Summary
Protein mikro kristalleri kullanılarak X-ışını kristalografisi için bir protokol sunulmuştur. Saflaştırmadan sonra ya da selüloda in vivo büyümüş mikrokristalleri analiz eden iki örnek karşılaştırılmıştır.
Abstract
Birçok sinkrotron tesisindeki yüksek kaliteli mikro odaklı ışın çizgilerinin ortaya çıkması, bir meydan okumayı temsil etmek için kullanılan en büyük boyutunda 10 μm'den küçük kristallerin rutin analizine izin vermiştir. X-ışını kristalografisi ile protein mikrokristallerinin yapısı tespiti için in vivo olarak yetiştirilen kristaller üzerine odaklanılarak iki alternatif iş akışını sunuyoruz. Mikrokristaller sonikasyon ile hücrelerden ekstrakte edilir ve diferansiyel santrifüj ile saflaştırılır veya kristal içeren hücrelerin akış sitometrisi ile hücre tasnif edilmesinden sonra selülozda analiz edilir. İsteğe bağlı olarak, saflaştırılmış kristaller veya kristal içeren hücreler, deney aşamasında ağır atom çözeltilerine batırılır. Bu örnekler, mikrometre bir desteğe uygulama ve sıvı azotta flaş soğutması ile benzer şekilde difraksiyon deneyleri için hazırlanır. İzole edilmiş mikro kristallerin ve kristalin kırınım deneylerinin kısaca tanımlanması ve karşılaştırılmasıModel oluşturma ve iyileştirme için uygun veri kümeleri üretmek için bir mikrofocus sinkrotron beamline kullanan hücreler içerir.
Bu iş akışları, böcek hücrelerinin bir rekombinant bakülovirüs ile enfekte edilmesiyle üretilen Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polidrin kristalleriyle örneklendirilir. Bu vaka çalışmasında, selülo analizinde saflaştırılmış kristallerin analizinden daha verimlidir ve ekspresyondan arıtmaya kadar ~ 8 gün içinde bir yapı meydana getirir.
Introduction
Biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapılarının belirlenmesinde X-ışını kristalografisinin kullanımı, son yirmi yılda sürekli bir ilerleme kaydetti. Uzman olmayan araştırmacılar tarafından X-ışını kristalografisinin artan alımı, bu yaklaşımın birçok alanda 1 hayat bilimleri alanında demokratikleşmesini örneklendirmektedir 1 .
Tarihsel olarak, ~ 10 μm altında boyutlardaki kristaller, yapı tespiti için kullanışlı olmasa da, zorlayıcı olarak kabul edilmiştir. Dünyadaki senkrotron ışın kaynakları ve mikro kristalleri idare eden aletlerin geliştirilmesi gibi teknolojik gelişmeler sayesinde özel mikro odaklı kirişlerin artan miktarda bulunması, X-ışını mikro-kristalografisinin geniş kullanımını engelleyen bu engellerin çoğunu ortadan kaldırdı. Seri X-ışını mikrokristalografisinde gelişmeler 2 , 3 ve mikro elektron kırınımı 4 haYapı tayini için mikro ve nanokristallerin kullanımının sadece mümkün olmadığı değil aynı zamanda bazen büyük kristaller 5 , 6 , 7'nin kullanılmasına tercih edildiğini göstermiştir.
Bu ilerlemeler ilk olarak peptitler 8 ve böcek virüsleri 9 , 10 tarafından üretilen doğal kristaller üzerine uygulanmıştır. Bunlar artık membran proteinleri ve büyük kompleksler gibi en zorlu sistemleri içeren biyolojik makromoleküllerin çeşitliliği için kullanılmaktadır 11 . Bu mikro kristallerin analizini kolaylaştırmak için meso , özellikle de membran proteinleri 12 ve mikroakışkan yongalar 13 içinde analiz edilmiştir.
Bu yeni mikro-kristalografi yöntemlerinin varlığı ,In vitro kristalojeneze klasik bir alternatif sunan yapısal biyoloji 14 , 15 , 16 için yeni bir yol olarak in vivo kristalizasyon. Ne yazık ki, in vivo kristaller üretilse bile, hücrelerden arındırma sırasında ligandların bozulması veya kaybı, senkrotron beamline'daki kristallerin manipülasyonu ve görüntülenmesindeki zorluklar ve sıkıcı X-ışını kırınım deneyleri gibi birçok engel kalmaktadır. Alternatif bir kristaller, herhangi bir saflaştırma adımı olmadan doğrudan hücre içinde analiz edilmiştir 17 , 18 , 19 . Karşılaştırmalı bir analizi cellulo yaklaşımlarında, saflaştırılmış kristallerin ve daha yüksek çözünürlük 20 verim verileri analizi daha etkili olabileceğini göstermektedir.
Bu protokolProtein mikrokristalografisinde yeni araştırmacılara yardımcı olma eğilimindeydi. Bir sinkrotron beamline'da X-ışını kırınımı deneyleri için örnek hazırlama ve manipülasyon üzerine odaklanan metodolojileri sağlar. Selüloz analizinde akış sitometrisi ile klasik mikrokristalografide veya kristal içeren hücreler için izole edilmiş kristaller kullanılarak iki seçenek önerilmiştir ( Şekil 1 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: İn vivo kristalizasyon, bakteri, maya, bitkiler, böcekler ve memeliler de dahil olmak üzere birçok organizmada bildirilmiştir (referans 21'de gözden geçirilmiştir). Ayrıca, memeli hücrelerinin geçici transfeksiyonunu ve böcek hücrelerinin bakulovirüs enfeksiyonunu kullanarak laboratuarda rekombinant proteinlerin kristalleştirilmesi sağlanmıştır. Aşağıdaki protokol, referans 22'de verilen talimatlara uygun olarak üretilen, bakulovirüs polihedrin promotörü altında bir rekombinant bakulovirüs içinde klonlanmış Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polidrin geni kullanılarak geliştirilmiştir. Bu nedenle, bu protokol diğer hücre tiplerine ( örn., Memeli hücreleri) adapte olsa da, burada böcek hücreleri için prosedürleri açıklıyoruz. Protokol, ilgi proteinlerinin aşırı sentezlenmesine zaten ulaşıldığını varsayıyor. Yeniden birleştirici bir bakülovirüsün üretimi için yöntemler ve ilgilenilen proteinin ekspresyonu için kullanımı, avReferanslar 23 , 24 , 25 , 26 , 27'de mevcut değildir .
1. Kristal içeren hücrelerin tanımlanması
- Eğer hücreler tek katmanlı olarak yetiştirilirse, doğrudan şişe içerisinde inceleyin. Hücreler sıvı kültürde büyürlerse aşağıdaki protokolü kullanın.
- Steril serolojik bir pipet kullanarak, bir mikrosantrifüj tüpüne 500 mcL hücre aktarın. Ana kültürün sterlininin korunmasını sağlamak için özen gösterin; Sınıf II biyogüvenlik kabinindeki hücreleri tutun ve standart aseptik teknikleri takip edin.
- Mikro santrifüj tüpünden 5 μL hücre pipetleyin.
- Hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için sıvıya dikkatle bir cam lamel yerleştirin. Slayt 15 dakika içinde görselleştirilemiyorsa, buharlaşmayı önlemek için lamelleri vakum gresiyle kapatın.tirme.
- Şişeyi veya ters yüzü mikroskopta slaytla. Varsa, faz kontrastı ve / veya diferansiyel interferans kontrast mikroskopisi (DIC) kullanın. Her iki teknik saydam örneklerdeki kontrastı arttırır ve çizgileri ve kenarları vurgular; böylece in vivo kristallerin tanımlanmasını kolaylaştırır.
- Hücreleri dikkatle inceleyin. Potansiyel bir kristali algılayarak 200X büyütmeyle başlayın ve maksimum büyütme ile yakınlaştırın. Kristallerin varlığı dolaylı olarak hücre morfolojisindeki değişiklikler tarafından önerilebilir ( Şekil 2 ). Refrakteritede keskin kenarlar ve değişiklikler arayın (faz kontrastı veya DIC kullanılıyorsa). Bilinen in vivo kristaller, çubuklar, iğne yığınları, küpler, piramitler ve çokyüzlü gibi farklı şekilleri benimser. (Bazi örnekler için bkz. Şekil 2 ve Tablo 1 ).
Not: Her bir durumda kristal içeren hücrelerin oranı farklı olacaktır ve gerçekleşebilir.N preparatları arasında değişir ancak genel olarak, tüm hücrelerde kristaller bulmasını beklememelisiniz. Benzer şekilde, hücre başına kristal sayısı da değişkendir (bkz. Tablo 1 ) ve bir hücrede birden fazla kristal bulunabilir. Bu faktörlerin mümkün olduğunca enfeksiyonun çeşitliliğini ayarlayarak, ekspresyonun uzunluğunu değiştirerek ve protein yapısını değiştirerek optimize ettirilmesi gerekir. Bir taraftan, protein ekspresyonu ve kristal içeren hücrelerin sayısını en yükseğe çıkaran hücre büyümesi koşulları verimliliği artıracaktır ( örneğin enfeksiyon çoğalması ve hücre kültürünün hasat edilmesi). Öte yandan, hücrelerin tek bir kristal içerdiği koşullar veri toplamanızı kolaylaştırır ( örn., Düşük enfeksiyon çeşitliliği). Adım 2.2'de açıklanan akış sıralama ile zenginleştirildiğinde, kristal içeren hücrelerin oranı düşük olsa bile, daha büyük kristalleri ( örneğin hücre başına tek bir kristal) hedeflemenizi öneririz. - Kristal varsa(Tek katmanlı bir şişeye görüntülerken) pozisyonlarını kaydedin ve kristal içeren hücrelerin yüzdesini hesaplayın. Varsa, değişiklikleri tek bir hücre düzeyinde izleyebilen bir kamera ile donatılmış bir mikroskop kullanın.
- Süspansiyon içindeki hücreler için, referans 28'de ayrıntılarıyla verilen protokolden sonra hücre canlılığı derecesini belirleyin. Tek katmanlı bir ortamda kültürlenen hücreler için, görme denetimi ile birleşmenin yaklaşık derecesini ve ayrılmış hücrelerin miktarını hesaplayın.
- Kristal büyümesini, hücre büyümesini ve canlılığı günde iki kez izleyin.
- Kristal büyümesi durduğunda hücreleri hasat edin. Viral polimerler gibi olağanüstü sağlam kristaller için, inkübasyon süresinin uzatılması (> 4 gün) büyük kristaller sayısını arttırır. Bununla birlikte, tipik protein kristallerinde, canlılığın% 80'in altına düştüğünde hücreleri hasat etmesini ve hücre lizisinden kaynaklanacak zararları önlemenizi öneririz.
- Şişeyi inkübatörden çıkarın veAdım 2.2 mümkün olan en kısa sürede. Aksi belirtilmedikçe, hücreleri buzda tutun aşağıdaki basamaklarda.
2. Örnek Arıtma
Not: İn vitro kristallerin saflaştırılmış kristallerden ve selülo içindeki iki analiz metodunu açıkladık .
- Kristallerin saflaştırılması
Not: İlgili kristallerin düşük sıcaklıklara karşı hassas olduğuna dair kanıtlar olmadıkça, buz üzerinde çalışın ve kristal bozulmasını önlemek için buz gibi tamponlar kullanın.- 50 mL konik bir santrifüj tüpünde 50 mL enfekte Sf9 hücrelerini pipetleyin. Bu, tipik bir deneyde ~ 4 x 108 hücreyi temsil eder.
- 4 ° C'de 10 dakika süreyle 450 x g'de pellet hücreleri.
- Süpernatantı atın ve pelet 40 mL soğutulmuş fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 içinde tekrar süspansiyon haline getirin.
Not: PBS, standart bir izotonik tampon olarak saflaştırma için başlangıç noktası olarak mim amacı ile önerilmiştirIn vivo kristallerinin büyüdüğü hücresel ortamı iterek. Hücre kültüründe yetiştirilen in vivo kristallerinin çoğu için bugün 9 , 14 , 29 için kullanılmıştır . Alternatif olarak, DMEM ortamı memeli hücrelerinden in vivo kristallerin saflaştırılmasında başarıyla kullanılmıştır 19 . Kristaller PBS'deki transferlerinden gözle görülür derecede muzdarip veya kötü kırınım mevcutsa, bu parametrenin bozulma olasılığı kaynağı olarak araştırılması gerekir. - Yeniden süspansiyon haline getirilmiş pelleti, 19 mm'lik bir sonda ile sonikatör kullanarak 10 mA'de 30 saniye süreyle sonike hale getirin. Numunenin ısıtılmasını önlemek için, sonikleştirilirken buzla dolu bir behere yerleştirin. Kristaller aşama 2.1.7'de değerlendirildiği gibi sonikasyon ile hasar görmüş görünüyorsa, kimyasal veya mekanik hücre parçalanması alternatif olarak kullanılabilir.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 450 xg'de santrifüjleyin. Santrifüjden sonra, 2 kat ortaya çıkar:Soluk kahverengi bir hücrenin enkazı tabakası ve beyaz ve tebeşir altındaki bir polihedrin kristalleri topağı.
- Süpernatantı atın ve üst tabakayı temkinli pipetleme yöntemiyle çıkarın. Alt pelleti 40 mL soğutulmuş PBS'de tekrar süspanse edin.
- Işık mikroskopu ile görüntüleme yöntemiyle numunelerin kalitesini değerlendirin.
- Bir cam slayt üzerine 5 uL hücre veya saflaştırılmış kristaller pipetleyin. Bu oda sıcaklığında yapılabilir.
- Hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için sıvıya dikkatle bir cam lamel yerleştirin.
- 200X büyütmede ters çevrilmiş mikroskop ile slayt görüntü. Slayt hazırlanışından 15 dakika sonra örnek alın. Slayt 15 dakika içinde görselleştirilemiyorsa, buharlaşmayı önlemek için lamelleri vakum gresiyle kapatın.
NOT: Polihedralar durumunda, kristaller, yan başına ~ 1 ila 10 μm arasında refraksiyon küveti olarak görünür. Keskinlik kaybı işaretleri arayan kristallerin bütünlüğünü kontrol edin( Örn. Yuvarlak kenarlar), çatlaklar veya çözünme. Ayrıca, yığınlar ve düzensiz boyut ve şekillerde nesneler olarak görünecek olan hücre döküntüsünün varlığını izleyin.
- 2.1.5 ila 2.1.7 arasındaki adımları tekrarlayın; kristaller pisliklerden arınana kadar pelleti her devirde tekrar süspansiyon haline getirmek için kullanılan PBS hacmini yarıya indirin. Soğutulmuş PBS'nin 1 mL'sinde nihai pelleti tekrar süspanse edin ve kristalleri bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Saflaştırılmış kristalleri 4 ° C'de saklayın.
- Üreticinin tarif ettiği gibi bir hemositometre kullanarak kristaller konsantrasyonunu hesaplayın. Kristalleri, sayım hücreleri gibi sayın.
Şekil 3 : Saflaştırılmış İn Vivo Mikrokristaller. Sf9 böcek hücrelerinden BmCPV1 polihedrin kristallerinin temsilcisi tarafından arıtılması ( a ) pellet haline getirilmiş hücre parçacıkları ve ağlama( B ) enkaz ve kristal katmanlar üzerine yakınsama. Çöküntü tabakası, süpernatana özenle yeniden süspanse edilebilir ve daha hızlı kristal saflaştırması için atılabilir. ( C ) Saflaştırılmış çokyüzlü optik mikroskop görüntüsü. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
- Akış sitometresi ile kristal içeren hücrelerin izolasyonu
Not: Kapıların akış sitometrisinde tanımlanmasını kolaylaştırmak için ilgi konusu proteini ifade eden paralel bir kontrol kültürünün büyütülmesi önerilir. Bu, ilgili olmayan bir rekombinant bakulovirüs ile Sf9 hücrelerinin bir şişesini enfekte ederek veya sahte bulaşmış hücreler hazırlayarak yapılabilir. Numunelerin sıralanması ve görüntülenmesi genellikle oda sıcaklığında yapılır.
DİKKAT: Propidyum iyodür şüpheli bir kanserojendir ve ele alınmalıdır.dikkatle.- Akan sitometri analizine uyarlanmış bir tüp içinde 4 mL enfekte Sf9 hücrelerini pipetle - 3 x 10 7 hücreyi temsil eder -. Ayrıca, rekombinant olmayan bir bakülovirüs ile enfekte edilmiş eşdeğer sayıda Sf9 hücresi içeren ikinci bir tüp hazırlayın.
- Akış sitometrik değerlendirmeden hemen önce, her iki numuneye de propidyum iyodür (PI) 1 μg / mL son konsantrasyonda ilave edin. Bu adım, ileri ve yan saçılım arsa üzerinde hücre dağılımını değiştirebilecek veya maskeleyebilecek ölü hücreleri, hücre yığınlarını ve enkazı tanımlamak için gereklidir. 1 mg / mL'lik PI stoklarını suda hazırlayın ve ışığa karşı korunan 4 ° C'de saklayın.
- Hücreleri, ileri (FSC) ve yan saçılım (SSC) 'ye göre hücre ayırma yeteneğine sahip standart bir akış sitometresine uygulayın. Kontrol ( yani kristal içermeyen) numunedeki en az 20.000 olayı analiz edin. Ölü hücreleri, hücre yığınlarını ve çöpü analizden attıktan sonra, SSC arsa için FSC'yi üretin.
- En az 20.000'i bile analiz edinKristal içeren numunenin ts. Sahte alfabe ile FSC - SSC arsasını karşılaştırın. Kristal içeren hücrelere karşılık gelen farklı bir popülasyonun görünümünü arayın. Tipik olarak, hücre içi kristallere sahip hücrelerin morfolojik karmaşıklığının artması nedeniyle daha yüksek SSC'ye sahip olacaklardır. Kristal büyümesinin hücre hacminde bir artışa neden olması durumunda, FSC de artabilir. Sahte plottan farklı dağılım grafiğinin alanlarına karşılık gelen hücre popülasyonlarını izole etmek için akış belirleyicisinin kapaklarını tanımlayın. Hangi popülasyonun kristal içeren hücrelerle ilişkili olduğunu teyit etmek için sıralanan örnekleri 1. adımda açıklandığı gibi ışık mikroskobu ile görüntüleyin.
- Adım 2.2.4'te tanımlanan kapıları kullanarak, PBS'de veya başka izotonik tamponda bulunan kristal içeren hücreleri sıralayın. Sonraki adımları kolaylaştırmak için sıralanmış kristal içeren hücrelerin sayısını ve nihai hacmi kaydedin. Sıralanmış hücreleri buz üzerinde veya 4 ° C'de saklayın.
Not: Bir saat içerisinde> 300.000 polihedra-conBoyama hücreleri, 100 mm'lik bir meme (39 kHz'lik bir frekansta 138 kPa) ile bir hücre sıralayıcıda sıralanır. Bu hücrelerin miktarı> 1.000 mesh hazırlamak için yeterlidir. - Adım 2.1.7'de detaylandırılan protokolü takiben, kristal içeren hücrelerdeki zenginleştirmeyi teyit etmek için hücreleri ışık mikroskopuyla görüntüleyin. Veri toplama için numune hazırlığı, hücre ayırma işleminden sonra mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır, çünkü kristaller zamanla bozunabilir veya hücre lizisinden dolayı serbest bırakılabilir.
Şekil 4 : Hücrenin sınıflandırılması. ( A ) Kristal içermeyen enfekte olmayan hücreler (taklit) ve ( b ) BmCPV1 polihedrini aşırı sentezleyen bir rekombinant bakülovirüs ile enfekte edilmiş Sf9 hücrelerinden örnek akış sitometrisi dağılım grafikleri. İki popülasyon arasındaki dağılım modelindeki farklılıklar alKristal içeren hücre popülasyonunun kapanması (kırmızı kapı, yüksek SSC değerleri). Her arsa 20.000 sıralama olayını temsil eder. SSC: yan ışık saçılımı; FSC: ileri ışık dağılımı. ( C ) Hücre içi kristallerin varlığını gösteren, sıralanmış hücrelerin temsili bir popülasyonunun optik mikroskopi görüntüsü. Ölçek = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
3. Veri Toplama için Örnek Hazırlama
Not: Hücreler veya kristaller, bölüm 3.1'de detaylandırılan deneysel aşamalı takip protokolü için türevlendirileceklerse. Aksi takdirde, doğrudan saflaştırılmış kristaller için 3.2'ye veya selülo analizinde 3.3'e gidin .
- Saflaştırılmış veya sellülo mikrokristallerde türetilmesi
DİKKAT: Kullanmadan önce ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formlarına (MSDS) başvurun.Deneysel aşamalandırma için kullanılan kimyasalların çoğu akut olarak toksiktir. Kimyasal duman kabini ve kişisel koruyucu ekipmanlar da dahil olmak üzere tüm uygun güvenlik uygulamalarını kullanın. Atık ürünlerinizi kurum politikanıza uygun olarak atın.
Not: Ağır atomların doğası, konsantrasyonları ve inkübasyon süresi, BmCPV1 polihedranın kristalleri için gösterge niteliğinde bir temel üzerinde verilmiştir. Bu parametreler her yeni hedef için deneysel olarak belirlenmelidir. Adım 3.3.2'deki tripan mavisi ile sonraki boyamalar, hücreler faz için kullanılan kimyasal bileşik ile kolaylıkla renklendirilirse atlanabilir.- İstenen ağır atomların doymuş çözeltilerini (veya deneysel fazlama için kullanılan diğer kimyasalların solüsyonlarını) hazırlayın. Tipik olarak, her ağır atom için 100 μL'den daha düşük hacimler gereklidir. Çözülmemiş tuzları ve artıkları, oda sıcaklığında 5 dakika süreyle bir mikrosantrifüjde maksimum hızda santrifüje sokarak çıkarın.
- ~ 50.000 kristalin alikotları hazırlayınVeya ağır atom bileşiği başına sıralanmış hücreler. PBS, türetme için kullanılan kimyasalla uyumlu değilse ( örn. Çökelti oluştuğunda ve solüsyon bulutlu hale gelir), kristalleri 4,000 xg'de 3 dakika oda ısısında bir mikrosantrifüjde veya hücreleri 3 dakika boyunca 150 xg'de peletleyin, Süpernatant ve kristalleri veya hücreleri uygun bir tamponun 20 uL'sinde hafifçe tekrar süspanse edin. PBS izi kalmadığından emin olmak için peletleme ve tekrar süspansiyon tekrarlayın. Tüm alikotlar için nihai hacmi 20 μL'ye ayarlayın.
- Kristallere veya hücrelere 20 μL ağır atom çözeltisi veya diğer kimyasal bileşikler ekleyin. Ağır atomun optimum konsantrasyonu, hücresel parametrelerin bir kombinasyonuna (geçirgenlik, hedef dışı proteinler ...) ve ilgilenilen proteinin kristalinin doğasına bağlı olacaktır. Başlangıç noktası olarak 3 farklı konsantrasyonu test edin: tam doygunluk, 1 / 10e, 1 / 100e.
- Numuneleri 3 gün süreyle 4 ° C'de tutun. Poli kristalleriEdrin çok dirençli ve yoğundur ve ağır atomları birleştirmek için uzun süre ıslatılmasını gerektirir; Diğer kristaller türleri için, ağır atomların inkübasyon süresi ve konsantrasyonu deneysel olarak belirlenmelidir. Kuluçka süresinin çok kısa olması, ağır atomun uygun miktarlarda katılmasına izin vermezken, uzun inkübasyon süreleri kristallerin bütünlüğünü etkileyebilir, bu nedenle kırınım kalitesini düşürür veya hatta onları çözer. Bir başlangıç noktası olarak, her bir ağır atom çözeltisi için ( örneğin 1 dakika, 1 saat ve geceleme) 3 farklı inkübasyon süresini deneyin. Başarılı türetme, bölüm 5'de kısaca anlatıldığı gibi kırınım verilerini analiz eder ve orada yapılan atıflarla değerlendirilir.
- Fazla ağır atom çözeltisini, bir mikro santrifüjde oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 4000 xg'de kristalleri peletleyerek veya süpernatanı çıkararak 150 xg'deki hücreleri peletleyerek yıkayın, süpernatanı çıkarın ve 10 uL tampon içinde kristalleri veya hücreleri hafifçe yeniden askıya alın .
- Adım 2.1.9'da hesaplanan kristal konsantrasyonuna dayanarak, numuneyi seyrelterek konsantrasyonu 10 7 kristal / mL'ye ayarlayın; Veya bir mikro santrifüjde oda sıcaklığında 3,000 dakika boyunca kristalleri 4,000 xg'de pelet haline getirerek, süpernatanı çıkararak nihai hacmi ayarlayarak ve kristalleri yavaşça yeniden askıya alarak.
- Numuneler önceden dondurulması gerekiyorsa, kuru yükleyiciyi soğutun veya sıvı azot ile yıkayın. Viyaller veya topları uygun şekilde hazırlayın ve sıvı azot ile soğutun.
- Kristal peletini süspansiyon haline getirin ve pipetleme ile bir mikrometre üzerine 0.5 μL damla kristal uygulayın. 25 μm kare ile 700 μm gözenek kullanınDelikleri başlangıç noktası olarak kullanın. Örgü alanı kritik değildir, ancak daha geniş bir alan ağ başına daha fazla kristal sağlar ve hazırlama esnasında buharlaşmayı yavaşlatır. Deliklerin boyutu, 25 μm'den büyük kristaller boyutuna uyması için optimize edilmelidir. Sistematik çalışmalar için gerekliyse, veri toplamada metodik bir ızgara taramasını kolaylaştırmak için dizine eklenmiş ağlar mevcuttur.
- Aşırı sıvının çoğunu bir kağıt fitili ile lekeleyerek çıkarın. Kristaller birbirine dokunmadan eşit olarak ağ üzerine yayılmalıdır. Adım 3.1.1'i tekrarlayın. Örnek konsantrasyonunun optimizasyonu için. Hızlı bir şekilde ilerleyin ve fazla miktarda sıvı çıkarmayın. Kriyoprotektan yokluğunda, sıvı, tuz kristali oluşumu ve / veya film kaybı riski ile hızlı bir şekilde buharlaşır.
- Kriyoprotektan ekleyin: Ağda% 50 etilen glikol içeren 0.5 mcL'lik bir çözelti pipetle pipetleyin (kriyobufferin bileşimi numuneye uyarlanacaktır; c'nin optimizasyonu için önerilerReferans 30'da ryoprotektant bulunabilir). Kağıt fitili ile lekelenerek fazla sıvı alın. Önceki adımın aksine, kalan film tabakası, kristal, kiriş yolu ve goniometre arasındaki uyum sürecini zorlaştıran paralaks etkilerini azaltmak için mümkün olduğunca ince olmalıdır; Ve ışın yolunda sıvı tarafından X-ışınlarının saçılmasının neden olduğu arka planı en aza indirgemek.
- Mikrometizi hemen sıvı azottaki gibi hızlıca soğutun ve bir şişe veya robot pakete aktarın, daha sonra kuru bir nakliye aracına veya depolamak için dewar'a gönderin.
- Kristal içeren hücrelerle mikromesh hazırlama
DİKKAT: Sıvı azot kullanımı, boğulma, soğuk yanmalar, oksijen açısından zengin atmosferdeki ateş ve patlama gibi tehlikelere neden olur. Lütfen kurumunuzun risk yönetimi ve emniyetli çalışma uygulamalarına başvurun.- Sıralanmış hücreleri 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücrenin c temelindeHücre listeleyici tarafından kaydedilen ounts, numuneyi PBS ile sulandırarak konsantrasyonu 10 7 hücre / mL'ye ayarlayın; Veya hücreleri bir mikrosantrifüjde oda sıcaklığında 150 xg'de 3 dakika pellet haline getirerek, süpernatanı çıkararak nihai hacmi ayarlayarak ve yavaşça hücreleri yeniden askıya alarak.
- Hücreleri,% 0.2 w / v'lik bir nihai konsantrasyona eşit bir tripan mavisi çözeltisi (% 0.4 w / v) ile karıştırın.
- Numuneler önceden dondurulması gerekiyorsa, kuru yükleyiciyi soğutun veya sıvı azotla yıkayın. Viyaller veya topları uygun şekilde hazırlayın ve sıvı azot ile soğutun.
- Hücreleri yavaşça yeniden süspanse edin ve bir mikromet üzerine sıralanmış hücrelerin 0.5 mcL'sini pipetleyin.
- Kağıt fitili ile lekelenerek fazla sıvı alın. Hücreler, birbirine dokunmadan eşit olarak ağ üzerine yayılmalıdır. Kriyoprotektan kullanmıyorsa (adım 3.3.6) kalan çözücü filmin paralaks etkilerini azaltmak için mümkün olduğunca inceltilmiş olması gerekirE kristal, kiriş yolu ve goniometre arasındaki hizalama süreci; Ve ışın yolunda sıvı tarafından X-ışınlarının saçılmasının neden olduğu arka planı en aza indirgemek.
- İsteğe bağlı olarak, hücrelere kriyoprotektan ekleyin: ağ üzerinde% 50 etilen glikol,% 50 PBS solüsyonu 0.5 mcL pipetle. Kriyobufferin bileşimi numuneye uyarlanacaktır; Kriyoprotektanın optimizasyonu için öneriler referans 30'da bulunabilir . Aşırı sıvıyı bir kağıt fitili ile lekeleyerek çıkarın ve yalnızca ince bir solvent tabakası bırakın.
Not: Kriyojenik koruma adımının atlanması , polihedrin kristalleri selülo içinde analiz edildiğinde X-ışını kırınımının kalitesini değiştirmedi, bu adım saflaştırılmış kristaller için gerekli 20 . Bu sadece hücrelerin kriyoprotektan çözeltisi ile kuluçkalanması için geçerlidir; Radyasyon hasarının kristaller üzerindeki etkilerini en aza indirgemek için örnek hala 100K'de analiz edilmelidir. - acilen buMikrometizi sıvı nitrojende flaşla soğutun ve bir şişe veya robot pakete aktarın, daha sonra kuru bir nakliye aracına veya depolama dewarına aktarın.
4. Veri Toplama
Not: Veri toplama için kullanılan parametreler kılavuz olarak verilmektedir ve her kristal türü ve sinkrotron beamline için optimize edilmelidir.
- Mikrofokus kristalografi beamline üzerinde veri toplayın (mikrofokus beamline'ların bir listesi ve özellikleri için bakınız referans 7 ). Mümkünse, kristallerin boyutuyla eşleşen bir kollektörlü kiriş kullanın.
- Tek Dalga Boyunca Anormal Dağılım yöntemi (SAD) ile deneysel fazlama için, seçilen ağır atomun anormal sinyalini maksimize eden bir enerjiden toplanır. Çoklu İzomorflu Değiştirme metodunu (MIR) kullanarak aşamalamak için, seçilen ağır atom için uygun emilim kenarının enerjisini toplamak (http://skuld.bmsc.washington.edu/sc adresinde mevcuttur)ardıl / AS_periodic.html).
- Örgü gonyometrenin üzerine yükledikten sonra, kiriş yoluyla yüzü (dışbükey taraf) ve yan yana eğilimleri kullanarak mikrometreleri ortalayarak başlayın. Ardından, mikromet ön yüzü açıkken mikrometrenin belirli bir yatay şeridinin merkezini hizalayarak hizalamayı ince ayarlayın (örneğin, orta mermi ile başlayın). Ardından, bu yatay şerit boyunca hizalama için yalnızca küçük yeniden ayarlamalar yapılarak veri toplayın. Mümkünse, hizalamayı ince ayarlamak için düşük doz X-ışını kırınımında rasterleme temelli merkezleme kullanın (sinkrotron kiriş çizgisindeki yerel kontağa danışın).
Not: Mikrokristallerde, radyasyon hasarına bağlı olarak (genellikle 1 ° salınımlı 10 ila 30 görüntü) sınırlı miktarda veri toplanabilirken, teoride kristalin sadece 10-30 ° için kiriş yolu ile hizalanması gerekir. Bununla birlikte, kristalin mikro ışın tarafından kolayca kaçılarak hizalamasının doğru olduğu kritiktir (genelde bir çembere paralelEr ~ 10 μm veya daha küçük). - Radyasyon hasarı nedeniyle kırınım kayboluncaya kadar difraksiyon verilerini toplayın. Polihedrin kristalleri için, 10 sn'lik maruz kalma süresi tipik olarak, bir CCD dedektörü (toplam doz <30MGy) ile 13 keV'da yaklaşık 3.6 x 10 11 foton / s akısı için 1 ° salınım için kullanılır. Kullanılan kristalin kiriş çizgisine ve niteliğine bağlı olarak bu ayarları optimize edin. Özellikle, piksel x-ışını dedektörleri için düşük doz ve ince dilimleme önerilir.
Not: Selülo strateji kullanılıyorsa, trypan mavisi ile lekelenmiş hücreler, destek arka planına karşı mavi noktalar olarak görünür ve böylece ışına hizalamaları kolaylaşır. Paralelleştirilmiş mikro ışın hücrelerle (~ 10 μm) aynı boyuta sahipse, bir hücrede bulunan tüm kristaller aynı anda aydınlatılacaktır. Birden fazla mikro kristal içeren hücreler için, bu, işlemlenmesi güç olabilen çoklu kırınım modelleri gözlemlenmesine yol açar. Bununla birlikte diKristallerden birinden gelen fraksiyon sıklıkla kırınım modeline hâkim olma eğilimindedir ve veri işleme sırasında tercihen endekslenir. Röntgen ışını hücreden çok daha küçük olan ışın çizgileri için, veri toplama öncesinde tek bir kristale ortalamak için çok düşük X-ışını akışında (>% 95 zayıflama) rasterleme kullanılmalıdır. - Şeritteki bir sonraki kristale ilerleyin.
- Şeridin tüm kristalleri test edildikten sonra, bir sonraki şeritte ilerleyin ve hizalama prosedürünü tekrarlayın. Yeterli veri toplanıncaya veya tüm kristaller test edilene kadar devam edin.
- İşlenmiş şeritlerin kristallerin kaçırılmaması ya da iki defa atılmaması için açıkça tanımlandığından emin olun (gerekirse bir eskiz çizin). Genellikle, hücrenin ışınlanması sonrasında tripan mavisi sarıya dönüşür ve bu işaret olarak kullanılabilir.
Şekil 5 : Micromesh Desteği Üzerindeki Örneklerden Veri Toplama Stratejisi. ( A ) Şerit başına veri toplama stratejisi; Her şeridin başında (noktalar) hizalama yapılır ve veriler şerit boyunca toplanır. ( B ) Mikrokristalografi beamline ekranında görüldüğü gibi trypan mavi lekeli, kristal içeren bir hücrenin bir örgü üzerinde yakınlaştırılması. ( C ) Mikrokristalografi ışın çizgisi ekranında görüldüğü gibi, bir örgü üzerinde saflaştırılmış bir polidrürün yakın çekimi. Örgü kareleri 25 μm x 25 μm'dir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
5. Veri İşleme
NOT: Burada, çoklu kristallerden gelen verilerin birleştiği seri mikrokristalografiye özgü veri işlem adımlarını kısaca kısaca değindik. Birçok mükemmel makale vardırDerinlik 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36'da veri işlemini açıklayan mevcut yapı ve yapının belirlenmesi bu protokolün kapsamı dışındadır.
- Referans olarak en iyi kırınım çözünürlüğü ve kaliteye sahip kristali seçin.
- HKL-2000 31 , Mosflm 32 veya XDS 33 gibi standart kristalografi paketlerini kullanarak her bir kristali bireysel olarak işleyin. Radyasyon hasarının veri setinin kalitesini bozmamasını sağlamak için, kabul edilebilir radyasyon hasarına sahip son görüntüyü dikkatlice seçin. Aşırı radyasyon hasarını belirten kestirim ölçütleri, her kristal türünün, işleme uygulamasının ve deneyin amacına özgüdür. BmCPV1 polihedrin kristallerinin faza alınması için, veriler bir kere sinyalden-n'ye atıldıktan sonra atılmıştırHKL-2000 31 tarafından bildirilen resim başına 2'den daha düşük veya R sym % 50'yi aştığında oise <I> / <σ (I)>.
- Her bir kristal için çözünürlük limitini ve karelerin sayısını tanımlayın ve veriyi çok az veya hiç sinyal ile entegre etmekten kaçınmak için doğru parametrelerle yeniden işleyin.
- XDS 33 CCP4 34, 35 ya da xScale gibi HKL-2000 31 SCALEPACK Scala gibi standart paketleri kullanarak bir referans kristal (ler) için en iyi kristallerinden Ölçeği ve birleştirme verileri. Veri kümesinin küresel kalitesini izlerken, ideal olarak veri kümesi kabul edilebilir bir tamlığa (>% 95) ulaşana kadar farklı kristallerden gelen verileri giderek ekleyin. Kötü izomorfizm gösteren kristalleri, birim hücre parametrelerindeki farklılıklar ve görüntü başına kötü R birleştirme / ki-kare ile tespit edilen en iyi / referans kristali reddetmek. Çok kaliteli veri kümeleri varsaReferans kristalleri ile ölçeklendirme yapmayın, birleştirilecek veri kümelerinin en iyi kombinasyonunu tanımlamak için hiyerarşik kümeleme gerçekleştiren BLEND 36 gibi bir program kullanın.
Not: Bazı boşluk gruplarında, referans kristali ile eşleştirmek için alternatif endeksleme seçeneklerinin test edilmesi gerekir. - Standart kristallografi paketleri kullanılarak deneysel faz oluşturma, moleküler replasman veya arıtmaya devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo mikro kristalleri kullanarak yapı belirleme için her iki alternatif yöntemin bir özeti sunulmaktadır ( Şekil 1 ). Polyhedra, sonikasyon ve santrifüjleme ile kolaylıkla saflaştınlabilir. Yoğunluklarından ötürü, pipetle çıkarılabilen kalıntıların altındaki tüpün tabanında bir tabaka oluştururlar ( Şekil 3a ve 3b ). Numune daha sonra birkaç tur sonikasyona tabi tutulur ve pelet beyaz ve tebeşir açısından değerlendirildiğinde yeterli seviyede saflığa ulaşılana kadar yıkar ( Şekil 3c ).
Selüloz yaklaşımda, enfekte edilmemiş hücrelerin akış sitometrisi profili, kristal içeren hücrelerin profiliyle karşılaştırılır ve kristal içeren hücreleri sıralamak için hangi hücre popülasyonunun seçilmesi gerektiğini belirlemek için kullanılırDiğer hücreler ( Şekil 4 ). Bu örnekte, polihedra içeren hücreler enfekte edilmemiş hücrelere göre daha yüksek yan dağılım gösterirler. Dağılım modelleri arasındaki diğer farklılıklar diğer kristal türleri için de gözlemlenebilir ve kapılama buna göre değiştirilmelidir.
Saflaştırılmış mikro kristaller veya kristal içeren hücreler bir mikrometreye pipetlenir ( Şekil 5 ). Saflaştırılmış kristaller küçük boyutları nedeniyle (Şekil 5c) belirlemek ve X-ray beam ile hizalamak için zahmetli ise tripan mavi ile boyanmış hücreler kolayca senkrotron ışın demetleri en (Şekil 5b) temin kameralar kullanılarak görüntülenebilir. Veri toplarken, merkezleme prosedürlerini en aza indirgemek ve aynı hücrenin veya kristalin iki katına çıkmamak veya herhangi bir kayıp olmasını önlemek için ızgara modelinde ilerlemek en iyisidir ( Şekil 5a ). Veri topluluğuDiffraction limitlerindeki farklılıklar, radyasyon hasarının etkisi ve olası izomorfizm eksikliği nedeniyle dikkatlice işlenmelidir.
Şekil 1 : In Vivo Mikrokristaller kullanılarak Yapı Tespiti için İki Yönteme Genel Bakış. Mikrokristaller, bir rekombinant ekspresyon sistemi kullanılarak ilgilenilen proteinin aşırı sentezlenmesiyle hücre kültüründe üretilir. Belirli durumlarda, mikro kristaller belirli koşullardaki hücreler tarafından doğal olarak üretilebilir. Üst sıra, hücrelerin lizlendiği klasik yaklaşımı ve kristaller diferansiyel santrifüjle saflaştırılmıştır. Saflaştırılmış mikro kristaller bir mikrometreye pipetle konur. Fazla sıvının çıkarılmasından sonra, bir kriyoprotektan çözeltisi eklenir, aşırı sıvı tekrar lekelenir ve ağ flaşla soğutulur. X ışını dif için Kesir deneyleri sırasında, kristaller, veri toplamada hız sınırlayıcı adım olabilir X-ışını demetiyle dikkatlice hizalanır. Alt sıra cellulo yaklaşımını göstermektedir. Hücreler, özellikle kristal içeren hücreleri seçmek için akış-sitometri ile sıralanır. Hücreler, görselleştirmeyi kolaylaştırmak ve bir mikrometre üzerine yaymak için tripan mavisi ile lekelenmiştir. Bu durumda, bir kriyoprotektan eklenmesi isteğe bağlıdır. X-ışını kırınımı deneyleri için, merkezleme işlemini kolaylaştıran sinkrotron beamlines'lerde bulunan tipik kameralar kullanılarak hücreler kolayca görselleştirilir.
GE Healthcare AB, Uppsala, İsveç'in otomatik sıvı kromatografi sisteminin görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
= "Xfig"> Şekil 2 : In Vivo Mikrokristallere Örnekler. İn vivo kristallerden seçilen örnekler: ( a ) Cypovirüs çokyüzurlu Sf9 hücreleri; ( B ) entomopoksvirus sferoidleri ile LD652 hücreleri; ( C ) Bacillus thuringiensis ile Cry3A kristalleri (ok); ( D ) Trypanosoma brucei cathepsin B kristalleri ile Sf9 hücreleri; ( E ) kalsinörin kristalleri olan Sf21 hücreleri (oklar); ( F ) PKOS'lı COS7 hücreleri tek tabaka: Inka1 kristalleri; ( G ) IgG kristalleri olan CHO hücreleri. 14 , 18 , 29 , 37 , 39 , 42'den izinle kopyalanır. Ölçek çubuğu = 10 μm. Largayı görmek için lütfen tıklayınız.Bu rakamın bir sürümü.
Tablo 1: Rekombinant proteinini ifade eden Kültürlenmiş Hücrelerde İn Vivo Kristallerin Özeti. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, geçmişte göz ardı edilen çok küçük kristallerin analizini kolaylaştırmak amacıyla mikro kristalleri analiz etmek için iki yaklaşım sunmaktadır.
Mikrokristal arıtım için kritik adımlar
Sunulan protokol, bir model sistem olarak Sf9 hücrelerinde eksprese edilen Bombyx mori CPV1 polihedrini kullanarak optimize edilmiştir. Bununla birlikte, in vivo mikro kristaller mekanik direnç açısından büyük bir değişkenliğe sahiptir. Örneğin, böcek hücrelerinde yetiştirilen katepsin B iğne benzeri kristaller katıdır ve mekanik strese karşı çok dirençlidir ve burada açıklanana benzer bir protokol kullanılarak saflaştırılabilir 14 . Öte yandan, aynı zamanda kültürlü böcek hücrelerinde yetiştirilen ve benzer bir iğne benzeri morfoloji ile ateşli olan ateşböceği lüsiferaz kristalleri, hücre lizizinde hemen çözülür 38 . Böylece, in vivo özütleme ve saflaştırma protokolüKristaller, adımlar 1.3, 2a.3-4, 2b.4, 3.1.3-4 ve 3.2a.5'de açıklandığı gibi özel durumlar için deneme yanılma esasına göre uyarlanmalıdır.
Kırılgan kristaller için, hücre parçacıklarından (kısmi) ayrılma, düşük hızlı santrifüjle ( örn., 200 xg) veya tekrarlanan sonikasyon yerine tüpün altına bir sükroz yastığının eklenmesiyle sağlanabilir. Genel bir kural olarak, kırınım veri toplama amaçları için hazırlanan kristal numunelerinin saflaştırılması gerekmez. Bu nedenle, hızlı bir şekilde arındırma kristallerin bozulmadan önce kriyo soğutması için tercih edilir.
In vitro ve in vivo mikro Uygulama
Her iki protokol de burada in vivo yetiştirilen kristallerin analizi ile gösterilmiş olsa da, metodoloji saflaştırılmış rekombinan proteinden kristal tepsilerde yetiştirilen mikro kristaller için kolayca kullanılabilir. Bu işteDurumda, aşağıdaki değişiklikler dikkate alınmalıdır: i) örgü desteği, pipetleme ile aktarılmak yerine, mikro kristalleri doğrudan kristalleştirme damlasından hasat etmek için kullanılabilir; Ii) Kristallerin miktarı sınırlayıcı bir faktör olabileceğinden, kristallerin aşırı uzaklaştırılmasını önlemek için, örgü desteğinden fazla sıvı lekelenirken özel dikkat gösterilmelidir; Iii) geleneksel kristalografide olduğu gibi, farklı kriyoprotektan tamponlarının test edilmesi gerekecektir (bakınız referans 30 ).
Öte yandan, in vivo büyümüş kristaller için , selülo yaklaşımı şiddetle tavsiye edilir. Hücrelerin saflaştırılmış kristallerden daha kolay görselleştirilmesi ve manipüle edilmesi bu yaklaşım, ışın kullanımı için daha verimli ve mikro kristalografide çok az veya hiç tecrübesi olmayan araştırmacılar için daha erişilebilir. Ekstraksiyon ve saflaştırmadan etkilenebilen kırılgan kristaller için de daha uygundur. Kimyasal ortamdaki değişikliklerden ötürü hücreden gelen ification, çevreleyen proteinlerin seyreltilmesi ve mekanik hasar. Ayrıca, hücreler, kristallere koruyucu bir ortam sağlarlar ve bir kriyoprotektan eklenmesi ihtiyacını hafifletirler. Kriyojenik koruma işleminin atlanması daha önce kusurların birikmesini önlediği ve oda sıcaklığında veri toplamak için bireysel kristaller arasındaki izomorfizmi geliştirdiği gösterilmiştir 40 . Selülo protokolü aynı zamanda, kriyojenik sıcaklıkta veri toplamaya izin verirken, kriyoprotektan çözeltisinde kuluçka gereksinimini de atlar. Genel olarak, selüloda veri toplamanın iki ana avantajı vardır: 1) Belirli bir ışınım süresi 20 için daha kaliteli ve daha yüksek çözünürlüklü veriler üretebilir; Ve 2) kristalleşmiş proteini, hücresel bir ortamda, biyolojik açıdan ilgili bir liganda tutma şansını arttırarak korur.
Ontent "> Teknik SınırlamalarSeri mikrokristalografinin özünde bulunan bir komplikasyon, veri toplama sırasında üretilen kısmi veri kümelerinin önemli bir sayısıdır. Sonuç olarak, veri işleme giderek zaman alan bir işlem haline gelir. Bununla birlikte, veri işleme için temel iş akışı büyük oranda otomatikleştirilebilir. Örneğin izomorf kristallerin optimal seçimi, örneğin BLEND 36'da uygulanan hiyerarşik küme analizi 28 ile belirlenebilir. Buna ek olarak, X-ışını serbest elektron lazerlerinin (XFEL) analizi için geliştirilen programlar, sinkrotron kiriş çizgileri 2 üzerinde toplanan seri mikrokristalografi verilerini işleyebilecek şekilde uyarlanabilir ve bazı kiriş çizgilerinde, örgü ve kristal algılamanın otomatik rasterlemesi, seri Veri toplama 2 , 41 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Avustralya Synchrotron'un MX2 beamline'ında destek için saflaştırılmış mikro kristaller, Daniel Eriksson ve Tom Caradoc-Davies, ve Monash Üniversitesi'ndeki FlowCore tesisindeki Kathryn Flanagan ve Andrew Fryga'nın resimlerinin sağlanması için Chan-Sien Lay'i onaylamak istiyorlar. Paha biçilmez yardım.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 cells | Life Technologies | ||
| SF900-SFM insect medium | Life Technologies | ||
| 1 L cell culture flask | Thermofisher Scientific | ||
| Shaking incubator for insect cell culture | Eppendorf | ||
| 50 mL conical tubes | Falcon | ||
| Centrifuge with swing buckets for 50 mL tubes | Eppendorf | ||
| Sonicator equiped with a 19 mm probe | MSE Soniprep 150 | ||
| Glass slides | Hampton Research | ||
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | ||
| Propidium iodide | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx cell sorter | BD Biosciences | ||
| Hampton Heavy atom screens | Hampton Research | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies. | |
| Paper wick | Mitigen | The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used. | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455. |
References
- Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 0(2014).
- Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2 (0), e01345 (2013).
- Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
- Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).
- Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
- Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
- Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
- Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451 (2015).
- Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
- Gallat, F. -X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497 (2014).
- Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
- Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
- Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
- Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
- Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
- Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
- Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).
- Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
- Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
- Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
- Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
- Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
- Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
- Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
- Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, Pt 4 271-281 (2011).
- Kabsch, W. XDS. Acta Cryst D. 66, Pt 2 125-132 (2010).
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, Pt 4 235-242 (2011).
- Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
- Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
- Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712 (2015).
- Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463 (2016).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
- Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
- Nass, K. Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).
