeras på huvuddäck. En liten specialbyggda hållare och fönster i den bakre panelen på flytande hanteraren var tvungna att placera skrivhuvudet och dess sensor på baksidan huvuddäck. 8 tips är spolas och tvättas med vatten från den huvudsakliga behållaren efter varje tubens steg som består av 4 alikvoter i motsvarande kolumner i reservoarer. Efter 4 tallrikar har fyllts, är de automatiskt förseglade och sättas tillbaka i sin ursprungliga position i karusellen. Den platta sealer utlöses av en viss drivrutin (kallas av kontrollerande mjukvaran). Sealer använder en rulle av 3-tums bred tejp som tillämpas på en tallrik med rullar under mekaniskt tryck. Vid slutförandet av programmet, är förfylld plattorna bort manuellt från carousel stackarna och lagras i en inkubator för 10 ° C som ligger inom anläggningen.
Figur 1 : Fylla behållarna med inledande screening kits. (A) översikt av det helautomatiska systemet 1. Karusellen är en separat automatiserad enhet med plattan stackar och det är inrymt i en väl gjord av klar akryl blad till höger huvuddäck. (B), huvuddäck för den flytande handler i drift med (en) tube-kylning transportören (ansluten till en kylning enhet under, visas inte), (b), snabbt tvätta station (ansluten till dränering, visas inte), (c), pipettering armen fyller 8 reservoarer 96 brunnar kristallisering platta, (d) gripper armen att föra en fylld plattan på (e) motordrivna SBS bärare av plattan sealer. Baksidan av däck är (f), utskrift huvudet av bläckstråleskrivare ansluten till (g) bläckstråleskrivare styrenheten under sealer. (C), en märkt plattan (namn på skärmen) och datum för produktionen fylls med kristallisering villkor av 8 ledande fasta tips av polytetrafluoreten-coated rostfritt stål. (D) tvärsnitt av en förseglad kristallisering väl. Behållaren innehåller 80 µL av kristallisering tillstånd (medan övre är väl tom). Reservoaren och övre samt djup specifikationer är i millimeter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1 visar de olika formuleringarna för de kommersiellt tillgängliga screening kit i provrör. Dessa kit används för att fylla behållarna i 96 brunnar kristallisering plattor (LMB01-LMB22) regelbundet med system 1.
| Plattan namn | Kit namn | leverantör | katalognummer | rör | grundläggande Beskrivning | ||
| LMB01 | Kristall skärm 1 | Hampton-forskning | HR2-110 | 48 | Sparse Matrix (pH 4,6-8,5) | ||
| Kristall skärm 2 | Hampton-forskning | HR2-112 | 48 | Stokastiska provtagning (pH 4,6-9,0) | |||
| LMB02 | Guiden 1 | Rigaku | 1009530 | 48 | Stokastiska provtagning (pH 4,5-10,5) | ||
| Guiden 2 | Rigaku | 1009531 | 48 | Stokastiska provtagning (pH 4,5-10,5) | |||
| LMB03 | Grid skärmen ammoniumsulfat | Hampton-forskning | HR2-211 | 24 | Grid-skärmen [AmS] = 0,8-3.2 M och buffertar pH 4.0-9,0 | ||
| Grid skärmen PEG/LiCl | Hampton-forskning | HR2-217 | 24 | Grid-skärmen [PEG 6000] = 0-30 %w/v, konc LiCl = 1,0 M och buffertar pH 4.0-9,0 | |||
| Snabb skärm | Hampton-forskning | HR2-221 | 24 | Grid skärmen, [NaKPO4] = 0.8-1.8 M vid pH 5,0-8,2 | |||
| Grid skärmen natriumklorid | Hampton-forskning | HR2-219 | 24 | Grid-skärmen [NaCl] = 1,0-4,0 M och buffertar pH 4.0-9,0 | |||
| LMB04 | Grid skärmen PEG 6000 | Hampton-forskning | HR2-213 | 24 | Grid-skärmen [PEG 6000] = 5-30 %w/v och buffertar pH 4.0-9,0 | ||
| Grid skärmen MPD | Hampton-forskning | HR2-215 | 24 | Grid skärmen MPD] = 10-65 %w/v och buffertar pH 4.0-9,0 | |||
| MemFac | Hampton-forskning | HR2-114 | 48 | Sparse Matrix för membranproteiner (pH 4,6-8,5) | |||
| LMB05 | PEG-Ion | Hampton-forskning | HR2-126 | 48 | Grid-skärmen [PEG 3350] = 20 %w/v och olika salter på 0,2 M (ingen buffertar) | ||
| Natrix | Hampton-forskning | HR2-116 | 48 | Ofullständig fakulteten (pH 5,6-8,5) | |||
| LMB06 | Kristall skärm Lite | Hampton-forskning | HR2-128 | 48 | Crystal skärm 1 med hälften av de ursprungliga fällningsmedel koncentrationerna | ||
| Anpassade Lite skärm | Molekylära dimensioner | ej tillämpligt | 48 | Ytterligare villkor med låga fällningsmedel koncentrationer | |||
| LMB07 | Guiden Cryo 1 | Rigaku | 1009536 | 48 | Stokastiska provtagning med villkor cryoprotected med låga MW pinnar (pH 4,5-9,4) | ||
| Guiden Cryo 2 | Rigaku | 1009537 | 48 | Stokastiska provtagning med villkor cryoprotected med låga MW pinnar (pH 4,5-10,1) | |||
| LMB08 | JBS1 | JenaBioScience | CS - 101L | 24 | Ofullständig fakulteten baserat på olika pinnar (pH 4,6-9,0) | ||
| JBS2 | JenaBioScience | CS - 102L | 24 | Ofullständig fakulteten baserat på PEG 4000 (pH 4,6-8,5) | |||
| JBS3 | JenaBioScience | CS - 103L | 24 | Ofullständig fakulteten baserat på PEG 4000 (pH 4,6-8,5) | |||
| JBS4 | JenaBioScience | CS - 104L | 24 | Ofullständig fakulteten baserat på medellång MW pinnar (pH 6.5-8.5) | |||
| LMB09 | JBS5 | JenaBioScience | CS - 105L | 24 | Ofullständig fakulteten baserat på tunga MW pinnar (pH 6,5-9,5) | ||
| JBS6 | JenaBioScience | CS - 106L | 24 | Ofullständig fakulteten baserat på AmS (pH 4,6-8,5) | |||
| JBS7 | JenaBioScience | CS - 107L | 24 | Ofullständig fakulteten baserat på MPD (pH 4,6-8,5) | |||
| JBS8 | JenaBioScience | CS - 108L | 24 | Ofullständig fakulteten baserat på MPD och etanol (pH 4,6-8,5) | |||
| LMB10 | JBS9 | JenaBioScience | CS - 109L | 24 | Ofullständig fakulteten baserat på gemensamma salter och 2-propanol (pH 4,6-8,5) | ||
| JBS10 | JenaBioScience | CS - 110L | 24 | Ofullständig fakulteten baserat på gemensamma salter (pH 4,6-8,5) | |||
| Tydlig strategi skärm 1 pH 4,5 | Molekylära dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Grid skärm med olika pinnar | |||
| Tydlig strategi skärm 1 pH 5,5 | Molekylära dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Grid skärm med olika pinnar | |||
| LMB11 | Tydlig strategi skärm 1 pH 6,5 | Molekylära dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Grid skärm med olika pinnar | ||
| Tydlig strategi skärm 1 pH 7,5 | Molekylära dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Grid skärm med olika pinnar | |||
| Tydlig strategi skärm 1 pH 8.5 | Molekylära dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Grid skärm med olika pinnar | |||
| Tydlig strategi skärm 2 pH 4,5 | Molekylära dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Grid skärm med olika pinnar | |||
| LMB12 | Tydlig strategi skärm 2 pH 5,5 | Molekylära dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Grid skärm med olika pinnar | ||
| Tydlig strategi skärm 2 pH 6,5 | Molekylära dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Grid skärm med olika pinnar | |||
| Tydlig strategi skärm 2 pH 7,5 | Molekylära dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Grid skärm med olika pinnar | |||
| Tydlig strategi skärm 2 pH 8.5 | Molekylära dimensioner | MD1-16LMB | 24 | Grid skärm med olika pinnar | |||
| LMB13 | Index | Hampton-forskning | HR2-144 | 96 | Liten gles matris och rutnät skärmar (pH 3,0-9,0) | ||
| LMB14 | SaltRX 1 | Hampton-forskning | HR2-107 | 48 | Grid skärm inklusive 22 unika salter kontra salthalt och pH (4.1-9,0) | ||
| SaltRX 2 | Hampton-forskning | HR2-109 | 48 | Grid skärm inklusive 22 unika salter kontra salthalt och pH (4.1-9,0) | |||
| LMB15 | MemStart | Molekylära dimensioner | MD1-21 | 48 | Gles matris för membranproteiner (pH 4.0-10,0) | ||
| MemSys | Molekylära dimensioner | MD1-25 | 48 | Grid skärm för membranproteiner (mestadels pinnar, pH 3,5-9,5) | |||
| LMB16 | JCSG + | QIAGEN | 130720 | 96 | Sparse Matrix (pH 4.0-10,0) | ||
| LMB17 | MORPHEUS skärmen | Molekylära dimensioner | MD1-46 | 96 | Grid skärm inklusive blandningar av tillsatser och cryoprotected villkor (pH 6.5-8.5) | ||
| LMB18 | PI minimal skärm | JenaBioScience | CS-127 | 96 | Ofullständig fakulteten (pH 4.0-9,5) | ||
| LMB19 | PI-PEG skärmen | JenaBioScience | CS-128 | 96 | Ofullständig fakulteten för membranproteiner (pH 4,8-8,8) | ||
| LMB20 | MORPHEUS II skärmen | Molekylära dimensioner | MD1-91 | 96 | Grid skärm inklusive blandningar av tillsatser (tunga atomer) och cryoprotected villkor (pH 6.5-8.5) | ||
| LMB21 | LMB kristallisering skärmen | Molekylära dimensioner | MD1-98 | 96 | Sparse matrix inklusive villkor som valts från LMB publikationer | ||
| LMB22 | MORPHEUS III skärmen | Molekylära dimensioner | ej tillämpligt | 96 | Grid skärm inklusive blandningar av tillsatser (läkemedelssubstanser) och cryoprotected villkor (pH 6.5-8.5) | ||
Tabell 1: formuleringar av kit hittade i LMB plattor. Varje kommersiell screening kit består av 24/48/96 villkor inledningsvis i provrör. LMB plattorna lagerhålles i 10 ° C inkubatorer ligger inom anläggningen där de är tillgängliga för användare när som helst.
2. system 2 och krav för att ställa in droppar
Figur 2A visar systemet 2 baserat på en flytande handler19 med positiv förskjutning och disponibel tips. De disponibla tips levereras i stapelbara rack lämplig för automatiserad hantering. En 3-läges däck nliter dispenser20 integrerades på höger sida av systemet. Aspirera/fördela på nliter fördelaren driver även med positiv förskjutning använder disponibla microsyringes (medföljer i stora spolar). Som en fristående robot används en avtagbar strip-innehavaren block att ladda protein provexemplaren. För helt automatiserad processen ersätter en plattan med 384 brunnar i PCR-strip-innehavaren. En liknande fästplatta sealer att system 1 integrerades på vänster sida. De sealer och nliter dispenser stå på specialbyggda, upphöjda arbetsbord för den huvudsakliga gripper att nå plattan bärarna av dessa två integrerade robotar (ett fönster hade skäras i båda sidopanelerna av flytande hanteraren för gripdon för åtkomst utanför huvuddäck). Huvudprogrammet kräver särskilda drivrutiner för att utlösa nliter tubens program och sealer i sinom tid. Systemets 2 är 2 850 mm bred, djup 800 mm och 800 mm hög. Ytterligare utrymme behövs bredvid roboten för visning av kontrollerande PC. Två soptunnor är placerat under systemet för tips och microsyringes kasseras under processen (kontrollerande PC lagras också under). Ett viktigt kännetecken av systemet 2 är den övergripande layouten, som behåller enkel tillgång till de tre robotarna så att de kan användas individuellt för protokollen optimering som beskrivs ovan, eller andra protokoll som beskrivs på andra ställen såsom kristallisering screening22av membranproteiner lipidic mesophases21 och slumpmässiga microseed matris.
Figur 2B är en närbild av däcket som är utrustad med en enda robotarm. Armen integrerar 12 oberoende pipettering sonder och huvudsakliga griparen. Positionerna för sonderna kan styras individuellt i en riktning för att komma åt olika platser längs axeln mellan sonder eller ens enda rör. Sonderna kan plocka upp antingen disponibla tips (1-12) eller ett par av plattan-flyttningen adaptrar. Två uppsättningar av 4 staplar som innehåller 50 µL disponibla tips läses inledningsvis. Flytande nivåer identifieras automatiskt som tips är ledande. Tallrik-flytta adaptrar är utformade med 2 skarpa stift på insidan som bildar en valfri gripper när det behövs. På huvuddäck är ligger en 24 lägen mikrorör kylning bärare för provet, även om endast 1-2 befattningar används här. Dessutom finns det en bärare för PCR-plattan och även 2 lagring bärare för stapelbara, specialbyggda SBS lock (figur 2 c). Slutligen finns det 4 glidande bärare, vardera med 5 platser för kristallisering plattor (4 x 5 = 20 plattor).
Figur 2 : Ställer in droppar för ånga diffusion experiment. (A) Översikt över helautomatiserade systemet 2. (B), huvuddäck för den flytande handler i drift med (en) lagring transportörer för högar av SBS lock, (b) den stapelbara tips, (c) kylning-transportören med ett prov i mikrorör, (d) Flygbolaget för 2 plattan rör sig adaptrar, (e), PCR-plattan för att överföra protein till nliter hantering roboten, (f), 9 förseglade plattor som har släppts tillbaka i sina ursprungliga positioner, (g) valfria griparen ta bort SBS locket på den 10: e skylt om transporteras på däck av den flytande handler, (h), de nästa 10 plattor vara beredd med SBS lock ovanpå, (jag) huvudsakliga gripdon som används för att transportera PCR och kristallisering plattorna, (j) huvudsakligen automatisk arm att integrera 12 pipettering sonder (2 som används för att fungera som tillval gripper) och huvudsakliga gripdon och (k) däck av nliter dispensern. (C) interna anpassade SBS lock gjort av aluminium. Locken integrera en gummiduk för att undvika avdunstning av villkor och två små hål vara noggrant plockas upp av valfria griparen. (D) tvärsnitt av en förseglad kristallisering väl där behållaren är fylld med ett tillstånd och övre-brunnen innehåller en droplet består från både protein provet och skick. Eftersom fällningsmedel i droplet-programmet är mindre koncentrerad än i skick, vatten koncentrationerna av alla komponenter i rullgardinsmenyn stiga genom förlust under processen för Jämviktstiden genom vapor diffusion (mycket schematiskt representeras av en pil). (E) ljus micrographs 100 nL och (F), 200 nL droppar produceras av nliter behållaren med en provlösning (20% v/v polyetylenglykol 400, 0,001% w/v Safranin som rött färgämne). Storleken och formen av dropparna kan variera enligt chemicophysical egenskaperna för villkoret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Huvudprogrammet startar med valfria griparen bort SBS locket från den första kristallisering plattan. Efter att locket överfördes till motsvarande lagring transportören, transporteras kristallisering plattan till däcket på nliter dispensern. Pipettering armen överför sedan mängden prov krävs för att starta droppar från det normalt kylda mikroröret till den första kolumnen av PCR-plattan. Därefter viktigaste griparen flyttar PCR-plattan på däck av nliter dispensern som kommer att förbereda droppar efter de alternativ som valts av användaren i början (t.ex. droppstorlek). För detta protein provet dispenserats först i övre-brunnar (med en enda uppsättning av 8 microsyringes och multi-dispensering), då villkoren kristallisering är förpackat på protein droppar (varje rad kräver nu 8 nya microsyringes att undvika korskontaminering). Vid slutförandet av programmet för att ställa in droppar, huvudsakliga griparen transporterar motsvarande plattan till plattan sealer, sedan placerar PCR-plattan tillbaka i sitt ursprungliga läge (mer protein kommer ut i nästa kolumn av PCR-plattan för följande plattan ). Slutligen, förseglade kristallisering plattan flyttas tillbaka till sin ursprungliga position på däck: Vapor diffusion experiment har redan börjat i denna platta (figur 2D). Denna cykel upprepas enligt antalet plattor. När det behövs, tar bort valfria griparen en tom tip rack så att pipettering armen åt fler tips. Programmet tar 2 tim och 20 min och 440 µL prov att förbereda enda droppar i 20 plattor med 100 nL prov + 100 nL skick (figur 2E och 2F).
När du använder den nliter dispensern som fristående robot för två ytterligare skyltar (se protokoll, steg 1.2.3), hela den uppsättning av initial screening värmeväxlarplattor i 10 ° C inkubatorn kan ställas in (22 LMB plattor x 96 villkor = 2 112 villkor).
Tabell 2 visar kraven för huvudprogrammet enligt användarval i systemet 2.
| Tallrikar | Droppe storlek (nL) | Provexemplaren | Tips krav | Varaktighet | |||
| Antal | Typ | Vol. 1 (µL) | Vol. 2 (µL) | 50 µL tips | Microsyringes | ||
| 10 | 96 brunnar | 100 | 240 | 0 | 80 | 1040 | 1 h 12 min |
| 20 | 96 brunnar | 100 | 440 | 0 | 160 | 2080 | 2 h 20 min |
| 10 | 96 brunnar | 100 | 240 | 240 | 160 | 2080 | 1 h 45 min |
| 20 | 96 brunnar | 100 | 440 | 440 | 320 | 4160 | 3 h 05 min |
| 10 | 48-väl | 1000 | 624 | 0 | 80 | 560 | 1 h 10 min |
| 20 | 48-väl | 1000 | 1208 | 0 | 160 | 1120 | 2 h 16 min |
Tabell 2: exempel på huvudprogrammet optionerna tillgänglig på systemet 2 för att ställa in kristallisering droppar. Den nödvändiga mängden protein prov, tips och microsyringes varierar beroende på programmet. Volymerna av prov ' vol. 1' (1 droppe) och ' vol. 2' (drop 2) beräknas som följer: (8 tips x krävs volym per brunn av PCR-plattan + 4 µL förlorade volym) x antal kristallisering plattor + 40 µL död volym i mikrorör. Volymen som krävs per brunn av PCR-plattan för 100 nL droppar i 96 brunnar kristallisering plattan är 2 µL medan 6,8 µL krävs för 1.000 nL droppar i en 48-well platta (död volym i brunnar av PCR-plattan: 0.8 µL). En ytterligare volym av provet tas i beaktande ('förlorad volym') på grund av avdunstning från mikroröret och andra förluster (t.ex. prov klibba på tips). Till exempel för 20 MRC plattor, 100 nL, 1 droppe protokoll, provmängden krävs är: (8 x 2 + 4) x 20 + 40 = 440 µL (dvs, motsvarande 22 µL per platta). För varje platta och varje prov krävs åtta disponibla 50 µL tips. Till exempel, för 10 tallrikar, 2-drop-protokollet, antalet tips krävs är 8 x 10 x 2 = 160 tips. Antalet microsyringes beräknas som följer: (8 + antal villkor per platta) x antal prover x antal plattor. För 10 x 48 brunnar, är antalet flytande handler tips krävs exempelvis: (8 + 48) x 1 x 10 = 560 tips.
3. utformningen, förberedandet och hantering av lösningarna som 4-hörn
Båda formuleringarna av de 4 hörn lösningarna ('A, B, C och D') och motsvarande optimering skärmen (figur 3A) genereras automatiskt av ett Excel-kalkylblad. Det finns olika kalkylblad för olika antal villkor — i huvudsak 24, 48 och 96 villkor — och även kalkylblad att förbereda två olika optimering skärmar i en enda skylt. Vanligtvis förbereder en uppsättning 4 x 10 mL hörnet lösningar i provrör från som 2 – 3 optimering skärmar kan förberedas, beroende på antalet och volymen av villkoren. Lösningarna är hälls i tråg som de aspirerade genom en spruta-baserade flytande hanterare och senare dispenseras direkt i plattor (figur 3B). De två linjära Övertoningarna koncentrationer resultera från blandning A, B, C och D på systematiskt olika nyckeltal (figur 3 c).
Figur 3: 4-hörn metoden för att förbereda optimering skärmar. (A) framställning av de två lutningarna av koncentrationer över layouten plattan med 96 brunnar. (B) spruta-baserade flytande hanteraren redo att förbereda en skärm med 4 sprutor infogas i huvudet av roboten. En kristallisering plattan sitter i den motorized SBS-hållaren och 4 Starta lösningar (A, B, C och D) har redan varit dispenseras i deras respektive dalar (lösningarna har varit rött endast i demonstrationssyfte). (C) förhållanden för lösningarna A, B, C och D över 96 reservoarer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 3 visar krav för program som är tillgängliga för användare på spruta-baserade vätska-hanteraren.
| Plåt typ | Lol villkor | Vol. i plattan (reservoarer, µL) | Vol. i tråg (mL) | Varaktighet |
| 96 brunnar | 48 | 80 | 1.6 | 2 min 5 SEK |
| 96 brunnar | 96 | 80 | 2.5 | 3 min 50 SEK |
| 96 brunnar | 2 x 48 | 80 | 1.6 | 2 min 50 SEK |
| 48-väl | 24 | 200 | 1.8 | 2 min 25 SEK |
| 48-väl | 48 | 200 | 3 | 4 min 20 SEK |
Tabell 3: program på spruta-baserade flytande hanteraren för att förbereda optimering skärmar enligt metoden 4-hörn. Plattan med 96 brunnar kan användas för att förbereda 96 - eller 48-skick optimering skärmen (när två 48-skick skärmar är förberedda samtidigt roboten skall vara utrustade med 8 sprutor och 8 dalar). Andra program kan användningen av 48 brunnar. De börsnoterade volymerna i tråg inkluderar den obligatoriska dödvolym (0,5 mL).
4. tillsats screening
Figur 4 visar hur du utför en additiv screening börjar antingen med 96 tilläggslösningar redan i behållarna av kristallisering plattan (protokoll 1) eller i brunnarna i en låg profil cell kultur plattan används som en re-usable additiv skärmen ( protokoll 2). Tabell 4 listar program som är tillgängliga på den nliter dispensern enligt de två typerna av protokoll.
Figur 4: två typer av protokoll för additiv screening. 96-tillsatsen skärmarna lagras vid-20 ° C. Följande protokoll 1, additiv skärmen läggs inledningsvis till behållarna i kristallisering plattorna (och idealiskt lager detta sätt). En flytande hanterare eller multipipette används för att fördela villkoret i behållarna som innehåller tilläggslösningar (additiv skärmen utgör 10% av den slutliga volymen i reservoarer: 8 µL för 80 µL slutlig volym). Efter blandning förhållandena på en mikroplattan mixer (visas inte), används mikrosprutan-baserade nliter dispensern för att ställa in droppar (tabell 4). Följande protokoll 2, additiv skärmen läggs först senare när du konfigurerar kristallisering droppar. Denna tid nliter dispensern är anställd att förbereda droppar med en extra komponent på sina däck (den re-usable cell kultur plattan som innehåller tillsatsen skärmen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Protokollet | Droppe storlek (nL) | Strip typ | Prov vol. (µL) | Lol av microsyringes | Varaktighet | ||||
| Typ | Källa av tillsatser | Protein | Villkor | Tillsats | I varje brunn för (strip) | Totalt | |||
| 1 | 96-väl kristallisering plattan | 100 | 100 | 0 | 2 ΜL | 2 | 16 | 104 | 2 min |
| 1 | 96-väl kristallisering plattan | 200 | 200 | 0 | 5 ΜL | 3.8 | 31 | 104 | 2min 10 SEK |
| 2 | 96-väl cell kultur plattan | 200 | 200 | 100 | 5 ΜL | 3.8 | 31 | 200 | 3min 45 SEK |
| 2 | 96-väl cell kultur plattan | 500 | 500 | 100 | 5 ΜL | 7,4 | 60 | 200 | 4min 15 SEK |
Tabell 4: program på den mikrosprutan-baserade nliter dispensern för additiv screening. Volymen som krävs av provet i varje brunn 8-väl Strip beräknas enligt följande: död volym + 12 x släppa storlek. Det finns 2 typer av remsor (2 µL och 5 µL). De döda volymerna är 0.8 µL för 2 µL brunnarna (som kan faktiskt innehålla 3,2 µL max.) och 1.4 µL för 5 µL brunnarna (max 7,5 µL.). Den totala mängden protein som behövs är: 8 x volym i väl av remsan (runda upp värde). Döda är de V-formade brunnarna i 96 brunnar cell kultur plattan 2,5 µL. Antalet microsyringes varierar beroende på det valda programmet (8 + 96 = 104; eller 8 + 2 x 96 = 200).
På grund av utspädning av villkoret med tillsatsen under protokoll 1 måste villkoret förberedas på ett proportionellt högre koncentration än från början. Ökningen av slutliga koncentrationer uppnås lättast genom att minska den slutliga tillsatsen av vatten till den beräknade slutliga volymen. Efter detta, helt enkelt intäkter med den vanliga uppsättningen upp av droppar som blandar kondition och prov (t.ex., 100 nL protein + 100 nL skick redan blandat med tillsatser). Protokoll 2 (t.ex., 200 nL protein + 200 nL skick + 100 nL tillsats) underlättar screening vid olika koncentrationer av tillsatser genom att helt enkelt variera volymen av additiv skärmen lagt till. Protokoll 2 innebär mer eller mindre utspädning av droppar (som kan förändra kristallisering).
Den flytande hanteraren från system 2 kan användas för att aspirera tillräckligt villkora i 12 tips och fördela 8 portioner i behållarna i en plattan med 96 brunnar (se protokoll, steg 2.2.2), även om detta steg kan naturligtvis göras manuellt med en flerkanalspipett ( Figur 4). Flera plåtar kan fyllas åt gången med samma skick när med flytande hanterare (för att testa olika additiv skärmar senare). När du förbereder 2 plattor, Fyll reagensmedelsbehållaren med minst 23 mL. När du förbereder 3 plattor, Fyll reagensmedelsbehållaren med minst 31 mL.
5. kristallisering tallrikar och kopplade enheter
Utformningen av båda MRC sittande-drop vapor diffusion kristallisering plattorna (96 brunnar 2-släpp och 48-väl 1-släpp, figur 5A och figur 5B) ger egenskaper som möjliggör tillförlitlig och effektiv automatiserad kristallisering experiment, med särskilt den sfärisk formen av övre-brunnar och en svag V-form av behållarna som underlättar noggrann dosering och även centrifugering när centrering av droppar krävs. Övre-brunnarna har dessutom en lins effekt för optimal belysning under ett stereomikroskop (polymeren är UV transmissibel för detektion av UV-absorberande eller fluorescerande kristaller23).
En anpassad seal (figur 5 c) gör inställningen upp hängande droppe kristallisering experiment inom båda typer av plattor med hjälp av en nliter dispenser (protokoll inte visas). Slutligen, båda MRC plattor har samma yttre mått och rim. Fälgen passar in i spåren av vår specialbyggda plattan innehavaren (figur 5 d), som används för att manuellt placerar/tar bort förseglingstejpen utan utspillda vätskor.
Figur 5: The MRC kristallisering tallrikar och kopplade enheter utvecklas på LMB. (A) A1-hörnet av plattan med 96 brunnar. Reservoaren (avlånga) ligger på vänster sida av kristallisering brunnen, två sfäriska övre-brunnarna till höger. Måtten är i millimeter. (B) A1-hörnet av 48-väl plattan. Behållaren är på höger sida av brunnen (1 stor övre-ja bara). (C), MRC hängande droppe sigill. (D), hotellets egna plattan hållare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
6. proteinkristaller
Figur 6 visar exempel på användbar kristaller erhålls med vår automatiserade protokoll.
Figur 6: ljus micrographs av droppar som innehåller kristaller erhålls efter de automatisera protokoll. (A, B) Kristaller från startskärm OmpF och MreB i plåtar beredd med 2 fullt automatiserade system (se protokollet avsnitten 1.1 och 1.2, villkor: LMB07 väl A4 och LMB20 väl D12, respektive, storleken på dropparna är 100 nL protein + 100 nL skick, arbete av Andrzej Szewczak, LMB)24. (C, D) Bar domän kristaller före och efter optimering av första villkor med metoden 4-hörn (steg 2.1, LMB02 B6, 1,000 nL + 1.000 nL, opublicerade verk av Leonardo Almeida-Souza, LMB). (E, F) Tung kedja av mänskliga dynein 1 N-terminal domän kristaller före och efter optimering av de ursprungliga villkoren med metoden 4-hörn (LMB20 E6, 200 nL + 200 nL, sedan 500 nL + 500 nL, opublicerade verk av Edgar Morales-Ríos, LMB). (G, H) Kompletterar faktor D kristaller före och efter optimering av villkoret med additiv screening (steg 2.2, ursprungliga skick från hotellets egen skärm, 200 nL + 200 nL, additiv D6 på skärmen 96-skick additiv opublicerade verk av Matthias Bauer, LMB). (Jag, J) Virala kuvert glykoprotein25 kristaller före och efter optimering av villkoret med additiv screening (steg 2.3, LMB20 A2, 150 nL + 150 nL, sedan 200 nL + 200nL + 100 nL tillsatsen E5 från 96-skick additiv skärmen, opublicerade verk av Petter Modis, Cambridges universitet, Storbritannien). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
1 - förberedelse och användning av inledande skärmar lagras i plattor
Screening kit ska blandas före som distribueras i plattor eftersom ljus nederbörd eller fas separation uppstår i vissa rör under lagring. När en skärm består av två Kit (2 x 48 rör), placeras det första röret av andra satsen i läge E1 av kyla transportören. När en skärm består av 4 Kit (4 x 24 rör), det första röret av andra satsen placeras i läge C1, det första röret av tredje satsen placeras i läge E1 och det första röret av fjärde satsen placeras i läge G1. Medan du för in rören i deras kyla bäraren, placeras lock på en bricka efter standard 96 brunnar liggande layout. Eftersom väl nummer anges ovanpå locken av tillverkarna, möjliggör detta dubbelkontroller om alla rör har placerats i rätt ordning. Detta bidrar också till att ersätta rätta locken på rören när du fyller ett minskat antal plattor.
Vi lagrar förfylld plattorna vid 10 ° C, en kompromiss för att undvika frysning och lagring vid 4 ° C som kan orsaka försämring av villkor och problem med tätning. Plattorna är lagrade för upp till flera månader med normalt ingen märkbar kondens på insidan av tätningen. Detta är mindre sant för LMB05, LMB06, LMB09 och LMB10 plåtar eftersom dessa villkor med relativt höga koncentrationer av flyktiga reagenser (tabell 1). Liten mängd kondens på insidan av tätningen minskar tätning effektivitet och kan orsaka korskontamination mellan brunnarna samtidigt öppna plattorna. För att hjälpa till med att förhindra kondens under inledande nedkylning, överföras plåtar först från karusellen i en isolerad picknick svalare som lagras i ett kallt rum 4 ° C över natten. Mycket långsam kylning minimerar utvecklingen av temperaturskillnader inom de slutna brunnarna och därmed minskar kondens övergripande15. Dessutom när plattorna lagras i 10 ° C inkubator, placeras en egen anpassad SBS polystyren locket på plattan längst upp i varje stack (visas inte).
Våra förfylld tallrikar hela uppsättningen kan användas som en stor inledande skärm mot en roman, vattenlösliga, protein provet. Alternativt kan färre plattor väljas för att matcha särskilda krav. Till exempel LMB15 och LMB19 är skärmar som särskilt utformats för membran protein prover26,27, eller LMB20 är en skärm som formulerat med tung-atomer att underlätta experimentella utfasningen av diffraktion data28 (se även : Formulering MORPHEUS protein kristallisering skärmar).
2. ställa in kristallisering droppar
När du använder systemet 2, bör screening kit med betydande mängder flyktiga reagenser behandlas först. Detta undviker kondens bildas på gummit av SBS locken, som skulle kunna påverka locket hantering och plattan tätning. En SBS locket har lite av clearance när högst upp på en tallrik, vilket är varför de behöver anpassas initialt (se protokoll, steg 1.2.6). De protein döda volymerna i brunnarna av PCR-plattan är relativt generösa (0.8 µL, se legenden om tabell 2). Observera att lika generösa döda volymer är anställda när du använder nliter dispensern individuellt med protein i 8-väl remsor (tabell 4). Mindre döda volymer kan fungera, men vissa prover följa tipsen, kalibrering av en robot kan bli något missvisande, rummet kan vara varmare än vanligt, etc. Alla leda till provet förluster omfattas av de generösa döda volymerna för att konsolidera metoden.
Senaste utvecklingen aktiverat ytterligare miniatyrisering av experiment och därmed provmängden krävs för screening kristallisering villkor kan minskas betydligt genom att integrera de motsvarande teknik29,30 . Vissa aspekter av ytterligare miniatyrisering måste emellertid noggrant övervägande, såsom avdunstning av droppar31 och manipulering av mikrokristaller32.
Centrifugering av plattan (2 000 rpm, 1 min) kunde slutligen integreras som en rutinmässig sista steg när du konfigurerar kristallisering droppar (i sfäriska övre-brunnar). En mer enhetlig storlek och form av droppar som följd av centrifugering kan minska reproducerbarhet frågor33,34. Visst, centrerad droppar lättar senare bedömning av experiment med Mikroskop som krävs brännvidden blir liknande över hela plattan.
3. fördelarna med metoden 4-hörn
Den viktigaste fördelen med metoden 4-hörn är dess enkelhet, vilket minimerar fel och underlättar enkel automatiserad protokoll. Exempelvis kommer de 4 hörn lösningarna alltid placeras på däck på en flytande hanterare följer samma layout. Dessutom är alla program baserade på fasta utväxlingar mellan lösningarna (figur 3 c).
Manuell beredning av 4 hörn lösningar föredras automatiserad hantering av lösningar vid höga koncentrationer som kan vara mycket trögflytande. Relativt snabb och noggrann aspiration/utlämning går då på de flesta typer av flytande hanterare med minimikrav för optimering av flytande klasser. Hörnet lösningar kan dock fortfarande för trögflytande för en robot med en vätska-system att fungera effektivt. Det är därför vi valt en flytande hanterare med positiv förskjutning (figur 3B).
Förutom de 2 linjära Övertoningarna koncentrationer, kan en tredje komponent (dvs, en uppsättning buffertar/tillsatser) provas vid en konstant koncentration på ett bekvämt sätt. För detta är en relativt stor volym av en grundläggande uppsättning hörnet lösningar på en passande högre koncentration, exklusive komponenten att varieras, beredd först. Sedan läggs lager lösningar inklusive denna komponent för att justera de slutliga koncentrationerna. Exempelvis är 50 mL av en uppsättning 4 hörn lösningar beredda på 10% högre koncentrationer än från början. Detta core set är sedan uppdelad i 5 mindre underdatauppsättningar 4. Slutligen läggs 10% av olika buffert-pH-lösningar till varje delmängd.
4. format och typer av additiv skärmar
Skärmarna är normalt lagras vid-20 ° C (figur 4) eftersom de inte används regelbundet och innehåller flyktiga/instabila föreningar. Användning av en fryst additiv skärm som lagras i ett djupt väl (1 mL i brunnar) måste planeras tidigt eftersom det tar 12-24 hr för alla additiv lösningar till Tina helt i rumstemperatur. Dessutom en mängd användare dela samma additiv skärm, vilket kan orsaka problem med förorening. Slutligen, höjden av djupt väl block gör dem olämpliga för de flesta nliter automater. Som en praktisk lösning att kringgå dessa frågor, ska skärmen överföras från djupt väl blocket till låg profil plattor (figur 4).
Additiv skärmar som omfattar ett brett utbud av enda reagens (med enstaka koncentrationer) har historiskt sett varit mycket populära35,36. Dock har andra typer av additiv skärmar utvecklats som integrerar blandningar av tillsatser37 eller ett minskat antal enda tillsatser finns i olika koncentrationer38. Slutligen, en kompletterande strategi är att undersöka effekten av tillsatser på proverna före kristallisering39,40.
5. ytterligare överväganden
God praxis: De flesta skärmar innehåller skadliga eller ens giftiga ämnen och därmed adekvat personskydd ska vara anställd under protokoll. Lika, rörliga delar av robotar kan leda till skador, särskilt när du försöker manuellt störa medan ett program körs (även om de flesta robotarna har nödstopp-knappen/system). På grund av de tekniska komplexitet inblandade, regelbunden kontroll av robotar, skärmar och program med tidigare kännetecknas prover är viktiga för ihållande hög reproducerbarhet.
Genomströmning: Som en fingervisning mellan 4000 till 8.000 LMB produceras plattor årligen med system 1 (och därefter anställd av användare för inledande screening). Det är inte anpassade till lager en stor mängd förfylld plattorna vid 10 ° C när den beräknade omsättningen är mycket lägre, som efter 4-5 månader, vissa villkor börjar försämras och avdunsta. Olika förhållningssätt till automation protokoll har genomförts för små - till medelstora laboratorier41.
Lagra och bedöma experiment: Efter beredning droppar, lagras pläterar på låg-vibration hyllor i ett rum på 4 eller 18 ° C med hårt kontrollerad temperatur (+/-0,5 ° C maximal avvikelse). Experiment är bedömd med kallt ljus källa Mikroskop. Olika automatiserade bildsystem är kommersiellt tillgängliga, men man bör noga överväga alla aspekter: den hastighet som krävs för att skanna en tallrik blir tillräckligt hög genomströmning? Kommer föremål än kristaller störa autofokus? Blir den resulterande kvaliteten på bilder tillräckligt att upptäcka mycket små kristaller (särskilt runt kanten av droppar)? 42 , 43 , 44
Jämförelse av kristallisering villkor: Efter noggranna utredningar om naturen från början-erhållande kristaller, kan man analysera trender och likheter över förhållanden med hjälp av LMB skärmen databas eller C6 Webbverktyg45.
Disclosures
Vi intygar härmed ett motstridiga kommersiella intresse eftersom LifeArc kommersialiserar följande: 96 - och 48-brunnen MRC plattor, MRC hängande droppe tätningen, MORPHEUS, Pi, ÅNGSTRÖM och LMB kristallisering skärmarna.
Acknowledgments
MRC-LMB kristallisering anläggningen är vänligt stöds av medicinsk forskning rådet (Storbritannien). Vi tackar medlemmar i LMB för deras stöd: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den Ent och Pat Edwards (strukturella studier), Steve Scotcher och de andra medlemmarna i den mekaniska verkstaden, Neil Grant och Jo Westmoreland (visuella hjälpmedel), Paul Hart och Tom Pratt (IT). Vi vill också tacka Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart och Heather Ringrose (Hamilton Robotics, Storbritannien), Paul Thaw, Robert Lewis och Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Schweiz), George Stephens och Donald Ogg (Alphabiotech, UK), Neil Williams (Markem-Imaje, UK) och Graham Harris (The Cleveland Agency) för teknisk hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Robots | |||
| Freedom EVO® | Tecan | n/a | Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0. |
| Microlab® STAR™ | Hamilton | n/a | Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE™ technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface. |
| Mosquito® | TTP Labtech | n/a | Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422. |
| Dragonfly® | TTP Labtech | n/a | Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196. |
| Adhesive plate sealer | Brandel | n/a | Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot). |
| Inkjet printer 9232 | Markem-Imaje | n/a | Integrated to System 1. Touchscreen interface. |
| Crystallization screens | |||
| Crystal Screen™ 1 | Hampton Research | HR2-110 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01 |
| Crystal Screen 2™ | Hampton Research | HR2-112 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01 |
| Wizard™ Classic 1 | Rigaku | 1009530 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02 |
| Wizard™ Classic 2 | Rigaku | 1009531 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02 |
| Grid Screen™ Ammonium Sulfate | Hampton Research | HR2-211 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ PEG/LiCl | Hampton Research | HR2-217 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Quick Screen™ | Hampton Research | HR2-221 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ Sodium Chloride | Hampton Research | HR2-219 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ PEG 6000 | Hampton Research | HR2-213 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| Grid Screen™ MPD | Hampton Research | HR2-215 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| MemFac™ | Hampton Research | HR2-114 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| PEG/Ion™ | Hampton Research | HR2-126 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05 |
| Natrix™ | Hampton Research | HR2-116 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05 |
| Crystal Screen Lite™ | Hampton Research | HR2-128 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06 |
| Custom Lite screen | Molecular Dimensions Ltd | n/a | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06 |
| Wizard™ Cryo 1 | Rigaku | 1009536 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07 |
| Wizard™ Cryo 2 | Rigaku | 1009537 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07 |
| JBS1 | JenaBioScience | CS-101L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS2 | JenaBioScience | CS-102L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS3 | JenaBioScience | CS-103L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS4 | JenaBioScience | CS-104L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS5 | JenaBioScience | CS-105L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS6 | JenaBioScience | CS-106L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS7 | JenaBioScience | CS-107L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS8 | JenaBioScience | CS-108L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS9 | JenaBioScience | CS-109L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| JBS10 | JenaBioScience | CS-110L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 6.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 7.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 8.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Index™ | Hampton Research | HR2-144 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13 |
| SaltRX™ 1 | Hampton Research | HR2-107 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14 |
| SaltRX™ 2 | Hampton Research | HR2-109 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14 |
| MemStar™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-21 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15 |
| MemSys™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-25 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15 |
| JCSG-plus™ Suite | Qiagen | 130720 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16 |
| MORPHEUS® screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17 |
| Pi minimal screen | JenaBioScience | CS-127 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18 |
| Pi-PEG screen | JenaBioScience | CS-128 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19 |
| MORPHEUS® II screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-91 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20 |
| LMB crystallization screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-98 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21 |
| Additive screens | |||
| HT additive screen | Hampton Research | HR2-138 | Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well). |
| MORPHEUS® additive screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-93-500 | Frozen in 96-well deepwell block (500 µL per well). |
| ANGSTROM additive screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-100 | Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well). |
| MORPHEUS® additive screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-93 | Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped wells (100 µL per well). |
| ANGSTROM additive screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-100-FX | Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped well (100 µL per well). |
| HIPPOCRATES additive screen | Molecular Dimensions Ltd | n/a | 48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS® III). |
| Other consumables | |||
| 96-well MRC 2-drop plate | Swissci | MRC 96T-UVP | Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80 µL. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible. |
| 48-well MRC 1-drop plate ('MAXI plate') | Swissci | MMX01-UVP | Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200 µL. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 µL. UV transmissible. |
| MRC hanging drop seal | Swissci | n/a | Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible. |
| Adhesive sealing tape | Hampton Research | HR4-50 | 3-inch wide Duck® HD Clear™ for sealer and manual sealing. |
| Adhesive aluminium sheet | Beckman Coulter | 538619 | Used to reseal additive screens. |
| Ink cartridge | Markem-Imaje | 9651 | System 1 (inkjet printer). |
| Solvent cartridge | Markem-Imaje | 8652 | System 1 (inkjet printer). |
| 50 µL tips | Hamilton | 235947 | System 2 (STAR™ liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE™ tips in disposable stacks. |
| Reagent container | Hamilton | 194052 | Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols. |
| PCR plate | Thermo Scientific™ | AB-2150 | System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito®). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells. |
| microsyringes | TTP Labtech | 4150-03020 | Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito® nanoliter dispenser (9mm spacing). |
| strip-holder block | TTP Labtech | 3019-05013 | SSB device for the Mosquito® strips, aka '4-way Reagent Holder'. |
| 2 µL 8-well strip | TTP Labtech | 4150-03110 | Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 µL. |
| 5 µL 8-well strip | TTP Labtech | 4150-03100 | Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 µL. |
| 5 mL syringes | TTP Labtech | 4150-07100 | Syringe body and piston for the Dragonfly® liquid handler. Pack of 100. |
| Troughs/Reservoirs | TTP Labtech | 4150-07103 | Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly®. Pack of 50. |
| Orbital microplate shaker | CamLab Limited | n/a | Variomag® for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm). |
| Microplate mixer | TTP Labtech | 3121-01015 | MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins. |
References
- Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Principles, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
- McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
- Bergfors, T. M. Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
- Dessau, M. A., Modis, Y. Protein Crystallization for X-ray Crystallography. J. Vis. Exp. (47), e2285 (2011).
- Crick, F. H. C. X-Ray Diffraction of Protein Crystals. Methods Enzymol. 4, 127-146 (1957).
- Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281, 3995-4009 (2014).
- Chruszcz, M., Wlodawer, A., Minor, W. Determination of Protein Structures-A Series of Fortunate Events. Biophys. J. 95, 1-9 (2008).
- Manjasetty, B. A., Büssow, K., Panjikar, S., Turnbull, A. P. Current methods in structural proteomics and its applications in biological sciences. 3 Biotech. 2, 89-113 (2012).
- Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J. Biol. Chem. 254, 12219-12223 (1979).
- Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J. Appl. Cryst. 23, 409-411 (1991).
- Stevens, R. C. High-throughput protein crystallization. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 558-563 (2000).
- Berry, I. M., Dym, O., Esnouf, R. M., Harlos, K., Meged, R., Perrakis, A., Sussman, J. L., Walter, T. S., Wilson, J., Messerschmidt, A. SPINE high-throughput crystallization, crystal imaging and recognition techniques: current state, performance analysis, new technologies and future aspects. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1137-1149 (2006).
- Luft, J. R., Collins, R. J., Fehrman, N. A., Lauricella, A. M., Veatch, C. K., DeTitta, G. T. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. J. Struct. Biol. 142, 170-179 (2003).
- Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. S. Membrane protein structure determination-the next generation. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 78-87 (2014).
- Stock, D., Perisic, O., Löwe, J. Robotic nanoliter protein crystallisation at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Prog. Biophys. Mol. Biol. 88, 311-327 (2005).
- Gorrec, F. The current approach to initial crystallization screening of proteins is under-sampled. J. Appl. Cryst. 46, 795-797 (2013).
- Hennessy, D. N., Narayanan, B., Rosenberg, J. M. Automatic implementation of precise grid screens: the four-corners method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1001-1003 (2009).
- Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
- DiLorenzo, M. E., Timoney, C. F., Felder, R. A. Technological Advancements in Liquid Handling Robotics. JALA. 6, 36-40 (2001).
- Jenkins, J., Cook, M. Mosquito: An Accurate Nanoliter Dispensing Technology. JALA. 9, 257-261 (2004).
- Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. (67), e4000 (2012).
- Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (78), e50548 (2013).
- Dierks, K., Meyer, A., Oberthür, D., Rapp, G., Einspahr, H., Betzel, C. Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wavelengths longer than 300 nm. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 66, 478-484 (2010).
- Szewczak, A. Structural studies of the bacterial MreBCD complex. , University of Cambridge, UK. (2016).
- Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., Modis, Y. Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion. J. Virol. 83, 4338-4344 (2009).
- Gorrec, F., Palmer, C. M., Lebon, G., Warne, T. Pi sampling: a methodical and flexible approach to initial macromolecular crystallization screening. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67, 463-470 (2011).
- Parker, J. L., Newstead, S. Current trends in α-helical membrane protein crystallization: An update. Protein Sci. 21, 1358-1365 (2012).
- Gorrec, F. The MORPHEUS II protein crystallization screen. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 71, 831-837 (2015).
- Yin, X., et al. Hitting the target: fragment screening with acoustic in situ co-crystallization of proteins plus fragment libraries on pin-mounted data-collection micromeshes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 70, 1177-1189 (2014).
- Wu, P., Noland, C., Ultsch, M., Edwards, B., Harris, D., Mayer, R., Harris, S. F. Developments in the Implementation of Acoustic Droplet Ejection for Protein Crystallography. JALA. 21, 97-106 (2015).
- Zipper, L. E., et al. A simple technique to reduce evaporation of crystallization droplets by using plate lids with apertures for adding liquids. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 70, 1707-1713 (2014).
- Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. Microcrystal manipulation with laser tweezers. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1297-1302 (2013).
- Newman, J. Initial Evaluations of the Reproducibility of Vapor-Diffusion Crystallization. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 826-832 (2007).
- Reis, N. M., Chirgadze, D. Y., Blundell, T. L., Mackley, M. R. The effect of protein-precipitant interfaces and applied shear on the nucleation and growth of lysozyme crystal. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1127-1139 (2009).
- McPherson, A., Koszelak., S., Axelrod, H., Day, J., Robinson, L., McGrath, M., Williams, R., Cascio, D. The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins. J. Crystal Growth. 76 (3), 547-553 (1986).
- Sauter, C., Ng, J. D., Lorber, B., Keith, G., Brion, P., Hosseini, M. W., Lehn, J. -M., Giegé, R. Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids. J. Crystal Growth. 196, 365-376 (1999).
- McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules. J. Struct. Biol. 156, 387-406 (2006).
- Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov. Today. 21, 819-825 (2016).
- Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).
- Chari, A., et al. ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space. Nat. Methods. 12, 859-865 (2015).
- Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., Sussman, J. L., Stuart, D. I., Perrakis, A. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 1426-1431 (2005).
- Wilson, J. Automated Evaluation of Crystallisation Experiments. Cryst. Rev. 10, 73-84 (2004).
- Snell, E. H., et al. Establishing a training set through the visual analysis of crystallization trials. Part I: ∼150 000 images. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 1123-1130 (2008).
- Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
- Newman, J., Fazio, V., Lawson, B., Peat, T. The C6 Web Tool: A Resource for the Rational Selection of Crystallization Conditions. Cryst. Growth & Des. 13, 12219-12223 (2010).
