Summary
Dette arbeidet demonstrerer en ny tilnærming til å vurdere spredning, differensiering og fartøydannende potensial av vaskulære endotelceller (VESCs) gjennom brystfettpute-transplantasjon etterfulgt av helfestet vevsberedning for mikroskopisk observasjon. En linjesporingsstrategi for å undersøke oppførselen til VESCs in vivo presenteres også.
Abstract
Endotelceller (EC) er de grunnleggende byggeblokkene i den vaskulære arkitekturen og formidler vaskulær vekst og remodeling for å sikre riktig karutvikling og homeostase. Imidlertid forblir studier på endotel-lineærhierarki unnvikende på grunn av mangel på verktøy for å få tilgang samt å evaluere deres oppførsel in vivo direkte . For å løse denne mangelen er det utviklet en ny vevsmodell for å studere angiogenese ved bruk av brystfettpute. Mammekirtlen utvikler seg hovedsakelig i postnatalstadier, inkludert pubertet og graviditet, i løpet av hvilken robust epitelutbredelse er ledsaget av omfattende vaskulær remodeling. Mammarfettputer gir plass, matrise og rike angiogene stimuli fra det voksende brystepitelet. Videre er brystfettputer lokalisert utenfor bukhulen, noe som gjør dem til et lett tilgjengelig podningssted for å vurdere det angiogene potensialet til eksogene celler. Dette arbeidet beskriver også en effektivitetNt-sporingstilnærming ved bruk av fluorescerende reportermus for spesifikt å merke den målrettede populasjonen av vaskulære endotelceller (VESCs) in vivo . Denne linjesporingsmetoden, kombinert med etterfølgende fullmikroskopi av vev, muliggjør direkte visualisering av målrettede celler og deres etterkommere, hvorved spredningskapasiteten kan kvantifiseres og differensieringsforpliktelsen kan være skjebnesvart. Ved bruk av disse metodene har en populasjon av bipotent protein C-reseptor (Procr) som uttrykker VESCs nylig blitt identifisert i flere vaskulære systemer. Procr + VESC, som gir opphav til både nye EC og pericytter, bidrar aktivt til angiogenese under utvikling, homeostase og skadereparasjon. Samlet beskriver dette manuskriptet en ny brystfettpudstransplantasjon og in vivo linjesporingsteknikker som kan brukes til å evaluere stamcelleegenskapene til VESCs.
Introduction
Under utvikling og homeostase skjer vaskulær vekst og remodeling trofast i samsvar med organs vekst og reparasjon. Angiogenese beskriver genereringen av nye fartøyer fra eksisterende blodkar og anses som en stor styrke som formidler disse dynamiske vaskulære endringene. Hvert blodkar er innert med et lag av endotelceller (EC), og de ser ut til å være grunnlaget for fartøyarkitekturen. I lang tid forblir mekanismen gjennom hvilken EC-bassenget fylles under homeostase, uklart, og argumenter ble hevet over hvorvidt vaskulær omsetning er et resultat av moden EC-proliferasjon eller er bidraget av vaskulær stamme / stamcelleraktivitet. På grunn av mangelen på direkte fysiologiske bevis forblir eksistensen og den cellulære identiteten til vaskulære endotelceller (VESCs) også kontroversielle.
En av de vanligste tilnærmingene som brukes til å verifisere stamcelleadferd er gjennom transplanenTasjon av formodede stamceller i mottakermus. Denne metoden måler stammen potensialet av kandidat stamceller in vivo. Transplantasjon ble først brukt på studien av knoglemarvstamceller 1 , som bidro til etableringen av de hierarkiske karakteristikkene til det hematopoietiske systemet 2 . I endotelfeltet er en basementmembranmatriksmatrise ( f.eks. Matrigel) -plugg satt subkutant under flankehuden et standard in vivo angiogenese-assay som brukes til å adressere fartøydannelsesevnen til transplanterte ECs. Flere eksperimentelle metoder, inkludert kolonidannelse i 3D-kultursystemer og transplantasjon, har foreslått potensielle EC-progenitor / VESC-populasjoner 3 , 4 , 5 , 6 . Imidlertid, siden ECs innebygd i kjellermembranmatrisen er relativt adskilt fraDet omkringliggende vevet, gir dette ikke det optimale nisjemiljøet som kreves for å fullt ut undersøke det angiogene potensialet for transplanterte celler. Som et resultat er kar som er dannet i matrikspluggen overveiende kapillærlignende og funksjonelt uimplementerbare.
Mammekirtlen utvikler seg postnatalt, med den mest robuste veksten som oppstår under pubertet og graviditet. I pubertetstadiet gjennomgår brystepitelet en rask ekspansjon, for å oppta hele brystfettpuden, ledsaget av effektiv remodeling av de omkringliggende vaskulære strukturer. Dermed gir brystkjertelen en utmerket modell for studier av angiogenese. Det gir rom, matrise og rike angiogene stimuli fra det voksende brystepitelet og er derfor et ideelt podningssted for å vurdere det angiogene potensialet til eksogene celler. I tillegg tillater brystfettpuden at de dannede eksogene karene integreres med vertscirkulasjonssystemet, hvilket muliggjør videre fUunksjonell evaluering og representerer en fordel over subkutan transplantasjon.
Selv om in vitro- dyrking og transplantasjonsanalyser er like effektiv måte å undersøke regenereringsegenskapene til en cellepopulasjon på, er det kjent at slike analyser kan stimulere plastisitet når celler tas bort fra deres native habitater, og endringer kan bli indusert når celler frakobles fra Deres fysiologiske omgivelser 7 . Derfor er oppnåelse av direkte in vivo bevis på celle skjebne nøkkelen til å fremme den nåværende forståelsen av endotel-populasjoners adferd.
Genetisk skjebne kartlegging ( dvs. in vivo lineage tracing) er viktig for identifisering av VESCs og for undersøkelse av deres egenskaper i kroppens system, da det kan avsløre in vivo stamcelleadferd i sin fysiologiske kontekst, og den faktiske stammen kan være vurdert. Lineage traciNg gir direkte bevis på langsiktig utholdenhet ( dvs. selvfornyelse) av kandidat VESCs og deres evne til å produsere celletyper for opprinnelsesvevet ( dvs. differensieringspotensial).
Denne protokollen beskriver en ny brysttransplantasjonsteknikk for brystfettfett og en linjesporingsmetode for å observere fartøygenerasjonsegenskapen til VESCs. Disse teknikkene overvinne mangler av tilgjengelige analyser og gir en ny måte å optimalisere stamcelleegenskapene til VESCs. Disse tilnærmingene er effektive verktøy som kan brukes til å vurdere endotel-populasjoners adferd og fartøyformende egenskaper, samt å bestemme endring av vaskulærcellepotensial i et patologisk miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av dyrepleie- og brukskomiteen ved Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, kinesisk vitenskapsakademi i henhold til den godkjente protokollen SIBCB-NAF-15-002-S335-003.
1. Isolering av VESC fra Mus Mammary Gland
- Mammary gland høst og vev fordøyelse.
- Bruk 8 uker gamle Actin-GFP modne jomfru reportermus, med vekter som varierer mellom 20 og 25 g, som vevsgivere.
Merk: Celler som kommer fra giveren kan lett spores av GFP-uttrykk. - Klargjør vævsfordøyelsesbase medium bestående av 5% føtalt bovint serum (FBS), 1% pen / strep og 25 mM HEPES i RPMI1640. Filtrer blandingen gjennom et 0,22 μm filter for å sterilisere og forvarme det til 37 ° C i et vannbad.
- Offer musene i et CO 2 -kammer. Dissect ut det fjerde par inguinal brystkjertlene ved å først lage en vertikal hud iNcision på underkroppens midterlinje ved hjelp av en skalpell (eller kirurgisk saks). Skyll forsiktig huden til den ene siden for å eksponere den inguinale brystkjertelen ved hjelp av tinger. Hent den fjerde inguinale brystkjertlene fra begge sider og skjær dem i fine biter i en 6 cm petriskål med saks.
- Mål totalvekten av hakket vev og plasser det i en 50 ml rør.
Merk: Pass på at det resulterende vevstykket er mindre enn 1 mm 3 i størrelse for hvert stykke. Et typisk utbytte er ca. 5000 VESC per dyr.
- Mål totalvekten av hakket vev og plasser det i en 50 ml rør.
- Forbered fordøyelsesbase medium i et 50 ml toppet sentrifugerør ved et volum på 10 ml pr. 1 g vevstikk. Tilsett kollagenase type 3 ved konsentrasjonen av 300 enheter per 10 ml fordøyelsesbase medium for å danne fordøyelsesbufferen. Bland jevnt og legg det til vevstikket.
- Plasser 50 ml-sentrifugerøret på en gyngeplattform horisontalt og sett hastigheten til 100 o / min og temperaturen til 37 o C. agitereBrystvevet i 2 timer. Kontroller og skyll røret manuelt hvert 20. minutt for å sikre riktig fordøyelse.
Merk: Formålet med vevsfordøyelse før FACS er å fremstille en enkelt-celleoppløsning fra fast vev. Derfor, ved slutten av fordøyelsen, bør innholdet være en tykk løsning uten synlige vevstykker.
- Bruk 8 uker gamle Actin-GFP modne jomfru reportermus, med vekter som varierer mellom 20 og 25 g, som vevsgivere.
- En-celle løsning forberedelse.
- Etter fordøyelsen, fyll opp 50 ml sentrifugerøret med pre-oppvarmet, sterilt PBS og inverter røret for å blande jevnt. Sentrifuger røret ved 200 xg i 5 minutter for å oppnå en cellepellet.
- Fjern supernatanten og flip bunnen av røret for å løsne opp pelletspellet. Legg i 3 ml rødblodcellelyseringsbuffer (se Materialetabell) og inkuber i en vevskultur hette ved romtemperatur (RT) i 5 minutter for å eliminere de røde blodcellene.
- Tilsett 10 ml sterilt PBS og inverter røret for å blande jevnt. Sentrifuger vevinnholdet ved 200 xg i 5 min og diskArd supernatanten. Tilsett 3 ml forvarmet 0,05% trypsin og oppbevar røret ved 37 ° C i 5 minutter for ytterligere å fordøye det gjenværende vevet.
- Tilsett 3 ml forvarmet IMDM og tilsett deretter 100 μl DNase I-løsning (0,25 mg DNase I fortynnet i 1 ml PBS). Oppbevar røret ved 37 ° C for å bryte opp DNA-filamenter. Pass vevsblandingen gjennom en 70 μm cellefilter for å oppnå celleoppløsningen. Skyll silen to ganger med 2 ml PBS + 5% FBS for å nøytralisere den enzymatiske fordøyelsen.
- Sentrifuger celleblandingen ved 200 xg i 5 minutter for å pelletere cellene. Kast supernatanten og resuspender cellepellet i 1 ml PBS + 5% FBS for antistofffarging.
- FACS-basert Procr + VESC-isolasjon.
- Behandle celleblandingen oppnådd fra donorbrystvev til antistofffarging etter publiserte rutineprotokoller 8 .
Merk: Følgende antistoffer ble brukt: anti-musBlodlinje-FITC, anti-mus CD31 (PECAM1) -PECY7, anti-mus CD105-APC (alle brukt i en konsentrasjon på 1 μg / ml), anti-mus CD201 (Procr) -biotin (anvendt ved en konsentrasjon på 2,5 Μg / ml) og streptavidin-v450 (brukt ved en konsentrasjon på 0,5 ug / ml).- Etter antistofffarging, fyll opp cellene med PBS + 5% FBS og sentrifuger deretter ved 200 g i 5 minutter. Kast supernatanten og resuspender cellene med 1 ml PBS + 5% FBS. Filtrer gjennom en 40 μm cellesylinder. Plasser på is til FACS sortering.
- Fortsett å utføre FACS-basert sortering for å isolere Procr + VESCs.
- Analyser den ufarvede prøven og hver enkeltfargekontroll for å bestemme spenningen for hver farge. Beregn kompensasjonsparametrene for å unngå automatisk fluorescens eller bakgrunnsfarger. Sett opp malen for riktig gating og sortering for de ønskede cellepopulasjonene.
- For å etablere hierarkiet av FACS sortering, må du først fjerne rusk fraAlle hendelser og deretter kaste bort dubletter eller klebende celleklynger ved å utløse med bredde. Gate-out blodlinje-celler og deretter bruk CD31 + og CD105 + for å definere endotel-populasjonene.
Merk: Procr + -celler ble isolert fra CD31 + CD105 + ECs sammenlignet med en FMO-kontroll. Et representativt FACS analyseplot er vist i Figur 1 . En FACS-isolert VESC-befolkning bør suspenderes i IMDM + 50% FBS og lagres på is til videre behandling.
- Behandle celleblandingen oppnådd fra donorbrystvev til antistofffarging etter publiserte rutineprotokoller 8 .
2. In Vivo VESC Vessel Formation Assay Ved hjelp av Mammary Fat Pad
- Forbered primære EC for transplantasjon.
- Fyll opp de FACS-sorterte cellene med 10 ml PBS + 5% FBS og sentrifuger deretter ved 200 xg i 5 minutter for å slå ned cellene ned til bunnen.
- Aspirer væsken forsiktig, teller celle nummeret ved hjelp av et hemocytometer, og resuspender cellepellet med basalmembranmatriksblandingen (consiSting av 50% kjellermembranmatrise og PBS med 20% FBS, supplert med 100 ng / mL rmVEGF og 60 U / ml heparin) for å nå en arbeidskonsentrasjon på 15.000 celler / 15 μl.
Merk: Basermembranmatriksblandingen skal alltid lagres på is. - Fortynn de sorterte og tellte cellene i serie for å nå de nødvendige inntakskonsentrasjonene i en 1,5 ml mikrotube, slik at de endelige injeksjonsvolumene ikke overstiger 15 μL totalt. Legg 0,1% Trypan blå til hvert rør for bedre innholdsvisualisering under transplantasjon. Pipetten grundig å blande. Oppbevar rørene på is til bruk.
Merk: Vellykket fartøysgenerering kunne oppnås med minimum 100 VESC.
- Transplanter primære EC til bruskfettpuden.
- Desinfiser de kirurgiske instrumentene og benken. Hvis du bruker de samme instrumentene på flere dyr, kan en perle steriliser brukes til desinfeksjon.
- Bedøve 3-ukers BALB / c naken mikrofonE ved bruk av bedøvelsesprotokollen anbefalt av institusjonens veterinær og IACUC. Legg hver mus i bakre stilling, med ryggen på operasjonstabellen. Immobiliser lemmer med tape.
- Dip en bomullspinne i jodbasert antiseptisk oppløsning. Tørk hele underlivsområdet av musen grundig for å sterilisere hudoverflaten før kirurgi.
- Hold og løft magesekken på musen med tau. Bruk en kirurgisk skalpell for å lage en liten, 1 cm vertikal snitt. Gjør to kutt ca 0,5 - 1 cm i lengden, hver mot bakbenet, for å oppnå en opp-ned, Y-formet snitt.
- Bruk tanger og en bomullspinne for å forsiktig skille huden fra magen og pinne huden sideveis for å eksponere de inguinale brystkjertlene. Plasser musen under et stereoskop og sett forstørrelsen til 2.0X. Sørg for å justere fokuset slik at brystfettpuden kan ses tydelig og betjenes.
- Sett en 27G 1/2 "needlE på is for å pre-chill. Forbered en 1 ml sprøyte med grunnmembranmatriksblanding i forveien for å fjerne mulige luftbobler fanget i nålfasthetsområdet. Pipetter ut 15 μl blandet oppløsning på hylsen av mikrocentrifugerøret og aspirer deretter hele volumet i den primerte sprøyten.
- Hold brystfettpuden foran inguinal lymfeknude, bruk fine pinsetter, og løft den litt for enkel injeksjon. Sett ca. 1/4 av sprøytenålen forsiktig inn i fettputen.
- Frigjør pincettene fra padsplaten for å gripe og stabilisere sprøytenålen. Injiser løsningen langsomt for å forhindre væskelekkasje. Hold i noen sekunder for å forsikre deg om at celleblandingen er størknet for å minimere lekkasjen når du trekker ut nålen.
- Lukk hudflappen med absorberbare suturer. Sutur huden flap med størrelse 5-0 ikke-reaktiv monofilament sutur og lukk sårene med en kirurg-stil knuter, hver knute tilnærming0,3 cm fra hverandre. Alternativt, lukk huden med sårklammer.
- Plasser opererte mus i et eget bur for gjenoppretting. Plasser en varmelampe over buret for å forhindre at de bedøvede musene lider av hypotermi. Legg mykt papir og bomull i bunnen av buret for å holde musene varm etter operasjonen.
- Vær oppmerksom på musene nøye før alle mottakere er helt våken. For de neste dagene, bruk kirurgisk smertestillende midler fortrinnsvis til alle dyr eller som instruert av anleggsdyrlægen. Påfør antibiotika i henhold til godkjent dyreprotokoll hvis det oppstår sårinfeksjon. Hvis det kirurgiske såret ble lukket med sårstifter, fjern sårklipsene 10 dager etter operasjonen, når såret er helt lukket.
3. Full-Mount Vev Forberedelse for Mikroskopisk Observasjon
- Vevshøst
- Ved 2-4 uker etter implantasjon bedøves mottakeren BALB / cNakenmus med en intraperitoneal injeksjon av 2,5% bedøvelsesmiddel i en dose på 0,12 ml per 20 g kroppsvekt, som i trinn 2.2.2.
Merk: Positiv fartøyvekst kan detekteres 2-4 uker etter celletransplantasjon. - Merk mottakerens systemiske sirkulasjon med en haleveininjeksjon av isolectin-647 fargestoff ved en dose på 50 μg / 25 g kroppsvekt, resuspendert i 50 μL sterilt PBS. Tillat hvileperiode på 5 - 10 min. Offer musene ved å bruke CO 2 .
- Dissekterer området av brystvev hvor cellene ble injisert første gang etter trinn 2.2.4; Bruk kirurgiske saks. Ved hjelp av et kirurgisk blad, hogg vevet i omtrent 3-4 mm 3 kuber i en 6 cm petriskål.
- Ved 2-4 uker etter implantasjon bedøves mottakeren BALB / cNakenmus med en intraperitoneal injeksjon av 2,5% bedøvelsesmiddel i en dose på 0,12 ml per 20 g kroppsvekt, som i trinn 2.2.2.
- Vevsfordøyelse og preparering for antistofffarging.
- Fordel vevstykkene i et 15 ml sentrifugerør fylt med 10 ml forvarmet fordøyelsesbasemedium (trinn 1.1.2) tilsatt kollagenase III(300 U per 10 ml).
- Plasser 15 ml sentrifugerøret horisontalt på en gyngeplattform med hastigheten satt til 100 rpm, og temperaturen satt til 37 ° C i ca. 1 time for å løsne vevstrukturen og fjerne overflødig adipocytvev.
Merk: Adipocytter har en tendens til å produsere auto-fluorescens som kan resultere i en støyende fluorescerende bakgrunn. Ved slutten av fordøyelsen skal vevstykkene ha et mykt, overskyet utseende. Den optimale fordøyelsesperioden avhenger av størrelsen på hakkede vevstykker og bør derfor justeres tilsvarende for å oppnå de beste resultatene. Siden vevsvaskulaturen allerede er merket med fluorescens-merket Isolectin, bør alle følgende prosedyrer utføres beskyttet mot lys. - Vask vevstykkene med PBS ved romtemperatur i 10 minutter. Fiks det helfestede vevet ved å plassere bitene nøye i en 6 cm petriskål halvfull med 4% PFA (pH 7,2 - 7,4) for å bevare fluorescensen. Plasser PetriskålenPå en gyngeplattform og omrør forsiktig vevet i 30 minutter ved RT.
Merk: PFA er kreftfremkallende og skal håndteres med forsiktighet. - Fjern resterende PFA og vask det faste vevet tre ganger med fullmontert vaskebuffer (0,1% tween i PBS), med et 10-minutters intervall mellom hver vask.
- Hele-mount vev antistoff farging.
- Fortynn det primære antistoffet i antistofffargingsbuffer i et 2 ml sentrifugerør. Inkuber vevet med primært antistoff over natten ved 4 ° C.
Merk: Rat anti-CD31 (konsentrasjon: 10 μg / mL) eller rotte anti-VE-Cadherin (CD144 / Cdh5; konsentrasjon: 2,5 μg / mL) ble anvendt som de primære antistoffene. Både CD31 og VE-Cadherin er celleoverflate markører pleide å gjenkjenne endotelet. 5x antistofffargingsbuffer fremstilles med 500 mM maleinsyre, pH 7,5; 750 mM NaCl; Og 0,5% (v / v) tween oppløses i PBS. Bare legg til et passende serumvolum (5%) ved tilberedning av fersk 1x arbeidsoppløsning9 . - Fjern antistofffargingsbufferen og vask det hele monterte vevet tre ganger med vaskebuffer, med et 10-minutters intervall. Inkuber vevet med sekundært antistoff (se Materialetabell ) pluss DAPI ved RT i 4 timer på en gyngeplattform eller over natten ved 4 ° C.
Merk: Bruk DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) ved en sluttkonsentrasjon på 5 μg / ml for å visualisere kjernene. - Vask det helfestede vevet med vaskebuffer 3 ganger i 10 minutter hver. Inkuber vevstykkene i 80% glyserol eller 80% sukrose natten over for å dehydrere vevet for bedre bevaring.
- Plasser de enkelte vevstykkene på en glidelåse og fjern den overdreven dehydreringsbufferen. Dekk vevet med monteringsmedium, sett et deksel og trykk forsiktig på vevet for å sette det.
- Utfør konfokal mikroskopisk bildeoppkjøp. For helmonterte brystkjertler, kjøp bilder ved hjelp av en 40X med NA = 1.3 oljeobjektivve. Oppnå fliser av Z-stabler med en optisk seksjonsoppløsning på 1.024 x 1.024 og en lagseparasjon på 1,0 - 1,2 μm.
Merk: For å fange det riktige fluorescenslyset, bør filterstrålesplitteren settes til tredobbelt dikroisk (TD) 488/553/638, med forsterkningsinnstillingen ved PMT Gain 600-800. Følgende exciterings- / utslippskilder skal benyttes: mGFP, med eksitasjons- / utslippsmaxima på 488/509 nm; MTomato med eksitasjons- / utslippsmaxima på 532/588 nm; Alexa-647, med eksitasjons- / utslippsmaxima på 594/665; Og DAPI, med eksitasjons- / utslippsmaksima på 350/470.
- Fortynn det primære antistoffet i antistofffargingsbuffer i et 2 ml sentrifugerør. Inkuber vevet med primært antistoff over natten ved 4 ° C.
4. Lineage Tracing ved hjelp av en genmodifisert musemodell
- Oppdag Procr + VESCs ved hjelp av musemodellen.
- Bruk Procr Creert2-IRES-tdTomato / + (referert til som Procr Creert2 ) innstramming av musestammen .
Merk: I denne musemodellen, en Creert2-IRES-tdTomato kassett Procr 11 .- Kryss Procr Creert2- mus med Rosa26 mTtomatomGFP (referert til som R26 mTmG ) reporterstamme for å spore skjebnen til endogene Procr + ECs in vivo 11 . Identifiser alle merkede endogene Procr + EC og deres etterkommere ved bruk av GFP-uttrykk.
- Administrer tamoxifenoppløsning 11 (10 mg tamoxifen oppløst i 1 ml jordnøttolje + 10% etanol for å oppnå en stamopløsning på 10 mg / ml) intraperitonealt i en dose på 4 mg / 25 g kroppsvekt i pubertaletrinnet (5 uker Gammel) for å følge utviklingsskjebnen til Procr + ECs.
- Analyser klonformingseffektiviteten til merkede celler ved fullmontering av immunfarging etter fremgangsstrinnene beskrevet i trinn 3. Oppnå brystfettputer fra behandlede mus både etter kortsiktig (2 dager) og forlengede tidsperioder (opptil 10 måneder). Se figur 3 .
- Bruk Procr Creert2-IRES-tdTomato / + (referert til som Procr Creert2 ) innstramming av musestammen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mammary VESCs Isolasjon:
For å isolere endotel-populasjonen for den resulterende transplantasjonsanalysen, modne (8 uker gamle), ble jomfrukjertler med jomfru høstet som donormateriale. Endotelceller ble isolert ved anvendelse av en antistoffbasert cellesorteringsteknikk. Representative plott av FACS-analysen av VESC-populasjonen i 8-ukers C57BL / 6-brystkirtel ECs er vist i Figur 1 (Figur tilpasset fra Yu et al. 8 med tillatelse).
Mammary Fat Pad Transplantation:
Brystfettpuden gir et ideelt sted for studier av angiogenese. Etter FACS-basert isolasjon ble Procr + ECs blandet med 0,5% kjellermembranmatrise og 0,1% trypanblå indikator og ble så transplantertTed til den tomme fettpute av 3 uker gamle SCID mottakere. Under puberteten skaper brystfettpuden et angiogent miljø som fremmer remodeling av vaskulaturen i samsvar med brystepitel utvidelse. Som et resultat ble transplantert Procr + ECs (GFP + ) innlemmet i de store fartøyene til verten ( figur 2B , piler) og også dannet sekundære og tertiære GFP + -karboner ( figur 2B , pilespisser). Selv om transplanterte Procr + ECs også kan generere kar i en matriksplugg-analyse (satt inn under flankehuden), ser de dannede karene bare ut som kapillærlignende ( figur 2A ; figuren er tilpasset fra Yu et al. 8 med tillatelse).
Fartøyets funksjonalitet dannet av Procr + VESCs:
For å undersøke om GFP + vEsseler i brystfettputer er en del av den funksjonelle sirkulasjonsvaskulaturen, isolectin ble administrert ved intravenøs injeksjon før høsting. GFP + -fartøyene var isolectin +, hvilket indikerer at de dannede karene er luminert og forbundet med vertsvaskulaturen ( figur 2B ; figur tilpasset fra Yu et al. 8 med tillatelse).
Mammary VESC Lineage Tracing ved hjelp av Procr Creert2 ; Rosa26 mTmG Musemodell :
Procr Creert2 ; Rosa26 mTmG- mus ble brukt for skjebnesporing av Procr + VESCs in vivo ( Figur 3A ). For å undersøke hvordan Procr + VESCs bidrar til robust angiogenese og vaskulær remodeling i løpet av brystkirtlen pubertal utvikling, Procr Creert2 ; Rosa26 mTmG var administreringD med tamoksifen for å indusere GFP-ekspresjon i Procr + endotel-populasjonen. Brystfettputer av medikamentbehandlet Procr Creert2 ; Rosa26 mTmG- mus ble høstet både kortsiktige (2 dager etter injeksjon, figur 3B ) og langsiktig (opptil 10 måneder etter injeksjon; figur 3C -F; figur tilpasset fra Yu et al. 8 med tillatelse). Hele monteringen ble utført for å visualisere sporingsresultatet. Den vaskulære endotelidentiteten kan valideres ved farging med endotel-overflate markør VE-Cadherin (Cdh5; Figur 3B , høyre bilde).
Figur 1: Analyse av VESCs i musekjertelkjertel. FACS-analyse av Procr-uttrykk i 8-ukers C57BL / 6 brystkirtel ECs. 8 uker gammel vIrgin C67BL / 6 kvinnelige mus ble brukt til brystkjertelsamling. Etter at celleprøver ble fremstilt ble ikke-fargede prøver og hver enkeltfargekontroll analysert for å bestemme spenningen for hver farge. Kompensasjonsparametrene ble beregnet for å unngå automatisk fluorescens eller bakgrunnsfarvning. En mal ble etablert for riktig gating og å sortere for de ønskede cellepopulasjoner. For å etablere hierarkiet av FACS-sortering ble utslipp fra alle hendelser eliminert, og deretter ble dubletter eller klebemiddelcelleklynger kassert. Lineage-celler ble gated ut, og CD31 og CD105 ble brukt til å definere endotel-populasjonene. Procr + -celler ble isolert fra CD31 + CD105 + ECs sammenlignet med FMO-kontroll. Denne figuren er blitt modifisert fra Yu et al. 8 , med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: VESC Mammary Fat Pad Transplantation Assay. ( A ) Et fartøy dannet fra Procr + ECs i en kjellermembranmatriksplugg satt subkutant under flankehuden. ( B ) Konfokalbilde av en mottakerbrystfettpute, som indikerer integrasjonen og bidraget til transplantert Procr + ECs (GFP +) for å verne brystvaskulatur. ECs ble motsatt med CD31. ( C ) Intravenøs injeksjon i mottakermus med isolectin viste at utvekstene dannet luminiserte kar. Skalbjelke, 50 μm. Bilder ble ervervet ved hjelp av et 40X NA 1.3 oljemål. Tile-skanninger av Z-stabler ble anskaffet ved en optisk seksjonsoppløsning på 1.024 x 1.024, og hvert lag var 1,0-1,2 pm fra hverandre. For å fange det riktige fluorescenslyset ble filterstrålesplitteren satt til TD 488/553/638, med gAin setting ved PMT Gain 600-800. Følgende exciterings- / utslippskilder ble brukt: mGFP, med eksitasjons- / utslippsmaxima på 488/509 nm; MTomato, med eksitasjons- / emisjonsmaxima på 532/588 nm; Alexa-647, med eksitasjons- / utslippsmaxima på 594/665; Og DAPI, med eksitasjons- / utslippsmaksima på 350/470. Denne figuren er blitt modifisert fra Yu et al. 8 , med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Lineage Sporing av Procr + ECs demonstrerer deres bidrag til EC Clonal Expansion under utvikling. ( A ) Illustrasjon av linjesporingsstrategien ved hjelp av Procr Creert2 ; Rosa26 mTmG linje (venstre panel). eksperimentellOppsett som brukes på kort sikt (2 dager) og langsiktig (7 dager til 10 måneder), som angitt (Høyre panel). ( BF ) Helmontert konfokal avbildning av brystvasculatur etter forskjellige lengder av sporingsperioder, som indikerer den opprinnelige plasseringen av merket Procr + EC og deres bidrag til brystvaskulatur ved forskjellige sporingstrinn. Skalbjelke = 50 μm. Denne figuren er blitt modifisert fra Yu et al. 8 , med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Angiogenese-analyser representerer en god eksperimentell tilnærming til å studere vaskulær dynamikk. Mus retinal vaskulatur, som utvikler seg postnatalt, har vist seg å være en attraktiv modell for å studere angiogenese 12 . Til tross for at den er relativt tilgjengelig, er faktisk manipulering i retina vaskulærsengen ganske vanskelig. Hittil har den best beskrevne in vivo transplantasjonen vært plug-analysen, som omslutter celler inne i en kjellermembranmatriksmasse og kirurgisk implantater / injiserer subkutant ved flankområdet til en mottakermus. Denne angiogeneseanalysen er effektiv ved å teste det regenerative potensialet og kar-dannende evne til innebygde celler. Siden plasseringen av den implanterte matrikspluggen imidlertid skaper et relativt isolert miljø for cellene i, gir det ikke en optimal fysiologisk nisje. Nylig har en ny lungeangiogenesemodell også blitt utviklet ved å bruke en fibrinplast på surfenCe-stedet av muselungen 13 . Imidlertid utgjør manipulatene enda en risiko, fordi denne teknikken opererer invasivt inne i brysthulen til musen, og gjør det derfor vanskelig å bruke i en mer generalisert analyseinnstilling.
I angiogenese-analysen som er beskrevet her, transplanteres et lite volum av celleblanding inne i brystkirtlen, som gir rom, matrise og rike angiogene stimuli under pubertet. Dette gjør det mulig for de genererte fartøyene å overholde og integrere seg i remodeling vertsvaskular, slik at det blir mulig å utføre en annen funksjonell evaluering, så vel som å representere en fordel i forhold til den subkutane plug-analysen. Dessuten er brystfettpuden lokalisert utenfor bukhulen, noe som gjør det til et veldig tilgjengelig sted. Drift på brystfettpuden introduserer begrenset nød til mottakerdyret, og unngår invasive kirurgiske prosedyrer involvert i retinale og lungebaserte analyser.
Blodvasculatur hvitHele et organ blander seg ofte mellom vevskomponenter for å maksimere vaskulær dekning, slik at tilførsel av blodsyre og materialoverføring kan optimaliseres. Av den grunn oppfanger den konvensjonelle delen av vevet ofte den rørformede strukturen av dens kar. Analyse på vaskulære egenskaper utføres best når karene kan bevares og forbli intakt. Hele bærepreparatet av et vev kan i stor grad bevare hele den vaskulære arkitekturen innenfor. Denne metoden tillater ikke bare observasjonen av den autentiske romlige fordeling av blodkaret i et organ, men også forholdet til andre vevskomponenter.
Homeostasen til et stamcelleholdig vev opprettholdes ved å balansere genereringen og tapet av cellemasse. Stamceller i det bestemte beboelsesorganet er ofte skjermet og i nær kontakt med det omgivende vevsmiljøet, referert til som stamcelle nisje. Derfor stuDøranalysering av voksen stamcellervev bør fortrinnsvis utføres i en intakt fysiologisk kontekst. Transplantasjonsanalyser kan gi et middel til å vurdere cellepotensialet, mens linjesporingsteknikken muliggjør utforskning av ekte cellefellesskap innen det naturlige habitat. I de senere år har in vivo linjesporing blitt en kraftig teknikk for eksperimentell evaluering av stammeegenskaper. Denne strategien har blitt brukt til å identifisere vevstammen stamceller og deres avkom i flere vev, inkludert tarmene 10 , 14 , hårsekkene 15 , magen 16 og bukspyttkjertelen 17 . Linjesporingsmetoden er i stor grad avhengig av den genetiske merkingen av stamceller og initieres i definerte populasjoner. Derfor er det vanskelig å utelukke muligheten for at faktisk stammen er funnet i en enda mindre subpopulasjon innenfor de merkede cellene. Det er derfor avgjørende å kartlegge opprinnelsescellen av sporte kloner med presisjon og kvantitativt måle sporingseffektiviteten over tid. På den måten kan selvbetjeningskapasiteten til den merkede befolkningen gripes inn.
Den beskrevne angiogeneseanalysen kan modifiseres for spesifikke studieformål: det kan ikke bare brukes til å teste båtgenerasjonsevnen til endotel-populasjoner av interesse, men også for å evaluere effekten av angiogene faktorer på lokalisert beholderomforming. Siden brystkirtlen gjennomgår dynamiske morfologiske endringer i ulike utviklingsstadier ( f.eks pubertet, østrus sykluser og graviditet), bør man ta hensyn til effekten av systemiske endringer, som for eksempel hormonell nivåvariation, under resultatfortolkning. De kritiske trinnene i denne analysen inkluderer primær endotelcelleisolasjon. For optimal oppnåelse av levedyktige celler for transplantasjon bør prosedyrer for FACS-isolasjon bE gjennomføres forsiktig. Forsiktighet bør utvises for å unngå hard håndtering under cellepreparater, som for eksempel cellepelletløser og suspensjon. Et annet kritisk trinn er celleblandingens injeksjon i fettpatronen. Under fettpudseinjeksjonen er det viktig å sikre at celleblandingen er nøyaktig avsatt inne i fettputen. Dette kan være vanskelig hvis nålinnsatsen er for dyp / grunne eller hvis det totale volumet overstiger anbefalt dose.
Denne protokollen gir en rekke eksperimentelle metoder som bidro til identifisering av en endotel-stamcellepopulasjon. Gjennom disse teknikkene var det mulig å vurdere stamcelleegenskaper gjennom transplantasjon, samt å spore og observere deres oppførsel under fysiologiske prosesser in vivo . Disse tilnærmingene er effektive verktøy som kan brukes på flere disipliner, inkludert studier av endotel-populasjoner i tumormiljøer og for endringer i deres cellepotensiale. JegN spesielt er fettpudstransplantasjonen og helmontering forberedt reproducerbare og kraftige metoder som kan hjelpe til i fremtidige anstrengelser for å undersøke ulike aspekter av vaskulær biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (31530045 og 31371500 til YAZ, 31401245 til QCY), Kinas departement for vitenskap og teknologi (2014CB964800), Det kinesiske vitenskapsakademiet (XDB19000000 til YAZ) og den kinesiske Society of Cell Biology (Early Career fellesskap til QCY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1x) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps - Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µL per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1x | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 µg/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
- Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
- Bompais, H., et al. Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).
- Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell. PLoS Biol. 10 (10), e1001407 (2012).
- Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels. EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Snippert, H. J., Clevers, H. Tracking adult stem cells. Embo Rep. 12 (2), 113-122 (2011).
- Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor. Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Wang, D. S., et al. Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression. Nature. 517, 81-U201 (2015).
- Stahl, A., et al. The Mouse Retina as an Angiogenesis Model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012 (2014).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).
